專利名稱：牛膝提取物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種天然植物提取物及其提取方法和新用途。
背景技術(shù)：
慢性咽炎(chronicpharyngitis)為咽部黏膜、黏膜下層及淋巴組織的慢性炎癥， 可分為單純性、增生性和萎縮性三種類型。以發(fā)音困難，咽部不適、發(fā)干、異物感或輕度疼痛、干咳、惡心，咽部充血呈暗紅色，咽后壁可見淋巴濾泡等為主要臨床表現(xiàn)。慢性咽炎患者，因咽分泌物增多，故常有清嗓動作，吐白色痰液。目前治療慢性咽炎的方法很多，如西醫(yī)一般主張用口泰、復(fù)方硼砂溶液等漱口液， 含服華素片、安吉含片、g菌含片等。這些藥物長期使用會導(dǎo)致口腔內(nèi)環(huán)境紊亂，采用抗生素藥物達(dá)到咽部較少，且會產(chǎn)生耐藥性和毒副作用。對于肥厚增生性咽炎，可采用激光、微波、 冷凍等方法。但這些療法目前有濫用趨勢，門診上經(jīng)常見到因手術(shù)后咽部瘢痕嚴(yán)重增生、攣縮而病情加重前來就診的病人。因此，采用天然植物有效成分預(yù)防或治療慢性咽炎越來越受人關(guān)注。在江蘇省揚(yáng)州等地民間，常用莧科牛膝屬植物牛膝Uchyran thes biden ta ta Blume.)泡茶治療和預(yù)防慢性咽炎，效果顯著。中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，牛膝性味酸平，歸肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，活血通經(jīng)，引火下行，利尿通淋等功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，牛膝具有抗衰老、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛消炎、提高機(jī)體免疫力等多種生物活性和藥理作用，其主要活性物質(zhì)以牛膝多糖、牛膝皂苷研究較多。但是，在研究和應(yīng)用方面存在以下問題
(1)牛膝治療和預(yù)防慢性咽炎雖在民間有所應(yīng)用，但應(yīng)用地域并不廣泛，其它地區(qū)用于治療咽炎的記載較少。(2)對牛膝功效的研究，目前以抗衰老、抗腫瘤、提高免疫力等較多，對抗炎作用報道較少，抗炎研究都大多停留在對急性炎癥及其可能相關(guān)因素方面，針對在慢性咽炎方面的研究更為少見。(3)將牛膝用于治療和預(yù)防慢性咽炎還停留在經(jīng)驗水平上，其作用機(jī)理尚不明確。以牛膝為原料，具有以下優(yōu)點
(1)在河南焦作等地，有大面積栽培，即歷史上有名的地道藥材“懷牛膝”。每年秋后采收地下部分，并將地上莖葉部分廢棄。因此，與一般市售清咽功能產(chǎn)品原料相比，牛膝原料豐富易得，原料成本更低。(2)中國傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)認(rèn)為，牛膝性平，適宜人群更廣泛，特異體質(zhì)者長期食用也不易對身體產(chǎn)生不良影響。在我國衛(wèi)生部于2002年3月5日公布的《關(guān)于進(jìn)一步規(guī)范保健食品原料管理的通知》中，牛膝已經(jīng)被批準(zhǔn)列入“可用于保健食品的物品名單”。因此，安全性較高，無毒副作用。(3)將牛膝作為單方使用，更易于質(zhì)量控制。本發(fā)明涉及牛膝提取物的制備方法及其在清咽功能方面的新用途。取本發(fā)明提取物的有效部位，附加常規(guī)使用的輔料，按照常規(guī)工藝方法，可制成多種劑型的清咽保健食品或是藥品，如清咽保健飲料、清咽保健口香糖、清咽保健糖果制品或是藥用片劑、顆粒劑、軟
膠囊劑等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供牛膝有效部位在清咽功能方面的新用途，并公開牛膝提取物有效部位的制備方法。本發(fā)明所述的牛膝提取物，是通過以下方法制備將牛膝以極性溶劑室溫提取 3-5次，每次1-3天；將3-5次提取液過濾后合并，常壓濃縮得粗提物浸膏。將粗提物浸膏以蒸餾水溶解，采用石油醚脫脂后，分別用乙酸乙酯、正丁醇依次萃取3-5次，合并正丁醇萃取液，常壓濃縮至無醇味后_70°C冷凍干燥成凍干粉，即為牛膝的提取物有效部位。所述的牛膝可取全株植物，包括根、莖、葉和種子，優(yōu)選地上部分。提取的極性溶劑使用水、醇類，或是水與醇類的混合物。優(yōu)選的醇包括甲醇、乙醇、 正丁醇或是其混合物，最優(yōu)選的是乙醇，乙醇濃度為體積比10%-95%。浸提時溶劑量為原料重量的1-15倍。提取可以在靜態(tài)或是動態(tài)下，優(yōu)選在靜態(tài)條件下。提取溫度從室溫到溶劑回流溫度的范圍內(nèi)，優(yōu)選在15°C _35°C的溫度下。提取可連續(xù)或間歇進(jìn)行，間歇提取時可重復(fù)3-5次，提取時間是8-72小時，優(yōu)選為M-觀小時。本發(fā)明還公開了上述牛膝提取物在制備清咽類和/或抗炎類的保健食品或藥品中的應(yīng)用。依據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》(2003)中“清咽功能”的評價方法，通過動物實驗證明，牛膝的該有效部位對慢性炎癥模型的大鼠具有顯著的抗炎消腫的作用，可預(yù)防慢性炎癥類疾病的發(fā)生。
具體實施例方式在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體的實施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下的實施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。 所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時表明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。牛膝的該有效部位可以用于各種清咽類和/或抗炎類的保健食品或藥品，使用范圍包括在此主料基礎(chǔ)上，適量添加其它提取物、和/或添加其它原料和/或添加食品添加劑的各種配方。實施例1 牛膝有效部位的制備
選用懷牛膝地上部分包括莖、葉、種子為植物原料，85%的乙醇溶劑在靜態(tài)條件下浸提， 浸提時溶劑量為原料重量的1倍，溫度為室溫，間歇提取三次，一次Mh。將上述方法所得的提取液進(jìn)行合并，過濾。濾液常壓加熱濃縮至無醇味并呈一定體積后，以蒸餾水轉(zhuǎn)移溶解，通過萃取，得到有效部位。萃取劑分別為石油醚、乙酸乙酯和正丁醇。具體方法為講蒸餾水稀釋轉(zhuǎn)移液倒入萃取瓶中，先用石油醚脫脂，共3次，合并萃取液；取石油醚萃取水相再以乙酸乙酯進(jìn)行萃取，共3次，合并萃取水相溶液；再以正丁醇對其進(jìn)行萃取，共3次，合并正丁醇萃取有機(jī)相溶液，常壓加熱濃縮至無溶劑殘留后，入超低溫冰箱-70°C冷凍一晝夜，再進(jìn)冷凍干燥機(jī)凍干成粉末，此凍干粉末即為本發(fā)明的有效部位。牛膝提取物清咽保健功效的測定
本發(fā)明牛膝有效部位經(jīng)藥理學(xué)試驗實驗證實，具有清咽保健功效，可用于制備具有清咽功效的保健品。以下藥理實驗用于進(jìn)一步說明但不限于本發(fā)明。牛膝有效部位的清咽功效評價實驗 1. 1試驗材料
試驗材料本發(fā)明有效部位，置于玻璃干燥器或冰箱內(nèi)在陰涼處保存。試驗動物SPF級Wistar大鼠，單一性別，本實驗優(yōu)選雌性性別，體重150_220g。 共50只，隨機(jī)分5組，每組10只。試驗環(huán)境條件無對流風(fēng)，屏障系統(tǒng)。溫度為21_27°C，相對濕度為50%士5。樣品處理按《中國藥典》2010年版中藥材及飲片臨床標(biāo)準(zhǔn)修訂內(nèi)容中牛膝用法用量的推薦量4. 5-9. 0g，分別擴(kuò)大相應(yīng)倍數(shù)，設(shè)牛膝有效部位提取物低、中、高劑量，分別為400mg/kg、800mg/kg、1200mg/kg(大概相當(dāng)于人體推薦劑量的5、10、15倍)。低、中、高劑量受試液配制時分別按容量ImVlOOgBW的標(biāo)準(zhǔn)配制，配制液使用蒸餾水。主要儀器和試劑游標(biāo)卡尺、大鼠灌胃器、瓊脂、解剖手術(shù)設(shè)備。1. 2試驗方法與結(jié)果
1. 2. 1大鼠足趾腫脹試驗(參照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》中“清咽功能”的評價方法)
單一性別雌性大鼠按體重分為5組，分別為空白對照組、陽性對照組和3個受試樣品劑量組。各組分別按lml/100g灌胃量給藥。第一組為空白對照組灌胃給予10ml/kg蒸餾水， 第二組為陽性對照組灌胃給予50mg/kg阿司匹林，第三組為有效部位小劑量組灌胃給予 400mg/kg的活性物質(zhì)，第四組為有效部位中劑量組灌胃給予800mg/kg的活性物質(zhì)，第五組為有效部位高劑量組灌胃給予1200mg/kg的活性物質(zhì)。每日清晨空腹灌胃，晚間禁食12h， 不控制飲水，連續(xù)給藥30天，試驗結(jié)束當(dāng)天再給一次受試樣品，1小時后于大鼠右后足趾皮下注入1%瓊脂0. Iml/只，分別在致炎后1、3、5、7小時，測量各鼠足趾部厚度，同一部位測量三次，取平均值。分別比較不同濃度樣品和空白對照組在不同時間點足趾部厚度差異情況，觀察時間不少于30天。任一時間點刺激前后足跖厚度的差值明顯減少，差異有顯著性， 可判定該受試品動物實驗結(jié)果為陽性。試驗結(jié)果
經(jīng)口灌胃給予Wistar大鼠本發(fā)明樣品三種不同的濃度30天后，小劑量組即每公斤體重給藥400mg組沒有表現(xiàn)出抗炎消腫的功能，SPSS統(tǒng)計分析的/7值大于0. 05。中劑量組 800mg/kg和高劑量組1200mg/kg灌胃給藥30天后給予致炎劑，分別在1小時、3小時、5小時、7小時時足趾厚度的差值與對空白照組相比差異顯著，經(jīng)SPSS統(tǒng)計軟件分析，/7 < 0. 01 或/7 < 0. 05，提示該濃度的受試樣品對試驗動物具有清咽功能，且抗炎功效可維持7小時之久。
本發(fā)明樣品的三個劑量組與陽性對照組阿司匹林相比較，抗炎效果略低于阿司匹林；且本發(fā)明樣品的用藥劑量也高于阿司匹林，但與國藥字號的抗炎藥物相比，從服用安全性或是服用后的毒副作用角度考慮，本樣品的食用安全性遠(yuǎn)比阿司匹林要高。小劑量組經(jīng)SPSS統(tǒng)計軟件分析，ρ值大于0. 05，表明該劑量組的藥物對試驗動物沒有抗炎消腫的影響，抗炎功能不顯著。由此可表明，牛膝提取物的抗炎消腫功效是有一定劑量要求的。大鼠瓊脂肉芽腫實驗(參照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》中“清咽功能”的評價方法)
單一性別雌性大鼠按體重分為5組，分別為空白對照組、陽性對照組和3個受試樣品劑量組。各組分別按lml/100g灌胃容量給藥。第一組為空白對照組灌胃給予10ml/kg蒸餾水，第二組為陽性對照組灌胃給予50mg/kg阿司匹林，第三組為有效部位小劑量組灌胃給予400mg/kg的活性物質(zhì)，第四組為有效部位中劑量組灌胃給予800mg/kg的活性物質(zhì)，第五組為有效部位高劑量組灌胃給予1200mg/kg的活性物質(zhì)。給藥前各大鼠左腋下注射洲瓊脂溶液anl。每日清晨空腹灌胃，晚間禁食12h，不控制飲水，連續(xù)給藥30天。末次給藥后lh， 處死動物，剝離出肉芽瓊脂腫塊，稱取濕重，比較各給藥組與空白對照組之間有無統(tǒng)計學(xué)差異。實驗組與空白對照組比較，肉芽腫凈量明顯下降，經(jīng)統(tǒng)計處理差異有顯著性，可判定該受試樣品動物實驗結(jié)果陽性。試驗結(jié)果
給予致炎劑后，經(jīng)口灌胃給予Wistar大鼠本發(fā)明樣品三種不同的濃度30天后，小劑量組即每公斤體重給藥400mg組沒有表現(xiàn)出抗炎消腫的功能，SPSS統(tǒng)計分析的/7值大于 0. 05。中劑量組800mg/kg和高劑量組1200mg/kg灌胃給藥30天后，實驗組與空白照組相比差異顯著，肉芽腫凈量明顯下降，經(jīng)SPSS統(tǒng)計軟件分析/7 <0.01，提示該濃度的受試樣品對試驗動物具有清咽功能，且抗炎功效顯著。本發(fā)明樣品的三個劑量組與陽性對照組阿司匹林相比較，抗炎效果雖不及阿司匹林，且本發(fā)明樣品的用藥劑量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于阿司匹林，但與國藥字號的抗炎藥物相比，從服用安全性或是服用后的毒副作用角度考慮，本樣品的食用安全性遠(yuǎn)比阿司匹林要高。小劑量組經(jīng)SPSS統(tǒng)計軟件分析，ρ值大于0. 05，表明該劑量組的藥物對試驗動物沒有抗炎消腫的影響，不具有抗炎功能。由此可表明，牛膝提取物的抗炎消腫功效是有一定劑量要求的。從試驗數(shù)據(jù)分析可看出，在800mg/kg和1200mg/kg劑量范圍內(nèi)，本發(fā)明樣品的抗炎功能與用藥劑量呈量效正相關(guān)關(guān)系。2牛膝有效部位的安全性研究 2. 1試驗材料
試驗材料本發(fā)明有效部位(詳見實施例1)，置于玻璃干燥器在陰涼處保存。實驗動物SPF級Wistar大鼠，雌雄各半。試驗環(huán)境條件無對流風(fēng)，屏障系統(tǒng)。溫度為21_27°C，相對濕度為50%士5。2. 2試驗方法與結(jié)果 (1)急性毒性
SPF級Wistar大鼠按外來化學(xué)物急性毒性分級(WHO)微毒(5000 mg/kg)劑量灌胃給藥。試驗結(jié)果
SPF級Wistar大鼠雌雄性均未出現(xiàn)急性中毒癥狀，這個劑量換算到人體的可能致死量為> 1000g/60kg，即60kg體重的人每天服用大于IOOOg的量也許會產(chǎn)生微量的毒副作用， 而一般人每天是無法達(dá)到這個劑量的，所以認(rèn)定牛膝提取物的安全性很高，為確保其性狀穩(wěn)定，我們將繼續(xù)進(jìn)行下一步的亞慢性毒理實驗，以確保其安全性。( 2 )亞慢性毒性試驗(30天喂養(yǎng))
本發(fā)明有效部位(詳見實施例1)，以外來化學(xué)物急性毒性分級(WHO)微毒劑量5000mg/ kg的劑量灌胃連續(xù)給藥30天。試驗結(jié)果
通過30天的喂養(yǎng)實驗后觀察，10只大鼠(雌雄各半)飲食、活動糞便情況正常，生長發(fā)育良好，無一只出現(xiàn)明顯中毒癥狀，也無一只死亡。大鼠的肝、血液循環(huán)系統(tǒng)、腸胃系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、造血或凝血系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、眼、呼吸系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、皮膚和肌肉的一般檢查均無異常反應(yīng)出現(xiàn)，證明牛膝提取物是無毒、副作用的。長期食用也不會對人體產(chǎn)生不良的副作用。實施例2 選用懷牛膝地上部分包括莖、葉、種子為植物原料，甲醇溶劑回流提取， 浸提時溶劑量為原料重量的5倍，溫度為15°C _35°C，間歇提取5次，一次他。將上述方法所得的提取液進(jìn)行合并，過濾。濾液常壓加熱濃縮至無醇味并呈一定體積后，以蒸餾水轉(zhuǎn)移溶解，通過萃取，得到有效部位。萃取劑分別為石油醚、乙酸乙酯和正丁醇。具體方法為講蒸餾水稀釋轉(zhuǎn)移液倒入萃取瓶中，先用石油醚脫脂，共3次，合并萃取液；取石油醚萃取水相再以乙酸乙酯進(jìn)行萃取，共5次，合并萃取水相溶液；再以正丁醇對其進(jìn)行萃取，共5次，合并正丁醇萃取有機(jī)相溶液，常壓加熱濃縮至無溶劑殘留后，入超低溫冰箱-70°C冷凍一晝夜，再進(jìn)冷凍干燥機(jī)凍干成粉末，此凍干粉末即為本發(fā)明的有效部位。清咽功效評價與安全性與實施例1相似。實施例3 與實施例1基本相同，不同之處在于原料用10%的乙醇溶劑在靜態(tài)條件下浸提，浸提時溶劑量為原料重量的15倍，溫度為室溫，間歇提取三次，一次48h。實施例4 與實施例1基本相同，不同之處在于原料用95%的乙醇溶劑在靜態(tài)條件下浸提，浸提時溶劑量為原料重量的5倍，溫度為室溫，間歇提取三次，一次48h。實施例5 與實施例1基本相同，不同之處在于原料用正丁醇溶劑在靜態(tài)條件下浸提，浸提時溶劑量為原料重量的5倍，溫度為室溫，間歇提取三次，一次72h。
權(quán)利要求
1.一種牛膝提取物，其特征在于，由如下方法制成牛膝以極性溶劑室溫提取3-5次， 每次1-3天；將3-5次提取液過濾后合并，常壓濃縮得粗提物浸膏；粗提物浸膏以蒸餾水溶解，采用石油醚脫脂后，分別用乙酸乙酯、正丁醇依次萃取3-5次，合并正丁醇萃取液，常壓濃縮至無醇味后冷凍干燥為凍干粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛膝提取物，其特征在于，所述的極性溶劑為水、甲醇、乙醇、正丁醇或水與醇類的混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的牛膝提取物，其特征在于，所述的極性溶劑是乙醇，乙醇濃度為體積比10%-95%。
4.權(quán)利要求1所述牛膝提取物在制備清咽類和/或抗炎類的保健食品或藥品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及牛膝有效部位及清咽功能方面的新用途。所述牛膝有效部位由如下方法制成牛膝以極性溶劑室溫提取3-5次，每次1-3天；將3-5次提取液過濾后合并，常壓濃縮得粗提物浸膏；粗提物浸膏以蒸餾水溶解，采用石油醚脫脂后，分別用乙酸乙酯、正丁醇依次萃取3-5次，合并正丁醇萃取液，常壓濃縮至無醇味后冷凍干燥為凍干粉。本發(fā)明根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》(2003)中“清咽功能”的評價方法，通過動物實驗說明牛膝有效部位對慢性炎癥模型的大鼠具有顯著的抗炎消腫作用，可以用來制備預(yù)防慢性咽炎或抗炎的保健品或藥物。
文檔編號A61K36/21GK102357108SQ201110308159
公開日2012年2月22日 申請日期2011年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月12日
發(fā)明者崔桂友, 潘冬梅 申請人:揚(yáng)州大學(xué)