病毒基因表達的抑制的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及修飾的小干擾RNA(siRNA)核酸分子，尤其是通過添加一個2-O胍基丙基修飾的核苷進行修飾的siRNA。特別地，本發(fā)明涉及能沉默靶標序列的修飾的siRNA，利用所述siRNA治療和預防感染的方法，含有所述siRNA的藥劑以及所述siRNA的用途。
【專利說明】病毒基因表達的抑制
[0001]引言
[0002]本發(fā)明涉及通過RNA干擾途徑調(diào)芐基因表達的修飾的小干擾RNA分子(siRNA)。編碼本發(fā)明所述siRNA的核酸分子包括能使它們的物理性質(zhì)與野生型未修飾的siRNA相比產(chǎn)生差別的一個或多個修飾。在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施例中，所述siRNA的核酸序列包括至少一個具有2-0-胍基丙基(GP)結(jié)構(gòu)的核苷。在本發(fā)明的進一步的實施例中，所述siRNA的修飾提高了該修飾的siRNA的穩(wěn)定性，促進該修飾的siRNA導致的基因沉默并減少免疫刺激。
【背景技術(shù)】
[0003]合成的RNA干擾(RNAi)激活劑顯示出在病理基因沉默的治療應用方面有著相當大的潛力。一些典型的外源RNA干擾激活劑包括約2 Ibp的在3'末端具擁有2個堿基懸垂的雙鏈RNA。為了提高siRNAs的效果，在核糖的2' -OH基團進行化學修飾。使用這種方法已經(jīng)證明可提高穩(wěn)定性，促進基因沉默和減少免疫刺激。盡管這種方法有一定的作用，高效并可控的高負電荷核酸基因沉默子仍然是一個有待解決的問題。
[0004]為了評估在2'位置引入正電荷基團的潛在實用性，我們主要對包含2-0-胍基丙基(GP)結(jié)構(gòu)的新型siRNA的效果評估進行了研究。我們描述了所有四種用丙烯腈進行利用邁克爾加成反應然后進行雷尼鎳還原并胍基丙基化的GP修飾的核苷。所使用的這些前體成功地生成抗肝炎B病毒(HBV)siRNA。在病毒復制的細胞培養(yǎng)模式中的實驗表明所述GP修飾促進強化了基因沉默。此外，所述GP結(jié)構(gòu)并不影響熱力學穩(wěn)定性，并且在siRNA的種子區(qū)域的每個位點導入GP結(jié)構(gòu)并不改變預定HBV靶標的沉默效率。這些結(jié)果表明采用GP基團修飾的siRNA在推進合成的RNA干擾激活劑的治療應用可能起到了一定的作用。
[0005]使用合成的小干擾RNA (siRNA)來啟動RNA干擾(RNAi)介導的基因沉默在治療應用上具有相當大的潛力[1]，[2], [3]。典型地，siRNA為天然Dicer酶產(chǎn)物的合成模擬物，并且為在3'末端具有2個堿基懸垂的21-25個核苷酸(nt)雙鏈。使用合成siRNA的進展得益于研究反義RNA分子的豐富經(jīng)驗。因此，加速了使用合成siRNA的發(fā)展并且siRNA效率的提高得以于有價值的生物的和合成化學的見解。合成的siRNA相比表達的RNA干擾激活劑的優(yōu)勢在于他們可修改的化學修飾以提高穩(wěn)定性、安全性和特異性[4]，[5]。并且，利用化學合成程序可以實現(xiàn)臨床應用所需的可控的大規(guī)模制備。然而，盡管具有如此顯著的進步，這些聚陰離子的核酸穿過富含脂質(zhì)的細胞膜的轉(zhuǎn)運仍然是有問題的。用于運載合成RNA干擾激活劑至靶標細胞的載體包括包含脂質(zhì)復合物的陽離子脂質(zhì)[6]，共軛肽[7]或寡聚陽離子復合物，例如亞精胺[8]。然而，使用這些方法不一定都能成功。為了克服核酸的過多負電荷的困難，并同時提高熱穩(wěn)定性和血清穩(wěn)定性，我們前期研究了一種利用陽離子基團進行核糖2'限定修飾的方法[9]，[10]。最初，我們經(jīng)常得到2' -O-氨乙基-腺苷和2，-O-氨乙基-尿苷。合成限定初始步驟為用溴乙酸甲酯進行的烷化，然后緊接一系列的轉(zhuǎn)化反應。利用熒光素酶報告基因分析來測定基因抑制，結(jié)果表明，2' -O-氨乙基修飾至少對W -O Me siRNA修飾是有效的。2' _0_氨乙基衍生物的一個重要特性是當化學修飾發(fā)生在siRNA隨從鏈的3'端時它能夠援救活性較低的siRNA[ll]。這種途徑隨后通過開發(fā)能夠成功對所有四種核糖核苷進行烷化的方法得以改進[12]。這通過利用酞酰亞氨甲基三氟甲烷磺酸作為烷化劑并利用可以形成所有四種承載2' -O-氨乙基支鏈的亞磷酰胺的方法已經(jīng)實現(xiàn)。雖然令人鼓舞，但利用這些siRNA試劑的一個問題在于多步化學合成的產(chǎn)率相當?shù)?。此外，擴大合成反應也很困難。
[0006]為了解決這些問題，我們已經(jīng)研究了一種替代的2-0-胍基丙基(GP)核苷修飾的實用方法。采用此處報道的該新方法，我們描述了利用丙烯腈進行邁克爾加成反應[13，14，15]然后進行雷尼鎳還原[16]并胍基丙基化獲得的所有四種GP修飾的核苷的結(jié)構(gòu)。在B型肝炎病毒復制的細胞培養(yǎng)模型中利用之前顯示適合基于RNA干擾的病毒復制抑制的靶標序列對GP siRNA的效率進行評估[17，18，19，20]。結(jié)果表明，相比未修飾的對應部分病毒復制標記顯示出更高效的沉默。此外，所 述GP修飾的siRNA在血清條件下比未修飾的對照更穩(wěn)定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供了修飾的核酸分子和包含所述修飾的核酸分子的制品。
[0008]根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，所述修飾的核酸分子包括修飾的小干擾RNA(SiRNA)核酸分子。所述修飾的siRNA分子包含一條正義鏈和一條反義鏈,并且所述正義鏈中至少一個核苷酸或反義鏈中至少一個核苷酸是衍生自2-0-胍基丙基(GP)修飾核苷。此外,所述核酸分子能夠沉默靶標序列的表達，其中靶標序列是DNA或RNA序列。
[0009]本發(fā)明指明了，所述至少一個修飾的核苷酸是選自由2-0-胍基丙基腺苷亞磷酰胺，2-0-胍基丙基胞苷亞磷酰胺，2-0-胍基丙基鳥苷亞磷酰胺和2-0-胍基丙基尿苷亞磷酰胺組成的組。此外，本發(fā)明還提供了包含前述各種亞磷酰胺的組合的siRNA。
[0010]優(yōu)選地，所述修飾的核酸分子的正、反義鏈的長度分別為18-26個核苷酸，優(yōu)選地，長度為19-25個核苷酸，以及最優(yōu)選地，長度為21個核苷酸。
[0011]優(yōu)選地，所述至少一個修飾的核苷酸可以位于所述正義鏈或/和反義鏈。此外，所述修飾的核酸分子的正義鏈和反義鏈優(yōu)選地都包含人工合成序列。
[0012]應理解的是，所述修飾的SiRNA可以包括一個以任何來自包括微生物、植物或動物的組織的DNA或RNA為靶標的siRNA。優(yōu)選地，所述siRNA以微生物包括細菌和病毒的互補核酸分子作為靶標。更優(yōu)選地，所述siRNA以病毒的互補核酸序列作為靶標?？梢赃M一步理解的是，本發(fā)明中所述修飾的siRNA是核酸分子。
[0013]在本發(fā)明優(yōu)選的實施例中，所述修飾的siRNA抑制病毒復制。優(yōu)選地，所述病毒是肝炎病毒，并且最優(yōu)選地，所述病毒是B型肝炎病毒。
[0014]本發(fā)明所述修飾的siRNA相比未修飾的siRNA，在轉(zhuǎn)染進培養(yǎng)細胞和/或體內(nèi)時，不會誘發(fā)可檢測的干擾素反應。此外，所述修飾的siRNA相比包含相同序列的未修飾的siRNA,在標準血清分析中具有更大的穩(wěn)定性。在進一步的實施例中,所述修飾的siRNA相比包含相同序列的未修飾的siRNA表現(xiàn)出更強的對靶標基因表達的抑制。
[0015]在本發(fā)明優(yōu)選的實施例中，所述反義鏈可以包含如SEQ ID NO:1所示的序列。此外，可以在反義鏈的 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20 和 / 或 21 等位點或這些位點的任意組合位點插入所述至少一個2-0-胍基丙基(GP)修飾的核苷。[0016]所述反義鏈包含如SEQ ID NO:1所示的未修飾的序列或如SEQ ID Nos: 5, 6,7, 8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29 或 30 所示的任一序列。
[0017]在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施例中，所述正義鏈可以包含如SEQ ID N0:2所示的序列。此外，在所述正義鏈的 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20 和 / 或21等位點或這些位點的任意組合位點已經(jīng)插入至少一個2-0-胍基丙基(GP)修飾的核苷。
[0018]所述正義鏈包含如SEQ ID N0:2所示的未修飾的序列或如SEQ ID Nos:31或32所示序列中的任一序列。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的第二個方面，提供了一種治療或預防病毒感染的方法，其中所述方法包含向需要其的受試者施用治療量的本發(fā)明的所述核酸分子并佐以藥學上可接受的佐劑和/或載體。所述受試者可以是動物，優(yōu)選地是哺乳動物，并且最優(yōu)選地是人。此外，所述病毒感染是肝炎感染，并且最優(yōu)先地，所述肝炎感染是B型肝炎。
[0020]根據(jù)本發(fā)明的第三個方面，提供了本發(fā)明所述siRNA在治療或預防病毒感染中的應用，其中所述應用包含向需要其的受試者施用治療量的本發(fā)明的所述核酸分子以及藥學上可接受的佐劑和/或載體。所述受試者是動物，優(yōu)選地是哺乳動物，并且最優(yōu)選地是人。此外，所述病毒感染是肝炎感染，并且最優(yōu)先地，所述肝炎感染是B型肝炎。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的第四個方面，提供了用于治療或預防病毒感染的藥劑的制備方法，其中所述制備方法包含向需要其的受試者施用治療量的本發(fā)明的所述核酸分子以及藥學上可接受的佐劑和/或載體。 所述受試者是動物，優(yōu)選地是哺乳動物，并且最優(yōu)選地是人。此外，所述病毒感染是肝炎感染，并且最優(yōu)先地，所述肝炎感染是B型肝炎。
[0022]在本發(fā)明的另一方面，提供了包含本發(fā)明的所述siRNA和藥學上可接受的賦形劑、載體、佐劑等的制品。此外，還提供了一種包含前述制品和使用該制品的說明的試劑盒。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]本發(fā)明的非限制性的實施例將通過僅僅是例舉以及參照下列附圖的方式來描述:
[0024]圖1顯示的是制備寡聚核糖核苷酸所需的2-0-胍基丙基(GP)腺苷，胞苷和尿苷亞磷酰胺的合成，(i)丙烯腈、CsC03、叔丁醇、室溫；(ii)H2N-NH2.H20、甲醇、室溫(腺苷和胞苷衍生物);尿苷衍生物未脫保護；(iii)H2(30bar)、NH3、甲醇、30-60分鐘，室溫；(iv) 1,3-二叔丁氧羰基-2-(三氟甲磺酰基)胍、Et3N、CH2C12、0°C (30分鐘)，然后室溫30分鐘；(v)N'，N-二甲基甲酰胺-二甲基雙乙酸鹽、甲醇、室溫(腺苷衍生物)；苯甲酰氯、吡啶，(TC (30分鐘)，然后室溫30分鐘(胞苷衍生物)；將非保護基團應用至尿苷衍生物；(vi)Et3N.3HF、THF、室溫；(vii)4，4' _ 二甲氧基三苯甲基氯、吡啶，室溫；(viii) 2-氰乙基N，N，N' ,N'-四異丙基膦、4，5-二氰基咪唑、012(:12、室溫。
[0025]圖2顯示的是制備寡聚核糖核苷酸所需的2-0-胍基丙基鳥苷亞磷酰胺的合成，⑴丙烯腈、CsC03、叔丁醇、室溫；(ii)甲酸(70% )、二氧雜環(huán)乙烷/水；(iii)H2 (30bar)，NH3,甲醇、30-60分鐘，室溫；(iv) 1，3- 二叔丁氧羰基-2-(三氟甲磺?；?胍、Et3N、CH2C12、0°C (30分鐘)，然后室溫30分鐘；(v)異丁酰氯、吡啶、室溫；(viii)2_氰乙基N，N，N' ,N'-四異丙基膦、4，5-二氰基咪唑、012(:12、室溫。[0026]圖3顯示的是用于寡聚核糖核苷酸合成的2-0-胍基丙基-N2-N'，N-二甲基甲酰胺-鳥苷亞磷酰胺的合成的改進方法，(i)丙烯腈、CsC03、叔丁醇、室溫；(ii)甲酸(70% )、二氧雜環(huán)乙烷/水；(丨^)112(3(^&10，順3，甲醇、30-60分鐘，室溫；(iv) 1，3-二叔丁氧羰基-2-(三氟甲磺?；?胍、Et3N、CH2C12、0°C (30分鐘)，然后室溫30分鐘；(v) N，N-二甲基甲酰胺二甲縮醛、甲醇、室溫12小時；(vi)Et3N.3HF, THF,室溫；(vii)4，4-二甲酰氯、批啶、室溫；(viii) 2-氰乙基N，N，N' ,N'-四異丙基膦、4，5-二氰基咪唑、012(:12、室溫。
[0027]圖4顯示的是B型肝炎病毒基因組的組成并標示了本發(fā)明中使用的抗HBVsiRNA3的靶標位點。給出了相對于單個的EcoRI限制性位點(HBV基因型A，GenBank號:AP007263.1)的所述基因組的核苷酸坐標。HBV siRNA3的靶標序列從核苷酸1693延伸至1711。一部分雙鏈HBV DNA包含帶有粘性互補5'末端的正義鏈(+)和反義鏈(_)。調(diào)節(jié)HBV轉(zhuǎn)錄的正/反式作用元件分別用圓形和矩形符號表示。緊密環(huán)繞整個基因組的箭頭表示病毒開放讀碼框(連同起始密碼子)的方向。四個外部的箭頭表示具有都包含HBx的普通末端的HBV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
[0028]圖5顯示的是用于測定2-0-胍基丙基修飾的抗HBV siRNA效率的雙熒光素酶檢測。A.雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒的示意圖。HBx靶標序列被插入到hRLuc讀碼框的下游。使用海腎螢光素酶活性作為靶標沉默的指示劑，同時相對于組成型表達的螢火蟲熒光素酶的活性測定其效率。B.在緊接著與被指示的siRNA—起的雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的海腎螢光素酶活性與螢火蟲熒光素酶活性之比。對照包括陰性轉(zhuǎn)染，其中惰性質(zhì)粒DNA被用來替代siRNA和替代不具有與HBx靶標互補序列的陰性對照siRNA (scrambled siRNA)。數(shù)值用海腎螢光素酶活性與螢火蟲熒光素酶活性的均值比率(土SEM)來表示，并相對于陰性處理細胞進行修正。根據(jù)雙尾配對T檢驗測定的P值小于0.05時，則認為差異呈統(tǒng)計學上的顯著。
[0029]圖6顯示的是在培養(yǎng)細胞中通antiHBV siRNA對HBV復制的抑制。A.帶有HBVsiRNA3靶標位點的HBV可復制質(zhì)粒pCH_9/3091的示意圖。將pCH_9/3091用于轉(zhuǎn)染肝臟來源的培養(yǎng)中的Huh7細胞。B.與2-0-胍基丙基修飾的siRNA共轉(zhuǎn)染后測定細胞培養(yǎng)上清液中的HbsAg的濃度。數(shù)值以ELISA分析的相對光密度(OD)表示。未修飾的siRNA不包含2-0-胍殘基。對照為不含有與HBx靶標互補的序列的siRNA。數(shù)值用海腎螢光素酶活性與螢火蟲熒光素酶活性的均值比率(土SEM)來表示，并相對于陰性處理細胞進行校準。差異根據(jù)雙尾配對T檢驗，若P值小于0.05，則認為統(tǒng)計學顯著。
[0030]圖7表示的是2-0-胍基丙基修飾的siRNA的穩(wěn)定性評估。2_0_胍基丙基修飾的siRNA的反應板單獨用DMEM或含有80%胎牛血清的DMEM孵育0_24小時。然后利用聚丙烯酰胺凝膠電泳以及溴化乙錠染色判斷siRNA的降解。
[0031]圖8顯示了在轉(zhuǎn)染的HEK293細胞中干擾素反應評估。細胞用所述指示siRNA或聚肌苷酸-聚胞苷酸(poly (1:C))轉(zhuǎn)染。24小時后從細胞中提取RNA并進行定量實時PCR來檢測IFN- β和GAPDH mRNA的濃度。從3個獨立實驗中顯示出IFN- β和GAPDHmRNA濃度的校準比值的均值。poly(1:C)陽性對照表明在此處使用的條件下可以誘導細胞發(fā)生干擾
素反應。
[0032] 圖9顯示轉(zhuǎn)染了指示的未修飾和修飾的siRNA之后的細胞毒性評估。通過進行MTT (3- (4，5- 二甲基吡啶-2-基)-2，5- 二苯基溴化)分析評估體外siRNA毒性。細胞要么轉(zhuǎn)染有被修飾的siRNA (實驗對象)，要么轉(zhuǎn)染未修飾的siRNA或者沒有轉(zhuǎn)染(對照)。數(shù)據(jù)通過對570nm(產(chǎn)物)處的光密度與655nm(指示劑或細胞數(shù)量)處的光密度的定量比值來分析。數(shù)據(jù)表明，轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的細胞不存在顯著差異，這證明了被測siRNA沒有體外毒理作用。數(shù)值表示3個重復轉(zhuǎn)染的均值土標準差(*p〈0.05)。
[0033]圖10顯示了 HBV靶標部分和全部融入雙熒光素報告基因構(gòu)建的示意圖。包括完整靶標(A)，不完整靶標I (ITl) (B)，不完整的靶標2 (IT2) (C)和種子區(qū)(SO) (D)的HBx靶標序列被插入到hRLuc讀碼框的下游。海腎螢光素酶活性用作靶標沉默的指示劑并且效率通過相對于組成型表達的螢火蟲熒光素酶的活性測定。這些報告質(zhì)粒被用于比較抗HBVsiRNA的2-0-胍基丙基修飾位點在完全互補的和不完整的HBV靶標的沉默上的效果。
[0034]圖11顯示了與緊接著指示的siRNA共轉(zhuǎn)染的融合完整(CT)的，不完整的I (ITl)、不完整的2(IT2)和種子區(qū)的(SO)HBV靶標序列的雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒的海腎螢光素酶活性與螢火蟲熒光素酶活性之比。對照包括用惰性質(zhì)粒DNA替代siRNA和不具有與HBx祀標互補的序列的陰性對照siRNA (scrambled siRNA)的陰性轉(zhuǎn)染。每組實驗進行3個重復，并批量進行，其中修飾的siRNA包括1,2, 3,4, 5,6, 7, 8&9 (A), 9, 11，14，16&19(B)和10，17，18，20&21(C)位點上的GP基團。數(shù)值用海腎螢光素酶活性與螢火蟲熒光素酶活性的均值比率(土SEM)表示，并相對于陰性處理細胞進行校準。根據(jù)雙尾配對T檢驗，若P值小于0.05，則認為統(tǒng)計差異顯著。
[0035]圖12顯示了是在經(jīng)流體動力注入法的小鼠中檢測到的HBV表面抗原的血清濃度。血清分離自第3天(A)和第5天⑶的小鼠后利用BioRad ELISA試劑盒進行HBsAg檢測。平均值由每組小鼠的每個值確定，同時結(jié)果根據(jù)從陰性對照scrambled siRNA處理的小鼠中獲得的值進行校準。根據(jù)雙尾配對T檢驗，若P值小于0.01 (**)或0.001 (***)，則認為統(tǒng)計差異顯著。 [0036]圖13顯示在已經(jīng)受到流體動力注入法的小鼠中檢測到的循環(huán)B型肝炎病毒顆粒當量的血清濃度。從第3天(A)和第5天(B)的小鼠中分離出血清，然后利用實時定量PCR分析進行病毒DNA檢測。循環(huán)病毒顆粒當量(VPEs)的平均值由每組小鼠的每個值確定。根據(jù)雙尾配對T檢驗，若P值小于0.01 (**)或0.001 (***)，則認為統(tǒng)計差異顯著。
[0037]圖14顯示的是當細胞經(jīng)包含正義鏈和反義鏈上GP修飾的siRNA轉(zhuǎn)染后，利用雙熒光素酶報告基因分析評估體外HBV基因敲除。雙鏈siRNA包含與具有在一個位點(位點17，SEQ ID NO: 31)或三個位點(位點5，13&17，SEQ ID NO: 32)有GP修飾的正義鏈進行雜交的帶有指示的GP修飾的反義siRNA。數(shù)值代表3個重復轉(zhuǎn)染的均值土標準差(*p〈0.05 (*)或 0.01 (**)) ο
[0038]圖15顯示了當細胞經(jīng)正義鏈和反義鏈上均有GP修飾的siRNA轉(zhuǎn)染后，利用雙熒光素酶報告基因分析評估體外HBV基因抑制。雙鏈siRNA包含與具有三個位點(位點5，13&17, SEQ ID NO: 32)有GP修飾的正義鏈進行雜交的帶有指示的GP修飾的反義siRNA。數(shù)值表示3個重復轉(zhuǎn)染的均值土標準差Op〈0.05 O)或0.01 O*))。
[0039]本發(fā)明的詳細說明
[0040]現(xiàn)在將參照附圖在下文中對本發(fā)明進行更詳細地描述，但僅僅是部分而不是本發(fā)明全部實施例都被在此描述。
[0041]所描述的本發(fā)明不應限于所公開的具體實施例和修改中，其它實施例應包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。盡管在本文中采用了特定的術(shù)語，它們的使用僅具有通用的和描述性的意思而不是為了限制的目的。
[0042]本文所使用的術(shù)語具有它們在本領(lǐng)域中公認的的含義，除非另有說明。根據(jù)本文中的使用，下列術(shù)語具有以下限定的含義。
[0043]本文中使用的術(shù)語“核酸”是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另有限定，包括以類似天然存在的核苷酸的方式與核苷酸雜交的天然核苷酸的類似物。除非另有指明，特定核苷酸序列包括其互補序列。
[0044]術(shù)語“核苷”指通過β糖苷鍵與核糖或脫氧核糖連接的嘌呤或嘧啶堿基。核苷的常見示例有鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、胸腺嘧啶核苷、胞嘧啶核苷和尿嘧啶核苷。
[0045]術(shù)語“核苷酸”指在其核糖或脫氧核糖結(jié)構(gòu)上磷酸化的核苷。最常見的磷酸化位點是糖的5'碳原子。核苷酸的聚合物形成DNA或RNA。所述聚合物的糖和磷酸組成核酸骨架?！昂颂恰敝窻NA中發(fā)現(xiàn)的單糖，并且它的化學式為C5H1005，同時“脫氧核糖”指DNA中發(fā)現(xiàn)的單糖，并且它的化學式為C5H1004。
[0046]“siRNA”是“小干擾RNA”的縮寫。siRNA包括小的雙鏈RNA分子，反義_(引導)鏈和正義_(隨從)鏈。典型的siRNA分子包含19bp雙鏈區(qū)域，3'末端具有2個核苷酸懸垂。一條鏈與胞質(zhì)RNA誘導的沉默復合體(RISC)結(jié)合。通過RISC的影響直接導致序列特異性RNA裂解。siRNA引導鏈和其靶標之間的錯配可能導致翻譯抑制而不是RNA裂解。siRNA可以是合成的或通過Dicer酶對前體進行加工而來。 [0047]本文中使用的“RNA干擾”(RNAi)是一個通過合成的siRNA或核酸(包括miR, siRNA, shRNA)表達導致互補RNA發(fā)生序列特異性降解、序列特異性翻譯抑制或轉(zhuǎn)錄基因沉默的過程，并且本文中進一步使用的“RNAi編碼序列”指當其表達時能導致RNA干擾的核酸序列。
[0048]術(shù)語“Dicer酶”指能消化雙鏈RNA并負責RNAi前體突變的RNAse III酶。例如，Dicer負責作用于miRs前體形成成熟的miRs。“Drosha”是一種形成核微處理器復合體的一部分的RNAse III,該部分能識別特異性pr1-miR次級結(jié)構(gòu),裂解并釋放約60_80nt的miR前體序列。
[0049]術(shù)語“轉(zhuǎn)錄”指從DNA模板產(chǎn)生RNA的過程。“體外轉(zhuǎn)錄”指利用包含RNA聚合酶核RNA前體等實驗介質(zhì)將DNA序列轉(zhuǎn)錄成RNA分子轉(zhuǎn)錄過程，并且“細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄”指在活細胞中的DNA序列轉(zhuǎn)錄成RNA分子的轉(zhuǎn)錄過程，此外，“體內(nèi)轉(zhuǎn)錄”指在活體生物中DNA序列轉(zhuǎn)錄成RNA分子的轉(zhuǎn)錄過程。
[0050]本文中使用的術(shù)語“靶標核酸”或“核酸靶標”指源自基因的核酸序列，關(guān)于該序列，本發(fā)明所述RNA1-編碼序列被設計用來抑制、阻礙或阻止基因表達、酶活性或與其它細胞或病毒因子的相互作用。在本發(fā)明中，“靶標核酸”或“核酸靶標”包括任何可以被作為靶標的核酸，包括但不限于DNA、轉(zhuǎn)錄自DNA的RNA (包括mRNA前體核mRNA或其部分)以及同樣來自DNA的cDNA。
[0051]術(shù)語“引導序列”等同于術(shù)語“反義鏈”，并且如本文中所用，指源自RNAi效應器的短單鏈RNA片段，例如融入RISC的siRNA，miR, shRNA,負責序列特異性降解或在靶標識別序列對靶標RNA的進行翻譯抑制。此外，術(shù)語“RNAi效應器”指任何包括其前體的能導致RNA干擾的RNA序列(如shRNA, miR和siRNA)。[0052]當涉及連接至核苷的基團時，此處描述的“胍基”指一種包括三個氮原子和一個碳原子并具有下述化學結(jié)構(gòu)式的化學基團?！氨敝敢环N包括3個碳原子并具有下述化學結(jié)構(gòu)式的化學基團，并且“胍基丙基”指包含胍基共價連接至丙基組件上的化學基團。
[0053]
【權(quán)利要求】
1.一種修飾的小干擾RNA(SiRNA)核苷酸分子，包括正義連和反義鏈，其中正義鏈中的至少一個核苷酸或反義鏈中的至少一個核苷酸是衍生自2, -O-胍基丙基(GP)修飾的核苷酸，并且所述核苷酸分子能夠沉默靶標序列的表達。
2.權(quán)利要求1所述的核苷酸分子，其中，其中至少一個所述修飾的核苷酸選自由.2-0-胍基丙基腺苷亞磷酰胺，2-0-胍基丙基胞苷亞磷酰胺，2-0-胍基丙基鳥苷亞磷酰胺和.2-0-胍基丙基尿苷亞磷酰胺組成的組或它們的組合。
3.權(quán)利要求1或2所述的核苷酸分子，所述正義鏈、反義鏈的長度分別為18-26個核苷酸。
4.權(quán)利要求3所述的核苷酸分子，所述正義鏈、反義鏈的長度分別為21個核苷酸。
5.權(quán)利要求1至4任一所述的核苷酸分子，所述正義鏈、反義鏈都包括人工合成序列。
6.權(quán)利要求1至5任一所述的核苷酸分子，所述修飾的SiRNA以病毒的一個互補核苷酸序列為靶標。
7.權(quán)利要求1至6任一所述的核苷酸分子，其中所述修飾的SiRNA抑制病毒的復制。
8.權(quán)利要求6或7所述的核苷酸分子，其中所述病毒為肝炎病毒。
9.權(quán)利要求8所述的核苷酸分子，其中所述病毒是B型肝炎病毒。
10.根據(jù)權(quán)利要求1~9任一所述的核苷酸分子，當轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)細胞中時，與未修飾的siRNA相比，其中所述修飾的siRNA不誘發(fā)可檢測的干擾素反應。
11.根據(jù)權(quán)利要求1~10任一所述的核苷酸分子，其中所述修飾的siRNA比具有相同序列的未修飾的siRNA在標準血清檢測中具有更高的穩(wěn)定性。
12.根據(jù)權(quán)利要求1~11任一所述的核苷酸分子，其中所述修飾的siRNA比具有相同序列的未修飾的siRNA表現(xiàn)出更大的對靶標基因表達的抑制。
13.根據(jù)權(quán)利要求1~12任一所述的核苷酸分子，其中反義鏈包括SEQID NO:1所示的核苷酸序列且所述反義鏈的 .2.，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20 和/或21位點插入有至少一個Gp修飾的核苷酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求1~13任一所述的核苷酸分子，其中所述正義鏈包括SEQID NO:2所述的序列并且在所述正義鏈的5，13和/或17位點插入至少一個GP修飾的核苷酸。
15.一種治療或預防病毒感染的方法，所述方法包括向需要其的受試者施用治療劑量的權(quán)利要求1~14任一所述的核酸分子以及藥學上可接受的佐劑和/或載體。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，所述受試者是人類。
17.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的方法，其中所述病毒感染是肝炎病毒感染。
18.根據(jù)權(quán)利要求15至17任一所述的方法，其中所述肝炎病毒感染是B型肝炎所導致。
19.權(quán)利要求1~14任一所述的核苷酸分子在治療或預防病毒感染中的應用，其中所述應用包含向需要其的受試者施用治療有效量的所述核酸分子以及藥學上可接受的佐劑和/或載體。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的核苷酸分子，所述受試者為人類。
21.根據(jù)權(quán)利要求19或20所述的核苷酸分子，其中所述病毒感染是肝炎病毒感染。
22.根據(jù)權(quán)利要求19至21任一所述的核苷酸分子，其中所述肝炎病毒感染是B型肝炎所導致。
23.權(quán)利要求1~14任一所述核苷酸分子在用于治療或預防病毒感染的藥劑制備中的應用，其中所述應用包含向需要其的受試者施用治療有效量的所述核酸分子以及藥學上可接受的佐劑和/或載體。
24.權(quán)利要求23所述的應用，所述受試者為人類。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的應用，所述病毒感染為肝炎病毒感染。
26.根據(jù)權(quán)利要求23~25任一所 述的應用，所述肝炎病毒感染為B型肝炎所致。
【文檔編號】A61P31/20GK104011209SQ201280053081
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2012年10月26日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月28日
【發(fā)明者】帕特里克·阿巴思諾特, 賈斯廷·希恩, 阿布杜拉·伊利, 穆薩·馬里亞尼, 約蘭塔·布瑞恩斯卡, 詹尼弗·多諾費奧, 馬克西米利安C.R.·布夫, 約阿希姆W.·恩格斯, 斯蒂芬·貝恩哈特 申請人:約翰內(nèi)斯堡威特沃特斯蘭德大學, 歌德大學