專利名稱：膜相關病毒復制的抑制的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及使用抑制宿主細胞的葡糖苷酶活性的化合物治療病毒感染。也涉及使用抑制被感染細胞中葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性的化合物來治療脂類存儲疾病。特別涉及1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-D-葡萄糖醇及其衍生物的用途。
背景技術：
全世界有超過4千萬人被丙型肝炎病毒(HCV)慢性感染，并且它代表了對發(fā)達國家公眾健康的最嚴重的威脅之一(Hoofnagle等(1997)新英格蘭醫(yī)學雜志336347-356)。在美國，每年丙型肝炎病毒感染導致超過10000人死亡(丙型肝炎的治療，華盛頓郵報，1997年11月11日，A2中)，如缺乏有效干預措施，這個數(shù)字在未來二十年后將增加兩倍。慢性的HCV還增加了身患肝癌的危險。在多達85％的HCV患者中將發(fā)展成為持續(xù)感染，并且在開始感染的二十年內(nèi)，這些患者中至少有20％其慢性感染將導致肝硬變。在北美洲，估計有390萬人受到慢性感染，在美國，目前丙型肝炎病毒導致的并發(fā)癥是進行肝移植的首要原因。
HCV是屬于黃病毒科的RNA病毒。個體分離物包括密切相關、但仍然異源的病毒基因組的群體。這種遺傳多樣性使得病毒能逃脫宿主的免疫系統(tǒng)，導致高比率的慢性感染。
對HCV感感染有效的治療在數(shù)量和效率上有限。HCV感染的常規(guī)治療包括使用α-干擾素。但是，α-干擾素在大約20％感染HCV的人群中使用受到限制(Hoofnagle等(1997)新英格蘭醫(yī)學雜志336347-356)，并且使用這種化合物進行治療只在5％的患者中取得長期改善。此外，α-干擾素的并發(fā)癥和局限性嚴重地限制了這種治療方法的應用。在復發(fā)HCV感染的患者中，只有一半在包括使用α-干擾素和病毒唑(1-α-D-呋喃核糖基-1H-1，2，4-三唑-3-甲酰胺)的試驗性治療中取得長期改善。(丙型肝炎的治療，華盛頓郵報，1997年11月11日，A2中)。很明顯，使用干擾素的差強人意的結(jié)果促進了尋求更有效和毒性更低的療法。因此，對有效治療HCV感染的迫切需求仍然存在。
除了那些慢性感染HCV的人們，還有超過三億五千萬人慢性感染HBV。如缺乏有效的干預，可能會有超過一億五千萬人死于肝病。正如大多數(shù)HCV的攜帶者一樣，多達兩千萬HBV的攜帶者居住在發(fā)達國家。
很多感染HCV的個體也感染了HBV。治療HBV／HCV的復合感染極具挑戰(zhàn)性，因為HBV和HCV病毒的治療有明顯區(qū)別。HBV是嗜肝DNA病毒，而HCV是瘟病毒。HBV是含有DNA的病毒，通過聯(lián)合使用DNA依賴性RNA聚合酶和RNA依賴性DNA聚合酶(如逆轉(zhuǎn)錄酶)，在受感染細胞的細胞核中復制其基因組。HCV是含有RNA的病毒，通過使用一種或多種類型的RNA依賴性RNA聚合酶，在受感染細胞的細胞質(zhì)中復制其基因組。盡管HBV和HCV的感染經(jīng)常同時發(fā)生，已知的許多治療HBV感感染有效的化合物對HCV無效。例如，lamivudine(核苷類似物3TC)有用于治療HBV感染，但對HCV感染沒有作用。毫無疑問，HBV和HCV對抗病毒試劑的不同敏感性與它們基于遺傳的復制差異有關。對同時有效治療HBV和HCV感染的特別迫切的需求仍然存在。
從與受感染的動物細胞的細胞內(nèi)膜相關的膜中獲得其包膜的動物病毒對家畜業(yè)造成了重要損失(Sullivan等(1995)病毒研究38231-239)。這樣的動物病毒包括瘟病毒和黃病毒，比如牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、經(jīng)典型豬瘟病毒(classical swine fever virus)、邊境病病毒和豬瘟病毒。
已知HCV所屬的黃病毒群體含有由節(jié)肢動物載體傳播的許多人類疾病的起因物質(zhì)。由黃病毒引起的人類疾病包括各種出血熱、肝炎和腦炎。已經(jīng)鑒定了已知引起人類這些疾病的病毒，其中包括，例如黃熱病毒、登革病毒1-4、日本腦炎病毒、墨累溪谷腦炎病毒、Rocio病毒、西尼羅熱病毒、圣·路易腦炎病毒、蜱傳腦炎病毒、羊跳躍病病毒、波瓦生病毒，鄂木斯克出血熱病毒和Kyasanur森林出血熱病毒。因此，同樣存在治療感染了黃病毒或瘟病毒的動物以及人類的迫切需求。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種抑制從受感染細胞之胞內(nèi)膜的相關的膜獲得其包膜的病毒的形態(tài)發(fā)生的方法，方法包括將有效量的葡糖苷酶抑制劑給藥給細胞，從而抑制與細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關的葡糖苷酶活性。一方面，病毒選自黃病毒和瘟病毒，如丙型肝炎病毒、牛病毒性腹瀉病毒、經(jīng)典型豬瘟病毒、邊界病病毒和豬瘟病毒。另一方面，膜選自圍繞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的膜和圍繞高爾基體腔的膜。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，葡糖苷酶抑制劑是1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-D-葡糖醇(1，5-dideoxy-1，5-imino-D-glucitol)或其選自N-烷基、N-?；?、N-芳酰基、N-芳烷基和O-?；苌锏难苌铩?br> 本發(fā)明包括抑制從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)相關的細胞內(nèi)膜獲得其包膜的病毒的形態(tài)發(fā)生的一種方法，方法包括將有效量的葡糖苷酶抑制劑給藥給細胞，抑制與細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關的葡糖苷酶活性，從而抑制病毒的形態(tài)發(fā)生。感染受試病毒的哺乳動物細胞是特別期望的治療目標，它們包括，但不限于，人類肝細胞和牛單核細胞。
本發(fā)明還包括治療感染有這樣一種病毒的動物的方法，該病毒特征在于從病毒感染的細胞的ER相關膜中獲得其包膜。方法包括將有效量的葡糖苷酶抑制劑給藥給動物，以抑制感染有病毒的動物細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)葡糖苷酶活性，從而降低、切除或減少動物中的病毒感染。動物優(yōu)選哺乳動物，比如豬或牛，特別優(yōu)選人。
本發(fā)明的方法有用于抑制病毒的形態(tài)發(fā)生，或有用于治療感染有從與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關的膜中獲得其包膜的病毒的動物。因為黃病毒和瘟病毒均從與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關的膜中獲得其包膜，預期本發(fā)明的方法對抑制黃病毒和瘟病毒的形態(tài)發(fā)生或治療這兩種病毒的感染特別有用。黃病毒引起的感染包括，但不限于由黃熱病毒、登革病毒1-4、日本腦炎病毒、墨累溪谷腦炎病毒、Rocio病毒、西尼羅熱病毒、圣·路易腦炎病毒、蜱傳腦炎病毒、羊跳躍病病毒、波瓦生病毒，鄂木斯克出血熱病毒和Kyasanur森林出血熱病毒引起的感染。瘟病毒引起的感染包括但不限于HCV、風疹病毒、BVDV、經(jīng)典型豬瘟病毒、邊界病病毒和豬瘟病毒引起的感染。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種通過用1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-葡糖醇的N-烷基衍生物靶向作用于動物的肝細胞，使葡糖苷酶抑制劑或葡糖基轉(zhuǎn)移酶抑制劑靶向作用于所述肝細胞的方法。在一個優(yōu)選實施方案中，衍生物是N-壬基-1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-葡糖醇。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種治療脂類存儲疾病的方法，患病個體的細胞中累積了連接有葡糖基或半乳糖基的脂類。在本發(fā)明這一方面的一個實施方案中，該方法包括通過將有效抑制葡糖基轉(zhuǎn)移酶的量的N-壬基-1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-葡糖醇給藥給所述動物的病變細胞，由此限制細胞中糖脂的產(chǎn)生，從而治療動物溶酶體存儲疾病。在本發(fā)明這一方面的優(yōu)選實施方案中，動物患有Tay-Sachs病、Gaucher氏病、Krabbe氏病或Fabry氏病。
根據(jù)本發(fā)明的再一個方面，提供了保護感染了從動物細胞的內(nèi)膜獲得病毒組份的病毒的哺乳動物免于形成癌癥(所述病毒感染的后果之一)的預防方法，包括將有效抗病毒量的動物細胞葡糖苷糖抑制劑給藥給感染病毒的細胞。在本發(fā)明這方面的優(yōu)選實施方案中，抗病毒的葡糖苷糖抑制劑選自1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-葡糖醇及其衍生物。
附圖簡述

圖1顯示了DNJ衍生物N-丁基-DNJ(圖1a)和N-壬基-DNJ“578”(圖1b)在感染了牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)的Madin Darby牛腎(MDBK)細胞中的抗病毒效果。
圖2顯示了在經(jīng)DNJ衍生物處理的被感染的MDBK細胞的培養(yǎng)物中感染性BVDV的分泌。Y軸刻度代表了與無抑制劑上清感染所得的噬菌斑相比，經(jīng)處理的系統(tǒng)中所測得噬菌斑的相對百分數(shù)。X軸刻度代表用于噬菌斑檢測的抑制劑濃度。在圖的底部給出了IC50。圖2a由N-丁基-DNJ抑制；圖2b由N-壬基-DNJ抑制。
圖3顯示了N-丁基-DGJ(N-丁基-deoxygalactonojirimycin)對BVDV噬菌斑形成的影響，N-丁基-DGJ的濃度達到了680μg。在此濃度下，神經(jīng)酰胺特異性葡糖基轉(zhuǎn)移酶的活性被完全抑制。Y軸刻度代表了與無抑制劑上清感染所得的噬菌斑相比，經(jīng)抑制劑處理后所得噬菌斑的相對百分數(shù)。X軸刻度代表了在噬菌斑檢測中使用的抑制劑濃度。
圖4顯示了在感染的細胞培養(yǎng)物中將deoxymannojirimycin(DMJ)的濃度提高到能保護處理細胞免受ECA(一種復合的糖結(jié)合的凝集素)的致死效應，其對噬菌斑形成的影響。Y軸刻度代表了與無抑制劑噬菌斑測試上清感染所得噬菌斑(Y=100％)相比，經(jīng)抑制劑處理后所得噬菌斑的相對百分數(shù)。X軸表示了在檢測中使用的抑制劑濃度。
圖5顯示了沒有經(jīng)過感染(圖5a)、經(jīng)BVDV感染但不經(jīng)處理(圖5b)和BVDV感染并經(jīng)N-丁基-DNJ處理后，細胞中和細胞培養(yǎng)物的上清中病毒材料的相對感染性。
圖6顯示了取消N-丁基-DNJ(圖6a)和N-壬基-DNJ處理后，在感染細胞中BVDV產(chǎn)生的反彈?！?用藥；■=取消用藥。
圖7顯示了不同細胞類型對放射性標記的抑制劑的相對攝取◆NN-DNJ在HepG2細胞中；■NN-DNJ在MDBK細胞中；▲NB-DNJ在MDBK細胞中；●NB-DNJ在HepG2細胞中。
圖8顯示了放射性標記的亞氨基糖N-壬基-DNJ和N-丁基-DNJ在給Balb C小鼠給藥30，60和90分鐘后，在鼠器官中的分布。Y軸數(shù)值表示沿X軸標記的各個器官的放射性。結(jié)果根據(jù)器官的重量進行了標準化。
圖9顯示了具代表性的黃病毒科病毒的多蛋白序列的組織結(jié)構(gòu)(a)與瘟病毒BVDV相關的序列；和(b)與丙型肝炎病毒相關的序列。
優(yōu)選實施方案詳述由需要宿主細胞的糖苷酶來合成和正確折疊病毒包膜糖蛋白的病毒引起的感染可以通過將這些酶的抑制劑給藥給宿主細胞予以治療。靶病毒可以是任何在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)相關性細胞內(nèi)膜的合作下獲得其包膜組分的病毒。優(yōu)選的病毒是黃病毒或瘟病毒類型的成員。
一個細胞中“與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關的膜”意味著圍繞細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腔的膜、圍繞高爾基體(GA)的腔的膜、圍繞從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的囊泡的腔的膜或者圍繞由高爾基體到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的囊泡的腔的膜、圍繞由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體向細胞的細胞質(zhì)膜的囊泡的腔的膜、圍繞由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體向細胞的核膜的囊泡的腔的膜或者圍繞由從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體向細胞的線粒體膜的囊泡的腔的膜。預期本發(fā)明的方法優(yōu)先應用于抑制從宿主細胞的任何內(nèi)膜獲得形態(tài)發(fā)生組分的病毒的產(chǎn)生。
一個細胞中“與ER相關的葡糖苷酶”意味著嵌在細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)、結(jié)合在其腔側(cè)面或包含于ER相關的膜中的葡糖苷酶。例如，哺乳動物的α-葡糖苷酶I和α-葡糖苷酶II是與哺乳動物細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關的葡糖苷酶。
根據(jù)本發(fā)明所述方法處理的病毒感染的動物細胞可以是含有與細胞內(nèi)膜相關的葡糖苷酶的任何細胞，優(yōu)選含有與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)相關的酶的。特別優(yōu)選處理哺乳動物細胞，包括但不限于人的肝細胞和牛的單核細胞的治療。
據(jù)信對葡糖苷酶顯示出抑制效果的試劑能發(fā)揮作用是因為它們是葡萄糖的結(jié)構(gòu)類似物。其中一種試劑是被命名為1，5-二脫氧1，5-亞氨基-葡糖醇(或命名為deoxynojirimycin)的亞氨基糖，此后簡稱“DNJ”。已經(jīng)描述了許多DNJ的衍生物。DNJ和它的烷基衍生物是N-連接的寡糖加工酶--α-葡糖苷酶I和α-葡糖苷酶II的強抑制劑(Saunier等(1982)生物化學雜志25714155-14161；Elbein(1987)生物化學年度綜述56497-534)。這些葡糖苷酶與哺乳動物細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關。DNJ的N-丁基和N-壬基衍生物也可以抑制與高爾基體相關的葡糖基轉(zhuǎn)移酶。
使用DNJ衍生物治療被呼吸道合胞病毒(RSV)感染的哺乳動物的方法已有報導(授予Bryant等的美國專利5622972)。據(jù)信由于DNJ是葡萄糖的類似物因而表現(xiàn)出對葡糖苷酶的抑制性。但是，Bryant并沒有解釋DNJ衍生物表現(xiàn)出所觀測的抗RSV活性的機制。RSV，一種副粘病毒，從RSV感染的細胞的質(zhì)膜中獲得其包膜。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了使用DNJ以及N-甲基-DNJ能干擾非缺陷性的逆轉(zhuǎn)錄病毒的復制，如人類免疫缺陷病毒(HIV)、貓白血病病毒、馬傳染性貧血病毒和綿羊及山羊慢病毒(美國專利5643888和5264356；Acosta等(1994)美國醫(yī)院制藥雜志512251-2267)。
此前我們已經(jīng)指出在不損傷宿主細胞的生存力的情況下，在組織培養(yǎng)基中由人肝胚細胞瘤細胞分泌的人乙型肝炎病毒(HBV)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中α-葡糖苷酶活性的抑制劑敏感(Block等1994)。乙型肝炎病毒感染過的肝細胞分泌感染性的、含核衣殼的病毒粒子以及過量的不含DNA、非感染性的亞病毒顆粒。據(jù)認為所有這些顆粒都是從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)區(qū)室或后期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)區(qū)室如中間區(qū)室中芽生的(Huovila等(1992)細胞生物學雜志1181305-1320；Patzer等(1986)病毒學雜志58884-892)。抑制成熟HBV外運是由于2．15細胞(該細胞衍生自HepG2細胞)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常相關的一種或多種葡糖苷酶或葡糖基轉(zhuǎn)移酶的活性被抑制引起的(Lu等(1995)病毒學213660-665；Lu等(1997)美國科學院學報942380-2385)。
研究表明DNJ衍生物的抗-HIV的特性是HIV包膜蛋白的糖基加工異常的結(jié)果，而不是直接抑制HIV從細胞中芽生(Dedera等(1990)愛滋病研究及人類逆轉(zhuǎn)錄病毒6785-794；Fischer等(1995)病毒學雜志695791-5797；Taylor等(1994)抗微生物試劑與化學療法381780-1787)。
DNJ的一種衍生物，即N-丁基-1，5-雙脫氧-1，5-亞氨-D-葡糖醇(NBDNJ)，阻礙了成熟的HBV病毒粒子從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2細胞中外運，但并不阻止亞病毒顆粒的外運(Block等(1994)美國科學院學報912235-2239)。因此，認為從細胞質(zhì)膜芽生的HIV病毒粒子的形態(tài)發(fā)生似乎不受NBDNJ存在的影響。但是，從HIV感染過的、經(jīng)NBDNJ處理的細胞釋放的病毒粒子的感染性比從沒有經(jīng)NBDNJ處理的細胞釋放的HIV顆粒降低很多(Dedera等，同前；Fisher等，同前；Taylor等，同前)。這些研究表明NBDNJ的抗HIV的性質(zhì)是靶細胞中不正常的病毒融合所致，而不是直接抑制HIV從細胞中芽生。
最近我們證實了在HBV感染的旱獺動物模型中葡糖苷酶抑制劑的抗病毒效果。在慢性感感染有旱獺肝炎病毒(WHV)的旱獺中，使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)α-葡糖苷酶抑制劑進行治療導致病毒包膜糖蛋白的正常折疊和運輸被破壞，并且阻礙了感染性的有包膜病毒的分泌(Block等1998)。
與HIV和RSV的情況最有意義和明顯的差別在于，只有適量的葡糖苷酶被抑制會導致HBV和BVDV的分泌被強烈抑制。這預示著，與HIV和RSV等不同，對于從內(nèi)膜中芽生的病毒，僅僅一小部分的包膜病毒蛋白被破壞足以抑制病毒的分泌。這也許是基于這樣一個事實，即我們的證據(jù)表明被破壞的HBV和BVDV病毒蛋白質(zhì)作為病毒分泌的“顯性陰性”毒劑，也許可以認為它們本身就是抗病毒藥物，其效果不亞于藥物本身。
ER的α-葡糖苷酶擔負著從連接到新生糖蛋白的N-聚糖鏈上逐步除去末端的葡萄糖殘基的任務。這樣就使糖蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的伴侶蛋白-鈣聯(lián)接蛋白和鈣網(wǎng)蛋白相互作用，這兩種伴侶蛋白專一地與單葡糖基化的糖蛋白結(jié)合。與鈣聯(lián)接蛋白的相互作用對于某些但并非全部糖蛋白的正確折疊是很重要的，并且可以用葡糖苷酶的抑制劑特異性地靶向作用于依賴鈣聯(lián)接蛋白的蛋白質(zhì)。N-連接的聚糖在糖蛋白的命運和功能中發(fā)揮了很多作用。其中一個功能是通過介導凝集素類的伴侶蛋白-鈣聯(lián)接蛋白和鈣網(wǎng)蛋白與新生糖蛋白相互作用從而協(xié)助蛋白折疊。正是這樣的相互作用能通過用試劑(比如N-丁基-DNJ和N-壬基-DNJ)抑制α-葡糖苷酶的活性，導致一些蛋白錯誤地折疊并滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中來阻止。我們證實了N-壬基-DNJ誘導的一種乙型肝炎病毒(HBV)包膜糖蛋白的錯誤折疊防止了病毒形成和體外的分泌，并且這種抑制劑使糖基化發(fā)生改變，使慢性HBV感染的動物模型中的病毒水平降低。
HBV對由α-葡糖苷酶抑制引起的包膜蛋白的改變的極度敏感性以及無需為達到所觀察的抗病毒效果而將這些酶高度地抑制的事實，讓我們推測病毒的敏感性也許是基于這樣的事實發(fā)生折疊時，其需要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中寡聚化并組裝包膜。與HIV和RSV的情況不同，少數(shù)錯誤折疊的包膜蛋白可能足以破壞正常的包膜加工，并且與抑制劑對宿主細胞蛋白的影響(在抗病毒的抑制劑濃度時，宿主細胞的蛋白質(zhì)并沒有遭到破壞)相比，它們對病毒組裝的破壞作用得以放大。我們對機制的研究使我們提出只要病毒的一種或多種糖蛋白依賴于鈣聯(lián)接蛋白介導的折疊，從內(nèi)膜比如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中獲得其包膜的其他病毒對ERα-葡糖苷酶抑制同樣敏感。
雖然HBV和HCV有完全不同的生活周期，但它們以下三點相同它們靶向于肝，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和其它內(nèi)膜中芽生并且它們的包膜糖蛋白通過依賴于鈣聯(lián)接蛋白的途徑進行折疊。這促使我們研究對HBV有抗病毒效果的同一抑制劑是否以同樣的假定機理抑制HCV。
兩種HCV包膜糖蛋白E1和E2分別含有5或6以及11個N-連接的糖基化位點，在其生產(chǎn)性折疊過程中均與鈣聯(lián)接蛋白相互作用(Choukhi等1998)。由于缺乏有效的細胞培養(yǎng)復制系統(tǒng)，對HCV顆粒組裝的了解極其有限。但是，復合聚糖的缺乏、表達的HCV糖蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的定位，以及在細胞表面這些蛋白質(zhì)缺少表明開始的病毒顆粒的形態(tài)發(fā)生是通過從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中芽生入細胞內(nèi)的囊泡而發(fā)生的。另外，成熟的E1-E2異源二聚體不離開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在E1和E2的C-端區(qū)域都發(fā)現(xiàn)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號。
這引導我們?nèi)パ芯科咸擒彰笇α硪环N內(nèi)質(zhì)網(wǎng)芽生的病毒-牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)的影響，BVDV是人丙型肝炎病毒(HCV)的組織培養(yǎng)替代物。由于缺乏適當?shù)哪苤С秩薍CV復制的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)作為由FDA批準的HCV的模型生物(圖1)，因為兩者有相當程度的局部蛋白質(zhì)區(qū)域同源性(Miller等1990)、共同的復制機制，病毒的包膜可能也有同樣的亞細胞定位。強烈推薦使用所發(fā)現(xiàn)的對BVDV有抗病毒效果的化合物作為治療HCV的潛在侯選物。
同HCV一樣，BVDV是小的有包膜的正鏈RNA病毒，并且同所有的黃病毒科的病毒一樣，在一個單一的、長開放閱讀框(ORF)內(nèi)編碼其所有蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)蛋白在多聚蛋白的氨基端而非結(jié)構(gòu)蛋白或復制蛋白在羧基端。BVDV的多聚蛋白在編碼形成異源二聚體的包膜蛋白-gp25(E1)和gp53(E2)的區(qū)域內(nèi)有6個潛在的N-糖基化位點，在編碼gp48(EO)-一種功能未知的親水性分泌蛋白的區(qū)域內(nèi)有8個潛在的N-糖基化位點。連接到這些糖蛋白的寡糖結(jié)構(gòu)待測定。已證實了BVDV對ERα-葡糖苷酶抑制劑更敏感。這一點以及在體外使用的抑制劑被肝類型的細胞優(yōu)先吸收和體內(nèi)抑制劑在肝中表現(xiàn)出更長的滯留時間的事實表明了鼓舞人心的可能性即葡糖苷酶抑制劑能被用作廣譜抗肝炎病毒試劑。
在這里我們描述了BVDV對葡糖苷酶抑制劑的敏感性，并且討論了選擇性地依賴于聚糖加工的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)芽生病毒的可能原因。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)組織培養(yǎng)中的哺乳動物細胞因暴露于牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)導致的細胞毒性通過向組織培養(yǎng)基中加入葡糖苷酶抑制劑能得以抑制。在以下實施例中使用的葡糖苷酶抑制劑包括1，5-二脫氧1，5-亞氨基-葡糖醇(DNJ)的一種衍生物，特別是N-丁基-DNJ(NBDNJ)。并且BVDV誘發(fā)的細胞毒性的抑制是在幾乎觀察不到由NBDNJ介導的對宿主細胞的毒性的情況下取得的。因為BVDV是為人接受的丙型肝炎病毒(HCV)的組織培養(yǎng)模型(Henzler，H．J．和K．Kaiser(1998)自然生物技術161077-1078)，這里描述的用于抑制BVDV形態(tài)發(fā)生的組合物和方法也可應用于抑制HCV的形態(tài)發(fā)生。
在實施本發(fā)明方法中有效的組合物包括動物的葡糖苷酶抑制劑，優(yōu)選哺乳動物的葡糖苷酶抑制劑。本發(fā)明所述方法尤其期望的葡糖苷酶抑制劑是DNJ，1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-葡糖醇及其衍生物，有如下結(jié)構(gòu)式 其中R1選自下述基團(a)氫；(b)烷基；(c)鏈烯基；(d)烷氧基；(e)?；?；(f)芳基；(g)芳烷基；(h)芳?；缓?i)芳烷氧基；和(j)雜環(huán)基；和R3，R4，R5和R6可以相同或不同，選自下列基團(k)?；缓?l)芳?；?；其中所述烷基和鏈烯基基團具有1到14個碳原子、是線型或分支的、取代或非取代的，所述鏈烯基有1到6個雙鍵；所述酰基、芳烷基和芳?；?到14個碳原子，雜環(huán)基任選被鹵素、羥基、C1-10烷基、C1-10亞烷基、C1-10?；虲1-10烷氧基取代；或者所述化合物的對映異構(gòu)體或立體異構(gòu)體，或者所述化合物、對映異構(gòu)體或立體異構(gòu)體的生理上可接受的鹽、溶劑化物。
優(yōu)選的是DNJ的N-烷基、N-?；?、N-芳酰基、N-芳烷基和O-酰基衍生物。特別優(yōu)選的DNJ的衍生物是N-丁基-DNJ。另一種優(yōu)選的DNJ衍生物是1，5-二脫氧-1，5-壬基亞氨基(nonylylimino)-葡糖醇，這里將其命名為N-壬基-DNJ或NN-DNJ。
在例如美國專利5622972中已經(jīng)描述了DNJ的衍生物，包括1，5-二脫氧-1，5-丁基亞氨-D-葡糖醇；1，5-二脫氧-1，5-丁基亞氨-4R，6-O-苯亞甲基-D-葡糖醇；1，5-二脫氧-1，5-甲基亞氨-D-葡糖醇；1，5-二脫氧-1，5-己基亞氨-D-葡糖醇；1，5-二脫氧-1，5-壬基亞氨(-nonylylimino)-D-葡糖醇；1，5-二脫氧-1，5-(2-乙基丁基亞氨)-D-葡糖醇；1，5-二脫氧-1，5-芐氧羰亞氨-D-葡糖醇；1，5-二脫氧-1，5-苯乙酰亞氨-D-葡糖醇；1，5-二脫氧-1，5-苯甲酰亞氨-D-葡糖醇；1，5-二脫氧-1，5-乙基丙二酰亞氨-D-葡糖醇；1，5-二脫氧-1，5-氫化肉桂酰亞氨-D-葡糖醇；1，5-二脫氧-1，5-甲基丙二酰亞氨-D-葡糖醇；1，5-二脫氧-1，5-丁基亞氨-4R，6-O-苯亞甲基-D-葡糖醇；1，5-二脫氧-1，5-(苯氧甲基)羰亞氨-D-葡糖醇；1，5-二脫氧-1，5-乙基丁基亞氨-D-葡糖醇；1，5-二脫氧-1，5-己基亞氨-4R，6-O-苯亞甲基-D-葡糖醇；1，5-二脫氧-1，5-(2-甲基戊基)亞氨-D-葡糖醇；1，5-二脫氧-1，5-(3-煙酰)亞氨-D-葡糖醇；1，5-二脫氧-1，5-肉桂酰亞氨-D-葡糖醇；1，5-二脫氧-1，5-(4-氯苯基)乙酰亞氨-D-葡糖醇；和1，5-二脫氧-1，5-(4-雙苯基)乙酰亞氨-D-葡糖醇。
使用這些化合物的亞氨基保護的種類或亞氨基保護的種類的兩個或四個乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸酯(鹽)。
在例如美國專利5622972、4246345、4266025、4405714和4806650以及美國專利申請07／851818(1992年3月16日申請)中已知并描述了合成DNJ衍生物的方法。
在基本的1，5-二脫氧-1，5-亞氨-D-葡糖醇上進行替代可以影響作為抗病毒試劑的化合物的效力，另外也可以優(yōu)先將該分子靶向作用于一種而非另一種器官。例如，對于抑制細胞內(nèi)BVDV病毒的產(chǎn)生，N-丁基取代的DNJ的效果不如N-壬基-DNJ(圖1和實施例2)。實施例1中提供了比較各種取代化合物效力的方法。肝細胞優(yōu)先吸收N-壬基-取代的DNJ(圖7和實施例7)。在實施例8和圖8中提供了確定各種取代DNJ的優(yōu)先靶向作用屬性的方法。
這里所描述的DNJ衍生物可以以游離的胺形式或藥用可接受的鹽的形式使用。在Berge，S等(1977)制藥科學雜志66(1)1-18中提供了藥用鹽和用于制備鹽形式的方法。以DNJ衍生物的鹽酸鹽為例闡述了鹽形式。DNJ衍生物也可以以前藥的形式使用，如美國專利5043273和5103008中描述的6-磷酸化衍生物。明確期望的是使用進一步包括藥用可接受的載體的組合物和進一步包括有益于將組合物遞送給動物的成分的組合物。許多有益于將組合物遞送給人的可藥用接受載體和有益于將該組合物遞送給其它動物如牛的成分是本領域已知的。加入該載體和成分到本發(fā)明的組合物中是本領域普通技術人員力所能及的。
本發(fā)明的方法可進一步包括使用DNJ衍生物和補充的抗病毒劑。該補充的抗病毒劑可為任何已知的抗病毒劑，或者將被認識的任何抗病毒劑。例如，該補充的抗病毒劑化合物可是α-干擾素，病毒唑，lamivudine，藍菌素，莫能菌素，TurirumabTM(Protein Design Labs)PeniclovirTM(Smithkline Beecham，philadelphia，PA)，F(xiàn)amcidovirTM(Smithkline Beecham，Philadephia，PA)，BetaseronTM(Chiron Corp．)，Theradigm-HBVTM(Cytel，La Jolla，CA)，AdefovirDipivoxil(GS 840，Gilead Sciences，F(xiàn)oster city，CA)，Intron ATM(Schering Plough)，RoferonTM(Roche Labs)，β-干擾素，BMS200，475(Bristol Myers Squibb)，LobucavirTM(Bristol Myers Squibb)，F(xiàn)TC(Triangle，Inc．)，DAPD(Triangle，Inc．)，胸腺素α肽，Glycovir(Block等(1994)美國國家科學院院刊912235-2240)，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(Martin等，(1993)Hepatology 18775-780)，一種“免疫-細胞因子”(Guidotti等(1994)Jvirol 681265-1270)，CDG(Fourel等(1994)Jvirol 681059-1065)，或類似物。
治療脂質(zhì)貯存疾病其中在組織中累積了摻入復合脂類的葡糖基和半乳糖基殘基的一組脂沉積癥或脂質(zhì)貯存疾病可用本發(fā)明的葡糖基轉(zhuǎn)移酶抑制化合物，尤其是根據(jù)本發(fā)明的方法的N-壬基-1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-D-葡萄糖醇治療。其中的一些脂沉積癥是Gaucher氏病導致異常的葡糖腦苷脂在網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞中累積且臨床表現(xiàn)為肝脾腫大，皮膚色素沉著，骨骼損傷和結(jié)膜黃斑的脂代謝的家族性常染色體隱性紊亂。
此病的根本缺陷是缺乏葡糖腦苷脂酶活性，該酶在正常情況下能水解葡糖腦苷脂成葡萄糖和神經(jīng)酰胺。典型的病理性發(fā)現(xiàn)是廣泛的網(wǎng)狀細胞增生。該細胞充有葡糖腦苷脂和纖維狀細胞質(zhì)，有不同的外型和一或幾個位置特別的小核。在肝、脾、淋巴結(jié)和骨髓中可發(fā)現(xiàn)這些網(wǎng)狀細胞。
Krabbe’s病(半乳糖神經(jīng)酰胺脂沉積癥)繼發(fā)于缺乏半乳糖腦苷脂β-半乳葡糖苷酶的一種家族性脂類儲存病。以進行性遲滯發(fā)育、癱瘓、失明、聾癥以及假延髓麻痹為特征的嬰幼兒致死性疾病。
Fabry’s病(半乳糖基半乳糖基葡糖神經(jīng)酰胺脂沉積癥)在許多組織中累積糖脂的一種家族性脂肪代謝異常。代謝的異常是由于缺乏三己糖基神經(jīng)酰胺的代謝中所需的溶酶體酶α-半乳葡糖苷酶引起的，患有的個體有皮膚損傷和角膜混濁。
Tay-Sachs病(GM2神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥)由導致神經(jīng)節(jié)苷脂(復合鞘脂，包含由葡萄糖和半乳糖組成的寡糖)在腦中的積累的氨基己糖苷酶A缺乏引起的家族性隱性異常。
根據(jù)本發(fā)明所述方法給藥給動物或動物細胞的抗病毒試劑的量能有效抑制與細胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或其它內(nèi)膜相關的葡糖苷酶活性。根據(jù)本發(fā)明所述方法給藥給動物或動物細胞的葡糖轉(zhuǎn)移酶抑制劑的量能有效抑制與細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或其它內(nèi)膜相關的葡糖轉(zhuǎn)移酶活性。此處所用術語“抑制”指在沒有發(fā)明所述DNJ衍生化合物時表現(xiàn)出的生物活性的可檢測降低或減少。術語“有效量”指達到指定效果所需的組合物的量。此處所用術語“治療”指受試者癥狀的減輕或緩和，防止癥狀惡化或發(fā)展，對致病劑的抑制或降低，或給從此正常的受試者預防感染或異常。
因此，例如，治療患有脂肪沉積癥的患者可以是減少病變細胞中脂肪的積累，預防所治療患者的病情發(fā)展。對于病毒感染的治療包括破壞感染原、抑制或干擾它的生長或成熟，中和其病理學效應等。給藥給細胞或動物的組合物的量優(yōu)選在用藥的同時不誘發(fā)超過其有利方面的任何毒性效果。
本發(fā)明所述藥物組合物中的活性成分的實際劑量可以改變，以便活性化合物的用量能對特殊患者達到預期的治療結(jié)果。
所選劑量水平取決于所選擇的化合物的活性、用藥途徑、治療情況的嚴重性和所治療患者的情況和以前的病史。但是，本領域一般開始在低于達到預期治療效果所需水平用藥，然后逐步提高以達到預期效果。如果需要的話，為了給藥，可將每天的有效劑量分為多次劑量，如每天服藥2到4次。但是，應當理解對于任何具體患者，特殊的用藥劑量取決于各種因素，包括體重、整體健康狀況、膳食、用藥時間及途徑、與其它藥物組合使用以及所治療疾病的嚴重性。估計成人每天的劑量范圍通常在每千克體重大約1微克到1克，優(yōu)選大約10mg到100mg的葡糖苷酶抑制劑。當然，給藥給細胞或動物的組合物的量取決于本領域技術人員熟知的許多因素，比如葡糖苷酶抑制劑的分子量，用藥的途徑等等。
用于本發(fā)明的藥物組合物可以以固體口服劑、眼用劑、栓劑、氣霧劑，局部或其它的類似劑型。除了葡糖苷酶或葡糖轉(zhuǎn)移酶抑制劑外，這類藥物組合物可以包括藥用可接受的載體以及已知能增強和促進用藥的其它成分。另外一些可能的劑型，如微小顆粒、脂質(zhì)體，重封的紅細胞，以及基于免疫的系統(tǒng)也可用于給藥根據(jù)本發(fā)明的葡糖苷酶或葡糖轉(zhuǎn)移酶的抑制劑。這類藥物組合物可以通過任何已知的途徑進行給藥。文中所用術語“非腸道”包括皮下、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)和注射以及輸注技術，沒有任何限制。例如，藥物組合物可以通過口服、局部、非腸道、全身性地或肺的途徑進行給藥。
根據(jù)本發(fā)明的方法這些組合物可以以單劑的形式或給藥時間不同的多重藥劑的形式進行給藥。因為組合物對病毒的糖基化抑制作用的時效長于對正常的宿主細胞糖基化的抑制，用藥的策略可以進行調(diào)整以便延緩病毒的增殖而最小程度地影響宿主細胞的蛋白糖基化。例如，可以每周一次將一劑本發(fā)明組合物對動物進行給藥，在整個星期內(nèi)病毒的繁殖被延緩，而宿主細胞的蛋白糖基化只在每周短時間內(nèi)受到抑制。
使用這些藥物組合物的一個有利方面是它們抑制了宿主細胞的酶，而不是病毒的功能。病毒能發(fā)生突變是眾所周知的，對抗病毒試劑的抑制作用敏感的病毒功能會發(fā)生突變，使得子代病毒對該試劑的抑制作用具有抗性。例如，已有文獻證明HIV病毒的變異能力，其變異導致特定的抗病毒試劑如AZT不能透過。本發(fā)明的方法優(yōu)勢在于本方法所用組合物靶向作用于作為病毒生活周期中的一部分的被病毒利用的宿主細胞的功能。這個宿主功能，即由與宿主細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關的宿主葡糖苷酶催化的葡糖基化或與宿主細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關的宿主葡糖基轉(zhuǎn)移酶催化的葡萄糖基轉(zhuǎn)移，不會因為病毒基因組的變異而改變。因此，不可能形成對本發(fā)明的組合物具有抗性的病毒株。
實驗步驟在本發(fā)明中，觀察到NBDNJ抑制BVDV在組織培養(yǎng)中的MDBK單層細胞上形成噬菌斑的能力。例如，經(jīng)BVDV感染而未經(jīng)NBDNJ處理的兩種培養(yǎng)物中，在含有感染細胞的孔內(nèi)有16和25個病毒噬菌斑。經(jīng)BVDV感染然后在感染后馬上經(jīng)NBDNJ處理的細胞培養(yǎng)物上沒有產(chǎn)生可見的噬菌斑，通過中性紅染色觀察，單層細胞顯得健康并有活性。
牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)在這些實驗中被當作HCV的替代物使用。有必要在組織培養(yǎng)中使用HCV的替代物是因為HCV在組織培養(yǎng)基中、以及在除人和黑猩猩以外的動物中不能可靠地增殖。與HCV相類似，據(jù)認為BVDV是從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中芽生的瘟病毒(Harasawa等(1995)微生物與免疫學39979-985)。病毒學家認為BVDV是用于組織培養(yǎng)中HCV最近的生化替代物(Suzich等(1993)病毒學雜志676152-6158；Donis(1995)北美獸醫(yī)臨床11393-423)，并是權威專家的認可，包括美國食品和藥物管理局的專家非正式聲明的HCV可接受的替代物。
除當作HCV的替代物使用，BVDV也是重要的獸醫(yī)病原體(Donis(1995)北美獸醫(yī)臨床11393-423)。在美國重大的家畜損失要歸咎于BVDV(Sullivan等(1995)病毒研究38231-239)。
亞氨基糖衍生物N-丁基-deoxynojirimycin(NB-DNJ)和N-壬基deoxynojirimycin(NN-DNJ)強烈地抑制BVDV對在Madin Darby牛腎(MDBK)細胞的細胞病變作用。利用噬菌斑減少和產(chǎn)量檢測，證明壬基化合物(IC50=2．5μM)的效果是丁基化合物的46倍(IC50=115μM)。
在基于細胞的檢測中，N-壬基-DNJ對葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性的抑制比N-丁基-DNJ強烈地多，而對葡糖基轉(zhuǎn)移酶的抑制有用于治療很多溶酶體糖脂存儲疾病(F．M．Platt，G．R．Neises，G．Reinkensmeier，M．J．Townsend，V．H．Perry，R．L．Proia，B．Winchester，R．A．Dwek，T．D．Butter(1997)科學276428-431)，可以理解壬基DNJ和其它DNJ烷基鏈衍生物在治療溶酶體糖脂存儲疾病如Tay-Sachs、Gaucher’s病、Fabry’s等病中或許很有價值。由于NB-DNJ和NN-DNJ化合物不僅抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的α-葡糖苷酶，而且也抑制參與糖鞘脂生物合成的神經(jīng)酰胺特異性葡糖基轉(zhuǎn)移酶，因此有必要研究這些藥物通過何種途徑起到抗病毒的效果。使用N-丁基-deoxygalactonojirimycin(NB-DGJ)-一種只靶向作用于葡糖基轉(zhuǎn)移酶的抑制劑將兩種途徑進行藥理學區(qū)分。在噬菌斑減少檢測中，NB-DGJ對BVDV的噬菌斑形成沒有作用(圖3)。正如通過14C-軟脂酸-標記的NB-DGJ處理的MDBK細胞中Glc-神經(jīng)酰胺和神經(jīng)節(jié)苷脂劑量依賴性的減少(數(shù)據(jù)未發(fā)表)所顯示的，所用NB-DGJ的濃度足以完全抑制葡糖基轉(zhuǎn)移酶。這說明由NB-DNJ和NN-DNJ觀察到的抗病毒效果是由于參與N-多聚糖加工的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)α-葡糖苷酶受到抑制。
高爾基體的內(nèi)-α-D-甘露葡糖苷酶是能提供替代的脫葡糖基途徑的一種酶，從而使即便是葡糖苷酶受抑制的聚糖進一步加工為復合型寡糖，已表明這種酶在MDBK細胞中含量相當高。但是，并不是所有的蛋白質(zhì)都必然能利用這條途徑。例如，在MDBK細胞中由于castanospermine引起的葡糖苷酶被抑制期間，VSV-G蛋白仍保持對內(nèi)-H敏感。因此，用NB-DNJ和NN-DNJ處理MDBK細胞也可以抑制BVDV包膜糖蛋白獲得對病毒的分泌可能極為重要的復合型N-聚糖。為了檢測這種可能性，在噬菌斑減少檢測中使用高爾基體的甘露葡糖苷酶抑制劑deoxymannojirimycin(DMJ)(圖4)。DMJ，能抑制復合型N-聚糖的形成，但不干擾N-聚糖生物合成的早期步驟，對BVDV的噬菌斑形成沒有影響。這意味著NB-DNJ和NN-DNJ的抗病毒效果是由形成復合N-聚糖以前的步驟介導的。
正如NB-DNJ靶向作用于宿主細胞的酶，其它的N-葡糖基化宿主蛋白質(zhì)，包括病毒的受體，其功能也許會受到損害。如果真是這樣，可能會阻止病毒進入宿主細胞。為了驗證這種可能性，在感染病毒之前讓MDBK細胞在缺乏或存在1mg／ml NB-DNJ的情況下生長六天。用藥物進行預處理并不能阻止病毒的入侵(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，表明在葡糖苷酶受抑制的細胞中病毒的受體是有功能的。
在感染乙型肝炎病毒(BBV)、葡糖苷酶受到抑制的HepG2細胞中，有包膜的病毒的分泌被抑制，病毒DNA在細胞內(nèi)積聚。但是，還不清楚感染性顆粒中是否含有累積的DNA，因為在組織培養(yǎng)物中很難確定HBV的感染性。
阻礙BVDV的分泌可能還導致病毒物質(zhì)在細胞內(nèi)積累，在這種情況下驗證這些物質(zhì)是否具有感染性較容易。將未經(jīng)處理和經(jīng)NB-DNJ處理的感染細胞徹底洗滌，兩三天后的經(jīng)凍融裂解細胞。進行產(chǎn)量檢測以確定細胞裂解液和上清中噬菌斑形成單位(pfu)的數(shù)量(圖5)。對于未經(jīng)處理的細胞，兩天后從細胞內(nèi)得到大多數(shù)具有感染性的病毒物質(zhì)(超過97％)，三天后在上清中能檢測到1／3的具感染性的病毒物質(zhì)。有意義的是，NB-DNJ處理的細胞兩天后不含可檢測的具感染性的物質(zhì)，三天后也很少。在培養(yǎng)基中沒有發(fā)現(xiàn)具感染性的物質(zhì)。這些數(shù)據(jù)表明在感染狀態(tài)下經(jīng)抑制劑處理的細胞中不積累BVDV。
只要培養(yǎng)基中存在NB-DNJ，并且葡糖苷酶受到抑制，感感染有BVDV的細胞既不分泌也不積累感染性病毒。我們想確定在除去抑制劑后病毒需要多長時間從葡糖苷酶的抑制中恢復并重新進行分泌。在移去含有藥物的培養(yǎng)基，并換用無藥物(減藥)或含藥物的培養(yǎng)基(加藥)之前，將感染過的細胞用1mg／ml NB-DNJ或30μg／ml NN-DNJ處理兩天(即，直到未經(jīng)處理的對照細胞中的噬菌斑完全形成)。定時從培養(yǎng)基中取樣，利用噬菌斑減少和產(chǎn)量檢測法檢測具感染性的物質(zhì)。直到除去藥物后24小時內(nèi)檢測不到具感染性的物質(zhì)，并且24和48小時之間病毒才開始反彈(圖6)。
亞氨基糖是葡糖苷酶和葡糖基轉(zhuǎn)移酶的可逆抑制劑，在除去藥物的兩小時內(nèi)酶活性接近正常。但N-壬基-DNJ和N-丁基DNJ的抗病毒效果在除去兩小時后持續(xù)長時間(圖6)，特別是對于HBV(Lu等(1997))。因此我們提出亞氨基糖抑制劑的抗病毒效果實際上是由除去藥物后長壽命的缺陷病毒糖蛋白在胞內(nèi)持續(xù)存在引起的。這些長壽命的缺陷糖蛋白以顯性陰性的形式發(fā)揮作用，因此它們本身可以看作是真正的抗病毒試劑。認識到這些缺陷糖蛋白作為抗病毒試劑是有創(chuàng)造性的，可以用來對這些病毒引起的感染進行治療并開發(fā)新療法。
以下參考下列實施例來描述本發(fā)明。這些實施例僅供闡述發(fā)明，不應解釋為對發(fā)明的限制，而應認為發(fā)明包含了由本文提供的教導而顯而易見的任何和所有變化。
實驗材料與方法細胞、病毒與抑制劑非細胞病變(ncp)的無BVDV MDBK細胞和細胞病變(cp)的BVDV(NADL毒株)由John McCauley博士(動物衛(wèi)生研究所，Compton，英國)惠贈。MDBK和HepG2細胞保存在含10％胎牛血清(PAA實驗室，澳大利亞)的RPM1 1640培養(yǎng)基(GIBCO／BRL)中，已對細胞進行篩選，發(fā)現(xiàn)沒有BVDV和BVDV特異性抗體的細胞。N-丁基-deoxynojirimycin(NB-DNJ)和N-壬基-deoxynojirimycin(NN-DNJ)由Monsanto Searle提供。將NB-DNJ溶于培養(yǎng)基中并在使用前過濾。在乙醇中配制NN-DNJ的13mg／ml儲存液，使用前用培養(yǎng)基進行稀釋。N-丁基-deoxygalactojirimycin(NB-DGJ)和deoxymannojirimycin(DMJ)購自Boehringer Mannheim(德國)，分別在水中配制成200mM和100mM的儲液，使用前用培養(yǎng)基稀釋并過濾。NB-[U-14C]deoxynojirimycin(比活4．4mCi／mmol)和deoxynojirimycin(DNJ)由G．D．Searle惠贈。
由于缺乏能支持人HCV進行復制的適合的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)作為FDA批準的HCV的模型生物(圖1)，因為它們有相當程度的局部蛋白區(qū)域同源性(Miuer等，1990)、相同的復制機制并且病毒包膜可能有相同的亞細胞定位。強烈推薦將發(fā)現(xiàn)對BVDV有抗病毒效果的化合物用作治療HCV的潛在侯選物。
噬菌斑減少和產(chǎn)量檢測MDBK細胞在存在或缺乏抑制劑的情況下(見圖例)生長于六孔平板中，用cp BVDV(感染復數(shù)=0．005；每孔500pfu)于37℃感染一個小時，僅用生長培養(yǎng)基或用生長培養(yǎng)基和抗病毒試劑取代接種物，并在存在或缺乏抑制劑的情況下培養(yǎng)兩或三天(噬菌斑減少檢測)。在顯微鏡下用肉眼對噬菌斑進行計數(shù)，從孔中移去含有分泌的感染性病毒的上清，用它在六孔平板中感染新鮮的MDBK單層細胞。三天后，在顯微鏡下對所得的噬菌斑計數(shù)(產(chǎn)量檢測)。
實施例1抗病毒的抗葡糖苷酶的存在對暴露于BVDV的MDBK單層細胞噬菌斑形成的影響MDBK細胞(ATCC保藏號22 CCL F11859，無BVDV)在24-孔盤的每一孔中生長到半鋪滿狀態(tài)，并形成單層細胞。所用培養(yǎng)基是含有10％(V／V)的馬血清的Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基。將BVDV的NADL病毒株(ATCC保藏號NADL 534VR)的儲液稀釋到每毫升大約500到1000噬菌斑形成單位(pfu)，懸浮于生長培養(yǎng)基中，在存在病毒時培養(yǎng)細胞一個小時，以小于1的感染復數(shù)(moi)(噬菌斑形成條件)感染大約105個細胞。單獨用生長培養(yǎng)基或含有圖5軸上標明量的藥物(每毫升多達1000微克NBDNJ)的生長培養(yǎng)基取代接種物。感染后三天，在將單層細胞經(jīng)溶于乙醇中的0．2％(W／V)的結(jié)晶紫染色之前和之后用顯微鏡進行觀察，檢測是否存在病毒誘發(fā)的噬菌斑并計數(shù)(圖5)。通過錐蟲染料外排和MTT檢測，證實經(jīng)NBDNJ處理的細胞是有活性的(以CC50顯示結(jié)果，或?qū)е翸TT活性的存活力下降50％所需藥物的數(shù)量)。在以下表格和圖1中有這些實驗的結(jié)果。
表1 經(jīng)N-丁基-DNJ處理。暴露于BVDV的細胞經(jīng)1000μgNBDNJ／ml處理。
注“C”表示發(fā)現(xiàn)鋪滿的細胞裂解。
“1 ”表示出現(xiàn)了也許是代表單個pfu的小的細胞裂解區(qū)。
“s”表示出現(xiàn)了比被BVDV PFU感染的MDBK單層細胞中通常觀察到的噬菌斑小的噬菌斑。
實施例2在有N-丁基-DNJ和N-壬基-DNJ的情況下感染性BVDV的分泌MDBK細胞在24孔盤的每一孔中生長到半鋪滿狀態(tài)。然后在生長培養(yǎng)基中懸浮有大約500pfu BVDV的NADL病毒株的情況下，將上述細胞于37℃培養(yǎng)1小時，使細胞感染BVDV。分別用生長培養(yǎng)基或含有如表2和表3所示濃度的NBDNJ和NNDNJ的生長培養(yǎng)基取代接種物。三天后取上清，用于感染六孔平板中的新鮮MDBK單層細胞。三天后，在將單層細胞經(jīng)溶于乙醇中的0．2％(W／V)的結(jié)晶紫染色之前和之后用顯微鏡進行觀察，檢測是否存在噬菌斑，用0．2％中性紅染色以檢查存活性，檢測是否存在病毒誘發(fā)的噬菌斑并計數(shù)。結(jié)果表示為用無抑制劑的噬菌斑檢測上清進行感染時形成的噬菌斑(=100％)的百分數(shù)。在表2和表3以及圖1A和圖1B中列出了這些實驗的結(jié)果表2重復實驗結(jié)果由逗號分開
注“C”表示觀察到鋪滿細胞裂解表3加入N-壬基-DNJ對BVDV導致的噬菌斑形成的影響
注“C”表示觀察到鋪滿細胞裂解。N-壬基-DNJ葡糖苷酶抑制劑(糖生物學研究所，牛津大學“化合物578”)。重復實驗結(jié)果由逗號隔開。
測定出抑制50％的噬菌斑形成的NB-DNJ的濃度(IC50)大約為20μg／ml。計算出NB-DNJ誘發(fā)50％MDBK死亡的濃度(CC50)大于1000μg／ml。N-壬基-DNJ的IC50值大約為0．75μg／ml，N-壬基-DNJ的CC50值約為100μg／ml。
對經(jīng)NB-DNJ或NN-DNJ處理的細胞，病毒誘發(fā)的噬菌斑是數(shù)量減少或只是大小減少還不太清楚。BVDV感染的細胞經(jīng)200μg／ml的NB-DNJ或10μg／ml的NN-DNJ處理后沒有可見的細胞病變效果。經(jīng)1000μg／ml的NB-DNJ處理的細胞沒有產(chǎn)生可測的毒性。經(jīng)50μg／ml NN-DNJ處理導致單層細胞呈現(xiàn)“脅迫的”的外觀，盡管通過活性染色并沒有觀測到毒害效果。
實驗結(jié)果表明NN-DNJ和NB-DNJ是高效的抗BVDV藥物。因為BVDV的感染是組織培養(yǎng)中與HCV感染最相關的模型，還因為BVDV和HCV在生化、病毒學和遺傳上非常相似，這些數(shù)據(jù)充分表明NN-DNJ和NB-DNJ也是高效的抗HCV的藥物。
實施例3NB-DGJ抑制神經(jīng)酰胺特異性葡糖基轉(zhuǎn)移酶的對照檢測MDBK細胞在14C-軟脂酸N-丁基-deoxygalactojirimycin存在下生長至鋪滿。細胞用PBS洗滌三次，從培養(yǎng)瓶上刮下細胞，并用氯仿∶甲醇(2∶1，V／V)于4℃抽提過夜。保存初次抽提液并再加入0．5ml氯仿∶甲醇(2∶1，V／V)于室溫抽提三個小時。合并抽提液并取小份進行閃爍計數(shù)。將樣品調(diào)整到200000cpm，氮氣下干燥，然后懸浮于10μl的氯仿∶甲醇(2∶1，V／V)中，經(jīng)TLC(氯仿∶甲醇(2∶1，V／V)進行分離。放射性標記的脂質(zhì)通過熒光照相術進行檢測，觀察到的劑量依賴性的Glc-神經(jīng)酰胺和神經(jīng)節(jié)苷脂的降低(數(shù)據(jù)未發(fā)表)表明在沒有抗病毒效果的濃度下神經(jīng)酰胺特異性葡萄轉(zhuǎn)移酶被抑制。
實施例4DMJ抑制復合糖的形成的對照檢測MDBK細胞在缺乏或含有300μg／ml DGJ的情況下生長三天。用識別GalβGalNAc表位的雞冠刺桐(ECA)的凝集素(28μg／ml和280μg／ml)將細胞染色，并經(jīng)FACS進行分析。在較低的凝集素濃度下，染色強度的改變表明凝集素可得的的結(jié)合部位(即復合聚糖)減少。在較高凝集素濃度下，存在DMJ可以使細胞免于因與凝集素結(jié)合而死亡，結(jié)果見圖4。
實施例5感染后的、經(jīng)NB-DNJ處理的細胞胞內(nèi)和胞外病毒物質(zhì)的感染性未感染的(A)和BVDV-感染的(B和C)MDBK細胞在缺少(A和B)或存在(C)1mg／ml的NB-DNJ的情況下生長2或3天。保存上清并將細胞洗滌，經(jīng)凍融裂解。進行產(chǎn)量檢測以便確定上清(S／N)和細胞裂解物中的噬菌斑形成單位(PFU)。結(jié)果示于圖5。
實施例6
用NB-DNJ或NN-DNJ處理感染細胞后的BVDV的反彈已感染的MDBK細胞(500pfu／孔)在有(A)1mg／ml的N-丁基-DNJ或(B)30μg／ml的N-壬基-DNJ的情況下培養(yǎng)兩天。移去含有藥物的培養(yǎng)基并換上無藥物(減藥)或含藥物(加藥)的培養(yǎng)基。定時從培養(yǎng)基中取樣，通過噬菌斑減少和產(chǎn)量檢測對感染性物質(zhì)進行檢測，結(jié)果見圖6。
實施例7不同細胞類型對放射性標記的抑制劑的吸收MDBK和HepG2細胞在12孔板中生長直至鋪滿，并在有C14-NB-DNJ和H3-NN-DNJ(100000cpm／孔)的情況下培養(yǎng)指定時間，移取上清并予以保存。細胞經(jīng)PBS(2×500μl)洗滌，用500μl冰預冷的10％高氯酸／2％磷鎢酸固定，用冰預冷的乙醇洗滌兩次并風干。使用500μl0．5M NaOH在室溫下過夜裂解細胞。通過液體閃爍計數(shù)來計算上清、PBS洗液和裂解細胞中放射活性的百分比。結(jié)果見圖7。
實施例8N-[3H]N-DNJ的制備在有1mol當量的氰硼[3H]氫化鈉(Amersham，10Ci／mmol)的情況下用壬醛(1．2mol當量)將DNJ(61μmol)在室溫還原胺化三個小時。通過陽離子交換和反相高效液相色譜(HPLC)從反應體系中純化氚標記的NN-DNJ。該產(chǎn)品是大于95％的HPLC放射性純的，通過質(zhì)譜和1H-NMR驗證化合物的結(jié)構(gòu)。比活為145mCi／mmol。
實施例9
放射性標記的亞氨基糖在器官中的分布放射性標記的NN-DNJ和NB-DNJ在真空下干燥，重懸于全鼠血清(Becton Dickenson)并在冰上超聲處理一分鐘。用0．2μm的濾器過濾懸浮液，在濾液中回收放射性物質(zhì)，通?；厥章蕿?8％-95％。通過口腔管飼法將濾液給Balbc鼠用藥(1-3μCi一只鼠)，30、60、90分鐘后將鼠用頸脫位法處死并摘取器官。將器官稱重并用Ultra-Turrax勻漿器在水中以濃度0．2-0．4g／ml進行勻漿，取小份測定放射性。結(jié)果見圖8。
實施例10用N-壬基-1，5-亞胺基-D-葡糖醇治療Gaucher氏病用N-壬基-1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-葡糖醇(N-壬基-DNJ)通過口服或非腸道地給藥治療患有Gaucher’s病的個體，該病臨床上通過脾腫大和伴有在網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞中異常葡糖腦苷脂累積的典型的網(wǎng)狀細胞增生進行診斷。劑量從基礎水平的10mg／kg／天慢慢提高到可觀察到治療效果，臨床癥狀的改善或經(jīng)活組織檢查發(fā)現(xiàn)網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞內(nèi)的葡糖腦苷脂減少表明治療效果。根據(jù)患者的臨床反應取消或重新開始用N-壬基-DNJ進行治療。
文中引用的每篇和所有專利、專利申請以及公開出版物此處全文引入作為參考。盡管參考具體實施方案已公開了本發(fā)明，但很顯然本領域技術人員可以在不脫離本發(fā)明的實際精神和范圍的情況下提出發(fā)明的其他實施方案和變化。附錄的權利要求書應解釋為包括所有這些實施方案和等同變化。
權利要求
1．有效量葡糖苷酶抑制劑、葡糖基轉(zhuǎn)移酶抑制劑或破壞蛋白折疊的試劑在制備抑制病毒產(chǎn)生的藥物中的用途，所述病毒在位于受感染宿主細胞的胞內(nèi)膜中的酶合作下進行復制。
2．有效抗葡糖苷酶或抗葡糖基轉(zhuǎn)移酶量的1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-D-葡糖醇衍生物在制備抑制病毒產(chǎn)生的藥物中的用途，所述病毒在受感染宿主細胞的胞內(nèi)膜中的酶協(xié)助下進行復制，所述衍生物有如下通式 其中R1選自下列基團(m)氫；(n)烷基；(o)鏈烯基；(p)烷氧基；(q)?；?r)芳基；(s)芳烷基；(t)芳酰基；和(u)芳烷氧基；和(v)雜環(huán)基和R3，R4和R5可以相同或不同，選自下列基團(w)酰基；和(x)芳?；缓蚏6是氫、或烷基、鏈烯基、?；⒎减；头纪榛鶊F，其中所述烷基和鏈烯基基團是線型或分枝的，取代或非取代的，所述鏈烯基有1到6個雙鍵；所述?；碗s環(huán)基任選被鹵素、羥基、C1-10烷基、C1-10亞烷基、C1-10酰基和C1-10烷氧基取代；和所述化合物的對映異構(gòu)體或立體異構(gòu)體，和所述化合物、對映異構(gòu)體或立體異構(gòu)體的生理上可接受的鹽或溶劑化物。
3．權利要求2的用途，其中所述1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-D-葡糖醇衍生物在R1上被一個烷基基團所取代。
4．權利要求3的用途，其中所述1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-D-葡糖醇衍生物有如下通式
5．權利要求4的用途，其中所述1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-D-葡糖醇衍生物在R3、R4、R5和R6位上被氫取代。
6．權利要求2的用途，其中所述1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-D-葡糖醇衍生物有如下通式
7．權利要求6的用途，其中所述1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-D-葡糖醇在R3、R4、R5和R6位上被氫取代。
8．權利要求1-7的用途，其中在R3、R4和R5至少有一個是?；?br> 9．權利要求2的用途，其中將1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-D-葡糖醇衍生物給藥給哺乳動物宿主細胞。
10．權利要求9的用途，其中將1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-D-葡糖醇衍生物給藥給人類宿主細胞。
11．權利要求2的用途，其中將1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-D-葡糖醇衍生物在體內(nèi)給藥給所述的宿主細胞。
13．權利要求2的用途，其中所述宿主細胞被屬于黃病毒類的一種病毒感染。
14．權利要求12的用途，其中在宿主細胞內(nèi)的黃病毒選自黃熱病毒、登革病毒1-4、日本腦炎病毒、墨累溪谷腦炎病毒、Rocio病毒、西尼羅熱病毒、圣·路易腦炎病毒、蜱傳腦炎病毒、羊跳躍病病毒、波瓦生病毒，鄂木斯克出血熱病毒和Kyasanur森林出血熱病毒。
15．權利要求12的用途，其中所述宿主細胞被丙型肝炎病毒感染。
16．權利要求2的用途，其中所述宿主細胞被屬于瘟病毒類的一種病毒感染。
17．權利要求2的用途，其中所述宿主細胞被在其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或環(huán)繞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的膜協(xié)助下復制至少部分其病毒結(jié)構(gòu)的病毒所感染。
18．權利要求2的用途，其中所述宿主細胞被在其高爾基體或高爾基體的腔膜協(xié)助下復制至少部分其病毒結(jié)構(gòu)的病毒所感染。
19．有效量1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-D-葡糖醇的N-烷基衍生物在制備藥物中的用途，所述藥物用于將抗葡糖苷酶或抗葡糖基轉(zhuǎn)移酶的藥劑遞送給需要其的脊椎動物的肝細胞。
20．有效抗葡糖苷酶或抗葡糖基轉(zhuǎn)移酶量的1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-D-葡糖醇的衍生物在制備治療牛病毒性腹瀉病毒感染的細胞的藥物中的用途，其中所述衍生物選自N-烷基、N-?；-芳基、N-芳烷基和N-芳?；苌?。
21．權利要求19的用途，其中病毒感染的細胞是牛單核細胞。
22．有效抗病毒量動物細胞葡糖苷酶抑制劑在制備藥物中的用途，所述藥物用于保護被從動物細胞的內(nèi)膜獲得病毒組分的病毒感染的動物不會患上所述病毒感染留下的后遺癥之一的癌癥。
22．權利要求21的用途，其中所述葡糖苷酶抑制劑選自1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-D-葡糖醇及其衍生物。
23．有效的葡糖基轉(zhuǎn)移酶抑制量的N-壬基-1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-D-葡萄糖醇在制備治療動物溶酶體脂類存儲疾病的藥物中的用途。
24．權利要求24的用途，其中所述動物患有Tay-Sach氏病、Gaucher氏病、Krabbe氏病或Fabry氏病。
全文摘要
利用抑制宿主細胞葡糖苷酶或葡糖基轉(zhuǎn)移酶的化合物來抑制宿主細胞膜芽生病毒的形態(tài)發(fā)生和由此導致的感染的方法。利用抑制葡糖基轉(zhuǎn)移酶的化合物來治療脂類存儲疾病的方法。
文檔編號A61K31/445GK1290168SQ98813042
公開日2001年4月4日 申請日期1998年12月10日 優(yōu)先權日1997年12月11日
發(fā)明者B·S·布隆伯格, T·M·布羅克, R·A·德威克, A·密塔, F·普拉特, T·D·布特斯, N·澤茨曼 申請人:牛津大學院長校長專家委員會, 托馬斯杰斐遜大學, B·S·布隆伯格