Nadph氧化酶4抑制劑及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及Nox4抑制劑、其藥物組合物以及它們的用于治療和/或預(yù)防骨質(zhì)疏松癥或破骨細(xì)胞生成功能障礙，特別是骨質(zhì)疏松的和預(yù)骨質(zhì)疏松的破骨細(xì)胞生成功能障礙的應(yīng)用。
【專利說明】NADPH氧化酶4抑制劑及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及在治療和/或預(yù)防骨質(zhì)疏松癥和/或破骨細(xì)胞生成功能障礙(osteoclastogenesis dysfunction)如骨質(zhì)疏松的或預(yù)骨質(zhì)疏松的破骨細(xì)胞生成功能障礙中有用的藥劑。
【背景技術(shù)】
[0002]骨是一種取決于生物體(即使在成年期)的需求而發(fā)生永久性重塑的動(dòng)態(tài)的器官。骨的形成由成骨細(xì)胞介導(dǎo)，而源自骨髓系(the myeloid linage)的破骨細(xì)胞吸收骨。在體內(nèi)以及在培養(yǎng)模型中，破骨細(xì)胞生成需要分化因子“TNF-超家族的核因子kB配體的受體激活劑(RANKL, receptor activator of nuclear factor kappa B ligand)和巨曬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF, macrophage colony stimulating factor)”。M-CSF 誘導(dǎo)RANK、骨髓細(xì)胞上的RANKL受體的表達(dá)，而RANK配體的結(jié)合啟動(dòng)破骨程序和破骨細(xì)胞基因如抗酒石酸酸性憐酸酶(TRAP, tartrate-resistant acid phosphatase)和組織蛋白酶K(Cathepsin K)的誘導(dǎo)。即使成熟的破骨細(xì)胞被RANKL激活，從而促進(jìn)它們的存活和誘導(dǎo)導(dǎo)致骨再吸收的結(jié)構(gòu)變化。細(xì)胞因子如TGFii能夠進(jìn)一步促進(jìn)破骨細(xì)胞生成。TGF3與氧化應(yīng)激相關(guān)聯(lián)，因?yàn)樗黾恿嘶钚匝醮?R0S, reactive oxygen species)的形成和誘導(dǎo)了 NADPH 氧化酶 Nox4 的表達(dá)(Sturrock et al., 2006, Am.J.Physiol Lung Cell Mol.Physiol.，290:L661-L673)。
[0003]破骨細(xì)胞生成功能障礙已經(jīng)被廣泛描述為導(dǎo)致漸進(jìn)性骨質(zhì)流失的條件(Silvestris et al., 2011, Adv.Exp.Med.Biol., 714: 113-28 ；Maruotti etal., 2011, Clin.Exp.Med., Π (3): 137-45 ；ffang et al., 2011, Oral Dis., 17(2):129-42),特別是破骨細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的疾病如糜爛性關(guān)節(jié)破壞、牙根再吸收或先天牙齒萌出異常癥(primary eruption failure)和作為骨質(zhì)疏松癥發(fā)展的處所(premices)。因此,禁止破骨細(xì)胞生成過程將會(huì)影響這些疾病的原因，然而增強(qiáng)破骨細(xì)胞功能將僅影響臨床結(jié)果，但會(huì)伴隨觸發(fā)增強(qiáng)骨代謝并可能導(dǎo)致不太有利的骨結(jié)構(gòu)的不希望的副作用。
[0004]NADPH氧化酶(NOX)是通過生物膜轉(zhuǎn)移電子的蛋白。一般地，電子受體是氧氣且電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的產(chǎn)物是超氧化物。因此，NOX酶的生物學(xué)功能是由氧氣產(chǎn)生活性氧簇(reactive oxygen species, R0S)。活性氧簇(ROS)是氧-衍生的小分子,包括氧自由基(超氧陰離子[.02_]，羥基[H0.]，過氧化氫[R00.]，烷氧基[ROe]和過氧羥基[Η00.])和某些或者是氧化劑和/或容易轉(zhuǎn)化成自由基如過氧化氫(H2O2)的非自由基。含氮的氧化劑，如一氧化氮也稱作活性氮簇(reactive nitrogen species, RNS)。ROS的產(chǎn)生通常是開始于超氧化物或過氧化氫生成的級(jí)聯(lián)反應(yīng)?；蛘咦园l(fā)地，尤其在較低的PH值下，或者被超氧化物酶催化，超氧化物也歧化成過氧化氫。ROS產(chǎn)生的級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的其它要素包括超氧化物與一氧化氮生成過氧亞硝酸鹽(peroxynitrite)的反應(yīng),過氧化物酶-催化的由過氧化氫形成次氯酸的反應(yīng)和導(dǎo)致羥基自由基生成的鐵-催化的芬頓反應(yīng)(Fenton reaction)。
[0005]ROS極易與大量分子反應(yīng),這些分子包括其它小的無(wú)機(jī)分子如DNA,蛋白，脂質(zhì),碳水化合物和核酸。這種初始反應(yīng)可以生成次級(jí)自由基，因此使?jié)撛诘膫Ρ对?。ROS不僅參與細(xì)胞損傷和殺傷病原體，而且還參與幾乎所有細(xì)胞和組織內(nèi)的大量的可逆調(diào)節(jié)過程。然而，盡管ROS在調(diào)芐基礎(chǔ)生理過程中很重要，ROS的產(chǎn)生還可以不可逆地破壞或改變靶分子的功能。因此，逐漸將ROS確定為在生物有機(jī)體中破壞的主要貢獻(xiàn)者，即所謂的“氧化應(yīng)激”。
[0006] 雖然Nox蛋白的唯一已知功能是產(chǎn)生活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)，Nox4與其它的NADPH氧化酶的不同之處在于它產(chǎn)生過氧化氫酶，而不是超氧化物，且在于組成型活性酶的活性受表達(dá)水平和導(dǎo)致急性激活的非信號(hào)通路的調(diào)控(Takac etal., 2011, J.Biol.Chem., 286:13304-13313 ；Helmcke et al., 2009, Antioxid.Redox.Signal.，11:1279-1287)。NADPH氧化酶Nox4在分化的細(xì)胞內(nèi)普遍表達(dá)且Nox4的誘導(dǎo)已與間充質(zhì)細(xì)胞如心肌細(xì)胞，脂肪細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中的分化過程相聯(lián)系。
[0007]通過破骨細(xì)胞的增加的作用，氧化應(yīng)激已經(jīng)涉及在細(xì)胞培養(yǎng)模型中增強(qiáng)的骨再吸收和骨質(zhì)疏松癥以及破骨細(xì)胞生成(Lee et al., 2005, Blood, 106:852-859 ；Sasakiet al., 2009, J.Med.1nvest, 56:33-41) ?然而，盡管已經(jīng)表明NADPH氧化酶在破骨細(xì)胞生成過程中被上調(diào)，且抑制所有Nox蛋白的組分，p22phox防止破骨細(xì)胞生成(Sasaki etal., 2009, above),但是每個(gè)催化活性Nox亞型的作用是不明確的或者有爭(zhēng)議的。Sasaki etal., 2009, Free Radical Biology&Medicine, 47, 189-199 提供的證據(jù)表明 Noxl 和 Nox2 被抑制以限制破骨細(xì)胞生成和在阻止ROS產(chǎn)生和破骨細(xì)胞生成中Nox4抑制效率低下以及上面的Lee et al.，2005得出的結(jié)論是Noxl而不是Nox2或Nox4在骨髓單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞譜系細(xì)胞(bone marrow monocyte-macrophage lineage cells)的 RANKL-誘導(dǎo)的 ROS產(chǎn)生中是重要的。
[0008]因此，研發(fā)致力于對(duì)破骨細(xì)胞，骨再吸收和破骨細(xì)胞生成的作用的用于治療骨質(zhì)疏松癥的新的活性藥劑，是非?？扇〉?。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明針對(duì)的出乎意外的發(fā)現(xiàn)是，缺失Nox4基因?qū)е鹿侵衅乒羌?xì)胞標(biāo)記蛋白破骨細(xì)胞相關(guān)受體(OSCAR, osteoclast marker protein osteoclast-associatedreceptor)表達(dá)較低以及成骨細(xì)胞標(biāo)記蛋白骨橋蛋白(the osteoblast marker proteinosteopontin)表達(dá)較高，從而結(jié)果為Nox4通過破骨細(xì)胞生成的調(diào)控控制骨量。特別地，本發(fā)明針對(duì)的出乎意外的發(fā)現(xiàn)是，在體內(nèi)抑制Nox4能夠防止骨質(zhì)流失。特別地，本發(fā)明針對(duì)通過使用根據(jù)本發(fā)明的Nox4抑制劑來防止Nox4上調(diào)的結(jié)果即破骨細(xì)胞生成功能障礙的能力。
[0010]本發(fā)明針對(duì)在治療和/或預(yù)防骨質(zhì)疏松癥，特別是骨質(zhì)疏松的或預(yù)骨質(zhì)疏松的破骨細(xì)胞生成功能障礙中有用的Nox4抑制劑。值得注意的是，本發(fā)明涉及在抑制或降低Nox4活性中有用的新的分子。
[0011]第一方面，本發(fā)明提供了一種Nox4抑制劑，該Nox4抑制劑用于在治療和/或預(yù)防破骨細(xì)胞生成功能障礙和/或骨質(zhì)疏松癥中使用。
[0012]第二方面，本發(fā)明提供了一種或多種Nox4抑制劑在制備用于治療和/或預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的藥物組合物中的應(yīng)用。[0013]第三方面，本發(fā)明提供了新的Nox4抑制劑，及其互變異構(gòu)體，幾何異構(gòu)體，光學(xué)活性形式和藥學(xué)上可接受的鹽。
[0014]第四方面，本發(fā)明涉及用于作為藥物使用的新的Nox4抑制劑，及其互變異構(gòu)體，幾何異構(gòu)體，光學(xué)活性形式和藥學(xué)上可接受的鹽。
[0015]第五方面，本發(fā)明涉及含有至少一種根據(jù)本發(fā)明的Nox4抑制劑，及其互變異構(gòu)體，幾何異構(gòu)體，光學(xué)活性形式和藥學(xué)上可接受的鹽以及其藥學(xué)上可接受的載體，稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。
[0016]第六方面，本發(fā)明涉及含有與至少一種在治療或預(yù)防骨質(zhì)疏松癥中有用的共藥劑(co-agent)相結(jié)合的至少一種Nox4抑制劑，以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
[0017]第七方面，本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防或治療破骨細(xì)胞生成功能障礙和/或骨質(zhì)疏松癥的方法，包括在需要其的受試者中給藥有效量的一種或多種Nox4抑制劑。
[0018]第八方面，本發(fā)明涉及一種用于減少患者骨中破骨細(xì)胞生成的方法，包括在需要其的患者中給藥有效量的一種或多種Nox4抑制劑或其藥物制劑。
[0019]第九方面，本發(fā)明涉及Nox4抑制劑在制備用于預(yù)防和/或治療破骨細(xì)胞生成功能障礙和/或骨質(zhì)疏松癥的藥物制劑中的應(yīng)用。
[0020]第十方面，本發(fā)明涉及Nox4抑制劑在制備用于預(yù)防和/或治療骨質(zhì)疏松的破骨細(xì)胞生成和預(yù)骨質(zhì)疏松的破骨細(xì)胞生成的藥物制劑中的應(yīng)用。
[0021]第^ 方面，本發(fā)明涉及一種破骨細(xì)胞生成(ostoeclastogenesis)抑制劑的確定方法。
[0022]本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)通過以下詳細(xì)說明將是顯而易見的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1示出了小鼠中Nox4基因敲除對(duì)骨密度、破骨細(xì)胞的數(shù)量、分化和ROS形成的影響。A:實(shí)施例2中測(cè)定的小梁骨密度；B:如von Kossa, 1901，Beit.Path.Anat.，29:163所述的馮?科薩技術(shù)(von Kossa technique)染色的股骨末梢未脫鈣切片的圖片；C:實(shí)施例2中測(cè)定的最終力(Ultimate force)(最大頻率，F(xiàn)max) ；D:實(shí)施例3中測(cè)定的組織形態(tài)學(xué)分析計(jì)數(shù)的TRAP陽(yáng)性破骨細(xì)胞(N.0c)的數(shù)量以及E:如Mukherjee et al.，2008，J.Clin.1nvest.,118:491-504 所述的使用 Sigma-Aldrich(www.sigma_aIdrich.com) 387A-1KT方法的用Mayer的帆紫(hemalaun)反染的TRAP染色切片的典型圖片；F:如Shen et al.，2005，J.Biol.Chem.，280，40589-98所述的對(duì)股骨裂解液的破骨細(xì)胞標(biāo)記蛋白破骨細(xì)胞相關(guān)受體(OSCAR)、成骨細(xì)胞標(biāo)記骨橋蛋白和裝載參照3-磷酸甘油醛脫氫酶(loading control GADPH)的免疫印跡分析(Western blot analysis) ;G, H:如實(shí)施例3 所述的通過TRAP染色確定的由骨髓細(xì)胞體外分化的破骨細(xì)胞的數(shù)量(G)和典型圖片(H) ；1:實(shí)施例3中測(cè)定的預(yù)分化脾(spIeenocytes)中活性氧簇(ROS)百分?jǐn)?shù)；n≥3 ;*ρ〈0.05。
[0024]圖2示出了如實(shí)施例3所述的在野生型和Νοχ4-/_小鼠中測(cè)定的骨形成標(biāo)記物(原骨膠原IN-末端肽，ΡΙΝΡ)的血清濃度㈧與那些骨再吸收標(biāo)記物(TRAP5b)比較的血清濃度(B)和羧基末端膠原交聯(lián)結(jié)(CTX)的血清濃度(C) ；n ≥3 ;*p〈0.05。
[0025] 圖3示出了如實(shí)施例2所述的測(cè)定取自野生型和Nox4-/-小鼠的股骨末梢的(A)小梁寬度和(B)厚度的形態(tài)計(jì)量學(xué)；n ^ 3 ;*p〈0.05。
[0026]圖4示出了 Nox4在RANKL誘導(dǎo)信號(hào)中的作用及其上的Nox4抑制劑的效果，如實(shí)施例4所述的向骨髓來源的單核細(xì)胞提供M-CSF使用(RANKL)或不使用RANKL(ctl)預(yù)處理30h，在骨髓來源的單核細(xì)胞中通過Fura2熒光來測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Ca2+。A:野生型和Nox4-/-小鼠細(xì)胞的比較:在野生型細(xì)胞中Nox4抑制劑(化合物(I)或溶劑對(duì)鈣離子濃度的影響；n ^ 3 ;*ρ〈0.05。
[0027]圖5示出了如實(shí)施例5所述的在體內(nèi)Νοχ4對(duì)于骨質(zhì)流失的作用。A:對(duì)取自健康受試者和骨質(zhì)疏松癥患者或佩吉特氏病(Morbus Paget)患者的人骨材料染色的Nox4強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，η = 3-4 ;*ρ〈0.05 ；B,C:卵巢切除6周后股骨末梢的骨小梁密度。野生型(WT)動(dòng)物(未標(biāo)記，no label),用它莫西芬(tamoxifen)處理的野生型動(dòng)物(WT)和用它莫西芬處理的 Nox4-Flox-Flox-ERT2-Cre+/0 小鼠(N4_Cre*/*)的比較。η = 8-12 ;*ρ〈0.05 (C)；用溶劑(ctl)或Νοχ4抑制劑處理η = 11-14共6周的野生型(WT)動(dòng)物的比較⑶。 [0028]統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有的值是平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)。經(jīng)ANOVA (方差分析)后經(jīng)LSD事后比較檢驗(yàn)(LSD post hoc testing)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P值小于0.05的被認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著，WT:野生型小鼠；N4-/-:Nox4敲除小鼠。
[0029]圖6示出了在體內(nèi)Nox4對(duì)于骨質(zhì)流失的作用。如實(shí)施例5所述的用Nox4抑制劑處理的野生型(WT)動(dòng)物與假手術(shù)動(dòng)物(sham operated animals),對(duì)照(即動(dòng)物進(jìn)行卵巢切除術(shù)并用溶劑(ctl)處理)和帕米膦酸二鈉組(pamidronat group)相比較，帕米膦酸二鈉組即動(dòng)物進(jìn)行卵巢切除后用帕米膦酸二鈉處理，10mg/kg,每周一次。A，B:卵巢切除后6周股骨末梢總的(A)和骨小梁(B)骨密度；*p〈0.05 ；C, D:通過校準(zhǔn)的微型CT技術(shù)測(cè)定的卵巢切除后6周股骨末端總的(C)和骨小梁⑶骨密度的恢復(fù)；E:總斷裂強(qiáng)度(與圖1所述類似)。
[0030]統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有的值是平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)。經(jīng)ANOVA后經(jīng)LSD事后比較檢驗(yàn)(LSD post hoc testing)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，p值小于0.05的被認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著。
【具體實(shí)施方式】
[0031]以下各段提供了組成根據(jù)本發(fā)明的化合物的各種化學(xué)部分的定義且旨在說明書和權(quán)利要求書中一致應(yīng)用，除非另外明確陳述的定義提供了更廣泛的定義。
[0032]本發(fā)明所用的“N0X4抑制劑”是指能夠完全或部分抑制，阻止，減輕，或直接干擾N0X4的任何物質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)直接被定義為影響酶的酶活性，細(xì)胞定位，蛋白穩(wěn)定性，信使RNA或Nox4蛋白的表達(dá)的化合物。優(yōu)選地，在使用只表達(dá)NOX亞型N0X4蛋白，如重組蛋白N0X4的膜的無(wú)細(xì)胞測(cè)定中，Nox4抑制劑應(yīng)該能夠降低酶活性和ROS的產(chǎn)生。因此，術(shù)語(yǔ)“抑制劑”是指包括，但不限于，完全或部分抑制NADPH氧化酶4活性的分子。根據(jù)一種具體的實(shí)施方式，與其它Nox蛋白如Nox2相比，Nox4抑制劑有一種主要的Nox抑制活性組分。
[0033]例如，N0X4抑制劑包括在骨退化初始能夠防止或減少破骨細(xì)胞分化或降低破骨細(xì)胞數(shù)量的物質(zhì)，因此，N0X4抑制劑能夠防止、減少或消除破骨細(xì)胞生成功能障礙。例如，N0X4抑制劑包括小分子、肽、類肽物(peptidomimetics)、嵌合蛋白、天然或非天然蛋白質(zhì),核酸衍生的聚合物(如DNA和RNA適配體，siRNAs，shRNAs，PNAs，或LNAs)，與N0X4有拮抗活性的融合蛋白、抗體拮抗劑如中和性抗N0X4抗體或能夠驅(qū)動(dòng)N0X4拮抗劑表達(dá)的基因治療載體。
[0034]特別地，N0X4抑制劑是在功能性活性氧簇(ROS)產(chǎn)生試驗(yàn)中呈現(xiàn)出小于5微摩爾的抑制常數(shù) Ki 的藥劑，例如 Gaggini et al., 2011, Bioorganic and Medicinalchemistry, Vol.19 (23)，6989-6999中所述的那些N0X4抑制劑。例如，N0X4抑制劑是在使用只表達(dá)NOX亞型N0X4蛋白，如重組蛋白N0X4的膜的無(wú)細(xì)胞測(cè)定中，抑制ROS產(chǎn)量在1_2微摩爾范圍內(nèi)的藥劑。
[0035]術(shù)語(yǔ)“siRNA”是指小干擾RNA，其是能夠敲除或沉默來自靶基因的靶mRNA的雙鏈RNA(大約19-23個(gè)核苷酸)。作為寡核苷酸，人工合成的siRNAs可以化學(xué)合成，作為短發(fā)夾RNAs，人工合成的siRNAs可以克隆到質(zhì)?；虿《据d體(腺病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒)以在任何類型的細(xì)胞中產(chǎn)生瞬時(shí)或穩(wěn)定性轉(zhuǎn)染(Martin et al.，2007，Ann.Rev.Genomics Hum.Genet.，8:81 — 108 ；Huang et al.，2008，Expert.0pin .Ther.Targets, 12 (5)，637-645)。
[0036]根據(jù)本發(fā)明的治療或方法的術(shù)語(yǔ)“療效”能夠基于在疾病或病癥響應(yīng)于根據(jù)本發(fā)明的用途或方法的過程中的變化進(jìn)行測(cè)定。例如，根據(jù)本發(fā)明的治療或方法的療效可以通過骨質(zhì)流失的減少，和/或骨礦物質(zhì)密度的增加(通過X線斷層攝影術(shù)或密度計(jì)量學(xué)或雙能量X射線骨密度儀進(jìn)行測(cè)定)以及在骨質(zhì)疏松患者中骨翻轉(zhuǎn)原生質(zhì)標(biāo)記物(plasmamarkers)如骨膠原片段的變化和/或骨質(zhì)疏松性骨折的風(fēng)險(xiǎn)的降低，或者通過在患者如絕經(jīng)后的婦女，呈現(xiàn)出進(jìn)食障礙或過度使用如口服皮質(zhì)類固醇(即氫化可的松)或抗雌激素類的藥物的個(gè)體中發(fā)展成為骨質(zhì)疏松癥特別是破骨細(xì)胞生成功能障礙的風(fēng)險(xiǎn)的降低進(jìn)行測(cè)定。在另一方面，根據(jù)本發(fā)明的治療或方法的療效可以通過對(duì)骨密度、骨礦物質(zhì)化或骨代謝標(biāo)記物如堿性磷酸酶，C-端肽I型膠原蛋白(CTX)和骨鈣素部分進(jìn)入血液的測(cè)量進(jìn)行測(cè)定。
[0037]本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“有效量”是指引起破骨細(xì)胞分化和/或破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)或破骨細(xì)胞生成的可檢測(cè)的降低的根據(jù)本發(fā)明的至少一種N0X4抑制劑或其藥物制劑的量。
[0038]本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“破骨細(xì)胞生成功能障礙”是指與繼發(fā)性原因如由固定(immobilization)、溶骨性骨轉(zhuǎn)移和骨腫瘤引起的佩吉特氏骨質(zhì)流失的增多的骨翻轉(zhuǎn)或骨再吸收相關(guān)的任何病癥。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“破骨細(xì)胞生成功能障礙”是指與繼發(fā)性原因如佩吉特氏病，由固定(immobilization)、溶骨性骨轉(zhuǎn)移和骨腫瘤引起的骨質(zhì)流失,如由破骨細(xì)胞過度活躍引起的骨再吸收，作為增加破骨細(xì)胞的形成或細(xì)胞活性增強(qiáng)的結(jié)果的增多的骨再吸收相關(guān)的任何病癥。在另一種實(shí)施方式中，破骨細(xì)胞生成功能障礙包括糜爛性關(guān)節(jié)破壞，如已發(fā)現(xiàn)的(類風(fēng)濕)關(guān)節(jié)炎，骨關(guān)節(jié)病糖尿病，骨轉(zhuǎn)移，牙根再吸收或先天牙齒萌出異常癥(primary eruption failure),由于失活導(dǎo)致的伴有骨質(zhì)流失和骨萎縮的繼發(fā)性甲狀芳腺功能九進(jìn)癥。
[0039]通常情況下，受試者中的破骨細(xì)胞生成功能障礙可以通過測(cè)定骨密度表現(xiàn)組織學(xué)或破骨細(xì)胞酶如抗酒石酸堿性磷酸酶(tartrat-resistant alkaline phosphatase)的原生質(zhì)測(cè)量的測(cè)定進(jìn)行檢測(cè)。
[0040]如本發(fā)明所用的，“治療(treatment)”和“治療(treating) ”諸如此類一般意指獲得期望的藥理學(xué)和生理學(xué)效果。該效果就預(yù)防或部分預(yù)防疾病，癥狀或其病癥(conditions)而言是預(yù)防性的和/或就部分或完全治愈疾病，病癥，癥狀或?qū)膊∮蟹醋饔枚允侵委熜缘?。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“治療(treatment)”包括在哺乳動(dòng)物尤其是人類中疾病的任何治療，以及包括:(a)使易患病但還沒有被診斷患病的受試者免于疾病；(b)抑制疾病，即阻止它的發(fā)展；或緩解疾病，即使疾病和/或其癥狀或病癥消退。
[0041]本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“受試者”是指哺乳動(dòng)物。例如，本發(fā)明所涵蓋的哺乳動(dòng)物包括人類，靈長(zhǎng)類，家養(yǎng)動(dòng)物如牛，羊，豬，馬等。
[0042] 術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的鹽或復(fù)合物(complexes)”是指本發(fā)明下面規(guī)定的化合物的鹽或復(fù)合物。這樣的鹽的例子包括，但不限于，通過本發(fā)明的化合物與有機(jī)或無(wú)機(jī)堿或有機(jī)的伯，仲或叔烷基胺反應(yīng)形成的堿加成鹽，有機(jī)或無(wú)機(jī)堿如氫氧化物，如那些選自由堿金屬(鈉，鉀或鋰)、堿土金屬(如鈣或鎂)組成的組的金屬陽(yáng)離子的碳酸鹽或碳酸氫鹽。這樣的鹽的其它例子包括，但不限于，根據(jù)本發(fā)明的化合物與有機(jī)或無(wú)機(jī)酸如鹽酸，草酸或類似物質(zhì)反應(yīng)形成的酸加成鹽。
[0043]“藥學(xué)上的活性衍生物(Pharmaceutically active derivative) ”是指在給藥給受試者時(shí)能夠直接或間接提供本發(fā)明所公開的活性的任何化合物。術(shù)語(yǔ)“間接”也包括通過內(nèi)源性酶或代謝可以轉(zhuǎn)化成藥物的活性形式的前體藥物。所述前體藥物是根據(jù)本發(fā)明的化合物的衍生物，并表現(xiàn)出具有化學(xué)或代謝分解的基團(tuán)的NADPH氧化酶4抑制活性，以及在體內(nèi)通過溶劑分解在生理?xiàng)l件下可以轉(zhuǎn)化成藥學(xué)上的活性化合物的化合物。本發(fā)明進(jìn)一步涵蓋了根據(jù)本發(fā)明的化合物的任何互變異構(gòu)體。
[0044]根據(jù)本發(fā)明的Nox4抑制劑
[0045]在一種實(shí)施方式中,本發(fā)明提供了一種在ROS產(chǎn)生的功能測(cè)定中表現(xiàn)出對(duì)Nox4抑制活性從IOnM或更低至500nM的抑制常數(shù)(Ki)的N0X4抑制劑。
[0046]在另一種【具體實(shí)施方式】中，提供的N0X4抑制劑是siRNA。
[0047]在另一種【具體實(shí)施方式】中，提供的N0X4抑制劑是抗-N0X4抗體。
[0048]在另一種【具體實(shí)施方式】中，提供的N0X4抑制劑選自以下組:
[0049]4-(2-氟-4-甲氧基苯基)-2-(2-甲氧基苯基)_5_(吡啶_3_基甲基)_1Η_吡唑并[4，3-c]吡啶-3，6 (2H, 5H) - 二酮；
[0050]2-(2-氯苯基)-4_ (4-甲氧基苯基)-5-(批嗪-2-基甲基)-1H-吡唑并[4，3_c]吡啶 _3，6(2H，5H)-二酮；
[0051]4-(4-氯苯基)-2_ (2-甲氧基苯基)-5-(吡嗪-2-基甲基)-1H-吡唑并[4，3_c]吡啶 _3，6(2H，5H)-二酮；
[0052]2-(2-氯苯基)-4-(2-氟-4-甲氧基苯基)-5-[(1_甲基-1H-吡唑-3-基)甲基]-1H-吡唑并[4，3-c]吡啶-3，6 (2H, 5H) - 二酮；
[0053]4-(2-氟-5-甲氧基苯基)-2-(2-甲氧基苯基)_5_(吡啶_3_基甲基)_1Η_吡唑并[4，3-c]吡啶-3，6 (2H, 5H) - 二酮；
[0054]2-(2-氯苯基)-5-[(2-甲氧基吡啶-4-基)甲基]_4_甲基-1H-吡唑并[4，3_c]吡啶 _3，6(2H，5H)-二酮；
[0055]2- (2-甲氧基苯基)-4-甲基-5-(吡啶_3_基甲基)-1H-吡唑并[4，3-c]批啶-3，6(2H，5H)-二酮；
[0056]4- (4-氯-2-氟苯基)-2- (2-甲氧基苯基)-5-(吡啶-3-基甲基)-1H-吡唑并[4，3-c]吡啶-3，6 (2H, 5H) - 二酮；[0057]4- (5-氯-2-氟苯基)-2- (2-氯苯基)_5_ (吡啶_3_基甲基)-1H-吡唑并[4，3-c]吡啶 _3，6(2H，5H)-二酮；
[0058]2-(2-氯苯基)-5-[(6-甲氧基吡啶-3-基)甲基]_4_甲基-1H-吡唑并[4，3_c]吡啶 _3，6(2H，5H)-二酮；
[0059]4- (4-氯-2-氟苯基)-2- (2-氯苯基)_5_ (吡啶_3_基甲基)-1H-吡唑并[4，3-c]吡啶 _3，6(2H，5H)-二酮；
[0060]4- (5-氯-2-氟苯基)-2- (2-氯苯基)_5_ (吡啶_4_基甲基)-1H-吡唑并[4，3-c]吡啶 _3，6(2H，5H)-二酮；
[0061]4-(2-氟-5-甲氧基苯基)-2-(2-甲氧基苯基)-5_[(1_甲基-1H-吡唑_3_基)甲基]-1H-吡唑并[4，3-c]吡啶-3，6 (2H, 5H) - 二酮；
[0062]4- (5-氯-2-氟苯基)-2- (2-甲氧基苯基)-5-(吡啶-3-基甲基)-1H-吡唑并[4，3-c]吡啶-3，6 (2H, 5H) - 二酮；
[0063]2-(2-氯苯基 )-4_甲基-5-(吡啶-3-基甲基)_1Η_吡唑并[4，3-c]吡啶-3，6(2H，5H)-二酮；
[0064]2-(2-氯苯基)-4-(4-氯苯基)-5-(批嗪-2-基甲基)-1H-吡唑并[4，3_c]吡啶-3，6(2H，5H)-二酮；
[0065]2-(2-氯苯基)-4-(2-氟苯基)-5-(批啶-3-基甲基)-1H-吡唑并[4，3_c]吡啶-3，6(2H，5H)-二酮；
[0066]2-(2-氯苯基)-4-(4-氯苯基)-5-(批啶-4-基甲基)-1H-吡唑并[4，3_c]吡啶-3，6(2H，5H)-二酮；
[0067]4- (4-氯-2-氟苯基)-2- (2-氯苯基)_5_ (吡啶_4_基甲基)-1H-吡唑并[4，3-c]吡啶 _3，6(2H，5H)-二酮；
[0068]2-(2-甲氧基苯基)-4-(3-甲氧基苯基)-5-[(1_甲基-1H-吡唑-3-基)甲基]-1H-吡唑并[4，3-c]吡啶-3，6 (2H, 5H) - 二酮；
[0069]2- (2-氯苯基)-4- (2-氟-4-甲氧基苯基)-5-(吡啶-3-基甲基)-1H-吡唑并[4，3-c]吡啶-3，6 (2H, 5H) - 二酮；
[0070]4-(2-氟-4-甲氧基苯基)-2-(2-甲氧基苯基)-5_[(1_甲基-1H-吡唑_3_基)甲基]-1H-吡唑并[4，3-c]吡啶-3，6 (2H, 5H) - 二酮；
[0071]2-(2-甲氧基苯基)-4-(4-甲氧基苯基)-5-[(1_甲基-1H-吡唑-3-基)甲基]-1H-吡唑并[4，3-c]吡啶-3，6 (2H, 5H) - 二酮；
[0072]2-(2-甲氧基苯基)-4-(3-甲氧基苯基)_5_(吡啶-3-基甲基)_1Η_吡唑并[4，3-c]吡啶-3，6 (2H, 5H) - 二酮；
[0073]2-(2-氯苯基)-4-(4-氯苯基)-5-(批啶-3-基甲基)-1H-吡唑并[4，3_c]吡啶-3，6(2H，5H)-二酮；
[0074]4-(4-氯-2-氟苯基)-2_ (2-氯苯基)-5-[(2-甲氧基吡啶-4-基)甲基]_1Η_吡唑并[4，3-c]吡啶-3，6 (2H, 5H) - 二酮；
[0075]2- (2-氯苯基)-4- (2-氟-4-甲氧基苯基)-5-(吡啶-4-基甲基)-1H-吡唑并[4，3-c]吡啶-3，6 (2H, 5H) - 二酮；
[0076]2-(2-氯苯基)-4_ (2，6-二氟苯基)-5-(批啶-4-基甲基)-1H-吡唑并[4，3_c]
【權(quán)利要求】
1.一種Nox4抑制劑，所述Nox4抑制劑用于在預(yù)防和/或治療破骨細(xì)胞生成功能障礙和/或骨質(zhì)疏松癥中使用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Nox4抑制劑，其中，在ROS產(chǎn)生的功能測(cè)定中，Nox4抑制劑表現(xiàn)出對(duì)Nox4抑制活性從約IOnM或更低至500nM的抑制常數(shù)(Ki)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的Nox4抑制劑，所述Nox4抑制劑用于預(yù)防和/或治療骨質(zhì)疏松癥。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的Nox4抑制劑，所述Nox4抑制劑用于預(yù)防和/或治療骨質(zhì)疏松的或預(yù)骨質(zhì)疏松的破骨細(xì)胞生成功能障礙。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的Nox4抑制劑，所述Nox4抑制劑用于在預(yù)防和/或治療選自佩吉特氏病，由固定、溶骨性骨轉(zhuǎn)移和骨腫瘤引起的骨質(zhì)流失的繼發(fā)性原因的骨再吸收中使用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的Nox4抑制劑，所述Nox4抑制劑用于在預(yù)防和/或治療糜爛性關(guān)節(jié)破壞，骨關(guān)節(jié)病糖尿病，骨轉(zhuǎn)移，牙根再吸收或先天牙齒萌出異常癥，由于失活導(dǎo)致的伴有骨質(zhì)流失和骨萎縮的繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥中使用。
7.選自以下組的Nox4抑制劑:
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的Nox4抑制劑，所述Nox4抑制劑用于作為藥物使用。
9.含有至少一種根據(jù)權(quán)利要求7所述的Nox4抑制劑，以及其藥學(xué)上可接受的載體，稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的用于使用的Nox4抑制劑,其中,所述Nox4抑制劑為根據(jù)權(quán)利要求7所述的Nox4抑制劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-6或10中任意一項(xiàng)所述的用于使用的Nox4抑制劑,其中，所述Nox4抑制劑與至少一種在治療或預(yù)防骨質(zhì)疏松癥中有用的共藥劑給藥。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的Nox4抑制劑，其中，所述共藥劑選自二膦酸鹽，雌激素和維生素D。
13.含有與至少一種在預(yù)防和/或治療破骨細(xì)胞生成功能障礙和/或骨質(zhì)疏松癥中有用的共藥劑相結(jié)合的至少一種Nox4抑制劑，以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中，所述Nox4抑制劑為根據(jù)權(quán)利要求7所述的Nox4抑制劑。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的藥物組合物，其中，所述共藥劑選自二膦酸鹽，雌激素和維生素D。
16.一種破骨細(xì)胞生成的抑制劑的確定方法，包括以下步驟: (i)用Nox4的編碼或者表達(dá)系統(tǒng)接觸待篩選的物質(zhì)； (ii)評(píng)價(jià)所述系統(tǒng)的Nox4活性或Nox-4表達(dá)能力； (iii)將步驟(ii)中的Nox4活性或Nox4表達(dá)能力與不存在所述物質(zhì)的系統(tǒng)的Nox4活性或Nox4表達(dá)能力進(jìn)行比較； (iv)選擇一種在步驟(iii)中觀察到Nox4活性或Nox4表達(dá)能力降低的物質(zhì)。
17.一種用于預(yù)防或治療受試者中破骨細(xì)胞生成功能障礙和/或骨質(zhì)疏松癥的方法，包括在需要其的受試者中給藥有效量的一種或多種Nox4抑制劑。
18.一種用于減少受試者骨中破骨細(xì)胞生成的方法，包括在需要其的受試者中給藥有效量的一種或多種Nox4抑制劑或其藥物制劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求17 或18所述的方法，其中，所述受試者患有骨質(zhì)流失，骨質(zhì)流失由破骨細(xì)胞過度活躍引起，作為增加破骨細(xì)胞形成或細(xì)胞活性增強(qiáng)的結(jié)果。
20.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的方法，其中，所述受試者患有破骨細(xì)胞生成功能障礙。
21.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的方法，其中，所述受試者患有選自佩吉特氏病，由固定、溶骨性骨轉(zhuǎn)移和骨腫瘤引起的骨質(zhì)流失的繼發(fā)性原因的骨再吸收。
22.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的方法，其中，所述受試者患有破骨細(xì)胞生成功能障礙包括糜爛性關(guān)節(jié)破壞，如已發(fā)現(xiàn)的(類風(fēng)濕)關(guān)節(jié)炎，骨關(guān)節(jié)病糖尿病，骨轉(zhuǎn)移，牙根再吸收或先天牙齒萌出異常癥，由于失活導(dǎo)致的伴有骨質(zhì)流失和骨萎縮的繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥O
【文檔編號(hào)】A61K31/444GK103945844SQ201280055349
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月11日
【發(fā)明者】R·布蘭德斯, K·施羅德, P·佩治, B·拉勒, F·加吉尼 申請(qǐng)人:吉恩基奧泰克斯股份有限公司