用組織因子抗體提高乳腺癌內(nèi)分泌藥物治療效果的方法
【專利摘要】一種通過組織因子拮抗劑提高乳腺癌內(nèi)分泌藥物治療療效的方法，該組織因子拮抗劑通過細胞內(nèi)信號傳導通路，提升或者重鑄雌激素受體在乳腺癌細胞中的表達，從而對以阻斷雌激素類的乳腺癌內(nèi)分泌藥物的療效起到提升和輔助作用。
【專利說明】用組織因子抗體提高乳腺癌內(nèi)分泌藥物治療效果的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及使用組織因子拮抗劑對于乳腺癌或者手術后防止癌癥擴算的效果，通 過組織因子拮抗劑提升雌激素受體在乳腺癌細胞中的表達，從而提高以雌激素受體抑制劑 類的內(nèi)分泌藥物的治療效果。所述的組織因子拮抗劑如針對組織因子的抗體，包括針對至 少一種組織因子的蛋白或者其片段特異性的所述抗體或者其變體。

【背景技術】
[0002] 乳腺癌的發(fā)病率在整個癌癥中排名第二，是我國女性最常見的惡性腫瘤，且發(fā)病 率呈逐年上升趨勢。目前對于乳腺癌的治療手段包括手術治療、放射治療、化學治療、內(nèi)分 泌治療和分子靶向治療。目前仍以手術切除為主，在科學和人文結合的現(xiàn)代乳腺癌治療新 理念指導下，乳腺癌的治療趨勢包括保留乳房和腋窩的微創(chuàng)手術、更為精確的立體定向放 療和選擇性更好的靶向藥物治療。分子靶向治療是近年來乳腺癌治療研究領域最為活躍的 部分，并有可能成為今后乳腺癌藥物研發(fā)的主要方向。同時根據(jù)乳腺癌的不同分型，體內(nèi)雌 激素受體（Estrogen receptor，ER)、孕激素受體（Progesterone receptor，PR)和人類表 皮生長因子受體2(HER2)都呈現(xiàn)陰性的患者，內(nèi)分泌治療和靶向用藥都受到極大的限制， 只能以化療為主。因此，探索對于腫瘤增殖、侵襲和轉移起作用的信號傳導通路，為新的分 子靶向藥物和改善內(nèi)分泌用藥提供理論基礎，對于提高乳腺癌臨床治療效果具有極其重要 的意義。
[0003] 組織因子（tissue factor, TF)是一個由263個氨基酸殘基組成的跨膜單鏈糖蛋 白，分子量約為47kDa。其中氨基端219個氨基酸殘基位于細胞膜外，緊隨其后的23個氨 基酸殘基則穿過細胞膜，其余21個氨基酸殘基位于細胞質內(nèi)。正常情況下，組織因子位于 血管壁外膜細胞，包繞血管的成纖維細胞，肝、脾、腎等器官的纖維囊，及皮膚外層的表皮細 胞、腎小球上皮細胞、腦皮質、心肌細胞、肺泡巨噬細胞、胃腸道壁、部分生殖泌尿道和子宮 內(nèi)膜基質細胞中，而在血管中膜或內(nèi)膜層卻很稀少。因此在正常情況下組織因子不存在于 循環(huán)中或不與循環(huán)血液接觸，只有當血管壁的完整性遭到破壞時TF才暴露于循環(huán)血液，通 過激活凝固級聯(lián)反應發(fā)揮止血作用。組織因子通過與因子VII/VIIa結合而啟動血液凝固 級聯(lián)反應。而且TF依靠其與細胞膜的緊密結合發(fā)揮"錨"作用，使生理性凝血過程局限于 損傷部位，而不從血液凝固的起始部位向遠處播散。當細胞表面表達的TF暴露于血漿蛋白 時，TF就會與其有高親和力的因子VII (factor VII，F(xiàn) VII)相粘連。而且TF2 Vila復合 物可進一步激活游離F VII。TF2 Vila復合物可迅速催化因子X的激活，這些過程最終導 致凝血酶產(chǎn)生。凝血酶進而催化纖維蛋白原轉變成纖維蛋白并聚合成纖維蛋白血塊，在血 栓形成過程中起著重要作用。TF除了在正常生理狀態(tài)下表現(xiàn)的功能外，越來越多的證據(jù)表 明TF在腫瘤的發(fā)展過程中起著重要的作用，TF的過度表達經(jīng)常與腫瘤的發(fā)生相關聯(lián)。
[0004] 雌激素受體（Estrogen receptor，ER)位于細胞核內(nèi)，介導雌激素的基因型效應， 即通過調節(jié)特異性靶基因的轉錄而發(fā)揮"基因型"調節(jié)效應，ER在乳腺癌的發(fā)生和治療中 起到重要作用。如果ER信號通路失調，可導致相關基因表達失衡或改變胞質內(nèi)蛋白功能， 促使乳腺細胞過度增殖或乳腺細胞凋亡受阻，從而導致乳腺癌的發(fā)生；另一方面目前針對 乳腺癌的內(nèi)分泌治療，大多以雌激素受體靶向，臨床上約有70%的乳腺癌患者為雌激素受 體陽性，雌激素受體陽性者應用內(nèi)分泌治療的有效率為50%?60%，而受體陰性者有效率 低于10%。Giacinti等嘗試去甲基化藥物可以使乳腺癌細胞的ER恢復表達，提高腫瘤對 抗雌激素藥物的敏感性，從而改善治療效果。Plescia等根據(jù)HSP90是乳腺癌疾病進程及 耐藥機制中許多關鍵蛋白的分子伴侶，影響ER的穩(wěn)定和結合激素的生物學功能，而嘗試用 HSP90的抑制劑sh印herdin進行乳腺癌治療。
[0005] W094/05328中公開了使用組織因子抗體抑制腫瘤的轉移的發(fā)作和發(fā)展，通過消除 微脈管系統(tǒng)中轉移細胞的長期粘著從而實現(xiàn)抑制轉移。但是并未公開是否通過和內(nèi)分泌藥 物聯(lián)合使用，并通過調控雌激素受體的表達而達到提升雌激素受體抑制劑類的內(nèi)分泌藥物 治療效果，從而達到抑制乳腺癌的轉移發(fā)作。
[0006] 專利1829531中公開了用抗組織因子抗體來抑制腫瘤生長的方法，主要通過組織 因子抗體抑制腫瘤血管形成，從而對于乳腺癌、胰腺癌等腫瘤移植到小鼠后檢測組織因子 抗體對于腫瘤的生長的影響。但是并未公開組織因子抗體對于腫瘤生長影響的機制的研 究，也并未嘗
[0007] 試對于組織因子抗體對于雌激素受體表達的影響的研究，并未公開組織因子抗體 和雌激素受體拮抗劑聯(lián)用對于雌激素受體陰性的腫瘤細胞的生長和轉移的抑制作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的：研究組織因子拮抗劑對于雌激素受體α的表達的影響情況，提升 針對ER α的內(nèi)分泌藥物的藥效作用。
[0009] 本發(fā)明所述的抗體是一種Fab抗體，可以是鼠源、人源、以及嵌合式的人單克隆抗 體或者他們的片段。所述抗體具備防止組織因子通過其細胞內(nèi)結構域產(chǎn)生的信號傳導的特 性。此類抗體應是本領域內(nèi)已知的，并且可以用于本發(fā)明的方法中。
[0010] 本發(fā)明所述的組織因子抑制劑提升了乳腺癌細胞中的雌激素受體的表達。
[0011] 本發(fā)明所述的組織因子抑制劑能夠和乳腺癌激素內(nèi)分泌藥物聯(lián)合使用，包括但不 限于他莫昔芬（三苯氧胺）、托瑞米芬（法樂通）、氟維司群（fulvestrant)、雷洛昔芬等藥 物，針對雌激素受體陰性和雌激素受體陽性的乳腺癌患者，能夠提升治療效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 下面結合附圖和具體的實施例對本發(fā)明做進一步詳細的說明。
[0013] 圖1圖示了 ERa在不同乳腺癌細胞中受TF及其抗體的影響情況。
[0014] 圖2圖示說明了在不同的乳腺癌細胞中TF及其抗體的影響腫瘤細胞增生及侵潤 情況。
[0015] 圖3圖示說明了皮下植入小鼠的人乳腺癌細胞的腫瘤生長速率（體積改變），從第 〇天到每周施用一次TF抗體，以及陰性對照PBS的情況。

【具體實施方式】
[0016] 以下結合具體實施例對上述方案作進一步說明，應理解，這些實施例是用于說明 本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實施例中所采用的實施條件可以根據(jù)具體廠家的條件 做進一步調整，未注明的實施條件通常為常規(guī)實驗中的條件。
[0017] 具體實施方案一，體外實驗
[0018] 1、乳腺癌細胞株MC F-7 cells(TF陰性表達，ER陽性表達）和MDA-MB-231 (TF陽 性表達，ER陰性表達）購自ATC C，分別在5% C02培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)液中，MCF-7細胞轉染 wild type TF(WTF)、切除了胞質域部分TF片段TF ACT (購自美國Rockville公司）。轉染 后的MCF-7細胞，通過PCR、ELISA和Western blotting技術檢測，ERa的m RNA和蛋白的 表達。轉染后的MCF-7細胞加入TF抑制劑MAB-5G9抗體lmg/ml，48小時后，同樣用ELISA， RT-PCR以及Western blotting檢測ERa的表達情況。
[0019] ELISA :取IX 106MCF-7細胞，破碎后離心1200rpm 8分鐘，取上清作為待測樣品。 ER a抗原3ug/ml，100ul/孔，4°C包被過夜，PBS洗板3次，5分鐘/次；第二天加入2% BSA 的PBS，37°C封閉1. 5小時；洗板后加入100ul每孔的待測樣品37°C，孵育lh ;再次洗板后 加入100ul/孔的HRP標記的anti-humanER，37°C，孵育lh ;洗板，每孔加入100ul顯色液， 靜止5分鐘待顯色后，每孔加入2M H2S04終止顯色，0D280mn讀數(shù)分析。
[0020] RT-PCR :取2X 106/ml MCF-7細胞，放到1. 5ml EP管中，加0. 2ml氯仿，劇烈搖動 30s，室溫3min。12000 X g，4°C離心，15min。吸上層無色水相，移入另一 EP管中（約0· 5ml)。 加等體積異丙醇，-20°C，30min。12000Xg，4°C離心，10min。在管底部可見微量RNA沉淀。 棄上清，加75%乙醇lml，振蕩7500Xg，4°C離心，10min。棄上清，用濾紙小心吸取殘留液 體，室溫干燥5-10min。沉淀溶于20μ 1 DEPC水，取1μ 1加入79μ 1 DEPC水測0D260/0D280 計算濃度與純度。
[0021] 逆轉錄合成cDNA
[0022] 反應體系如表1 :
[0023] 表 1
[0024]

【權利要求】
1. 組織因子的拮抗劑對于針對乳腺癌內(nèi)分泌藥物起到提高療效作用。
2. 權利要求1中所指的組織因子拮抗劑可以是鼠源、人源、以及嵌合式的人單克隆抗 體或者他們的片段。所述抗體具備防止組織因子通過其細胞內(nèi)結構域產(chǎn)生的信號傳導的特 性。
3. 根據(jù)權利要求2中，該抗體是一種Fab，F(xiàn)ab'，F(xiàn)(ab'）2的片段或者衍生物。
4. 根據(jù)權利要求2中，該抗體具備防止組織因子通過其細胞內(nèi)結構域產(chǎn)生的信號傳導 的特性。
5. 該抗體可以和乳腺癌激素內(nèi)分泌藥物聯(lián)合使用，包括但不限于他莫昔芬（三苯氧 胺）、托瑞米芬（法樂通）、氟維司群（fulvestrant)、雷洛昔芬等藥物聯(lián)合使用。
6. 該抗體對于乳腺癌細胞中的雌激素受體的表達起到促進作用。
7. 該抗體和乳腺癌激素內(nèi)分泌藥物聯(lián)合使用，對于雌激素受體陽性或者陰性的乳腺癌 患者都有效果。
8. 根據(jù)權利要求5,該抗體對于乳腺癌細胞包括但不限于MDA-MB-231。
9. 組織因子拮抗劑可用于腫瘤治療藥物，特指為乳腺癌內(nèi)分泌藥物的輔助治療藥物。
10. 根據(jù)權利要求9,該抗體對于以雌激素受體為靶向，或者以阻滯或者降低雌激素為 目的的乳腺癌內(nèi)分泌藥物起到良性的輔助作用。
【文檔編號】A61K31/565GK104056267SQ201310084936
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2013年3月18日 優(yōu)先權日:2013年3月18日
【發(fā)明者】李超, 夏志道 申請人:蘇州納諾康生物技術有限公司