治療或預防風濕性疾病的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于治療風濕性疾病的方法，所述方法包括施用富含STRO-1+細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。
【專利說明】治療或預防風濕性疾病的方法
[0001]相關(guān)申請數(shù)據(jù)
[0002]本發(fā)明要求于2012年7月4日提交的名稱為“治療或預防風濕性疾病的方法”的澳大利亞專利申請?zhí)?011902655的優(yōu)先權(quán)。所述申請的全部內(nèi)容特此以引用的方式并入。
[0003]序列表
[0004]序列表是以電子表格的形式與本申請一起提交。所述序列表的全部內(nèi)容特此以引用的方式并入。
[0005]領(lǐng)域
[0006]本發(fā)明涉及用于治療或預防風濕性疾病的方法。
[0007]背景
[0008]風濕性疾病是通常被稱為“關(guān)節(jié)炎”的一類常見疾病，所述疾病經(jīng)常與自身免疫反應相關(guān)或由自身免疫反應引起。這類疾病包括類風濕性關(guān)節(jié)炎、脊椎關(guān)節(jié)病(例如，強直性脊椎炎)、斯耶格倫綜合征(Sjorgren Syndrome)(干燥綜合征(Sicca Syndrome))、萊特爾氏病(Reiter’ s disease)、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、腸道關(guān)節(jié)炎(與炎性腸病相關(guān)的關(guān)節(jié)問題)、骶髂關(guān)節(jié)炎或脊椎炎、以及骨關(guān)節(jié)炎。
[0009]根據(jù)疾病控制中心(⑶C)，僅在美國有近5千萬成人已經(jīng)被診斷具有一些形式的關(guān)節(jié)炎。預測到2030年，這一數(shù)目會增加至6700萬成人。CDC估計在美國關(guān)節(jié)炎的成本為大約US$808億的關(guān) 節(jié)炎治療成本和大約US$470億的間接成本(例如，失去收入)?？偝杀?1278億是2003年美國國內(nèi)生產(chǎn)總值的1.2%。
[0010]類風濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎
[0011]類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是痛苦的慢性全身性疾病，其特征為嚴重的滑膜炎癥，伴隨關(guān)節(jié)軟骨和骨的破壞。RA的臨床過程是可變的并且經(jīng)常顯示緩解模式，但如果是進行性的則不可避免地導致關(guān)節(jié)變形和功能受損?？梢詤^(qū)分三種形式的RA:輕度，自限性疾??；輕微進行性疾??；以及侵襲性疾病，侵襲性疾病難以用藥物進行控制并且其特征為關(guān)節(jié)的功能衰退和放射性退化，例如關(guān)節(jié)間隙變窄和軟骨侵蝕，特別是在增殖性發(fā)炎的滑膜下的，被稱為血管翳。根據(jù)疾病的全身性性質(zhì)，存在關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，包括血管炎、肺泡炎、以及眼病。文獻中報告的所述疾病的流行性為美國人口的大約1%，其中婦女占所有病例的三分之二。
[0012]RA的發(fā)病通常隱伏疲勞、厭食、全身乏力以及肌肉骨骼疼痛。具體癥狀隨后出現(xiàn)。一些通常呈對稱形式的關(guān)節(jié)受到影響。最經(jīng)常這些是手、腕、膝以及腳的關(guān)節(jié)。關(guān)節(jié)疼痛和腫脹，并且運動受到限制。超過一小時的晨僵是非常典型的發(fā)現(xiàn)。在持久性炎癥的情況下，發(fā)展多種變形，所述變形最典型包括手腕的橈偏和近端指節(jié)間關(guān)節(jié)的過伸或屈曲；也發(fā)生其它變形。骨骼肌的萎縮發(fā)生。在所有患者的大約20%至30%中，存在關(guān)節(jié)周圍結(jié)構(gòu)或創(chuàng)傷部位上的類風濕性結(jié)節(jié)的發(fā)展，但是它們通常具有有限的臨床意義。所述結(jié)節(jié)可以在其它結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)，如胸膜或腦膜。類風濕性血管炎可以影響幾乎所有器官系統(tǒng)(肺、胃腸道、肝、脾、胰腺、淋巴結(jié)、睪丸、以及眼)。
[0013]對于RA來說，不存在治愈性治療。所有藥物方案主要試圖緩解癥狀和炎癥。阿司匹林和其它起效快的非類固醇抗炎藥物(NSAID)是一線治療。如果必要的話，將口服和可注射糖皮質(zhì)激素添加至所述藥物方案。三線治療包括改善疾病的抗風濕藥物(DMARDs)；它們起效緩慢，在一些情況下達幾個月。DMARD包括硫唑嘌呤、柳氮磺胺吡啶、金、D-青霉胺、羥氯喹、甲氨蝶呤以及環(huán)孢霉素。最近添加生物藥物，如Enbrel?、Remicade?以及Humira::K;已經(jīng)提供了替代治療模式，然而這些產(chǎn)品的常規(guī)使用可能抑制免疫防御系統(tǒng)并且已與機會性感染和如結(jié)核病的疾病的增加的發(fā)生率相關(guān)。
[0014]骨關(guān)節(jié)炎(OA)是西方人群體中最常見的關(guān)節(jié)炎形式。臨床上以疼痛和功能性殘疾為特征的膝OA是美國老年人中慢性殘疾的主導原因。
[0015]病理上，OA中最顯著的變化是關(guān)節(jié)軟骨的局灶性缺失以及邊緣和中心新骨形成。然而，OA不單單是關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨疾病。反而，它是滑膜關(guān)節(jié)的疾病，其中還在滑膜、囊、韌帶、關(guān)節(jié)周圍肌肉以及感覺神經(jīng)中發(fā)現(xiàn)改變。
[0016]雖然OA—度被認為是非炎性關(guān)節(jié)病，但是患者經(jīng)常表現(xiàn)出與局部炎癥和滑膜炎一致的病征和癥狀，并且來自臨床前和臨床研究的最新證據(jù)支持了炎癥和炎癥介質(zhì)在其病理生理學中的作用。
[0017]骨關(guān)節(jié)炎的當前治療包括非藥物療法、藥物療法、以及外科治療。非藥物治療包括鍛煉和減肥計劃、熱處理、以及輔助裝置或支撐件。對于膝OA來說，全范圍運動和強化鍛煉適用于減少損傷、改善功能以及關(guān)節(jié)保護。藥物包括鎮(zhèn)痛劑(例如，撲熱息痛)、為非選擇性環(huán)氧合酶(COX)抑制劑或選擇性C0X-2酶抑制劑的非類固醇抗炎藥物(NSAID)、關(guān)節(jié)內(nèi)注射的皮質(zhì)類固醇或透明質(zhì)酸、以及證實的或公認的改善疾病的骨關(guān)節(jié)炎藥物(DMOAD)。外科手術(shù)包括關(guān)節(jié)清創(chuàng)術(shù)和灌洗、以及最后的全膝關(guān)節(jié)成形術(shù)。
[0018]膝OA的最常使用 的藥物治療通常提供小于50%的疼痛緩解。例如，使用撲熱息痛、選擇性NSAID或非選擇性NSAID通常引起的膝OA疼痛的平均改善從使用100分(100-mm)視覺模擬量表的約70分的基線算起不超過30分。因此，在膝OA的疼痛管理方面存在相當大的改善空間。此外，沒有療法已經(jīng)被證明延遲結(jié)構(gòu)退化的進展。
[0019]強肓性脊椎炎
[0020]強直性脊椎炎(AS)是對患者功能、健康以及殘疾具有相當大的影響的慢性、進行性、炎性疾病。AS的流行性傳統(tǒng)上已經(jīng)被估計在0.1%至1.9%的范圍內(nèi)，其中受影響的男性比女性更多。作為中軸骨骼和大的外周關(guān)節(jié)的慢性疾病，AS引起炎性背痛和僵硬，并且它與其它皮膚、眼和腸的炎性疾病相關(guān)。在嚴重情況下，AS可能導致完全脊柱融合，從而引起極端身體限制。因此，仍然存在對安全且有效的AS治療的需要。
[0021]隨著疾病進展，患有AS的患者經(jīng)歷疼痛、關(guān)節(jié)僵硬、并且最終脊柱活動度的損失。這些臨床癥狀和隨后疾病進展導致健康相關(guān)生命質(zhì)量(HRQOL)方面的功能限制和損傷。
[0022]對于AS來說，不存在治愈。一般來說，治療包括嘗試使用藥物如NSAID、皮質(zhì)類固醇、以及DMARD來緩解疼痛和僵硬。
[0023]對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是清楚的是炎性關(guān)節(jié)疾病是對社會具有主要影響的一類致衰弱疾病。還需要用于這些疾病的治療劑。
[0024]概述
[0025]在本發(fā)明之前的工作中，諸位發(fā)明人尋求確定間充質(zhì)祖細胞(MPC)對風濕性疾病的作用。諸位發(fā)明人通常研究類風濕性關(guān)節(jié)炎的綿羊模型作為風濕性疾病的模型，因為許多這些疾病具有共同的特征，例如，自身免疫和關(guān)節(jié)中免疫細胞和炎性細胞因子的存在。諸位發(fā)明人已經(jīng)確定MPC有效降低關(guān)節(jié)炎的組織病理學指數(shù)，如，滑膜增生、基質(zhì)組織活化以及炎性細胞浸潤。此外，諸位發(fā)明人已經(jīng)展示了施用MPC降低促炎性細胞因子的水平，所述促炎性細胞因子如(例如)滑膜組織中的IL-6、TNFa、IL-17還有⑶14+細胞。諸位發(fā)明人考慮到降低這些細胞和細胞因子的水平的能力使得MPC(和/或它們的子代和/或由其分泌的可溶性因子)適合用于治療風濕性疾病，如，類風濕性關(guān)節(jié)炎和/或骨關(guān)節(jié)炎。
[0026]諸位發(fā)明人還確定MPC提供長期治療益處，其中細胞的單次注射的作用持續(xù)至少約30天。
[0027]諸位發(fā)明人已經(jīng)另外發(fā)現(xiàn)MPC或其子代遷移到風濕性疾病的病理學部位。這種遷移提供益處，因為它允許全身性施用所述細胞，這(例如)與將細胞施用到受試者的滑液中相比既容易又可以是更少困難和/或更小侵入性的。
[0028]通過標志物STR0-3的表達而分離的綿羊MPC在功能上等效于共表達標志物STR0-3和STR0-1的人MPC (如本文實施例2中所示)。
[0029]本發(fā)明因此提供一種用于治療或預防受試者中的風濕性疾病的方法，所述方法包括對受試者施用富含STRO-1細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。
[0030]在一個實施例中，所述風濕性疾病是自身免疫性風濕性疾病。
[0031]在一個實施例中，所述風濕性疾病選自由以下各項組成的組:類風濕性關(guān)節(jié)炎、斯蒂爾病(Still’s disease)(同義詞幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎或幼年類風濕性關(guān)節(jié)炎)、強制性脊椎炎、萊特爾氏病、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、腸道關(guān)節(jié)炎、骶髂關(guān)節(jié)炎、脊椎炎、以及骨關(guān)節(jié)炎。
[0032]在一個實施例 中，所述風濕性疾病是骨關(guān)節(jié)炎。
[0033]在示例性形式中，所述風濕性疾病是類風濕性關(guān)節(jié)炎。
[0034]在一個實施例中，所述方法包括施用富含STR0-1胃細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。
[0035]在一個實施例中，富含STRO-1細胞的群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子是全身性地施用的。例如，所述細胞是靜脈內(nèi)施用的。在這點上，諸位發(fā)明人已經(jīng)展示了STRO-1細胞和/或其子代遷移到受試者中發(fā)炎關(guān)節(jié)的部位。因此，本發(fā)明涵蓋在遠離受試者中發(fā)炎關(guān)節(jié)的部位施用STRO-1細胞和/或其子代。
[0036]在一個實施例中，所述STRO-1細胞和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子是以足以減少受試者中(例如，受試者的關(guān)節(jié)內(nèi)，如滑膜組織內(nèi))IL_6、TNFa、IL-17還有CD14+細胞的量施用。
[0037]細胞的示例性劑量包含0.1 X IO6至5X IO6之間個STRO-1細胞和/或其子代。例如，所述方法包括施用每千克0.3X IO6至2X IO6之間個STRO-1細胞和/或其子代。
[0038]在一個實施例中，所述細胞是以約0.3 X IO6個細胞/kg至約4 X IO6個細胞/kg之間、如約0.3X IO6個細胞/kg至2X IO6個細胞/kg之間的劑量施用。
[0039]所述方法的一種形式涉及施用低劑量的STRO-1細胞和/或其子代。這種低劑量是(例如)0.1 X IO5至約0.5 X IO6之間個STRO-1細胞/kg，如約0.3 X IO6個STRO-1細胞/kg。
[0040]在另一個實施例中，將高劑量的細胞施用至受試者。示例性劑量包含至少約
1.5X IO6個細胞/kg。例如，高劑量包含約1.5X IO6至約4X IO6之間個細胞/kg。例如，高劑量包含約1.5X IO6或約2X IO6個細胞/kg。諸位發(fā)明人已經(jīng)展示這類劑量(例如)通過降低IL-6、TNF α、IL-17、還有⑶14+細胞的水平來提供益處。
[0041]在一個實施例中,所述細胞是以約I億至3億個細胞的劑量施用，不考慮患者的體重。
[0042]在一個實施例中,所述細胞是以約I億至2億個細胞的劑量施用，不考慮患者的體重。
[0043]在一個實施例中,所述細胞是以約I億個細胞的劑量施用，不考慮患者的體重。
[0044]在一個實施例中,所述細胞是以約1.5億個細胞的劑量施用，不考慮患者的體重。
[0045]在一個實施例中,所述細胞是以約2億個細胞的劑量施用，不考慮患者的體重。
[0046]在一個實施例中,所述細胞是以約3億個細胞的劑量施用，不考慮患者的體重。
[0047]在一個實施例中，富含STRO-1+細胞的群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子是每周一次或以更低頻率、如每四周一次或以更低頻率施用。
[0048]本發(fā)明還涵蓋多次施用所述細胞和/或可溶性因子。例如，這種方法可以涉及施用所述細胞和監(jiān)測受試者以便確定炎性關(guān)節(jié)疾病的一種或多種癥狀發(fā)生或復發(fā)的時間，以及施用另一劑量的所述細胞和/或可溶性因子。用于評定風濕性疾病的癥狀的適合方法對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員將是清楚的和/或在本文中描述。
[0049]在另一個實施例中，細胞和/或可溶性因子根據(jù)固定時間表來施用，例如，每周或兩周或三周或四周或五周或六周或更長時間一次。
[0050]在一個實施例中，富含STRO-1+細胞的群和/或子代細胞是自體的或同種異體的和/或可溶性因子可以從自體或同種異體細胞得到。
[0051]在一個實施例中，富含STR0-1+細胞的群和/或子代細胞在施用之前和/或在獲得可溶性因子之前已培養(yǎng)擴增。
[0052]在一個實施例中，富含STRO-1+細胞的群是STR0-1氣和/或表達組織非特異性堿性磷酸酶(TNAP)和/或子代細胞和/或可溶性因子是從為STRO-1s的和/或表達TNAP的STRO-1+細胞得到。
[0053]在一個實施例中，STRO-1+細胞和/或其子代細胞和/或由其得到的可溶性因子是以包含所述STRO-1+細胞和/或其子代細胞和/或由其得到的可溶性因子和載體和/或賦形劑的組合物的形式來施用。
[0054]在一個實施例中，STRO-1+細胞和/或其子代細胞和/或由其得到的可溶性因子與另一種化合物一起施用用于治療或預防風濕性疾病。在一個實施例中，所述另一化合物是改善疾病的抗風濕藥物(DMARD)。在一個實施例中，所述DMARD選自由以下各項組成的組:輕氯喹、柳氮磺胺吡啶、甲氨蝶呤、來氟米特、硫唑嘌呤、D-青霉胺、金鹽、米諾環(huán)素、環(huán)孢霉素以及TNF抑制劑。
[0055]在一個實施例中，所述DMARD選自由以下各項組成的組:硫唑嘌呤、氯喹、羥氯喹、來氟米特、甲氨蝶呤以及柳氮磺胺吡啶。在一個實施例中，所述DMARD是甲氨蝶呤。
[0056]在另一個實施例中，所述DMARD是抗TNF抗體(例如，英夫利昔單抗、戈利木單抗或阿達木單抗)或可溶性TNF受體(例如，依那西普)。
[0057]在一個實施例中，STRO-1+細胞和/或其子代細胞和/或由其得到的可溶性因子與B細胞耗竭劑一起施用。在一個實施例中，所述B細胞耗竭劑是抗CD20抗體，如利妥昔單抗或奧法木單抗。[0058]在一個實施例中，將STRO-1+細胞和/或其子代細胞和/或由其得到的可溶性因子施用至患有類風濕性關(guān)節(jié)炎并且接受甲氨蝶呤治療的受試者。
[0059]在一個實施例中，STRO-1+細胞和/或其子代細胞和/或由其得到的可溶性因子是作為甲氨蝶呤療法的輔助和/或伴隨療法施用。
[0060]在一個實施例中，受試者患有中度活動性類風濕性關(guān)節(jié)炎或重度活動性類風濕性關(guān)節(jié)炎或中度至重度活動性類風濕性關(guān)節(jié)炎。
[0061]在一個實施例中，將STRO-1+細胞和/或其子代細胞施用至患有類風濕性關(guān)節(jié)炎并且接受甲氨蝶呤治療的受試者，其中所述細胞是以約I X IO6至約3 X IO6個細胞/kg的劑
量施用。
[0062]在一個實施例中，將STRO-1+細胞和/或其子代細胞施用至患有類風濕性關(guān)節(jié)炎并且接受甲氨蝶呤治療的受試者，其中所述細胞是以約1.5 X IO6至約2 X IO6個細胞/kg的劑量施用。
[0063]在一個實施例中，將STRO-1+細胞和/或其子代細胞施用至患有類風濕性關(guān)節(jié)炎并且接受甲氨蝶呤治療的受試者，其中所述細胞是以約1.5X106個細胞/kg的劑量施用。
[0064]在一個實施例中，將STRO-1+細胞和/或其子代細胞施用至患有類風濕性關(guān)節(jié)炎并且接受甲氨蝶呤治療的受試者，其中所述細胞是以約2X IO6個細胞/kg的劑量施用。
[0065]在一個實施例中，將STRO-1+細胞和/或其子代細胞施用至患有類風濕性關(guān)節(jié)炎并且接受甲氨蝶呤治療的受試者，其中所述細胞是以(不考慮患者的體重)約I億個細胞至約3億之間個細胞、如(不考慮患者的體重)約I億個細胞至約2億之間個細胞的劑量施用。
[0066]在一個實施例中，STRO-1+細胞和/或其子代細胞是全身性(例如靜脈內(nèi))地施用。
[0067]因此，在一個實施例中，本發(fā)明提供一種用于治療或預防受試者中的骨關(guān)節(jié)炎的方法，所述方法包括向受試者靜脈內(nèi)(或全身性地)施用富含STRO-1+細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。示例性細胞、劑量以及組合治療在本文中進行描述并且將加以必要的變更以適用于本發(fā)明的實施例。
[0068]在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種用于治療或預防受試者中的類風濕性關(guān)節(jié)炎的方法，所述方法包括向受試者靜脈內(nèi)(或全身性地)施用富含STRO-1+細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。示例性細胞、劑量以及組合治療在本文中進行描述并且將加以必要的變更以適用于本發(fā)明的實施例。
[0069]本發(fā)明另外提供一種用于治療或預防受試者中的風濕性疾病的富含STRO-1+細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。
[0070]本發(fā)明另外提供富含STRO-1+細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子在制造用于治療或預防受試者中的風濕性疾病的藥物中的用途。
[0071]序列表注釋
[0072]SEQ ID NO: 1，用于擴增編碼GAPDH的核酸的寡核苷酸
[0073]SEQ ID NO: 2，用于擴增編碼GAPDH的核酸的寡核苷酸
[0074]SEQ ID NO:3，用于擴增編碼SDF-1的核酸的寡核苷酸
[0075]SEQ ID勵:4，用于擴增編碼30?_1的核酸的寡核苷酸[0076]SEQ ID NO:5，用于擴增編碼IL_1 β的核酸的寡核苷酸
[0077]SEQ ID Ν0:6，用于擴增編碼IL_1 β的核酸的寡核苷酸
[0078]SEQ ID NO: 7，用于擴增編碼FLT-1的核酸的寡核苷酸
[0079]SEQ ID Ν0:8，用于擴增編碼FLT-1的核酸的寡核苷酸
[0080]SEQ ID NO: 9，用于擴增編碼TNF-α的核酸的寡核苷酸
[0081]SEQ ID NO: 10，用于擴增編碼TNF-α的核酸的寡核苷酸
[0082]SEQ ID NO: 11，用于擴增編碼KDR的核酸的寡核苷酸
[0083]SEQ ID NO: 12，用于擴增編碼KDR的核酸的寡核苷酸
[0084]SEQ ID NO: 13，用于擴增編碼RANKL的核酸的寡核苷酸
[0085]SEQ ID NO: 14，用于擴增編碼RANKL的核酸的寡核苷酸
[0086]SEQ ID NO: 15，用于擴增編碼瘦蛋白的核酸的寡核苷酸
[0087]SEQ ID NO: 16，用于擴增編碼瘦蛋白的核酸的寡核苷酸
[0088]SEQ ID NO: 17，用于擴增編碼CBFA-1的核酸的寡核苷酸
[0089]SEQ ID NO: 18，用于擴增編碼CBFA-1的核酸的寡核苷酸
`[0090]SEQ ID NO: 19，用于擴增編碼PPAR Y 2的核酸的寡核苷酸
[0091]SEQ ID NO: 20，用于擴增編碼PPAR Y 2的核酸的寡核苷酸
[0092]SEQ ID NO:21，用于擴增編碼OCN的核酸的寡核苷酸
[0093]SEQ ID NO:22，用于擴增編碼OCN的核酸的寡核苷酸
[0094]SEQ ID NO: 23，用于擴增編碼MyoD的核酸的寡核苷酸
[0095]SEQ ID NO: 24，用于擴增編碼MyoD的核酸的寡核苷酸
[0096]SEQ ID NO:25，用于擴增編碼SMMHC的核酸的寡核苷酸
[0097]SEQ ID NO:26，用于擴增編碼SMMHC的核酸的寡核苷酸
[0098]SEQ ID NO: 27，用于擴增編碼GFAP的核酸的寡核苷酸
[0099]SEQ ID NO: 28，用于擴增編碼GFAP的核酸的寡核苷酸
[0100]SEQ ID NO:29，用于擴增編碼巢蛋白的核酸的寡核苷酸
[0101]SEQ ID NO:30，用于擴增編碼巢蛋白的核酸的寡核苷酸
[0102]SEQ ID NO:31，用于擴增編碼S0X9的核酸的寡核苷酸
[0103]SEQ ID NO:32，用于擴增編碼S0X9的核酸的寡核苷酸
[0104]SEQ ID Ν0:33，用于擴增編碼X型膠原的核酸的寡核苷酸
[0105]SEQ ID Ν0:34，用于擴增編碼X型膠原的核酸的寡核苷酸
[0106]SEQ ID NO:35，用于擴增編碼聚集蛋白聚糖的核酸的寡核苷酸
[0107]SEQ ID NO:36，用于擴增編碼聚集蛋白聚糖的核酸的寡核苷酸
[0108]附圖簡述
[0109]圖l.TNAP(STR0_3)和間充質(zhì)前體細胞標志物STR0-1胃在成人骨髓形核細胞(BMMNC)中的共表達。通過孵育MACS選擇的BMMNC并用與FITC偶合的山羊抗鼠類IgM抗體間接標記的STR0-1 (X軸)和用與PE偶合的山羊抗鼠類IgG間接標記的STR0-3mAb(鼠類IgGl) (y軸)進行雙色免疫熒光和流式細胞術(shù)。點陣直方圖表示以列表模式數(shù)據(jù)形式收集的5X IO4個事件。垂直線和水平線設(shè)定為小于用在相同條件下處理的同種型匹配對照抗體1B5 (IgG)和1A6.12 (IgM)獲得的平均熒光的1.0%的反應性水平。結(jié)果表明STRO-1s細胞的較小群體共表達TNAP (右上象限)，而其余STRO-1+細胞未能與STR0-3mAb反應。
[0110]圖2.經(jīng)培養(yǎng)和擴增的STR0-1 *MPC的STRO-1** STR0-1 ?子代的基因表達譜。通過胰蛋白酶/EDTA處理制備離體擴增的骨髓MPC的單細胞懸浮液。將細胞用STR0-1抗體染色，所述STR0-1抗體隨后通過與山羊抗鼠類IgM-異硫氰酸突光素一起孵育加以顯現(xiàn)。熒光活化細胞分選㈧后，由經(jīng)過純化的表達STR0-1 ^或STR0-1胃的細胞的群制備總細胞RNA。使用RNAzolB提取方法和標準程序，從各子群體分離總RNA并且用作cDNA合成的模板。使用如先前所描述的標準方案(Gronthos等J Cell Sc1.116:1827-1835，2003)通過PCR擴增評定各種轉(zhuǎn)錄物的表達。此研究中所用的引物組在表2中示出。擴增后，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳對各反應混合物進行分析，并且通過溴化乙錠染色進行觀測(B)。使用ImageQant軟件參考持家基因GAPDH的表達來評定各細胞標志物的相對基因表達(C)。
[0111]圖3.經(jīng)過培養(yǎng)和擴增的STR0-1+MPC的STR0-1胃子代表達高水平的SDF-1，STR0-1?子代不能。(A)使用FACS根據(jù)區(qū)域STR0-1胃和STR0-1 ?/s將通過MACS分離的STR0-1+BMMNC制備物劃分為不同的STR0-1子集。從各STR0-1子群體制備總RNA并且用于構(gòu)建STRO-1*消減雜交文庫(B-C)。復制已經(jīng)用由經(jīng)過STRO-1s消減cDNA轉(zhuǎn)化的細菌克隆擴增的代表性PCR產(chǎn)物點二印的硝化纖維素過濾器。所述過濾器接著用[32P]三磷酸脫氧胞苷(dCTP)標記的STR0-1*⑶抑或STR0-1 ?/s (C)消減cDNA探測。箭頭指示含有對應于人SDF-1的cDNA片段的I個克隆的差異表達。(D)逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)-PCR分析顯示由在培養(yǎng)前通過MACS/FACS新鮮分離的BMMNC STR0-1群體制備的總RNA中SDF-1和甘油醛_3_磷酸脫氫酶(GAPDH)轉(zhuǎn)錄物的相對表達。bp表示堿基對。
[0112]圖4是示出類風濕性關(guān)節(jié)炎的綿羊模型的跛行得分的圖示。得分如本文所述進行確定。
[0113]圖5是示出在試驗過程中來自個體綿羊的右(未受刺激的)跗關(guān)節(jié)和左(受刺激的)跗關(guān)節(jié)的滑液中的白細胞計數(shù)的圖示(如圖中所指示)。綿羊B1627和B4036用雞II型膠原進行免疫并且所有其它綿羊用牛II型膠原進行免疫。在較高反應者中，對照側(cè)中的白細胞濃度也升高，這指示全身性反應的可能性。
[0114]圖6是示出對照綿羊(n=7)和用牛II型膠原進行免疫的綿羊(n=5)的滑液中白細胞計數(shù)的圖示。數(shù)據(jù)示出平均值土標準誤差。
[0115]圖7A是示出來自用牛II型膠原免疫的5只綿羊的右(對照)跗關(guān)節(jié)和左(受刺激的)跗關(guān)節(jié)的滑液中的針對牛II型膠原的IgM(左側(cè)圖)和IgG(右側(cè)圖)抗體的水平的圖示?；涸诔跏济庖咧?2天尸檢時取得。在受刺激的跗關(guān)節(jié)中，IgM的水平升高4至8倍并且IgG的水平升高10至60倍。
[0116]圖7B是示出來自用雞II型膠原進行免疫的2只綿羊的右(對照)跗關(guān)節(jié)和左(受刺激的)跗關(guān)節(jié)的滑液中的針對雞II型膠原的IgM(左側(cè)圖)和IgG(右側(cè)圖)抗體的水平的圖示?；涸诔跏济庖咧?2天尸檢時取得。在受刺激的跗關(guān)節(jié)中，IgM的水平升高3至5倍并且IgG的 水平升高2-8X 106倍。
[0117]圖8A示出來自所有組的左跗關(guān)節(jié)的滑膜的總組織病理學得分和單個組織病理學得分(增生、基質(zhì)活化、炎性細胞浸潤)。方差分析(Anova) =ρ〈0.04 ;ρ來自Mann-Whitney檢驗。
[0118]圖SB示出來自所有IV注射組的右跗關(guān)節(jié)的滑膜的總組織病理學得分和單個組織病理學得分。
[0119]圖SC示出來自關(guān)節(jié)內(nèi)注射(IA)鹽水或MPC的組的滑膜的總組織病理學得分和單個組織病理學得分。
[0120]圖9A 示出 CD14 評分系統(tǒng)(如 Mo 等，J Rheumatol.38:2301 - 2308, 2011 中所描述的內(nèi)膜評分方案)。
[0121]圖9B示出應用于CD4、CD8、Y - δ TCR、CD79a以及Ki_67的離散細胞評分方案。
[0122]圖9C 示出應用于 VCAM-1、IL-6、IL_10、IL-1 β、IL_17、TNFa 以及間質(zhì) CD14 的細胞因子和粘附分子評分系統(tǒng)。
[0123]圖1OA示出對照組和注射MPC的組的左跗關(guān)節(jié)滑膜組織中的⑶4、⑶8、y-δ TCR以及⑶79a的平均值土 SD免疫組織學得分。
[0124]圖1OB示出對照組和注射MPC的組的左跗關(guān)節(jié)滑膜組織中的VCAM-內(nèi)膜、VCAM-間質(zhì)、Κ?67-內(nèi)膜以及Ki67-間質(zhì)的平均值土 SD免疫組織學得分。
[0125]圖1OC示出對照組和注射MPC的組的左跗關(guān)節(jié)滑膜組織中的IL-10-內(nèi)膜、IL-10-間質(zhì)、ILl β -內(nèi)膜以及ILl β -間質(zhì)的平均值土SD免疫組織學得分。
[0126]圖1OD示出IV鹽水對照組和注射MPC的組的滑膜內(nèi)膜和間質(zhì)組織的IL_6和TNF- α的滑膜免疫組織化學染色得分的平均值+SEM。所示的ρ值使用Mann-Whitney非參數(shù)t檢驗進行計算。
[0127]圖1OE示出針對鹽水對照組和注射MPC的組的⑶14陽性細胞的滑膜免疫組織化學間質(zhì)組織染色的平均值+SEM。所示的ρ值使用Mann-Whitney非參數(shù)t檢驗進行計算。
[0128]圖1OF示出針對鹽水對照組和注射MPC的組的IL-17的滑膜免疫組織化學間質(zhì)組織染色的平均值+SEM。所示的ρ值從使用Krushal-Wallis檢驗和Dunns事后檢驗的方差分析(ANOVA)得到。
[0129]圖1lA示出針對CD14細胞進行免疫染色的滑膜切片的顯微照片，其示出分配得分。放大倍數(shù)X 100。
[0130]圖1lB示出針對TNF-α進行免疫染色的滑膜切片的顯微照片，其示出分配得分。放大倍數(shù)X 100。
[0131]圖1lC示出顯示針對IL-6進行免疫染色的滑膜切片的顯微照片，其示出分配得分。放大倍數(shù)X 100。
[0132]圖1lD示出針對IL-17進行免疫染色的滑膜切片的顯微照片，其示出分配得分。放大倍數(shù)X 100。
[0133]圖1lE示出針對IL-10進行免疫染色的滑膜切片的顯微照片，其示出分配得分。放大倍數(shù)X 100。
[0134]詳述
[0135]通用技術(shù)和選定的定義
[0136]在本說明書中，除非另有特別說明或上下文另有要求，否則提及單個步驟、物質(zhì)的組合物、步驟的組或物質(zhì)組合物的組應視為包括那些步驟、物質(zhì)組合物、步驟的組或物質(zhì)組合物的組中的一個或多個(即，一個或多個)。
[0137]除非另有特別聲明，否則本文描述的每個實施方案或?qū)嵤├谧鞅匾男薷牡那闆r下適用于每一個其它實施方案。[0138]本領(lǐng)域的技術(shù)人員應了解，本文所述的本發(fā)明容許具體描述的內(nèi)容以外的變化和修改。應理解，本發(fā)明包括所有這些變化和修改。本發(fā)明還包括在本說明書中個別地或共同地提及或指示的所有的步驟、特征、組合物和化合物，以及所述步驟或特征的任何和所有組合或其任何兩者或多者。
[0139]本發(fā)明在范圍上不受本文所述的具體實施方案限制，所述具體實施方案意圖僅是用于示例的目的。功能上等同的產(chǎn)物、組合物以及方法顯然在如本文所述的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0140]除非另有指示，否則在不進行過度實驗的情況下使用分子生物學、微生物學、病毒學、重組DNA技術(shù)、溶液相肽合成、固相肽合成以及免疫學的常規(guī)技術(shù)來執(zhí)行本發(fā)明。所述程序描述于以下文獻中，例如Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis，MolecularCloning:ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories, New York，第二片反(1989)，卷 1、II 以及 III 全部；DNA Cloning: A Practical Approach，卷 I 和 II (D.N.Glover編著，1985)，IRL Press，Oxford，全文；Oligonucleotide Synthesis:A PracticalApproach (M.J.Gait 編著，1984) IRL Press，Oxford，全文，以及尤其是其中 Gait 的論文，第 1-22 頁；Atkinson 等，第 35-81 頁；Sproat 等第 83-115 頁；以及 Wu 等，第 135-151頁；4.Nucleic Acid Hybridization:A Practical Approach (B.D.Hames 和 S.J.Higgins編著，1985) IRL Press，Oxford，全文；Immobilized Cells and Enzymes:A PracticalApproach (1986) IRLPress，Oxford，全文；Perbal，B.，A Practical Guide to MolecularCloning (1984) ；Methods In Enzymology (S.Colowick 和 N.Kaplan 編著,AcademicPress，Inc.)，全系列；J.F.Ramalho Ortigao，〃The Chemistry ofPeptide Synthesis〃見:Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website (Interactiva,德國)；Sakakibara，D.，Teichmanj J.，Lien, E.Land Fenichelj R.L (1976).Biochem.Biophys.Res.Commun.73336-342 ；Merrif ield, R.B.(1963).J.Am.Chem.Soc.85，2149-2154 ；Baranyj G.和 Merrifield，R.B.(1979)見 The Peptides (Gross, E.和 Meienhofer，J.編著)，卷.2，第 1-284 頁，Academic Press, New Yorkl2.Wiinschj E.編著(1974) Synthese von Peptidenin Houben-WeylsMetoden der Organischen Chemie (Miller, E.編著)，卷 15，第 4 版，第I 和 2 部分，Thieme，Stuttgart ;Bodanszky，Μ.(1984) Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlagj Heidelberg ；Bodanszky, M.和 Bodanszky，A.(1984)The Practice ofPeptide Synthesis, Springer-Verlagj Heidelberg ；Bodanszky, M.(1985) Int.J.PeptideProtein Res.25，449-474 ;Handbook of Experimental Immunology,卷 1-1V (D.M.Weir和 C.C.Blackwell 編著，1986，Blackwell Scientific Publications);以及 Animal CellCulture: Practical Approach,第 3 版(John R.W.Masters 編著，2000)，ISBN0199637970，全文。
[0141]在本說明書中，除非全文另有要求，否則詞語“包括(comprise)，或變化形式如“包括(comprises) ”或“包括(comprising) ”，將被理解為意指包括所述步驟或要素或整數(shù)或者步驟或要素或整體的組，但是不排除任何其它的步驟或要素或整數(shù)或者要素或整數(shù)的組。
[0142]如本文中所用的，術(shù)語“來源于”應意味指示指定的整數(shù)可從特定的來源來獲得，即使不一定直接來自該來源。在由STRO-1~細胞和/或其子代細胞得到的可溶性因子的上下文中，這個術(shù)語應意味一種或多種因子，例如蛋白質(zhì)、肽、碳水化合物等等是在體外培養(yǎng) STR0-1+細胞和/或其子代細胞期間產(chǎn)生。
[0143]如本文中所用的，術(shù)語“風濕性疾病”應被理解為意指以受試者中至少一個關(guān)節(jié)中 的炎癥反應為特征的任何疾病。在一個實施例中，所述風濕性疾病是由自身免疫性病狀引 起或與自身免疫性病狀相關(guān)。示例性風濕性疾病是本領(lǐng)域已知的和/或在本文加以描述。
[0144]如本文中所用的，術(shù)語“有效量”應被理解為意指足以減少受試者關(guān)節(jié)中的引起 風濕性疾病或與風濕性疾病相關(guān)的炎癥和/或炎性細胞的數(shù)目和/或炎性細胞因子的 STR0-1+細胞和/或其子代細胞和/或由其得到的可溶性因子的量。
[0145]如本文中所用的，術(shù)語“治療有效量”應被理解為意指足以減少或抑制風濕性疾病 的一種或多種癥狀的STR0-1+細胞和/或其子代細胞和/或由其得到的可溶性因子的量。
[0146]如本文中所用的，術(shù)語術(shù)語“預防有效量”應被理解為意指足以預防或抑制或延遲 炎性關(guān)節(jié)疾病的一種或多種可檢測的癥狀的發(fā)作的STR0-1+細胞和/或其子代細胞和/或 由其得到的可溶性因子的量。
[0147]如本文中所用的，術(shù)語“低劑量”應被理解為意指小于1 X 106個細胞/kg、但仍然 足以減少受試者關(guān)節(jié)中的炎癥和/或炎性細胞因子和/或炎性細胞的數(shù)目的STR0-1+細胞 和/或其子代的量。例如，低劑量包含每千克0. 5X106個或更少的細胞，或0. 4X106個或 更少的細胞或0. 3X106個或更少的細胞或0. 1X106個或更少的細胞。
[0148]如本文中所用的，術(shù)語“高劑量”應被理解為意指足以減少受試者中（例如，受試 者的關(guān)節(jié)內(nèi)，如滑膜組織內(nèi)）的IL-6、TNFa、IL-17還有CD14+細胞的STR0-1+細胞和/或 其子代的量，如多于1.5X106個細胞/kg。例如，高劑量包含約1.5X106至約4X106之間 個細胞/kg。例如，高劑量包含約1.5父106或約2父106/1^。
[0149]如本文中所用的，術(shù)語“治療（treat) ”或“治療（treatment) ”或“治療 (treating) ”應被理解為意指施用治療有效量的可溶性因子和/或細胞并且減少或抑制炎 性關(guān)節(jié)疾病的至少一種癥狀。
[0150]如本文中所用的的，術(shù)語“預防（prevent) ”或“預防（preventing) ”或“預防 (prevention) ”應被理解為意指施用預防有效量的可溶性因子和/或細胞并且停止或阻止 或延遲炎性關(guān)節(jié)疾病的發(fā)展或進展。
[0151]如本文中所用的，術(shù)語“可溶性因子”應被理解為意指可溶于水的由STR0-1+細胞 和/或其子代產(chǎn)生的任何分子，例如，蛋白質(zhì)、肽、糖蛋白、糖肽、脂蛋白、脂肽、碳水化合物 等。所述可溶性因子可以在細胞內(nèi)和/或由細胞分泌。所述可溶性因子可以是復雜混合物 (例如，上清液）和/或其組分和/或可以是純化的因子。在本發(fā)明的一個實施例中，可溶 性因子是上清液或是含于上清液內(nèi)。因此，本文涉及施用一種或多種可溶性因子的任何實 施例應被理解為在作了必要的修改的情況下適用于施用上清液。
[0152]如本文中所用的，術(shù)語“上清液”是指在適合的培養(yǎng)基（如，液體培養(yǎng)基）中體外 培養(yǎng)間充質(zhì)前體細胞和/或其子代細胞后產(chǎn)生的非細胞物質(zhì)。通常，上清液是通過在適合 的條件和時間下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，隨后通過如離心的過程移除細胞物質(zhì)后所產(chǎn)生。在 施用之前，上清液可能會或可能不會經(jīng)受進一步純化步驟。在一個實施例中，上清液包含少 于105個，如少于104個，例如少于103個以及例如無活細胞。
[0153]如本文中所用的，術(shù)語“正常或健康受試者”應被理解為意指如通過本領(lǐng)域已知和/或本文所述的任何方法所評定的未患炎性關(guān)節(jié)疾病的受試者。
[0154]如本文中所用的，術(shù)語“受試者”將理解為意指包括人類的任何動物，如哺乳動物。示例性受試者包括但不限于人類、靈長類、家畜(例如棉羊、牛、馬、驢、豬)、伴侶動物(例如狗、貓)、實驗室試驗動物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠、倉鼠)、捕獲的野生動物(例如狐貍、鹿)。在一個實施例中，哺乳動物是人或靈長類。在一個實施例中，哺乳動物是人。在一個實施例中，以下受試者符合治療的條件:所述受試者正在經(jīng)歷或已經(jīng)經(jīng)歷炎性關(guān)節(jié)疾病的一種或多種體征、癥狀、或其它指標，已經(jīng)被診斷患有炎性關(guān)節(jié)損害(無論是例如新近診斷的或先前診斷的)并且現(xiàn)在正在經(jīng)歷復發(fā)或再發(fā)，或處于發(fā)展炎性關(guān)節(jié)損害的風險。
[0155]風濕性疾病
[0156]在本發(fā)明的一個實例中，風濕性疾病是炎性關(guān)節(jié)疾病。炎性關(guān)節(jié)疾病在本文以最廣泛的含義來使用，并且是指對一個或多個關(guān)節(jié)的任何部分(包括結(jié)締組織和軟骨)的損害或部分或完全破壞，其中損害包括任何原因的結(jié)構(gòu)和/或功能損害并且特征為關(guān)節(jié)中的炎癥，并且可能會或可能不引起關(guān)節(jié)疼痛/關(guān)節(jié)痛(arthalgia)。這種損害可以由以下任何病狀引起，如自身免疫性疾病如關(guān)節(jié)炎(例如，急性和慢性關(guān)節(jié)炎)、類風濕性關(guān)節(jié)炎包括幼發(fā)型類風濕性關(guān)節(jié)炎、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(JIA)、或幼年RA(JRA),和階段如類風濕性滑膜炎、痛風或痛風性關(guān)節(jié)炎、急性免疫性關(guān)節(jié)炎，慢性炎性關(guān)節(jié)炎、退行性關(guān)節(jié)炎、II型膠原誘導的關(guān)節(jié)、感染性關(guān)節(jié)炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎、萊姆關(guān)節(jié)炎、增殖性關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、斯蒂爾病、脊椎關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、慢性進行性關(guān)節(jié)炎(arthritis chronicaprogrediente)、變形性關(guān)節(jié)炎、慢性原發(fā)性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、反應性關(guān)節(jié)炎、絕經(jīng)期關(guān)節(jié)炎、雌激素耗竭關(guān)節(jié)炎、以及強直性脊椎炎/類風濕性脊椎炎，不同于RA的風濕性自身免疫性疾病，繼發(fā)于RA的顯著累及全身(包括但不限于血管炎、肺纖維化或費爾蒂氏綜合征(Felty's syndrome))、血清陰性脊椎關(guān)節(jié)病、萊姆病、混合性結(jié)締組織病、與膠原病相關(guān)的自身免疫性病癥。
[0157]在一個實施例中，技術(shù)人員將會`理解，炎性關(guān)節(jié)疾病不是單獨由(例如)過度使用或運動損傷或?qū)﹃P(guān)節(jié)的撞擊所引起的對軟骨或骨或關(guān)節(jié)的損傷，因為這些病狀不是疾病。
[0158]在一個實施例中，所述炎性關(guān)節(jié)疾病與自身免疫性疾病相關(guān)或由自身免疫性疾病引起?！白陨砻庖咝约膊　笔瞧鹨蛴诨蜥槍κ茉囌叩淖陨斫M織或器官或其共分離或表現(xiàn)或由其產(chǎn)生的病狀的疾病。在一個實施例中，所述炎性關(guān)節(jié)疾病是自身免疫性炎性關(guān)節(jié)疾病，如因受試者針對抗原具有免疫反應(在所述受試者的關(guān)節(jié)中發(fā)生)而引起。
[0159]在一個實施例中，所述炎性關(guān)節(jié)損害是由關(guān)節(jié)炎引起，如類風濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、強直性脊椎炎、或銀屑病性關(guān)節(jié)炎。
[0160]在一個實施例中，所述炎性關(guān)節(jié)疾病是類風濕性關(guān)節(jié)炎。
[0161]在一個實施例中，所述炎性關(guān)節(jié)疾病是骨關(guān)節(jié)炎。
[0162]出于本文的目的，關(guān)節(jié)是在具有圍繞和支撐它的部分的(脊椎動物如動物的)骨骼元件之間的接觸點，并且包括但不限于例如，髖、脊柱的椎骨之間的關(guān)節(jié)、脊柱與骨盆之間的關(guān)節(jié)(骶髂關(guān)節(jié))、其中腱和韌帶附接至骨的關(guān)節(jié)、肋骨與脊柱、肩、膝、腳、肘、手、手指、腳踝以及腳趾之間的關(guān)節(jié)，但尤其是手和腳中的關(guān)節(jié)。
[0163]用于檢測和/或診斷炎性關(guān)節(jié)疾病和/或監(jiān)測治療的功效和/或是否需要或推薦另外治療的方法對于熟練的業(yè)內(nèi)人士來說是顯而易見的。例如，在治療過程中比較基線與不同時間點之間的壓痛和腫脹關(guān)節(jié)的數(shù)目是用于評定關(guān)節(jié)狀態(tài)和對治療的反應的典型方式。在RA的美國風濕病學會(ACR)關(guān)節(jié)計數(shù)(Felson等Arthritis&Rheumatology38:727-735，1995)中，針對壓痛評定68個關(guān)節(jié)并且針對腫脹評定66個關(guān)節(jié)(沒有評定髖的腫脹)。在歐洲最初采用的疾病活動度評分(DAS)中，44或28個關(guān)節(jié)計數(shù)用于RA中。除關(guān)節(jié)計數(shù)外，ACR評估標準包括以下要素以便包括綜合得分:患者整體(在視覺模擬量表[VAS]上)、患者疼痛、醫(yī)師整體、健康評定問卷(HAQ ;功能測度)、急性期反應物(C反應蛋白或沉降速度)。ACR20反應將構(gòu)成壓痛和腫脹關(guān)節(jié)計數(shù)的20%改善和綜合標準中的其它5個要素中的至少3個的20%改善。ACR50和70反應表示這些要素的至少50%和70%改善。ACR系統(tǒng)僅表示變化，而DAS系統(tǒng)表示疾病活動度的當前狀態(tài)和變化二者。DAS評分系統(tǒng)使用來源于RA中的臨床試驗的加權(quán)數(shù)學公式。例如，DAS28是0.56(T28)+0.28 (SW28) +0.70 (LnESR) +0.014GH，其中T表示壓痛關(guān)節(jié)數(shù)目，Sff是腫脹關(guān)節(jié)數(shù)目，ESR是紅細胞沉降速度，并且GH是整體健康。DAS的不同值表示高或低疾病活動度以及緩和，并且變化和終點得分導致通過反應的程度(無、中度、良好)來分類患者。
[0164]如本文使用，“類風濕性關(guān)節(jié)炎”是指可以根據(jù)針對類風濕性關(guān)節(jié)炎的分類的2000年修訂的美國風濕病協(xié)會標準或任何類似標準來診斷的公認的疾病狀態(tài)。RA的生理指標包括，對稱關(guān)節(jié)腫脹，其是特征性的但不是在類風濕性關(guān)節(jié)炎中不變的。手的近端指間(PIP)關(guān)節(jié)和掌指(MCP)、腕、肘、膝、踝以及跖趾(MTP)關(guān)節(jié)的梭形腫脹是通常受影響的并且腫脹容易檢測到。被動運動時的疼痛是用于關(guān)節(jié)炎癥的最敏感的測試，并且炎癥和結(jié)構(gòu)變形經(jīng)常限制受影響的關(guān)節(jié)的運動范圍。典型的可見變化包括MCP關(guān)節(jié)處的手指的尺骨偏移、MCP和PIP關(guān)節(jié)的過伸或過屈、肘的屈曲攣縮、以及腕骨和腳趾的半脫位?；加蓄愶L濕性關(guān)節(jié)炎的受試者可能會或可能不對DMARD具有抗性，因為DMARD在治療癥狀中不是有效的或不是完全有效的。此外，所述受試者可能已經(jīng)經(jīng)歷由于毒性或功效不足所致的對用TNF抑制劑(如依那西普、英夫利昔單抗和/或阿達木單抗)(例如，一周兩次每次25mg的依那西普持續(xù)3個月，或至少4次輸 注3mg/kg的英夫利昔單抗)和/或抗-CD20療法(例如，利妥昔單抗)實施的先前或當前治療的不充分反應。
[0165]類風濕性關(guān)節(jié)炎還可以通過自身抗體例如，類風濕因子(結(jié)合IgG的抗體)和/或抗環(huán)瓜氨酸肽和/或異質(zhì)核內(nèi)核糖核蛋白A2 (RA33)和/或II型膠原和/或應激蛋白(例如，BiP或hsp90)和/或葡萄糖6-磷酸異構(gòu)酶(GPI)的存在來診斷。
[0166]“銀屑病性關(guān)節(jié)炎”或“PsA”是以皮膚的炎癥(銀屑病)和關(guān)節(jié)的炎癥(關(guān)節(jié)炎)為特征的慢性疾病。銀屑病的特征是皮膚炎癥的具有鱗狀物的斑快、隆起的紅色區(qū)域，并且經(jīng)常影響肘和膝的頂端、頭皮、肚臍、以及生殖器區(qū)域或肛門的周圍區(qū)域。大約10%的患有銀屑病的患者還發(fā)展有他們關(guān)節(jié)的相關(guān)炎癥?；加醒仔躁P(guān)節(jié)炎和銀屑病二者的患者被診斷為患有銀屑病性關(guān)節(jié)炎。銀屑病性關(guān)節(jié)炎是全身性風濕性疾病，其還可以引起遠離關(guān)節(jié)和皮膚的身體組織(如眼睛、心臟、肺、以及腎)中的炎癥。
[0167]“強直性脊椎炎”或“AS”是脊柱和骶髂關(guān)節(jié)的慢性炎癥的一種形式，所述骶髂關(guān)節(jié)位于下背部骶骨(在尾骨正上方的骨)與髂骨(上臀部的任一側(cè)上的骨)接觸的地方。這些區(qū)域中的慢性炎癥引起脊柱中和脊柱周圍的疼痛和僵硬。隨時間推移，慢性脊柱炎癥(脊椎炎)可能導致椎骨完全粘合在一起(融合)，這是被稱為關(guān)節(jié)強直的一個過程。關(guān)節(jié)強直導致脊柱的活動度損失。強直性脊椎炎還是全身性風濕性疾病，這意味著它會影響整個身體的其它組織。因此，它可能引起遠離脊柱的其它關(guān)節(jié)以及其它器官(如眼睛、心臟、肺、以及腎)中的炎癥或?qū)λ鼈兊膿p傷。
[0168]MPC或子代細胞，和由其得到的上清液或一種或多種可溶性因子
[0169]MPC為在骨髓、血液、牙髓細胞、脂肪組織、皮膚、脾、胰、腦、腎、肝、心臟、視網(wǎng)膜、腦、毛囊、腸、肺、淋巴結(jié)、胸腺、骨、韌帶、肌腱、骨骼肌、真皮以及骨膜中發(fā)現(xiàn)的細胞；并且能夠分化成生殖系，如中胚層和/或內(nèi)胚層和/或外胚層。
[0170]在一個實施例中，MPC是多能細胞，其能夠分化成大量細胞類型，包括但不限于脂肪組織、骨組織、軟骨組織、彈性組織、肌肉組織、以及纖維結(jié)締組織。這些細胞所進入的特定譜系決定和分化路徑取決于來自機械影響和/或內(nèi)源性生物活性因子(如生長因子、細胞因子)和/或由宿主組織建立的局部微環(huán)境條件的各種影響。為多能細胞的MPC因此是非造血祖細胞，其分裂產(chǎn)生子細胞，所述子細胞為干細胞或適時不可逆分化產(chǎn)生表型細胞的前體細胞。
[0171]MPC對于標志物STR0-1呈陽性(即MPC是STRO-1細胞)。
[0172]在一個實施例中，STRO-1細胞是從由受試者(例如欲治療的受試者或相關(guān)受試者或不相關(guān)受試者(無論是相同物種抑或不同物種))獲得的樣本富集而來。術(shù)語“富含”或其變形在本文中用于描述一種細胞群體，其中當與細胞的未處理群體(例如處于天然環(huán)境中的細胞)相比較時，一種特定細胞類型的比例或者多種特定細胞類型的比例增加。在一個實施例中，富含STRO-1細胞的群包含至少約0.1%或0.5%或1%或2%或5%或10%或15%或20%或25%或30%或50%或75%的STR0_l+_細胞。在這方面，術(shù)語“富含STRO-1細胞的細胞群”將被理解為為術(shù)語“包含X%STR01+細胞的細胞群”提供明確的支持，其中X%是本文列舉的百分比。在某些實施例中，STRO-1細胞可以形成無性系的集落，例如，CFU-F(成纖維細胞)或其亞群(例如50%或60%或70%或70%或90%或95%)可以具有這種活性。
[0173]在一個實施例中，細胞群是富含包含處于可選擇的形式的STRO-1細胞的細胞制齊?。在這方面，術(shù)語“可選擇的形式”將被理解為意指細胞表達允許選擇STRO-r細胞的標志物(例如，一種細胞表面標志物)。標志物可以是STR0-1，但不一定是。例如，如本文描述的和/或例證的，表達STR0-2和/或STR0-3 (TNAP)和/或STR0-4和/或VCAM-1和/或⑶146和/或3G5的細胞(例如MPC)也表達STR0-1 (并且可以是STR0-1 *)。因此，表明細胞是STRO-1并不一定意指細胞由STR0-1表達來選擇。在一個實施例中，細胞是基于至少表達STR0-3來選擇，例如，它們是STR0-3+(TNAP+)。
[0174]提及選擇細胞或其群不需要從特定的組織來源進行選擇。如本文描述的，STRO-1細胞可以是從種類繁多的來源中進行選擇或分離或富集的。也就是說，在某些實施例中，這些術(shù)語為從任何包含STRO-1細胞(例如，MPC)的組織或血管化組織或包含周細胞(例如STRO-1+周細胞)的組織或本文描述的組織中的任何一種或多種中進行選擇提供支持。
[0175]在一個實施例中，本發(fā)明中所使用的細胞表達一種或多種個別地或全體選自由以下組成的組的標志物:TNAP+、VCAM-1+、ΤΗΥ-1、STR0-2+、CD45+、CD146+、3G5+ 或其任何組合。
[0176]“個別地”指本發(fā)明獨立地涵蓋所述標志物或標志物組，以及雖然個別標志物或標志物組可能未獨立地在本文中列出，但隨附權(quán)利要求書仍可彼此獨立地和分開地定義所述標志物或標志物組。
[0177]“全體”指本發(fā)明涵蓋任何數(shù)量的所述標志物或肽組或其組合，以及雖然所述數(shù)量的標志物或標志物組或其組合可能未在本文中具體列出，但隨附權(quán)利要求書仍可將所述組合或子組合與標志物或標志物組的任何其它組合獨立地和分開地定義。
[0178]例如，STRO-1+細胞是STR0-1* (同義詞STR0-1亮)。在一個實施例中，相對于STR0-1 ?或STR0-1 細胞，Stro-1亮細胞優(yōu)先富集。
[0179]例如，STR0-1胃細胞另外是 TNAP+、VCAM-1+、ΤΗΥ-1+、STR0-2+ 和 / 或 CD146+ 中的一種或多種。例如，細胞是為一種或多種的前述標志物而選擇和/或顯示表達一種或多種前述標志物。在這方面，顯示表達標志物的細胞不需要被特別地測試，而是可以測試預先富集或分離的細胞并且隨后使用，可以合理地假設(shè)分離的或富集的細胞也表達同樣的標志物。
[0180]在一個實施例中，間充質(zhì)前體細胞是如W02004/85630中所定義的血管周圍間充質(zhì)前體細胞。例如，間充質(zhì)前體細胞表達血管周圍細胞的標志物，例如，所述細胞是STRO-1+或STR0-1胃和/或3G5+。在一個實施例中，所述細胞是或之前是從血管化組織或器官或其部分分離的細胞的子代。
[0181]對于指定標志物稱為“陽性”的細胞，其可能根據(jù)標志物存在于細胞表面上的程度而表達低(低或暗)或高(亮、亮)水平的所述標志物，其中所述術(shù)語涉及細胞分選過程中所用的熒光或其它標志物的強度。低(或暗或深)和亮的區(qū)別應放在所分選特定細胞群體上所用的標志物的情形中加以理解。對于指定標志物稱為“陰性”的細胞不一定完全不存在于所述細胞。所述術(shù)語指細胞表達所述標志物的水平相對極低，并且當在可檢測標記時產(chǎn)生極低信號或者在背景水平以上不可檢測，例如使用同種型對照抗體檢測到的水平。
[0182]當在本文中使用時，術(shù)語“亮”是指細胞表面上的標志物在可檢測標記時產(chǎn)生相對較高的信號。雖然不希望受理論限制，但提出“亮”細胞所表達的靶標志物蛋白(例如由STR0-1識別的抗原)比樣本中的其它細胞多。例如，當用綴合FITC的STR0-1抗體標記時，如通過熒光活化細胞分選(FACS)分析所測定的STRO-1s細胞產(chǎn)生比非亮細胞((STRO-1s7?)高的熒光信號。例如，“亮”細胞構(gòu)成起始樣本中所含的最亮標記的骨髓單核細胞的至少約0.1%。在其它實施例中，“亮”細胞構(gòu)成起始樣本中所含的最亮標記的骨髓單核細胞的至少約0.1%、至少約0.5%、至少約1%、至少約1.5%或至少約2%。在一個實施例中，STR0-1胃細胞的STR0-1表面表達相對于“背景”(即STR0-1-細胞)具有2個對數(shù)量級以上的表達。相比之下，STR0-1 @和/或STR0-1 細胞的STR0-1表面表達與“背景”相比具有小于2個對數(shù)量級的表達，通常與“背景”相比約I個對數(shù)以下。
[0183]如本文所用，術(shù)語“TNAP”意欲涵蓋組織非特異性堿性磷酸酶的所有亞型。例如，所述術(shù)語涵蓋肝亞型(LAP)、骨亞型(BAP)和腎亞型(KAP)。在一個實施例中，TNAP是BAP。在一個實施例中，如本文所用的TNAP是指可以結(jié)合由2005年12月19日根據(jù)布達佩斯條約(Budapest Treaty)的規(guī)定以保藏編號PTA-7282保藏于ATCC的雜交瘤細胞系產(chǎn)生的STR0-3抗體的分子。
[0184]此外，在一個實施例中，STRO-1+細胞能夠產(chǎn)生克隆CFU-F。
[0185]在一個實施例中，大比例的STRO-1+多能細胞優(yōu)選能夠分化成至少兩種不同生殖系。多能細胞可以發(fā)展成的譜系的非限制性實例包括骨前體細胞；肝細胞祖細胞，其具有膽道上皮細胞和肝細胞的多潛能；神經(jīng)限制細胞，其可以產(chǎn)生會發(fā)展成少突膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的神經(jīng)膠質(zhì)細胞前體；神經(jīng)元前體，其會發(fā)展出神經(jīng)元；心肌和心肌細胞、葡萄糖反應性胰島素分泌胰腺β細胞系的前體。其它譜系包括但不限于成牙質(zhì)細胞、牙質(zhì)產(chǎn)生細胞和軟骨細胞，以及以下的前體細胞:視網(wǎng)膜色素上皮細胞、成纖維細胞、皮膚細胞(如角化細胞)、樹突狀細胞、毛囊細胞、輸尿管上皮細胞、平滑肌和骨骼肌細胞、睪丸祖細胞、血管內(nèi)皮細胞、肌腱、韌帶、軟骨、脂肪細胞、成纖維細胞、骨髓基質(zhì)、心肌、平滑肌、骨骼肌、周細胞、血管、上皮、神經(jīng)膠質(zhì)、神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。
[0186]在另一個實施例中，STRO-1+細胞在培養(yǎng)時不能產(chǎn)生造血細胞。
[0187]在一個實施例中，細胞是取自欲治療的受試者，使用標準技術(shù)在體外培養(yǎng)并且用于獲得上清液或可溶性因子或擴增細胞以自體或同種異體組合物形式施用至受試者。在可選實施例中，使用一種或多種已建立的人細胞系的細胞。在本發(fā)明的另一適用實施例中，使用非人動物的細胞(或者如果患者不是人，而來自于另一物種)。
[0188]本發(fā)明還涵蓋使用由自體外培養(yǎng)物產(chǎn)生的STRO-1+細胞和/或其子代細胞(后者也稱為擴增細胞)獲得或得到的上清液或可溶性因子。本發(fā)明的擴增細胞根據(jù)培養(yǎng)條件(包括培養(yǎng)基中刺激因子的數(shù)量和/或類型)、傳代次數(shù)等可以具有多種表型。在某些實施例中，子代細胞是在從親本群體傳代約2次、約3次、約4次、約5次、約6次、約7次、約8次、約9次或約10次后獲得。然而，子代細胞可以在從親本群體傳代任何次后獲得。
[0189]子代細胞可以通過在任何適合培養(yǎng)基中培養(yǎng)而獲得。如本文在提及細胞培養(yǎng)時使用的術(shù)語“培養(yǎng)基”包括細胞周圍環(huán)境的組分。培養(yǎng)基可以是固體、液體、氣態(tài)或相和材料的混合物。培養(yǎng)基包括液體生長培養(yǎng)基以及不供養(yǎng)細胞生長的液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基也包括膠狀培養(yǎng)基，如瓊脂、瓊脂糖、明膠和膠原蛋白基質(zhì)。示例性氣態(tài)培養(yǎng)基包括在皮氏培養(yǎng)皿(petri dish)或其它固體或半固體支持物上生長的細胞所暴露的氣相。術(shù)語“培養(yǎng)基”也指意欲用于細胞培養(yǎng)中的材料，即使其尚未與細胞接觸。換句話說，制備用于細菌培養(yǎng)的富營養(yǎng)液體是培養(yǎng)基。當與水或其它液體混合時變得適于細胞培養(yǎng)的粉末混合物可稱為“粉狀培養(yǎng)基”。
[0190]在一個實施例中，適用于本發(fā)明方法的子代細胞是通過使用經(jīng)過STR0-3抗體標記的磁性珠粒從骨髓分離TNAP+STRO-1+細胞，并接著培養(yǎng)擴增所分離的細胞來獲得(關(guān)于適合培養(yǎng)條件的實例，請參見Gronthos等Blood85:929-940，1995)。
[0191]在一個實施例中，所述擴增細胞(子代)(例如，至少在5次傳代后)可以是TNAP_、CC9+、I 類 HLA+、II 類 HLA' CD14' CD19' CD3' CDllaV、CD31' CD86' CD3[和 / 或 CD80'然而，在與本文所述不同的培養(yǎng)條件下，不同標志物的表達有可能會變化。此外，雖然具有這些表型的細胞可以在擴增細胞群中占優(yōu)勢，但這并不意指較小比例的細胞不具有這一種或多種表型(例如，小百分比的擴增細胞可以是CC90。在一個實施例中，擴增細胞仍具有分化成不同細胞類型的能力。
[0192]在一個實施例中，用于獲得上清液或可溶性因子或細胞本身的擴增細胞群包含其中至少25%(例如至少50%)的細胞是CC9+的細胞。
[0193]在另一個實施例中，用于獲得上清液或可溶性因子或細胞本身的擴增細胞群包含其中至少40%(例如至少45%)的細胞是STRO-1+的細胞。
[0194]在另一實施例中，擴增細胞可表達一種或多種全體或個別地選自由以下組成的組的標志物:LFA-3、THY-1、VCAM-1、ICAM-1、PECAM-1、P-選擇蛋白、L-選擇蛋白、3G5、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD90、CD29、CD18、CD61、整聯(lián)蛋白 β 6-19、血栓調(diào)節(jié)蛋白、CD10、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、NGF-R、FGF-R、瘦素-R(STR0_2=瘦素-R)、RANKL, STRO-1胃和⑶146或這些標志物的任何組合。
[0195]在一個實施例中，子代細胞是如W02006/032092中所定義和/或所述的多能擴增STRO-1+多能細胞子代(MEMP)。制備可用于得到子代的STRO-1*多能細胞的富集群體的方法描述于W001/04268和W02004/085630中。在體外情形中，STRO-1*多能細胞極少以絕對純制備物形式存在，而是一般與作為組織特異性定向細胞(TSCC)的其它細胞一起存在。WOO1/04268提出以約0.1%至90%的純度水平從骨髓采集所述細胞。包含可得到子代的MPC的群體可直接從組織來源采集，或者其可為已在離體擴增的群體。
[0196]例如，子代可獲自大致上純化的STRO-1*多能細胞的已采集且未擴增的群體，其構(gòu)成其所存在的群體總細胞的至少約0.1%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或95%。此水平可以通過例如選擇對至少一種個別地或全體選自由TNAP、STR0-1氣3G5+、VCAM-1、THY-1、⑶146和STR0-2組成的組的標志物呈陽性的細胞來實現(xiàn)。
[0197]MEMPS與新鮮采集的STRO-1*多能細胞的區(qū)別之處可在于其對于標志物STR0-1胃呈陽性且對于標志物堿性磷酸酶(ALP)呈陰性。相比之下，新鮮分離的STRO-1*多能細胞對于STR0-1胃和ALP兩者都呈陽性。在本發(fā)明的一個實施例中，至少15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的所施用細胞具有表型STR0-1氣ALP'在另一實施例中，MEMPS對于標志物Ki67、CD44和/或⑶49c/⑶29、VLA-3、α 3 β I中的一種或多種呈陽性。在另一實施例中，MEMP不顯示TERT活性和/或?qū)τ跇酥疚铫?8呈陰性。
[0198]STRO-1*細胞起始群體可源自W001/04268或W02004/085630中所述的任一種或多種組織類型，即骨髓、牙髓細胞、脂肪組織和皮膚，或許更廣泛來說來自脂肪組織、牙齒、牙髓、皮膚、肝、腎、心臟、視網(wǎng)膜、腦、毛囊、腸、肺、脾、淋巴結(jié)、胸腺、胰、骨、韌帶、骨髓、肌腱和骨骼肌。
[0199]應理解，在進行本發(fā)明時，帶有任何指定細胞表面標志物的細胞的分離可以通過多種不同方法來實現(xiàn)，然而，示例性方法依賴于結(jié)合劑(例如，抗體或其抗原結(jié)合片段)與所關(guān)注的標志物的結(jié)合，隨后分離顯示結(jié)合(為高水平結(jié)合抑或低水平結(jié)合)或不結(jié)合的那些細胞。最適宜的結(jié)合劑為抗體或基于抗體的分子，其中示例性方法為單克隆抗體或是基于單克隆抗體，因為這些后者試劑具有特異性?？贵w在兩個步驟中都可以使用，然而也可以使用其它試劑，因此這些標志物的配體也可以用于富集帶有所述標志物或缺乏所述標志物的細胞。
[0200]抗體或配體可連接至固體支持物以允許粗分離。示例性分離技術(shù)最大程度地保持欲收集的部分的活力。具有不同功效的各種技術(shù)可用于獲得相對較粗的分離。所用特定技術(shù)將取決于分離效率、相關(guān)細胞毒性、執(zhí)行的容易性和速度，以及復雜設(shè)備和/或技術(shù)技能的必要性。分離程序可包括但不限于使用涂有抗體的磁性珠粒的磁性分離、親和色譜和利用連接至固體基質(zhì)的抗體的“淘選”。提供精確分離的技術(shù)包括但不限于FACS。執(zhí)行FACS的方法對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。
[0201]針對本文所述的各標志物的抗體可商購獲得(例如抗STR0-1的單克隆抗體可從R&D Systems, USA商購獲得)、從ATCC或其它保藏組織獲得和/或可使用業(yè)內(nèi)公認的技術(shù)產(chǎn)生。
[0202]用于分離STRO-1*細胞的示例性方法例如包括第一步驟，其為利用例如識別STR0-1的高水平表達 的磁性活化細胞分選(MACS)的固相分選步驟。接著必要時可進行第二分選步驟以得到更高水平的前體細胞表達，如專利說明書W001/14268中所述。此第二分選步驟可能涉及使用兩種或更多種標志物。
[0203]獲得STRO-1-細胞的方法還可能包括使用已知技術(shù)進行第一富集步驟之前采集細胞來源。因此，組織將以手術(shù)方式移除。接著將構(gòu)成來源組織的細胞分離為所謂單細胞懸浮液。此分離可以通過物理和或酶學方式達成。
[0204]一旦獲得了適合的STRO-1-細胞群體，就可以通過任何適合方式對其進行培養(yǎng)或擴增以獲得MEMP。
[0205]在一個實施例中，細胞是取自欲治療的受試者，使用標準技術(shù)在體外培養(yǎng)并且用于獲得上清液或可溶性因子或擴增細胞以自體或同種異體組合物形式施用至受試者。在可選實施例中，使用一種或多種已建立的人細胞系的細胞來獲得上清液或可溶性因子。在本發(fā)明的另一適用實施例中，使用非人動物的細胞(或者如果患者不是人，則來自另一物種)來獲得上清液或可溶性因子。
[0206]本發(fā)明可以使用來自任何非人動物物種的細胞加以實施，包括但不限于非人靈長類動物細胞、有蹄類動物、犬科動物、貓科動物、兔類動物、嚙齒動物、鳥類動物和魚類動物細胞?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明的靈長類動物細胞包括但不限于黑猩猩、狒狒、食蟹獼猴和任何其它新世界或舊世界猴類的細胞?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明的有蹄類動物細胞包括但不限于牛、豬、綿羊、山羊、馬、水牛和野牛的細胞?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明的嚙齒動物細胞包括但不限于小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠和沙鼠細胞。可用 于實施本發(fā)明的兔類動物物種的實施例包括家兔、長腿大野兔、野兔、棉尾兔、雪地兔和鼠兔。雞(原雞(Gallus galIus))為可用于實施本發(fā)明的鳥類物種的一個實例。
[0207]適用于本發(fā)明方法的細胞在使用前或獲得上清液或可溶性因子前可儲存。保藏和儲存真核細胞和尤其哺乳動物細胞的方法和方案在本領(lǐng)域中是已知的(參見例如 Pollard, J.W.和 Walker, J.M.(1997)Basic Cell Culture Protocols,第二版，Humana Press, Totowa, N.J.；Freshney, R.1.(2000)Culture of Animal Cells,第四版，ffiley-Liss, Hoboken, N.J.)。維持所分離的干細胞(如間充質(zhì)干細胞/祖細胞)或其子代的生物活性的任何方法都可以結(jié)合本發(fā)明來使用。在一個實施例中，通過使用低溫保藏來維持和儲存細胞。
[0208]遺傳修飾的細朐
[0209]在一個實施例中，對STRO-1-細胞和/或其子代細胞進行遺傳修飾，例如，以表達和/或分泌相關(guān)蛋白質(zhì)。例如，細胞被工程改造來表達在治療炎性關(guān)節(jié)疾病中有用的蛋白質(zhì)，如抗TNF抗體(例如，阿達木單抗或英夫利昔單抗)或抗CD20抗體(例如，利妥昔單抗或奧瑞珠單抗(ocreIizumab))或可溶性TNF受體(例如，依那西普)或適用于治療此類病狀的肽(例如，如US5837686所描述的)。
[0210]遺傳修飾細胞的方法對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。例如，使欲在細胞中表達的核酸可操作地連接至用于在細胞中誘導表達的啟動子。例如，將核酸連接至可在受試者的多種細胞中可操作的啟動子，如病毒啟動子，例如CMV啟動子(例如CMV-1E啟動子)或SV-40啟動子。其它適合啟動子在本領(lǐng)域中是已知的并且應理解為在作了必要修改的情況下適用于本發(fā)明的實施例。
[0211]例如，核酸以表達構(gòu)建體的形式提供。如本文所用，術(shù)語“表達構(gòu)建體”是指具有在細胞中將表達賦予到可操作地連接的核酸(例如報道基因和/或可反選擇的報道基因)的能力的核酸。在本發(fā)明的上下文中，應了解，表達構(gòu)建體可包含或為質(zhì)粒、噬菌體、噬菌粒、粘粒、病毒亞基因組或基因組片段或能夠以可表達格式維持和/或復制異源DNA的其它核酸。
[0212]構(gòu)建適用于實施本發(fā)明的表達構(gòu)建體的方法對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說將是顯而易見的并且描述于以下文獻中:例如Ausubel等(見:Current Protocols inMolecular Biology.Wiley Interscience, ISBN047150338, 1987)或 Sambrook 等(見:Molecular Cloning:MoIecuIar Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratories, New York,第三版2001)。例如,使用例如PCR從適合模板核酸擴增表達構(gòu)建體的各組分并隨后克隆至適合的表達構(gòu)建體(如質(zhì)?；蚴删?中。
[0213]適于所述表達構(gòu)建體的載體是本領(lǐng)域已知的和/或在本文中描述。例如，適于哺乳動物細胞中的本發(fā)明方法的表達載體是例如由Invitrogen供應的pcDNA載體套裝的載體、PCI載體套裝的載體(Promega)、pCMV載體套裝的載體(Clontech)、pM載體(Clontech)、pSI 載體(Promega)、VP16 載體(Clontech)或 pcDNA 載體套裝的載體(Invitrogen)。
[0214]本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認識到另外載體和所述載體的來源，例如像LifeTechnologies Corporation、Clontech 或 Promega。
[0215]用于將分離的核酸分子或包含所述核酸的基因構(gòu)建體引入細胞中用于表達的方式對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是已知的。用于指定生物體的技術(shù)取決于已知的成功技術(shù)。用于將重組DNA引入細胞中的方式包括顯微注射、DEAE-葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體(如使用 lipofectamine (Gibco, MD, USA)和 / 或 cellfectin (Gibco, MD, USA))介導的轉(zhuǎn)染、PEG介導的DNA吸收、電穿孔和微粒轟擊(如`使用涂有DNA的鶴粒子或金粒子(AgracetusInc.,WI1USA))以及其它方式。
[0216]或者，本發(fā)明的表達構(gòu)建體是病毒載體。適合病毒在本領(lǐng)域中是已知的并且可商購獲得。用于遞送核酸和使所述核酸整合至宿主細胞基因組中的常規(guī)基于病毒的系統(tǒng)包括例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體或腺相關(guān)病毒載體?；蛘?，腺病毒載體適用于將保持游離形式的核酸引入宿主細胞中。病毒載體為靶細胞和組織中基因轉(zhuǎn)移的有效且通用的方法。另外，已在多種不同細胞類型和靶組織中觀察到高轉(zhuǎn)導效率。
[0217]例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒通常包含包裝能力高達6-10kb外來序列的順式作用長末端重復(LTR)。最小順式作用LTR就足以用于載體的復制和包裝，其接著用于將表達構(gòu)建體整合至靶細胞中以提供長期表達。廣泛使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括基于以下病毒的載體:鼠類白血病病毒(MuLV)、長臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SrV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和其組合(參見例如Buchscher等，J Virol.56:2731-2739 (1992)；Johann 等，J.Virol.65:1635-1640(1992) ;Sommerfelt 等，Virol.76:58-59 (1990)；Wilson 等，J.Virol.63:274-2318(1989) ；Miller 等，J.Virol.65:2220-2224(1991) ；PCT/US94/05700 ；Miller 和 Rosman BioTechniques7:980-990，1989 ；Miller, A.D.Human GeneTherapy7:5-14, 1990 ;Scarpa等Virology75:849_852，1991 ;Burns等Proc.Natl.Acad.SciUSA90:8033-8037, 1993)。
[0218]已開發(fā)各種腺相關(guān)病毒(AAV)載體系統(tǒng)用于核酸遞送。AAV載體可以使用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)容易地構(gòu)建。參見例如美國專利號5，173，414和5，139，941 ;國際公布號W092/01070 和 W093/03769 ；Lebkowski 等 Molec.Cell.Biol.5:3988-3996，1988 ；Vincent等(1990)Vaccines90(Cold Spring Harbor Laboratory Press) ；Carter CurrentOpinionin Biotechnology5:533-539, 1992 ；Muzyczka.Current Topics inMicrobiol, andImmunol.158:97-129，1992 ;Kotin,Human Gene Therapy5:793-801, 1994 ；Shelling 和Smith Gene Therapy7:165-169,1994 ;和 Zhou 等 J Exp.Med.179:1867-1875，1994。
[0219]適用于遞送本發(fā)明的表達構(gòu)建體的其它病毒載體包括例如來源于痘病毒家族的載體，如牛痘病毒和禽痘病毒或α病毒或綴合病毒載體(例如Fisher-Hoch等，Proc.NatlAcad.Sc1.USA56:317-321, 1989 中所述的載體)。
[0220]測定細胞和可溶性因子的治療/預防潛能
[0221]用于確定細胞或可溶性因子治療或預防或延遲炎性關(guān)節(jié)疾病的發(fā)病或進展的能力的方法對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。
[0222]例如，類風濕性關(guān)節(jié)炎的體外模型描述于Schultz等，Arthritis andRheumatism, 40:1420-1428, 1997中并且涉及在3維纖維蛋白基質(zhì)中培養(yǎng)來自患有關(guān)節(jié)炎的受試者的滑膜和關(guān)節(jié)軟骨外植體或滑膜細胞和軟骨細胞。將本文所述的細胞和或可溶性因子施用至所述培養(yǎng)物允許(例如)通過評定蛋白水解酶的表達、軟骨細胞基質(zhì)構(gòu)造、基質(zhì)降解或細胞數(shù)目來確定所述細胞/因子的治療/預防功效。
[0223]關(guān)節(jié)炎的另一體外模型涉及在存在TNF- α和/或IL_1 β的情況下培養(yǎng)軟骨盤與滑膜成纖維細胞。將本文所述的細胞和或可溶性因子施用至所述培養(yǎng)物允許(例如)通過評定蛋白水解酶的表達、膠原基質(zhì)構(gòu)造、基質(zhì)降解、或促炎性細胞因子水平(例如，IL-6和/或IL-8)或細胞數(shù)目來確定所述細胞/因子的治療/預防功效。
[0224]在另一個實施例中，在類風濕性關(guān)節(jié)炎的體外模型，例如小鼠的SKG株(Sakaguchi等，Nature, 426:454-460)、大鼠II型膠原關(guān)節(jié)炎模型、小鼠II型膠原關(guān)節(jié)炎模型或幾種物種的抗原誘導的關(guān)節(jié)炎模型(Bendele J Musculoskel NeuronInteract2001; I (4): 377-385)中評定本文所述的細胞和/或可溶性因子的功效。諸位發(fā)明人還已經(jīng)證明類風濕性關(guān)節(jié)炎的綿羊模型。
[0225]強直性脊椎炎的動物模型也是本領(lǐng)域中已知的，并且包括涉及使用聚集蛋白聚糖和/或多功能蛋白聚糖balb/c使小鼠免疫、過表達白細胞抗原-B27的ank/ank小鼠大鼠的模型。
[0226]根據(jù)前文本領(lǐng)域的技術(shù)人員將清楚的是，本發(fā)明還提供一種用于鑒別或分離用于治療、預防或延遲其炎性關(guān)節(jié)疾病的細胞或可溶性因子的方法，所述方法包括:
[0227](i)對患有炎性關(guān)節(jié)疾病的測試受試者施用細胞或可溶性因子并且評定受試者的關(guān)節(jié)中的炎癥；
[0228](ii)將(i)的受試者關(guān)節(jié)中的炎癥水平與患有所述炎性關(guān)節(jié)疾病但未施用所述細胞或可溶性因子的對照受試者關(guān)節(jié)中的炎癥水平進行比較，其中與對照受試者相比，測試受試者的關(guān)節(jié)炎癥減少表明所述細胞或可溶性因子治療、預防或延遲炎性關(guān)節(jié)疾病。[0229]本發(fā)明還提供一種用于鑒別或分離用于治療、預防或延遲其炎性關(guān)節(jié)疾病的細胞或可溶性因子的方法，所述方法包括:
[0230](i)接觸炎性關(guān)節(jié)疾病的測試體外模型并且確定所述模型中炎癥的一種或多種標志物的水平；
[0231](?)確定未施用所述細胞或可溶性因子的炎性關(guān)節(jié)疾病的對照體外模型中炎癥的一種或多種標志物的水平，其中與對照模型相比，測試模型中炎癥的標志物水平降低表明所述細胞或可溶性因子治療、預防或延遲炎性關(guān)節(jié)疾病。
[0232]炎癥的不例性標志物包括蛋白水解酶的表達、13父原基質(zhì)構(gòu)造、基質(zhì)降解、促炎性細胞因子水平(例如，IL-6和/或IL-8)或炎性細胞數(shù)目。
[0233]所述細胞可以是本文根據(jù)任何實施例描述的任何細胞。
[0234]細朐纟目合物
[0235]在本發(fā)明的一個實例中，STRO-1+細胞和/或其子代細胞是以組合物形式施用。例如，所述組合物包含藥學上可接受的載體和/或賦形劑。
[0236]術(shù)語“載體”和“賦形劑”是指在本領(lǐng)域中常規(guī)用于促進活性化合物的儲存、施用和/或生物活性的物質(zhì)的組合物(參見,例如,Remington’s Pharmaceutical Sciences,第16版，Mac Publishing Company(1980)。載體還可以減少活性化合物的任何不良副作用。適合的載體是(例如)穩(wěn)定的，例如，不能與載體中的其它成分反應。在一個實施例中，載體在用于治療所采用的劑量和濃度下不會在接受者體內(nèi)產(chǎn)生顯著的局部或全身性有害作用。
[0237]用于本發(fā)明的適合的載體包括常規(guī)使用的那些，例如水、鹽水、右旋糖水溶液、乳糖、林格氏溶液(Ringer’s solution)、緩沖溶液、透明質(zhì)酸以及二醇是示例性液體載體,特別是(當?shù)葷B時)溶液的載體。適合的藥用載體和賦形劑包括淀粉、纖維素、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、氯化鈉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。
[0238]在另一個實施例中，載體是介質(zhì)組合物，例如細胞在其中生長或懸浮的介質(zhì)組合物。例如，所述介質(zhì)組合物不在其所施用的受試者中誘導任何不良作用。
[0239]示例性介質(zhì)和賦形劑不會不利地影響細胞活力和/或細胞減少、預防或延遲炎性關(guān)節(jié)疾病的能力。
[0240]在一個實施例中，載體和賦形劑提供緩沖活性以使細胞和/或可溶性因子維持在適合的PH下，以便由此發(fā)揮生物活性，例如，載體或賦形劑是磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。PBS代表一種有吸引力的載體或賦形劑，因為其與細胞和因子相互作用的程度最低并且允許快速釋放細胞和因子，在這種情況下，本發(fā)明的組合物可以被產(chǎn)生為用于(例如)通過注射直接應用至血流或組織或圍繞組織或與組織相鄰的區(qū)域中的液體。
[0241]STRO-1+細胞和/或其子代細胞還可以并入或包埋于與接受者相容并且降解為對接受者無害的產(chǎn)物的支架中。這些支架提供對待移植到接受受試者體內(nèi)的細胞的支持和保護。天然和/或合成生物可降解性支架是所述支架的實例。
[0242]多種不同的支架可以成功地用于實踐本發(fā)明。示例性支架包括但不限于生物可降解的支架。天然生物可降解支架包括膠原、纖連蛋白以及層連蛋白支架。用于細胞移植支架的適合的合成材料應能夠支持廣泛細胞生長和細胞功能。所述支架還可以是可再吸收的。適合的支架包括聚乙醇酸支架，例如，如由Vacanti等,J.Ped.Surg.23:3-91988 ；Cima等，Biotechnol.Bioeng.38:1451991 ；Vacanti 等，Plast.Reconstr.Surg.88:753-91991所描述的；或合成聚合物如聚酸酐、聚原酸酯以及聚乳酸。
[0243]在另一個實施例中，細胞可以在凝膠支架(如來自Upjohn公司的Gelfoam)中施用。
[0244]適用于本文所述的方法的細胞組合物可以單獨施用或作為與其它細胞的混合物施用?？梢越Y(jié)合本發(fā)明的組合物施用的細胞包括但不限于其它多效或多能細胞或干細胞，或骨髓細胞。不同類型的細胞可以在臨施用前或施用前不久與本發(fā)明的組合物混合，或其可以在施用前一起共培養(yǎng)一段時間。
[0245]在一個實施例中,所述組合物包含有效量的或治療或預防有效量的細胞。例如，所述組合物包含約I X IO5個STRO-1+細胞/kg至約I X IO7個STRO-1+細胞/kg或約IXlO6個STRO-1+細胞/kg至約5 X IO6個STRO-1+細胞/kg。待施用的細胞的確切量取決于多種因素，包括患者的年齡、體重以及性別、以及所述炎性關(guān)節(jié)疾病的范圍和嚴重度。
[0246]在一個實施例中，將低劑量的細胞施用至受試者。示例性劑量包含每千克約
0.1 X 1O4至約0.5 X 1O6之間個細胞，例如每千克約0.1 X 1O5至約0.5 X 1O6之間個細胞，如每千克約0.5 X 1O5至約0.5 X 1O6之間個細胞，例如每千克約0.1 X IO6至約0.5 X1O6之間個細胞，例如，每千克約0.2 X 1O6或0.3 X 1O6或0.4X 1O6個細胞。
[0247]在一個實施例中，將高劑量的細胞施用至受試者。示例性劑量包含至少約
1.5X 1O6個細胞/kg。例如，高劑量包含約1.5X 1O6至約6X106之間個細胞/kg，如約
1.5 X 1O6至約5 X 1O6之間個細胞/kg，例如約1.5 X IO6至約4X 1O6之間個細胞/kg，例如，約1.5 X 1O6至約3X 1O6之間個細胞/kg。例如，高劑量包含約1.5X 1O6或約2X1O6個細胞 /kg。
[0248]在一個實施例中，細胞作為總細胞數(shù)目劑量施用，不考慮患者的體重。
[0249]例如，在一個實施例中，細胞是以約1億至3億之間個細胞的劑量施用，不考慮患者的體重。
[0250]例如，在一個實施例中，細胞是以約1億至2億之間個細胞的劑量施用，不考慮患者的體重。
[0251]在一個實施例中，細胞是以約1億個細胞的劑量施用，不考慮患者的體重。
[0252]在一個實施例中，細胞是以約1.5億個細胞的劑量施用，不考慮患者的體重。
[0253]在一個實施例中，細胞是以約2億個細胞的劑量施用，不考慮患者的體重。
[0254]在一個實施例中，細胞是以約3億個細胞的劑量施用，不考慮患者的體重。
[0255]在一些實施例中，細胞是含于不允許細胞離開進入受試者循環(huán)中，然而允許由細胞分泌的因子進入循環(huán)中的腔室中。以此方式，可通過允許細胞分泌因子進入受試者循環(huán)中來向受試者施用可溶性因子。所述腔室同樣可植入受試者的某一部位以增加可溶性因子的局部水平，例如在胰腺中或其附近植入。
[0256]在本發(fā)明的一些實施例中，可不必或不需要在起始細胞組合物療法前對患者進行免疫抑制。因此，移植同種異體或者甚至異種的STRO-1+細胞或其子代在一些情況下可能是耐受:的。
[0257]然而，在其它情況下，在起始細胞療法前以藥理學方式對患者進行免疫抑制和/或針對細胞組合物減少受試者的免疫反應可能是需要或適當?shù)摹＿@可以通過使用全身性或局部免疫抑制劑來實現(xiàn)，或者這可以通過在囊封裝置中遞送細胞來實現(xiàn)。細胞可以囊封在細胞所需要的營養(yǎng)物和氧以及治療因子可透過，而細胞不可透過的膠囊中來免疫體液因子和細胞。例如，囊封劑具有低變應原性，容易地且穩(wěn)定地位于靶組織中，并且對所植入的結(jié)構(gòu)提供附加保護。降低或消除對移植細胞的免疫反應的這些和其它方式在本領(lǐng)域中是已知的。作為替代，可對細胞進行遺傳修飾以降低其免疫原性。
[0258]可溶性因子的組合物
[0259]在本發(fā)明的一個實例中，由STRO-i細胞得到和/或由子代細胞得到的上清液或可溶性因子是以(例如)包含適合的載體和/或賦形劑的組合物形式施用。例如，所述載體或賦形劑不會不利地影響可溶性因子或上清液的生物學作用。
[0260]在一個實施例中，所述組合物包含穩(wěn)定可溶性因子或上清液組分(例如蛋白酶抑制劑)的物質(zhì)的組合物。例如，所包括的蛋白酶抑制劑的量不足以對受試者產(chǎn)生不良影響。
[0261]包含由STRO-1細胞得到和/或由子代細胞得到的上清液或可溶性因子的組合物可以被制備為適當?shù)囊后w懸浮液，例如，在培養(yǎng)基或在穩(wěn)定載體或緩沖溶液(例如，磷酸鹽緩沖鹽水)中的懸浮液。適合的載體在上文中進行描述。在另一個實施例中，包含由STRO-1細胞得到和/或由子代細胞得到的上清液或可溶性因子的懸浮液是用于注射的油性懸浮液。適合的親脂性溶劑或媒介物包括脂肪油如芝麻油；或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯；或脂質(zhì)體。待用于注射的懸浮液還可以含有增加懸浮液的粘度的物質(zhì)，如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、或葡聚糖。任選地，懸浮液還可以含有適合的穩(wěn)定劑或增加化合物的溶解度以允許制備高度濃縮溶液的試劑。
[0262]可以通過在具有上述的成分之一或其組合的適當溶劑中并入所需量的上清液或可溶性因子，根據(jù)需要隨后過濾滅菌來制備無菌注射溶液。
[0263]一般來說，通過將上清液或可溶性因子并入含有基本分散介質(zhì)和來自以上列出成分的其它所需成分 的無菌媒介物中來制備分散液。在用于制備無菌注射溶液的無菌粉末的情況下，示例性制備方法是真空干燥和冷凍干燥，此舉產(chǎn)生活性成分加來自其前述無菌過濾溶液的任何另外所需成分的粉末。根據(jù)本發(fā)明的替代方面，上清液或可溶性因子可以與增強它的溶解度一種或多種另外化合物一起配制。
[0264]其它示例性載體或賦形劑描述于以下文獻中:例如Hardman等，(2001)Goodman 和 Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, NewYork,N.Y.；Gennaro (2000)Remington: The Science and Practice ofPharmacy, Lippincott, Williams 以及 Wilkins, New York, N.Y.;Avis 等，(編著)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY ；Lieberman等，(編著)(1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY ；Lieberman等，(編著)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems, Marcel Dekker, NY ；Weiner 和 Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., NewYork, N.Y.。
[0265]治療性組合物通常應無菌并且在制造和儲存條件下穩(wěn)定。組合物可以被配制為溶液、微乳液、脂質(zhì)體、或其它有序結(jié)構(gòu)。載體可以是含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、以及液體聚乙二醇等)、以及其適合的混合物的溶劑或分散介質(zhì)?？梢?例如)通過使用包衣(如卵磷脂)、在分散液的情況下通過維持所需的粒度以及通過使用表面活性劑來維持適當?shù)牧鲃有?。在許多情況下，需要的是在組合物中包含等滲劑，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉?？勺⑸涞慕M合物的延長吸收可以通過在組合物中包含延遲吸收的試劑(例如，單硬酯酸鹽和明膠)來達成。此外，可溶性因子可以在時間釋放制劑中施用，例如在包含緩慢釋放聚合物的組合物中施用?；钚曰衔锟捎脤⒈Ｗo化合物免于快速釋放的載體進行制備，如控制釋放制劑，包括植入物和微囊化遞送系統(tǒng)。可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯、聚乳酸以及聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLG)。用于制備所述制劑的多種方法已獲得專利或通常為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所已知。
[0266]上清液或可溶性因子可以與(例如)提供可溶性因子的緩慢釋放的適當基質(zhì)組合施用。
[0267]組合物的附加組分
[0268]STRO-r細胞得到的上清液或可溶性細胞因子、STRO-r細胞或其子代可以與其它有益的藥物或生物分子(生長因子、營養(yǎng)因子)一起施用。當與其它藥劑一起施用時，它們可以在單一藥物組合物中、或在分開的藥物組合物中、與其它藥劑同時或按序(在施用其它藥劑之前或之后)一起施用?？梢怨餐┯玫纳锘钚砸蜃影辜毎蛲鰟?例如EPO、EPO模擬體、TPO、IGF-1和IGF-1I, HGF、半胱氨酸蛋白酶抑制劑)；消炎藥(例如，P38MAPK抑制劑、TGF-β抑制劑、他汀類、IL-6和IL-1抑制劑、PEMIROLAST,TRANLAST,REMICADE,SIR0LIMUS,以及 NSAID (非類固醇消炎藥，例如 TEPOXALIN、TOLMETIN、SUPR0FEN);免疫抑制/免疫調(diào)節(jié)劑(例如鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑，例如環(huán)孢素、他克莫司；mTOR抑制劑(例如，SIROUMUS、EVER0UMUS);抗增生劑(例如，咪唑硫嘌呤、霉酚酸酯)；皮質(zhì)類固醇(例如，潑尼松龍、氫化可的松)；抗體例如單克隆抗-1L-2a受體抗體(例如，巴利昔單抗、達克珠單抗)、多克隆抗T細胞抗體(例如抗胸腺細胞球蛋白(ATG);抗淋巴細胞球蛋白(ALG);單克隆抗T細胞抗體0KT3));抗血栓形成劑(例如，肝素、肝素衍生物、尿激酶、PPack(右旋苯基丙氨酸脯氨酸精氨酸氯甲基酮)、抗凝血酶化合物、血小板受體拮抗劑、抗凝血酶抗體、抗血小板受體抗體、阿司匹林、雙嘧達莫、魚精蛋白、水蛭素、前列腺素抑制劑和血小板抑制劑 )；和抗氧化劑(例如普羅布考、維生素A、抗壞血酸、生育酚、輔酶Q-10、谷胱甘肽、L-半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸)，以及局部麻醉劑。
[0269]在一個實施例中，所述細胞和/或可溶性因子是與免疫抑制劑或抗炎藥或DMARD或非類固醇抗炎藥物一起施用。
[0270]示例性免疫抑制劑/抗炎藥包括抑制細胞因子產(chǎn)生、下調(diào)或抑制自體抗原表達、或掩蔽MHC抗原的物質(zhì)。所述藥劑的實例包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(參見美國專利號4，665，077)、更昔洛韋、他克莫司、糖皮質(zhì)激素如氫化可的松或醛留酮、抗炎藥如環(huán)氧合酶抑制劑、5-脂肪氧合酶抑制劑、或白三烯受體拮抗劑；嘌呤拮抗劑如硫唑嘌呤或霉酚酸酯(MMF);烷化劑如環(huán)磷酰胺；溴隱亭；達那唑；氨苯砜；戊二醛(其掩蔽MHC抗原，如美國專利號4，120, 649中所描述)；MHC抗原和MHC片段的抗獨特型抗體；環(huán)孢霉素A ;類固醇如皮質(zhì)類固醇或糖皮質(zhì)類固醇或糖皮質(zhì)激素類似物，例如，潑尼松、甲潑尼龍，包括SO1...LI41「DROL1:R.甲潑尼龍琥珀酸鈉，以及地塞米松；二氫葉酸還原酶抑制劑如甲氨蝶呤(口服或皮下);抗瘧藥如氯喹和羥氯喹；柳氮磺胺吡啶；來氟米特；細胞因子拮抗劑如細胞因子抗體或細胞因子受體抗體，包括抗干擾素-α、-β、或-Y抗體、抗腫瘤壞死因子(TNF)-Ci抗體(英夫利昔單抗或阿達木單抗)、抗TNF-α免疫粘附素(依那西普)、抗TNF-β抗體、抗白細胞介素-2(IL-2)抗體和抗IL-2受體抗體、以及抗白細胞介素-6 (IL-6)受體抗體和拮抗劑；抗LFA-1抗體，包括抗⑶I Ia和抗⑶18抗體；抗L3T4抗體；異源抗淋巴細胞球蛋白；pan-T抗體如抗⑶3或抗⑶4/⑶4a抗體；含有LFA-3結(jié)合域的可溶性肽(W090/08187);鏈激酶；轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGF-β);鏈道酶；來自宿主的RNA或DNA ；FK506 ;RS_61443 ;苯丁酸氮芥；脫氧精胍菌素；雷帕霉素；T_細胞受體(US5114721)；T-細胞受體片段(W90/11294) ；BAFF拮抗劑如BAFF抗體和BR3抗體以及zTNF4拮抗劑；干擾T細胞輔助信號的生物劑，如抗⑶40受體或抗⑶40配體(⑶154)，包括針對⑶40-⑶40配體和CTLA4-1g的封閉性抗體；以及T-細胞受體抗體(EP340，109)如T10B9。本文的一些免疫抑制劑還是DMARD，如甲氨蝶呤。本文的示例性免疫抑制劑包括環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、硫唑嘌呤、來氟米特、MMF、或甲氨蝶呤。
[0271]“改善疾病的抗風濕藥物”或“DMARD”的實例包括羥氯喹、柳氮磺胺吡啶、甲氨蝶呤、來氟米特、依那西普、英夫利昔單抗(加口服和皮下甲氨蝶呤)、硫唑嘌呤、D-青霉胺、金鹽(口服)、金鹽(肌肉內(nèi))、米諾環(huán)素、環(huán)孢霉素(包括環(huán)孢霉素A和局部環(huán)孢霉素)、葡萄球菌蛋白A，包括其鹽和衍生物等。在一個實施例中，所述DMARD是甲氨蝶呤。
[0272]“非類固醇抗炎藥物”或“NSAID”的實例包括阿司匹林、乙酰水楊酸、布洛芬、氟比洛芬、萘普生、吲哚美辛、舒林酸、托美丁、保泰松、雙氯芬酸、酮洛芬、撲炎痛、甲滅酸、甲氨蝶呤、芬布芬、阿扎丙宗；C0X_2抑制劑如塞來考昔4-(5-(4-甲基苯基)-3-( 二氟甲基)-1H-吡唑-1-基)苯磺酰-胺、伐地考昔、美洛昔康、GR253035(Glaxo Wellcome);以及MK966 (Merck Sharp&Dohme),包括其鹽和衍生物等。
[0273]或者或另外，其它化合物是抗CD20抗體(例如，妥昔單抗或奧法木單抗)?；蛘呋蛄硗猓渌衔锸强笴D22抗體(例如，依帕珠單抗)。或者或另外，其它化合物是抗TNF抗體(例如，英夫利昔單抗或阿達木單抗或戈利木單抗)或可溶性TNF受體(例如，依那西普)?；蛘呋蛄硗?，其它化合物是CTLA-4拮抗劑(例如，阿巴西普(abatac印t)、CTLA4_Ig)?；蛘呋蛄硗猓渌衔锸强笽L-6或抗IL-6R抗體(例如,托珠單抗(tociIizumab))。
[0274]在一個實施例中， STRO-1+細胞和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子是作為其它治療化合物(例如，甲氨蝶呤)的輔助和/或伴隨療法施用。
[0275]“輔助療法”意指為先前治療的附加或補充的治療。
[0276]“伴隨療法”意指與另一治療同時給予但不是另一治療的補充治療的治療，例如，兩種治療可以單獨地治療風濕性疾病。
[0277]本文討論的共同施用治療劑或施用多于一種治療劑不一定意指所述治療劑是在單一組合物中施用。所述治療劑可以在單獨組合物中同時或循序施用。循序施用之間的時間可以是幾天，其條件是當施用第二治療劑時仍然存在足夠水平的第一治療劑來提供或增加第二治療劑的治療或預防益處。
[0278]在一個實施例中，如本文根據(jù)任何實例所描述的藥物組合物包含用于治療炎性關(guān)節(jié)疾病的化合物?；蛘?，如本文根據(jù)任何實施方案所描述的治療/預防方法另外包括施用用于治療炎性關(guān)節(jié)疾病的化合物(例如，在同一組合物或單獨組合物中和/或在相同或不同時間)。示例性化合物在本文進行描述并且應理解為在作了必要的修改的情況下適用于本發(fā)明的這些實例。
[0279]在另一個實施例中，如本文根據(jù)任何實例所描述的組合物另外包含誘導或增強祖細胞分化為血管內(nèi)皮細胞的因子。示例性因子包括，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血小板衍生生長因子O3DGF，例如，PDGF-BB)、以及FGF。[0280]在另一個實施例中，如本文根據(jù)任何實例所描述的組合物另外包含組織特異性定向細胞(TSCC)。在這方面，國際專利申請?zhí)朠CT/AU2005/001445證明了施用TSCC和STRO-1+細胞可以使得TSCC的增殖增強。在一個實施例中，TSCC是血管細胞。對受試者施用所述組合物可以導致血管的產(chǎn)生增加，例如導致被遞送至受影響的組織的營養(yǎng)成分增加。
[0281]醫(yī)療裝置
[0282]本發(fā)明還提供了用于使用或當在如本文根據(jù)任何實施例描述的方法中使用時的醫(yī)療裝置。例如，本發(fā)明提供包含如本文根據(jù)任何實施例描述的STRO-1+細胞和/或其子代和/或其可溶性因子和/或組合物的注射器或?qū)Ч芑蚱渌线m的遞送裝置。任選地，注射器或?qū)Ч芘c如本文根據(jù)任何實施例描述的方法的說明書一起包裝。
[0283]在另一個實施例中，本發(fā)明提供包含如本文根據(jù)任何實施例描述的STRO-1+細胞和/或其子代和/或其可溶性因子和/或組合物的植入物。任選地，植入物與如本文根據(jù)任何實施例描述的方法的說明書一起包裝。合適的植入物可以形成為具有支架，例如如上文所述，和STRO-1+細胞和/或其子代細胞和/或其可溶性因子。
[0284]施用模式
[0285]由STRO-1+細胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1+細胞或其子代可以手術(shù)植入、注射、遞送(例如，借助于導管或注射器)、或以其它方式直接或間接施用至需要修復或增強的部位，例如施用至關(guān)節(jié)中或關(guān)節(jié)鄰近處。
[0286]在一個實施例中，由STRO-1+細胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1+細胞或其子代是遞送至受試者的血流中。例如，由STRO-1+細胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1+細胞或其子代是以腸胃外方式遞送。腸胃外施用的示例性途徑包括但不限于腹腔內(nèi)、心室內(nèi)、腦室內(nèi)、鞘內(nèi)、動脈內(nèi)、結(jié)節(jié)內(nèi)或靜脈內(nèi)。在一個實施例中，由STRO-1+細胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1+細胞或其子代是動脈內(nèi)遞送至主動脈中、心臟的心房或心室中或血管中，例如，靜脈內(nèi)。
[0287]在細胞遞送至心臟的心房或心室的情況下，可以將細胞施用至左心房或左心室以避免可能由細胞快速遞送至肺引起的并發(fā)癥。
[0288]在一個實施例中，例如使用注射器或通過導管或中心管線將由STRO-1+細胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1+細胞或其子代注射至遞送部位中。
[0289]用于治療性制劑的施用方案的選擇取決于若干因素，包括實體的血清或組織周轉(zhuǎn)率、癥狀水平以及實體的免疫原性。例如，施用方案使與可接受水平的副作用相一致的遞送至患者的治療性化合物的量達到最大。因此，所遞送的制劑的量部分取決于具體實體和所治療的病狀的嚴重度。
[0290]在一個實施例中，由STRO-1+細胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1+細胞或其子代是以單次推注劑量來遞送?；蛘?，通過連續(xù)輸注、或通過間隔為(例如)一天、一周或每周1-7次的劑量來施用由STRO-1+細胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1+細胞或其子代。示例性劑量方案是涉及最大劑量或避免顯著不良副作用的劑量頻率的方案?？偯恐軇┝咳Q于所使用的化合物的類型和活性。適當劑量由臨床醫(yī)師例如使用本領(lǐng)域中已知或懷疑影響治療或預測影響治療的參數(shù)或因素來確定。一般來說，劑量始于稍小于最佳劑量的量并且在此后以較小增量增加直至相對于任何負面副作用達成所需或最佳作用。重要診斷指標包括糖尿病癥狀指標。[0291]諸位發(fā)明人已經(jīng)展示了在受試者中觀察至少四周由STRO-1*細胞和/或其子代和/或其得到的可溶性因子提供的治療益處。因此，在一些實施例中，細胞是每周一次、每兩周一次、每三周一次或每四周一次地施用。
[0292]根據(jù)本發(fā)明涉及治療或延遲炎性關(guān)節(jié)疾病的進展的實施例，在一個實施例中，STRO-1+細胞和/或其子代細胞和/或其得到的可溶性因子是在(例如)使用本領(lǐng)域已知的和/或本文所述的標準方法診斷出病癥之后施用。
[0293]對于涉及預防或延遲炎性關(guān)節(jié)疾病的發(fā)病的那些實施例，STRO-1*細胞和/或其子代細胞和/或其得到的可溶性因子可以在臨床上診斷出病癥之前施用。
[0294]患者群體[0295]本發(fā)明的方法還適用于治療屬于患有風濕性疾病的受試者的亞群體的受試者。
[0296]在一個實施例中，受試者患有風濕性疾病，例如，類風濕性關(guān)節(jié)炎，并且對TNF抑制劑(例如，抗TNF抗體或可溶性TNF受體)反應不充分。由于毒性或功效不足，“對TNF抑制劑反應不充分”的受試者已經(jīng)對使用一種或多種TNF抑制劑實施的先前或當前治療反應不充分。在一個實施例中，此類患者已經(jīng)接受(例如)一周兩次每次25mg的依那西普持續(xù)大于3個月或大于3mg/kg的英夫利昔單抗至少4次輸注,但對其反應不充分。
[0297]在一個實施例中，受試者患有風濕性疾病，例如，類風濕性關(guān)節(jié)炎，并且對甲氨蝶呤反應不充分。對“對甲氨蝶呤反應不充分”的受試者是由于毒性或功效不足，已經(jīng)對先前或當前甲氨蝶呤治療反應不充分的患者。在一個實施例中，患者已經(jīng)服用甲氨蝶呤(10-25mg/周)至少12周并且仍具有活動性疾病。
[0298]在一個實施例中，受試者已經(jīng)接受甲氨蝶呤治療。
[0299]在一個實施例中，受試者已經(jīng)接受使用甲氨蝶呤實施的治療并且與還未接受STRO-1+細胞和/或其子代細胞和/或由其得到的可溶性因子的受試者相比，施用STRO-1*細胞和/或其子代細胞和/或由其得到的可溶性因子延遲抗TNF療法的時效。
[0300]在一個實施例中，受試者患有活動性類風濕性關(guān)節(jié)炎?；加小盎顒有灶愶L濕性關(guān)節(jié)炎”的受試者意指具有類風濕性關(guān)節(jié)炎的活動性而非潛伏性癥狀的受試者。在一個實施例中，此類患者在基線訪問時具有大于6個月疾病持續(xù)時間的中度至重度活動性類風濕性關(guān)節(jié)炎。在一個實施例中，此類患者在篩選訪問時將具有:(1)腫脹關(guān)節(jié)計數(shù)(SJC) >4(66個關(guān)節(jié)計數(shù))、(2)壓痛關(guān)節(jié)計數(shù)(TJC) >4 (68個關(guān)節(jié)計數(shù))、和/或C-反應蛋白(CRP) >正常值上限(ULN)。
[0301]在一個實施例中，受試者患有中度活動性類風濕性關(guān)節(jié)炎或重度活動性類風濕性關(guān)節(jié)炎或中度至重度活動性類風濕性關(guān)節(jié)炎。
[0302]患有中度活動性類風濕性關(guān)節(jié)炎的個人通常具有以下癥狀中的至少兩種或三種或四種或全部的組合:
[0303].6與20之間個發(fā)炎關(guān)節(jié)
[0304]?通常沒有除關(guān)節(jié)外的組織中的炎癥
[0305]?升高的ESR或CRP水平
[0306].陽性類風濕性因子測試或抗環(huán)瓜氨酸肽(抗CCP)抗體
[0307]籲在X-射線時有炎癥跡象，但無骨損害跡象
[0308]具有重度活動性類風濕性關(guān)節(jié)炎的個人通常具有以下癥狀中的至少兩種或三種或四種或全部的組合:
[0309]?多于20個持久發(fā)炎的關(guān)節(jié)或功能性能力的迅速損失
[0310]?升高的ESR或CRP水平
[0311]?與慢性疾病相關(guān)的貧血
[0312]?較低的血白蛋白水平
[0313]?陽性風濕性因子測試，經(jīng)常具有高水平
[0314]?在X-射線時有骨和軟骨損害的跡象
[0315]?在除關(guān)節(jié)外的組織中的炎癥
[0316]在一個實施例中，受試者具有持久活動性類風濕性關(guān)節(jié)炎?；加谐志没顒有灶愶L濕性關(guān)節(jié)炎的個人具有至少6至12個月的炎癥跡象，并且可能具有不可逆的關(guān)節(jié)損害和功能損失。
[0317]在一個實施例中，施用所述細胞或可溶性因子抑制結(jié)構(gòu)性關(guān)節(jié)損害的進展。表達在受試者中“抑制結(jié)構(gòu)性關(guān)節(jié)損害的進展”是指例如，基于侵蝕關(guān)節(jié)計數(shù)和/或關(guān)節(jié)損傷得分防止或減慢(例如)患有類風濕性關(guān)節(jié)炎的受試者由風濕性疾病引起的結(jié)構(gòu)性關(guān)節(jié)損害。用于測量結(jié)構(gòu)性關(guān)節(jié)損害的進展的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且包括但不限于，Genant修改的總夏普得分(Total Sharp Score, TSS)、侵蝕得分(ES)、和/或關(guān)節(jié)間隙變窄(JSN)得分。在一個實施例中，本文所公開的方法另外包括例如使用本文所述的方法和/或通過X-射線來評定結(jié)構(gòu)性關(guān)節(jié)損害的進展。例如，所述評定是在最后一次施用所述細胞或 可溶性因子之后約I個月或3個月或6個月或12個月進行。
[0318]本發(fā)明在以下非限制性實施例中進行進一步描述。
實施例
[0319]實施例1:通討詵擇STR0-31細朐對MPC講行免瘡詵擇
[0320]骨髓(BM)是從健康正常的成人志愿者(20-35歲)中采集。簡單地說，從髂后嵴抽吸40ml BM至含肝素鋰抗凝劑的試管中。
[0321]如先前所述(Zannettino,A.C.等(1998) Blood92:2613-2628)使用Lymphoprep? (Nycomed Pharma, Oslo, Norway)通過密度梯度分離制備 BMMNC。在4 °C下以400Xg離心30分鐘后，用轉(zhuǎn)移吸管移除白細胞層并在由含有5%胎牛血清(FCS ;CSL Limited, Victoria, Australia)的漢克氏平衡鹽溶液(HBSS ;LifeTechnologies, Gaithersburg, MD)構(gòu)成的 “HHF” 中洗漆三次。
[0322]隨后如先前所述(Gronthos等(2003) Journal of Cell Sciencell6:1827-1835 ;Gronthos, S.和 Simmons, P.J.(1995)Blood85:929-940)通過磁性活化細胞分選法分離STR0-3+(或TNAP+)細胞。簡單地說，在冰上將約1-3X IO8個BMMNC在由10%(v/v)正常兔血清于HHF中組成的阻斷緩沖液中孵育20分鐘。在冰上將細胞與200 μ I的STR0_3mAb于阻斷緩沖液中的10 μ g/ml溶液一起孵育I小時。隨后通過在400 X g下離心將細胞在HHF中洗滌兩次。加入山羊抗小鼠 Y-生物素(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, UK)于HHF緩沖液中的1/50稀釋液且在冰上將細胞孵育I小時。如上將細胞在MACS緩沖液(補充有l(wèi)%BSA、5mM EDTA和0.01%疊氮化鈉的無Ca2+且無Mn2+的PBS)中洗滌兩次并重懸于最終體積為0.9ml的MACS緩沖液中。[0323]將100 u 1 抗生蛋白鏈菌素微珠（Miltenyi Biotec;Bergisch Gladbach, Germany) 加入細胞懸浮液中且在冰上孵育15分鐘。將細胞懸浮液洗滌兩次并重懸于0. 5ml MACS緩 沖液中且隨后上樣至微型MACS管柱(MS Columns, Miltenyi Biotec)上，并用0.5ml MACS 緩沖液洗滌三次以回收未結(jié)合STR0-3mAb的細胞（于2005年12月19日保藏于美國典型 培養(yǎng)物中心（American Type Culture Collection ;ATCC),保藏編號PTA-7282-參見國際公 布號W02006/108229)。再加入lmlMACS緩沖液后，由磁體移除管柱并通過正壓力分離TNAP+ 細胞。將來自各部分的細胞等分試樣用抗生蛋白鏈菌素-FITC染色并通過流式細胞術(shù)評估 純度。
[0324]實施例2:誦討STR0~3mAb詵擇的細朐是STR0_1A細朐
[0325]設(shè)計實驗以證實使用STR0_3mAb作為用于分離細胞STR0-1胃細胞的單一試劑的可 能性。
[0326]鑒于STR0_3(IgGl)的同種型與STR0-1 (IgM)的同種型不同，因此通過雙色FACS 分析基于與使用MACS程序分離的STR0-1+細胞的共表達評估STR0-3鑒定克隆CFU-F的能 力（圖1)。點陣直方圖表示以列表模式數(shù)據(jù)形式收集的5X104個事件。垂直線和水平線 設(shè)定為小于用在相同條件下處理的同種型匹配對照抗體lB5(IgG)和1A6. 12(IgM)獲得的 平均熒光的1. 0%的反應性水平。結(jié)果表明STR0-1胃細胞的較小群體共表達TNAP(右上象 限），而其余STR0-1+細胞未能與STR0-3mAb反應。隨后測定所有四個象限的通過FACS分 離的細胞的CFU-F發(fā)生率（表1)。
[0327]表1 :通過雙色FACS分析基于細胞表面標志物STR0-1和TNAP的共表達富集人骨 髓細胞（參考圖1)。將FACS分選的細胞在標準克隆條件下在補充有20%FCS的a MEM中 培養(yǎng)。數(shù)據(jù)表示鋪板的每105個細胞中第14天群落形成細胞（CFU-F)的平均數(shù)土SE(n=3 個不同骨髓抽吸物）。這些數(shù)據(jù)表明人MPC僅局限于BM(其明顯共表達STR0-1抗原）的 TNAP陽性部分。
[0328]
【權(quán)利要求】
1.一種用于治療或預防受試者中的風濕性疾病的方法，所述方法包括對所述受試者施 用富含STR0-1+細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述風濕性疾病選自由以下各項組成的組：類風濕 性關(guān)節(jié)炎、斯蒂爾病、強直性脊椎炎、萊特爾氏病、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、腸道關(guān)節(jié)炎、骶髂關(guān)節(jié) 炎、脊椎炎以及骨關(guān)節(jié)炎。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述風濕性疾病是類風濕性關(guān)節(jié)炎。
4.如權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述受試者在施用富含STR0-1+細胞 的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子之前正在接受甲氨蝶呤治療。
5.如權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其包括施用富含STR0-1胃細胞的細胞群和 /或其子代和/或由其得到的可溶性因子。丨
6.如權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述富含STR0-1胃細胞的群和/或其 子代和/或由其得到的可溶性因子是全身性地施用。
7.如權(quán)利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述STR0-1+細胞和/或其子代和/ 或由其得到的可溶性因子是以足以降低受試者的關(guān)節(jié)中IL-6、TNFa、IL-17和/或⑶14+ 細胞中的任何一種或多種的量施用。
8.如權(quán)利要求1至7中任一項所述的方法，其包括施用每千克0.1 X 106至5 X 106之 間個STR0-1+細胞和/或其子代。
9.如權(quán)利要求1至7中任一項所述的方法，其包括施用0.3 X 106個細胞/kg至2 X 106 個細胞/kg之間，其中所述細胞是STR0-1+細胞和/或其子代。
10.如權(quán)利要求1至9中任一項所述的方法，其包括施用低劑量的STR0-1+細胞和/或 其子代。
11.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述低劑量的STR0-1+細胞和/或其子代包含每 千克0. 1 X 105至0. 5X106之間個STR0-1+細胞和/或其子代。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述低劑量的STR0-1+細胞和/或其子代包含每 千克約0. 3X 106個STR0-1+細胞和/或其子代。
13.如權(quán)利要求1至9中任一項所述的方法，其包括施用高劑量的STR0-1+細胞和/或 其子代。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述高劑量的STR0-1+細胞和/或其子代包含每 千克約1. 5X105至約2X106之間個STR0-1+細胞和/或其子代。
15.如權(quán)利要求1至7中任一項所述的方法，其中STR0-1+細胞和/或其子代的所述劑 量包含約1億個細胞至約3億之間個細胞的劑量。
16.如權(quán)利要求1至15中任一項所述的方法，其中所述富含STR0-1+細胞的群和/或 其子代和/或由其得到的可溶性因子是每周一次或以更低頻率施用。
17.如權(quán)利要求1至15中任一項所述的方法，其中所述富含STR0-1+細胞的群和/或 其子代和/或由其得到的可溶性因子是每四周一次或以更低頻率施用。
18.如權(quán)利要求1至15中任一項所述的方法，其中所述富含STR0-1+細胞的群和/或 其子代和/或由其得到的可溶性因子是動脈內(nèi)施用至主動脈中、心臟的心房或心室中或靜 脈內(nèi)施用。
19.如權(quán)利要求1至18中任一項所述的方法，其中所述富含STR0-1+細胞的群和/或子代細胞是自體的或同種異體的和/或所述可溶性因子可以獲自自體或同種異體細胞。
20.如權(quán)利要求1至19中任一項所述的方法，其中所述富含STRO-I'細胞的群和/或子代細胞已經(jīng)在施用之前和/或在獲得所述可溶性因子之前經(jīng)過培養(yǎng)擴增。
21.如權(quán)利要求1至20中任一項所述的方法，其中所述富含STRO-I'細胞的群是STRO-1氣和/或表達組織非特異性堿性磷酸酶(TNAP)和/或所述子代細胞和/或可溶性因子是獲自作為STR0-1胃和/或表達TNAP的STRO-I'細胞。
22.如權(quán)利要求1至21中任一項所述的方法，其中所述STRO-I'細胞和/或其子代細胞和/或由其得到的可溶性因子以包含所述STRO-I'細胞和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子和載體和/或賦形劑的組合物的形式來施用。
23.一種富含STRO-I'細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子，其用于治療或預防受試者中的風濕性疾病。
24.一種富含STRO-I'細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子在制造用于治療或預防受試者中的風濕性疾病的藥物中的用途。
【文檔編號】A61K35/28GK103826647SQ201280042829
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2012年7月4日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月4日
【發(fā)明者】彼得·高希, 西爾維烏·伊泰斯庫 申請人:麥瑟布萊斯特公司