用于治療骨骼肌病的組合物和方法【專利摘要】本發(fā)明提供一種預(yù)防或治療肌病如骨骼肌病的方法，包括施用miRNA的調(diào)控物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述骨骼肌病是中央核性肌病。所述調(diào)控物可以是促進(jìn)miR-133家族成員的表達(dá)、功能或活性的激動(dòng)劑。所述miR-133家族成員可以是miR-133a或miR-133b?！緦＠f(shuō)明】用于治療骨骼肌病的組合物和方法[0001]對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用[0002]本申請(qǐng)要求2011年7月I日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)61/504，048的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益，其通過(guò)提述完整并入本文。[0003]電子方式提交的文本文件的描述[0004]隨本文以電子方式提交的文本文件的內(nèi)容以引用方式整體并入本文:序列表的計(jì)算機(jī)可讀格式副本(文件名:MIRG_029_01TO_SeqList_ST25.txt，記錄日期:2012年7月2日，文件大小5.3千字節(jié))。發(fā)明領(lǐng)域[0005]本發(fā)明一般涉及異常骨骼肌活性或功能的預(yù)防或治療，其通過(guò)調(diào)控微RNA(miRNA)的表達(dá)或活性而進(jìn)行。`具體地，調(diào)控miR-133家族成員的活性或表達(dá)。[0006]發(fā)明背景[0007]骨骼肌病是骨骼肌的肌病，且可以是遺傳性或獲得性的。人中央核性肌病(Humancentronuclearmyopathy,CNM)是一組先天性肌病,其特征在于肌無(wú)力和肌肉肌纖維中細(xì)胞核的異常中心化(1，2)。CNM可分類成3種主要形式:具有嚴(yán)重的新生期表型的隱性X連鎖的肌管性肌病(XLMTM)，其由肌微管素(myotubularin)基因(MTMl)中的突變導(dǎo)致；具有輕度、中度或嚴(yán)重表型的經(jīng)典常染色體顯性形式，其由發(fā)動(dòng)蛋白(dynamin)2基因(D匪2)中的突變導(dǎo)致；和呈現(xiàn)嚴(yán)重和中度表型的常染色體隱性形式，其由雙載蛋白(amphiphysin)2基因(BINl)中的突變導(dǎo)致(1，2)。盡管它們有異類的臨床表型，但CNM的所有3種形式均呈現(xiàn)以下普遍病理學(xué)特征:(a)I型肌纖維占優(yōu)勢(shì)和較小的纖維大??；(b)異常的NADH-四唑還原酶(NADH-TR)染色模式，指示線粒體異常；和(c)缺乏壞死、肌纖維死亡或再生(2)。[0008]XLMTM(CNM的最嚴(yán)重和最普遍的形式)已在小鼠和斑馬魚中進(jìn)行過(guò)廣泛研究(3-6)。具有Mtml基因的純合突變的小鼠形成進(jìn)行性CNM，其重現(xiàn)了XLMTM在人中的病理學(xué)特征(5)。Mtml缺陷性小鼠還展現(xiàn)出紊亂的三聯(lián)征和缺陷性興奮-收縮偶聯(lián)，其可能對(duì)XLMTM中受損的肌功能負(fù)責(zé)(3)。[0009]CNM的常染色體顯性形式與慢性進(jìn)行性CNM的廣臨床譜有關(guān)，從那些開(kāi)始于兒童期或青春期的到具有新生期發(fā)作的更嚴(yán)重的零散形式(7-9)。在最近若干年中已鑒定出DW2基因座中的多種錯(cuò)義突變，因此，常染色體顯性CNM亦稱為DW2有關(guān)的CNM。發(fā)動(dòng)蛋白2是一種涉及許多細(xì)胞功能(包括胞吞作用和膜運(yùn)輸)的遍在表達(dá)的大GTP酶(10，11)。然而，DW2基因中的多種錯(cuò)義突變?yōu)楹螌?dǎo)致CNM的準(zhǔn)確機(jī)制仍不清楚。此外，沒(méi)有針對(duì)DW2有關(guān)的CNM的小鼠模型，且表達(dá)最頻繁的CNM相關(guān)的D匪2突變R465WDnm2的敲入小鼠模型不能重現(xiàn)人CNM的常染色體顯性形式(9)。攜帶R465WDnm2突變的純合小鼠在出生后24小時(shí)內(nèi)死亡，而雜合小鼠產(chǎn)生肌病，接著是無(wú)中心化細(xì)胞核的萎縮和受損的肌功能(9)。[0010]微RNA通過(guò)抑制mRNA靶物的表達(dá)來(lái)調(diào)控細(xì)胞表型。微RNA(miRNA)是高度保守的非編碼小RNA，其通過(guò)抑制在3’不翻譯區(qū)^UTR)中具有互補(bǔ)序列的靶mRNA的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)一系列生物學(xué)過(guò)程(12)。miRNA的核苷酸2_8與mRNA祀物的Watson-Crick堿基配對(duì)導(dǎo)致mRNA降解和/或翻譯抑制。最近的研究已揭示了miRNA在調(diào)節(jié)骨骼肌分化中的作用，而且miRNA表達(dá)的變化與各種骨骼肌病癥有關(guān)(13-15)。然而，尚未證明miRNA涉及骨骼肌病。鑒定和表征涉及肌病的miRNA對(duì)于開(kāi)發(fā)新的治療辦法用于治療肌病如骨骼肌病(包括CNM)是重要的。[0011]發(fā)明概述[0012]本發(fā)明部分基于以下發(fā)現(xiàn)，即miRNA在骨骼肌結(jié)構(gòu)、功能、生物能學(xué)和肌纖維身份的維持中起著必要作用。因此，本文中公開(kāi)了用于治療或預(yù)防骨骼肌病的方法和組合物。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述骨骼肌病是中央核性肌病(CNM)。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于在有此需要的受試者中治療或預(yù)防CNM的方法包括對(duì)受試者施用miR-133家族成員的激動(dòng)劑。本文中還提供了一種在有此需要的受試者中維持骨骼肌結(jié)構(gòu)或功能、抑制快到慢的肌纖維轉(zhuǎn)化、或治療或預(yù)防線粒體功能障礙的方法，包括對(duì)所述受試者施用miR-133家族成員的激動(dòng)劑。[0013]所述miR-133家族成員可以是miR-133a或miR-133b。例如，所述激動(dòng)劑是包含miR_133a或miR_133b序列的多核苷酸。所述多核苷酸可包含pri_miR-133a、pre-miR-133a>或成熟miR_133a序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸包含pr1-miR-133b、pre-miR-133b、或成熟miR_133b序列。例如，所述多核苷酸可包含5’-UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG-3’(SEQIDNO:2)或5’-UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUA-3’(SEQIDNO:4)的序列。[0014]所述激動(dòng)劑可以是配制在脂質(zhì)遞送媒介物中的多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，所述多核苷酸由表達(dá)載體編碼。所述多核苷酸可在骨骼肌啟動(dòng)子如肌肉肌酸激酶啟動(dòng)子的調(diào)控下。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸為雙鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸綴合于膽固醇。所述多核苷酸長(zhǎng)度可以為約70至約100個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，所述多核苷酸長(zhǎng)度為約18至約25個(gè)核苷酸。[0015]在一些實(shí)施方案中，通過(guò)皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或腹膜內(nèi)施用路徑對(duì)受試者施用所述激動(dòng)劑。所述受試者可以是人。在一些實(shí)施方案中，所述受試者在肌微管素(MTMl)基因、發(fā)動(dòng)蛋白2(DNM2)基因和/或雙載蛋白2(BINl)基因中具有突變。[0016]本發(fā)明還提供一種用于鑒定骨骼肌中miR-133家族成員的調(diào)控物的方法，包括:(a)使骨骼肌細(xì)胞與候選化合物接觸；(b)評(píng)估m(xù)iR-133家族成員的活性或表達(dá)；并(c)將步驟(b)中的活性或表達(dá)與在缺少所述候選化合物情況下的活性或表達(dá)比較，其中測(cè)量的活性或表達(dá)之間的差異指示所述候選化合物是所述miR-133家族成員的調(diào)控物。所述miR-133家族成員可以是miR_133a或miR_133b,且細(xì)胞可在體外或體內(nèi)與候選化合物接觸。所述候選化合物可以是肽、多肽、多核苷酸或小分子。評(píng)估m(xù)iR-133家族的活性可包括確定T小管構(gòu)造、線粒體功能、D匪2表達(dá)、或I型肌纖維組成。[0017]附圖簡(jiǎn)述[0018]以下附圖形成本說(shuō)明書的一部分且包含以進(jìn)一步顯示本發(fā)明的某些方面?？赏ㄟ^(guò)參照這一個(gè)或多個(gè)附圖聯(lián)合對(duì)本文中呈現(xiàn)的特定實(shí)施方案的具體描述更好的理解本發(fā)明。[0019]圖1.骨骼肌中miR-133的表達(dá)。(A)成體WT小鼠組織中miR_133a的Northern印跡分析。取下印跡條并用經(jīng)32P標(biāo)記的U6探針作為加載對(duì)照重新探查。Sol，比目魚肌。(B)骨骼肌中miR-133的表達(dá)，通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)并相對(duì)于U6表示。[0020]圖2.具有正常肌外觀的4周齡dKO小鼠。(A)來(lái)自4周齡WT和dKO小鼠的比目魚肌、EDL、G/P和TA肌的H&E染色。比例尺=40μm。(B)將來(lái)自4周齡WT和dKO小鼠的TA肌用針對(duì)核纖層蛋白(Iaminin)的抗體免疫染色。使用DAPI染色來(lái)檢測(cè)細(xì)胞核且顯示無(wú)中心化的細(xì)胞核。尺寸條:30μπι。(C)4周齡WT和dKO小鼠的TA肌纖維的橫截面面積使用ImageJ程序測(cè)定。n=3WT和dKO。檢查來(lái)自每只小鼠的超過(guò)300根TA纖維。[0021]圖3.對(duì)dKO小鼠的表征。(A)中央核性纖維在6-8周齡WT和dKO小鼠的各肌組中的百分?jǐn)?shù)。對(duì)于WTn=3，而對(duì)于dKOn=6。誤差棒代表SEM。(B)測(cè)量12周齡WT和dKO小鼠的體重(Bff)和肌重相對(duì)于脛骨長(zhǎng)度(TL)比率。**代表p〈0.01;***代表p〈0.001。(C)從3月齡WT和dKO小鼠測(cè)定TA肌纖維的橫截面面積。對(duì)于WTn=5,而對(duì)于dKOn=7。[0022]圖4.dKO骨骼肌中的中央核性肌纖維。(A)對(duì)12周齡WT和dKO小鼠的比目魚肌、EDL、G/P和TA肌的H&E染色。比例尺:40μm。(B)針對(duì)核纖層蛋白的TA肌的免疫染色。細(xì)胞核用DAPI染色。dKOTA肌顯示中心細(xì)胞核。比例尺:40μm。(C)12周齡的4只WT小鼠和10只dKO小鼠中的中央核性肌纖維的百分?jǐn)?shù)。對(duì)于每只小鼠，對(duì)TA和G/P肌計(jì)數(shù)超過(guò)500根肌纖維，對(duì)比目魚肌和EDL肌計(jì)數(shù)超過(guò)300根肌纖維。(D)對(duì)dKOTA肌的NADH-TR染色揭示異常分布，輻射狀肌原纖維間網(wǎng)絡(luò)(箭頭)，和環(huán)狀纖維(星號(hào))。比例尺:20μπι。(E)WT,dKO和mdx小鼠TA肌的EBD攝取。顯示用核纖層蛋白的免疫顯色(綠色)；EBD在熒光顯微鏡下檢測(cè)為紅色信號(hào)。比例尺:100μm。(F)肌原性基因和胚胎MHC(Myh3)和圍產(chǎn)期MHC(Myh8)在WT和dKOTA肌中的表達(dá)，通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR確定。n=3(WT和dKO)。[0023]圖5.通過(guò)NADH-TR、H&E和免疫組織化學(xué)對(duì)dKO肌的分析。(A)12周齡WT和dKO小鼠的比目魚肌、EDL、G/P和TA肌的NADH-TR染色。比例尺=40μm。(B)4周齡WT和dKO小鼠的比目魚肌、EDL、G/P和TA肌的NADH-TR染色。比例尺=40μm。(C)12月齡WT和dKO小鼠的TA肌的H&E染色。比例尺=40μm。(D)對(duì)來(lái)自4周WT和dKO小鼠的TA肌的免疫染色，其使用針對(duì)DHPRα的抗體來(lái)檢測(cè)T小管分布。在此齡的WT和dKO肌之間T小管染色模式中沒(méi)有明顯差異。尺寸條:30μπι。[0024]圖6.dKO小鼠TA肌纖維中三聯(lián)征的解體。(A)T小管和SR的編碼組分的mRNA轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)，其通過(guò)在12周齡小鼠TA肌中的實(shí)時(shí)RT-PCR確定。n=3(WT和dKO)。(B)對(duì)來(lái)自12周齡WT和dKO小鼠TA肌的橫切面中T小管和SR的免疫染色。T小管由抗-DHPRa檢測(cè)，而SR的終池(terminalcisternae)由抗-RyRl檢測(cè)。細(xì)胞核通過(guò)DAPI檢測(cè)，而肌纖維周界由抗核纖層蛋白染色。取切片多重水平圖像并重構(gòu)建以創(chuàng)建3D效果。比例尺:30μπι。(C-J)WT和dKO肌的電子顯微圖。dKOTA肌顯示電子致密結(jié)構(gòu)的累積(D-F)，這在WTTA肌中不存在(C)。dKO肌(H和J)展現(xiàn)相比于WT肌(G和I)處于異常取向的T小管(箭頭)。比例尺:2ym(C和D)；0.5ym(E-H);0.2ym(HPJ)。[0025]圖7.對(duì)WT和dKOTA肌與SR和T小管有關(guān)的蛋白質(zhì)的Western印跡分析。Western印跡分析在來(lái)自3月齡WTdKOTA肌的蛋白質(zhì)裂解物上實(shí)施。使用抗體來(lái)檢測(cè)RyRUDPHRa、肌集鈣蛋白(Casq)、SERCA2、受磷蛋白(Phospholamban)(pin)、在絲氨酸16磷酸化的受磷蛋白(Serl6_pln)、Sarcolipin(sin)、CamKII和磷酸化的CamKII的表達(dá)。檢測(cè)作為加載對(duì)照的α-肌動(dòng)蛋白。[0026]圖8.dKO肌中的線粒體功能障礙。㈧從紅色和白色腓腸肌分離線粒體，并針對(duì)RCR、ADP刺激的3態(tài)呼吸(ADP)和FCCP刺激的呼吸(FCCP)測(cè)量氧消耗速率(OCR)。n=2(WT和dKO)。相對(duì)WT*P〈0.05。(B)在從紅色和白色腓腸肌分離的線粒體中測(cè)量脂肪酸氧化。在從紅色和白色四頭肌分離的線粒體中測(cè)量檸檬酸合酶酶活性。n=6(WT和dKO)。相對(duì)WT*P<0.05。[0027]圖9.miR-133a調(diào)節(jié)骨骼肌中的Dnm2表達(dá)。(A)顯示Dnn^S'UTR中miR_133a靶位點(diǎn)的位置以及miR-133a(5’-UUGGUCCCCUUCAACCAGCUA-3’(SEQIDNO:29))與來(lái)自小鼠(5，-UGCCCUCCAUGCUGGGACCAGGCUCCCCG-3’(SEQIDNO:30))、人(5，-CGCCCCUAUGCUGGGACCAGGCUCCCAG-3’(SEQIDNO:31))和大鼠(5，-UGCCCCCCAUGCUGGGACCAGGCUCCCCG-3’(SEQIDNO:32))的UTR的序列比對(duì)。顯示Dnn^S'UTR中保守的miR_133a結(jié)合位點(diǎn)(5，-GGGACCA-3，(SEQIDN0:33))。<5|ADnm23/UTR中的突變以破壞與miR_133a種子序列(5，-UGGUCCC-3’(SEQIDNO:34))的堿基配對(duì)。(B)將含有WT和突變Dnm23'UTR序列的螢光素酶報(bào)告構(gòu)建體與表達(dá)miR-133a的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到C0S-1細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，測(cè)量螢光素酶活性并相對(duì)于β_半乳糖苷酶活性標(biāo)準(zhǔn)化。(C)顯示W(wǎng)T和dKOTA肌中Dnm2mRNA表達(dá)的實(shí)時(shí)RT-PCR。n=3(WT和dKO)。(D)顯示W(wǎng)T和dKO小鼠的TA肌中發(fā)動(dòng)蛋白2蛋白表達(dá)的Western印跡。n=2(WT和dKO)。取下印跡條并用針對(duì)α-肌動(dòng)蛋白的抗體作為加載對(duì)照重新探查。還顯示對(duì)發(fā)動(dòng)蛋白2蛋白的定量，其通過(guò)密度計(jì)量學(xué)確定并相對(duì)于α-肌動(dòng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)化。[0028]圖10.骨骼肌中Dnm2的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致CNM。(A)對(duì)來(lái)自WT和MCK-DW2轉(zhuǎn)基因小鼠系Tgl和Tg2的TA肌的Western印跡分析,其使用抗發(fā)動(dòng)蛋白2和抗-myc來(lái)顯示轉(zhuǎn)基因的過(guò)表達(dá)。將抗微管蛋白用作加載對(duì)照。還顯示通過(guò)密度計(jì)量學(xué)確定的蛋白質(zhì)定量。(B)將6周齡WT、Tgl和Tg2小鼠的TA肌的橫切面用小麥胚凝集素(WGA)和DAPI染色以顯示轉(zhuǎn)基因小鼠中的中心細(xì)胞核(箭頭)。比例尺:100μπι。(C)7周齡轉(zhuǎn)基因小鼠TA肌中中央核性肌纖維的百分?jǐn)?shù)。(D)對(duì)11周齡WT和Tg2小鼠的TA和比目魚肌的組織學(xué)分析。將TA肌切面用H&E、抗核纖層蛋白和DAPI染色以顯示中心細(xì)胞核且用NADH-TR染色以揭示異常分布和輻射狀肌原纖維間網(wǎng)絡(luò)(箭頭)。比例尺:40μm。(E)10周齡WT和Tg2小鼠(n=3每組)以及3月齡WT和dKO小鼠(n=5每組)在踏車上進(jìn)行強(qiáng)迫的下坡跑動(dòng)。隨時(shí)間測(cè)量肌性能至力竭。還顯示總跑動(dòng)距離。*Ρ〈0.05;***Ρ〈0.001。[0029]圖11.對(duì)MCK-Dnm2轉(zhuǎn)基因小鼠的分析。⑷測(cè)量WT和MCK_Dnm2Tg小鼠在11周齡時(shí)的體重(Bff)和肌重。**代表p〈0.01;***代表ρ〈0.001。對(duì)于WT和Tg2小鼠，n=3。(B)對(duì)來(lái)自11周齡WT和Tg2小鼠的TA肌的免疫染色，其使用針對(duì)DHPRα的抗體來(lái)檢測(cè)T小管分布。尺寸條:30μπι。(C)上面部分:顯示發(fā)動(dòng)蛋白2蛋白在11周齡Tg2比目魚肌和心臟中表達(dá)的Western印跡分析。底部部分:對(duì)11周齡WT和Tg2小鼠的比目魚肌的組織學(xué)分析。將比目魚肌切片用H&E和異染性ATP酶染色以顯示I型肌纖維(深藍(lán)色)。[0030]圖12.dKO和MCK-DW2轉(zhuǎn)基因小鼠肌纖維中Dysferlin的胞內(nèi)積累。(A)對(duì)來(lái)自WT和dKO小鼠的TA肌進(jìn)行免疫染色以檢測(cè)發(fā)動(dòng)蛋白2和Dysferlin。在dKO肌纖維中觀察到Dysferlin的胞內(nèi)積累。覆蓋圖指示發(fā)動(dòng)蛋白2和Dysferlin在dKO肌的胞內(nèi)聚集物中的定位。比例尺:30μm。(B)對(duì)來(lái)自WT和Tg2小鼠的TA肌進(jìn)行免疫染色以檢測(cè)Dysferlin。在Tg2肌纖維中觀察到Dysferlin的胞內(nèi)積累。比例尺:30μπι。[0031]圖13.通過(guò)miR_133a對(duì)骨骼肌纖維類型的調(diào)控。(A)對(duì)來(lái)自12周齡WT和dKO小鼠比目魚肌的異染性ATP酶染色和抗MHC-1免疫染色顯示dKO比目魚肌中I型肌纖維的增加。還顯示比目魚肌的H&E染色。比例尺:100μm。(B)比目魚肌中I型肌纖維的百分?jǐn)?shù)，其通過(guò)異染性ATP酶染色測(cè)定。n=6(WT和dKO)。(C)比目魚肌中MHC同種型(isoform)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)，其通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR確定。n=3(WT和dKO)。還確定來(lái)自WT和dKO小鼠比目魚肌、EDL和TA肌的蛋白質(zhì)提取物的MHC同等型的表達(dá)，其通過(guò)甘油凝膠電泳繼之以銀染色進(jìn)行。[0032]圖14.對(duì)WT和dKO肌的纖維類型分析。(A)來(lái)自出生后第I天WT和dKO小鼠的比目魚肌和EDL肌的免疫組織化學(xué)，其使用針對(duì)MHC-1的抗體。比例尺=100μm。(B)對(duì)來(lái)自4周和2周WT和dKO小鼠的比目魚肌的異染性ATP酶染色。比例尺=100μm。[0033]發(fā)明詳述[0034]本發(fā)明部分基于以下發(fā)現(xiàn)，即miRNA在骨骼肌結(jié)構(gòu)、功能、生物能學(xué)和肌纖維身份的維持中起著必要作用。因此，本文中公開(kāi)了用于治療或預(yù)防異常骨骼肌功能或活性(如骨骼肌病)的方法和組合物。通過(guò)創(chuàng)建具有miR-133a-l和miR-133a_2的遺傳缺失的小鼠，發(fā)明人開(kāi)發(fā)出針對(duì)CNM的小鼠模型，其中該小鼠形成成體發(fā)作的CNM。該小鼠在II型(快縮(fast-twitch))肌纖維中形成CNM，伴隨有受損的線粒體功能、快到慢的肌纖維轉(zhuǎn)化和肌三聯(lián)征(興奮-收縮偶聯(lián)位點(diǎn))的混亂。這些異常模擬人CNM且至少能部分歸因于編碼發(fā)動(dòng)蛋白2的miR-133a靶物mRNA的失調(diào)，該發(fā)動(dòng)蛋白2是一種牽涉人中央核性肌病的GTP酶。如此，發(fā)明人確立miR133家族成員，具體而言miR-133a-l和miR-133a_2，是骨骼肌功能和內(nèi)穩(wěn)態(tài)的多方面所必要的。因此，本發(fā)明提供用于治療和預(yù)防異常骨骼肌功能或活性的新治療辦法，其通過(guò)調(diào)控miR-133家族成員的活性或表達(dá)。[0035]miR-133家族含有3種高度同源的miRNA:miR-133a_l、miR-133a_2和miR_133b。miR-l-l/miR-133a-2和miR-l-2/miR-133a_lmiRNA簇在心臟和骨骼肌肉中表達(dá)，而miR-206/miR-133b簇僅在骨骼肌中表達(dá)(16)。MiR-206是急性神經(jīng)損傷后神經(jīng)肌肉突觸的有效再生所需要的，而且miR-206的喪失加快了小鼠中肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophiclateralsclerosis)的疾病進(jìn)展(17)。MiR-1和miR_133a在心臟形成和功能中起著重要作用(18，19)，而且還顯示調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞體外增殖和分化(20)，然而未研究這些miRNA在體內(nèi)骨骼肌發(fā)育或功能中的潛在功能。[0036]MiR-133a-2與來(lái)自人20號(hào)染色體的miR-1-l共轉(zhuǎn)錄，而miR-133a_l與來(lái)自人18號(hào)染色體的miR-1-2共轉(zhuǎn)錄。MiR-133b與miR-206—起從來(lái)自人6號(hào)染色體基因間區(qū)的雙順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄本生成。MiR-133a-l和miR-133a_2彼此相同而與miR_133b相差兩個(gè)核苷酸(18)。MiR-133a-l和miR-133a_2在心臟和骨骼肌肉中表達(dá)，而miR_133b是骨骼肌特異性的(18)ο下面顯示了miR_133a和miR_133b的莖環(huán)和成熟序列:[0037]人miR_133a苯環(huán)(SEQIDNO:1):[0038]ACAAUGCUUUGCUAGAGCUGGUAAAAUGGAACCAAAUCGCCUCUUCAAUGGAUUUGGUCCCCUUCAACCAGC腳AGCUAUGCAUUGA[0039]人成熟miR_133a(SEQIDNO:2):[0040]UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG[0041]人miR-133b苯環(huán)(SEQIDNO:3):[0042]CCUCAGAAGAAAGAUGCCCCCUGCUCUGGCUGGUCAAACGGAACCAAGUCCGUCUUCCUGAGAGGUUUGGUCCCCUUCAACCAGCUACAGCAGGGCUGGCAAUGCCCAGUCCUUGGAGA[0043]人成熟miR_133b(SEQIDNO:4):[0044]UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUA[0045]本發(fā)明提供一種在有此需要的受試者中治療或預(yù)防中央核性肌病的方法，包括對(duì)所述受試者施用miR-133家族成員的激動(dòng)劑。還提供一種在有此需要的受試者中維持骨骼肌結(jié)構(gòu)或功能，抑制快到慢肌纖維轉(zhuǎn)化，和預(yù)防或治療骨骼肌細(xì)胞中的線粒體功能障礙的方法，包括對(duì)所述受試者施用miR-133家族成員的激動(dòng)劑。[0046]“激動(dòng)劑”可以是增加特定miRNA的活性或表達(dá)的任何化合物或分子。例如，在某些實(shí)施方案中，miR-133家族成員的激動(dòng)劑是包含成熟miR-133a或miR-133b序列的多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，所述多核苷酸包含SEQIDN0:2和/或SEQIDNO:4的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR-133家族成員的激動(dòng)劑可以是包含miR-133家族成員(如miR_133a或miR-133b)的pr1-miRNA或pre-miRNA序列的多核苷酸。在一個(gè)這類實(shí)施方案中，多核苷酸可包含SEQIDN0:1和/或SEQIDNO:3的序列。所述包含miR_133a或miR_133b的成熟序列、pre-miRNA序列或pr1-miRNA序列的多核苷酸可以是單鏈或雙鏈的。在一些實(shí)施方案中，所述多核苷酸與miR_133a或miR_133b的成熟序列、pre-miRNA序列或pr1-miRNA序列至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%互補(bǔ)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸包含與miR_133a或miR_133b的成熟序列、pre-miRNA序列或pr1-miRNA序列100%互補(bǔ)的序列。[0047]所述多核苷酸可含有一個(gè)或多個(gè)化學(xué)修飾，如鎖定的核酸、肽核酸、糖修飾如2’-O-烴基(例如2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基)、2’-氟和4’硫代修飾，以及主鏈修飾，如一個(gè)或多個(gè)硫代磷酸(phosphorothioate)、嗎啉代、或膦酰羧酸酯(phosphonocarboxylate)連接及包含其的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述包含miR_133a或miR-133b序列的多核苷酸綴合于類固醇，如膽固醇、維生素、脂肪酸、糖類或糖苷、肽或另一種小分子配體。在另一`個(gè)實(shí)施方案中，miR-133a或miR-133b的激動(dòng)劑可以是不同于miR-133a或miR_133b的試劑，其作用于增加、補(bǔ)充或替換miR-miR_133a或miR_133b的功倉(cāng)泛。[0048]在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR_133a或miR_133b的激動(dòng)劑可在體內(nèi)從載體表達(dá)?！拜d體”是一種可用于向細(xì)胞內(nèi)部遞送感興趣核酸的物質(zhì)的組合物。本領(lǐng)域中已知大量載體，包括但不限于，線性多核苷酸、與離子性或兩親性化合物關(guān)聯(lián)的多核苷酸、質(zhì)粒和病毒。如此，術(shù)語(yǔ)“載體”包括自主復(fù)制的質(zhì)?；虿《?。病毒載體的例子包括但不限于腺病毒載體、腺有關(guān)的病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等。表達(dá)構(gòu)建體可在活細(xì)胞中復(fù)制，或者其可合成制備。就本申請(qǐng)目的而言，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)構(gòu)建體”、“表達(dá)載體”和“載體”可互換使用以在一般的例示性意義上顯示本發(fā)明的申請(qǐng)，且不意圖限制本發(fā)明。[0049]在一個(gè)實(shí)施方案中，用于表達(dá)miR_133a或miR_133b的激動(dòng)劑的表達(dá)載體包含“可操作地連接”于編碼miR-133a或miR_133b的多核苷酸(如miR_133a或miR_133b的成熟序列、pre-miRNA序列或pr1-miRNA序列)的啟動(dòng)子。如本文中使用的，短語(yǔ)“可操作連接”或“在轉(zhuǎn)錄控制下”意指該啟動(dòng)子相對(duì)于多核苷酸處于正確的位置和取向以控制通過(guò)RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)和該多核苷酸的表達(dá)。編碼miR-133a或miR-133b的多核苷酸可編碼miR_133a或miR_133b的初級(jí)miRNA序列(pr1-miRNA)、前體-miRNA序列(pre-miRNA)或成熟miRNA序列。在一些實(shí)施方案中，所述多核苷酸編碼與miR-133a或miR-133b的成熟序列、pre-miRNA序列或pr1-miRNA序列至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%互補(bǔ)的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸編碼與miR-133a或miR-133b的成熟序列、pre-miRNA序列或pr1-miRNA序列100%互補(bǔ)的多核苷酸。[0050]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包含可操作地連接于啟動(dòng)子的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQIDNO:1的序列。在一些實(shí)施方案中，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%互補(bǔ)的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包含可操作地連接于啟動(dòng)子的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQIDN0:2的序列。在一些實(shí)施方案中，所述多核苷酸包含與SEQIDN0.2至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%互補(bǔ)的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包含可操作地連接于啟動(dòng)子的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQIDNO:3的序列。在一些實(shí)施方案中，所述多核苷酸包含與SEQIDN0.3至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%互補(bǔ)的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包含可操作地連接于啟動(dòng)子的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQIDNO:4的序列。在一些實(shí)施方案中，所述多核苷酸包含與SEQIDN0.4至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%互補(bǔ)的序列。[0051]所述包含SEQIDNO:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、或SEQIDN0:4序列的多核苷酸長(zhǎng)度可以為約18至約2000個(gè)核苷酸、約70至約200個(gè)核苷酸、約20至約50個(gè)核苷酸、或約18至約25個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，所述包含與SEQIDN0.1、2、3、或4至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%互補(bǔ)的序列的多核苷酸長(zhǎng)度為約18至約2000個(gè)核苷酸、約70至約200個(gè)核苷酸、約20至約50個(gè)核苷酸、或約18至約25個(gè)核苷酸。[0052]在某些實(shí)施方案中，編碼基因產(chǎn)物的核酸在啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下?！皢?dòng)子”指由細(xì)胞的合成體系或引入的合成體系識(shí)別的、啟動(dòng)基因的特定轉(zhuǎn)錄所需要的DNA序列。術(shù)語(yǔ)啟動(dòng)子用于本文將指在針對(duì)RNA聚合酶1、11、或III的啟動(dòng)位點(diǎn)周圍成簇的一組轉(zhuǎn)錄控制模塊。[0053]在一些實(shí)施方案中，可將人細(xì)胞巨化病毒(CMV)立即早期基因啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子、Rous肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)、大鼠胰島素啟動(dòng)子和甘油醛-3-磷酸脫氫酶用于獲得感興趣多核苷酸序列的高水平表達(dá)。還涵蓋使用本領(lǐng)域公知的其他病毒或哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)菌噬菌體啟動(dòng)子來(lái)實(shí)現(xiàn)感興趣多核苷酸序列的表達(dá)，只要表達(dá)水平足以用于某個(gè)給定的目的。在某些實(shí)施方案中，可使用組織特異性啟動(dòng)子，如骨骼肌特異性啟動(dòng)子來(lái)獲得感興趣多核苷酸序列的組織特異性表達(dá)。[0054]通過(guò)采用具有公知特性的啟動(dòng)子，可優(yōu)化轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化后感興趣蛋白質(zhì)的表達(dá)水平和模式。另外，對(duì)應(yīng)答特定生理學(xué)信號(hào)而表達(dá)的啟動(dòng)子的選擇可允許多核苷酸的可誘導(dǎo)性表達(dá)。在本發(fā)明背景中可采用幾種調(diào)節(jié)元件來(lái)調(diào)節(jié)感興趣多核苷酸(例如miR-133a或miR-133b的激動(dòng)劑)的表達(dá)。[0055]病毒啟動(dòng)子、細(xì)胞啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和可誘導(dǎo)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子可在表達(dá)構(gòu)建體中與感興趣的多核苷酸組合使用。另外，任何啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組合(如按真核生物啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫(kù)EPDB)也可用于驅(qū)動(dòng)多核苷酸的表達(dá)。如果提供適宜的細(xì)菌聚合酶(作為遞送復(fù)合物的一部分或作為另外的遺傳表達(dá)構(gòu)建體)，那么真核生物細(xì)胞可支持從特定細(xì)菌啟動(dòng)子的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄。[0056]下表不意圖窮舉所有可能的涉及促進(jìn)感興趣多核苷酸的表達(dá)的元件，而僅為其示例。可使用的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子的例子包括但不限于以下(或源自以下):免疫球蛋白重鏈、免疫球蛋白輕鏈、T細(xì)胞受體、HLADQa和/或DQP、β-干擾素、白介素_2、白介素-2受體、II類MHC5、II類MHCHLA_DRa、β-肌動(dòng)蛋白、肌肉肌酸激酶(MCK)、前清蛋白(轉(zhuǎn)甲狀腺素(Transthyretin))、彈性蛋白酶1、金屬硫蛋白(MTII)、膠原酶、清蛋白、α-胎蛋白、t_珠蛋白、β-珠蛋白、c-fos、c-HA-ras、胰島素、神經(jīng)細(xì)胞粘著分子(NCAM)、Ct1-AntitrypairuH2B(TH2B)組蛋白、小鼠和/或I型膠原、葡萄糖調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)(GRP94和GRP78)、大鼠生長(zhǎng)激素、人血清淀粉樣A(SAA)、肌鈣蛋白I(TNI)、血小板源性生長(zhǎng)因子(TOGF)、迪謝內(nèi)肌營(yíng)養(yǎng)不良(DuchenneMuscularDystrophy)、SV40、多瘤、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乳頭狀瘤病毒、乙肝病毒、人免疫缺陷病毒、細(xì)胞巨化病毒(CMV)和長(zhǎng)臂猿白血病病毒。[0057]可使用的可誘導(dǎo)元件/誘導(dǎo)物的例子包括但不限于以下(或源自以下):MTII/佛波酯(TFA)、重金屬；MMTV(小鼠乳腺瘤病毒)/糖皮質(zhì)激素；β-干擾素/聚(rl)x、聚(rc)；腺病毒5E2/E1A;膠原酶/佛波酯(TPA);間質(zhì)溶解素(Stromelysin)/佛波酯(TPA)；SV40/佛波酯(TPA);鼠MX基因/干擾素、新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus);GRP78基因/A23187;α-2-巨球蛋白/IL_6;波形蛋白/血清；1類MHC基因Η_2κb/干擾素；HSP70/E1A、SV40大T抗原；多育曲菌素(Proliferin)/佛波酯-TPA;腫瘤壞死因子/PMA;和促甲狀腺激素α基因/甲狀腺激素。[0058]特別感興趣的是肌肉特異性啟動(dòng)子，其包括但不限于:肌球蛋白輕鏈_2啟動(dòng)子(Franz等(1994)Cardioscience,Vol.5(4):235-43;KelIy等(1995)J.CellBiol.,Vol.129(2):383-396)、α肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(Moss等(1996)Biol.Chem.,Vol.271(49):31688-31694),肌鈣蛋白I啟動(dòng)子(Bhavsar等(1996)Genomics,Vol.35(1):11-23);Na+/Ca2+交換器啟動(dòng)子(Barnes等(1997)JBiolChemVo1272(17):11510-11517)>抗肌萎縮蛋白(dystrophin)啟動(dòng)子(Kimura等(1997)Dev.GrowthDiffer.，Vol.39(3):257-265)、alpha7整聯(lián)蛋白啟動(dòng)子(Ziober和Kramer(1996)J.Bi0.Chem.,Vol.271(37):22915-22)、腦促尿鈉排泄肽啟動(dòng)子(LaPointe等(1996)Hypertension,Vol.27(3Pt2):715-22)、αB-晶體蛋白/小熱激蛋白啟動(dòng)子(Gopal-Srivastava(1995)J.Mol.Cell.Biol.,Vol.15(12):7081-7090),α肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子(Yamauch1-Takihara等(1989)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,Vol.86(10):3504-3508)、ANF啟動(dòng)子(LaPointe等(1988)J.Biol.Chem.,Vol.263(19):9075-9078)、和肌肉肌酸激酶(MCK)啟動(dòng)子(Jaynes等，Mol.Cell.Biol.6:2855-2864(1986);Horlick和Benfield,Mol.Cell.Biol.,9:2396,1989;Johnson等，Mol.Cell.Biol.，9，3393(1989))。[0059]可包含多腺苷酸化信號(hào)以引起期望的多核苷酸的適宜多腺苷酸化。可采用任何這類序列如人生長(zhǎng)激素和SV40多腺苷酸化信號(hào)。還涵蓋為表達(dá)盒元件的是終止子。這些元件可起著增強(qiáng)信息水平和最小化從盒到其他序列讀通的作用。[0060]存在許多可將包含本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞的方式。在某些實(shí)施方案中，所述表達(dá)構(gòu)建體包含病毒和源自病毒基因組的工程化構(gòu)建體。某些病毒經(jīng)由受體介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞以整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)并穩(wěn)定和有效表達(dá)病毒基因的能力使其成為用于將外來(lái)基因轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的有吸引力的候選物。[0061]用于體內(nèi)遞送的一種方法牽涉使用腺病毒表達(dá)載體。“腺病毒表達(dá)載體”意圖包括那些含有腺病毒序列從而足以(a)協(xié)助構(gòu)建體的包裝和(b)表達(dá)其中已克隆的多核苷酸的構(gòu)建體。所述表達(dá)載體包含腺病毒的經(jīng)遺傳工程化形式。對(duì)腺病毒(一種36kB線性雙鏈DNA病毒)遺傳構(gòu)造的了解允許將腺病毒DNA的大片段用外來(lái)序列(長(zhǎng)達(dá)7kB)替換。與逆轉(zhuǎn)錄病毒相反，對(duì)宿主細(xì)胞的腺病毒感染不導(dǎo)致染色體整合，因?yàn)橄俨《綝NA可以附加體方式復(fù)制而無(wú)潛在遺傳毒性(genotoxicity)。還有,腺病毒是結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的,且在廣泛擴(kuò)增后未檢測(cè)到基因組重排。腺病毒基本上能感染所有的上皮細(xì)胞，不管其細(xì)胞周期階段如何。腺病毒因其中等大小的基因組、易于操作、高滴度、寬廣的靶細(xì)胞范圍和高感染性而尤其適宜用作基因轉(zhuǎn)移載體。該病毒基因組的兩端含有100-200個(gè)堿基對(duì)的反向重復(fù)(ITR)，其為病毒DNA復(fù)制和包裝所需要的順式元件。[0062]除了要求腺病毒載體為復(fù)制缺陷性或至少條件性缺陷性以外，不認(rèn)為腺病毒載體的性質(zhì)對(duì)于成功實(shí)踐本發(fā)明是至關(guān)重要的。腺病毒可以是42種已知的不同血清型或亞組A-F的任何一種。亞組C的腺病毒5型是獲得用于本發(fā)明的條件性復(fù)制缺陷性腺病毒載體的優(yōu)選的起始材料。這是因?yàn)橄俨《?型是人腺病毒，關(guān)于其已知大量生化和遺傳信息，且其很久以來(lái)就用于大多數(shù)采用腺病毒作為載體的構(gòu)建。[0063]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體是復(fù)制缺陷性的且將不會(huì)具有腺病毒El區(qū)。如此，可以方便地在已除去El編碼序列的位置導(dǎo)入編碼本文中公開(kāi)的激動(dòng)劑的多核苷酸。然而，腺病毒序列中構(gòu)建體的插入位置對(duì)本發(fā)明并不重要。還可以將編碼感興趣的激動(dòng)劑的多核苷酸插入E3替換載體中代替缺失的E3區(qū)，或E4區(qū)(其中輔助細(xì)胞系或輔助病毒補(bǔ)充E4缺陷)?？蓪⑾俨《据d體施用給不同的組織，如通過(guò)氣管滴注、肌注射、周圍靜脈注射和立體定向(stereotactic)接種到腦中。[0064]逆轉(zhuǎn)錄病毒載體也適用于在細(xì)胞中表達(dá)miR-133家族成員如miR_133a或miR-133b的激動(dòng)劑。逆轉(zhuǎn)錄病毒是一組單鏈RNA病毒，其特征是在受感染細(xì)胞中通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程將其RNA轉(zhuǎn)化成雙鏈DNA的能力。所得DNA然后穩(wěn)定地整合到細(xì)胞染色體內(nèi)作為原病毒，并指導(dǎo)病毒蛋白質(zhì)的合成。所述整合導(dǎo)致受體細(xì)胞及其后代中病毒基因序列的保留。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組含有3個(gè)基因gag、pol和env，其分別編碼殼體蛋白、聚合酶和被膜組分。在gag基因上游發(fā)現(xiàn)的序列含有用于將基因組包裝到病毒粒體中的信號(hào)。兩個(gè)長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)序列存在于病毒基因組的5’和3’端。這些含有強(qiáng)啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列，而且也是整合于宿主細(xì)胞基因組所需要的。[0065]為了構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將感興趣的多核苷酸插入病毒基因組中替換某些病毒序列來(lái)產(chǎn)生復(fù)制缺陷性病毒。為了產(chǎn)生病毒粒體，構(gòu)建含有g(shù)ag、pol和env基因但沒(méi)有LTR和包裝組分的包裝細(xì)胞系(Mann等，1983)。當(dāng)將含有cDNA的重組質(zhì)粒與逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR和包裝序列一起導(dǎo)入該細(xì)胞系中(通過(guò)例如磷酸鈣沉淀)時(shí)，該包裝序列允許重組質(zhì)粒的RNA轉(zhuǎn)錄本包裝到病毒顆粒中，然后其分泌到培養(yǎng)基中(Nicolas和Rubenstein,1988;Temin,1986;Mann等，1983)。隨后收集含有重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)基，任選地濃縮，并用于基因轉(zhuǎn)移。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能感染很多種細(xì)胞類型。[0066]其他病毒載體可在本發(fā)明中用作表達(dá)構(gòu)建體?？刹捎迷醋圆《救缗６徊《?、腺有關(guān)病毒(AAV)和皰疹病毒的載體。它們提供針對(duì)各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞的幾種有吸引力的特征。[0067]為了引起感興趣多核苷酸(即miR-133家族成員的激動(dòng)劑)的表達(dá)，應(yīng)將表達(dá)構(gòu)建體遞送到細(xì)胞中。該遞送可在體外完成(如在用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)室規(guī)程中)，或在體內(nèi)或離體完成(如在某些疾病狀態(tài)的治療中)。用于遞送的一種機(jī)制是經(jīng)由病毒感染，其中表達(dá)構(gòu)建體被殼體包裹在感染性的病毒顆粒中。[0068]本發(fā)明還涵蓋幾種用于將表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的非病毒方法,如本領(lǐng)域中已知的。這些包括磷酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖、電穿孔、直接顯微注射、DNA加載的脂質(zhì)體和Iipofectamine-DNA復(fù)合物、細(xì)胞超聲處理、使用高速微射彈(microprojectile)的基因轟擊(bombardment)、和受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。其中一些技術(shù)可成功適應(yīng)用于體內(nèi)或離體使用。[0069]一旦已將表達(dá)構(gòu)建體遞送到細(xì)胞中，編碼感興趣多核苷酸的核酸就可安置在不同位點(diǎn)并表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，可將編碼感興趣多核苷酸的核酸穩(wěn)定整合到細(xì)胞基因組中。該整合可以經(jīng)由同源重組(基因替換)在同類的位置和取向，或者可將其整合到隨機(jī)的非特定位置(基因增加)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述核酸可作為DNA的分開(kāi)的附加區(qū)段穩(wěn)定維持于細(xì)胞中。這類核酸區(qū)段或“附加體”編碼足以允許獨(dú)立于宿主細(xì)胞周期或與之同步進(jìn)行維持和復(fù)制的序列。如何將表達(dá)構(gòu)建體遞送到細(xì)胞中和核酸維持在細(xì)胞何處仍取決于采用的表達(dá)構(gòu)建體的類型。[0070]在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)構(gòu)建體可簡(jiǎn)單由裸重組DNA或質(zhì)粒組成。構(gòu)建體的轉(zhuǎn)移可通過(guò)上述任一種方法實(shí)施，所述方法物理或化學(xué)地使細(xì)胞膜通透化。這尤其適用于體外轉(zhuǎn)移但也可應(yīng)用于體內(nèi)使用。例如，已將磷酸鈣沉淀形式的多瘤病毒DNA遞送到成年和新生小鼠的肝和脾中，其顯示活性病毒復(fù)制和急性感染，而且磷酸鈣沉淀的質(zhì)粒的直接腹膜內(nèi)注射顯示導(dǎo)致所轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)。涵蓋將編碼感興趣多核苷酸(即miR-133家族成員的激動(dòng)劑)的DNA也以類似的方式轉(zhuǎn)移到體內(nèi)并表達(dá)。[0071]在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，裸DNA表達(dá)構(gòu)建體到細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移可能牽涉顆粒轟擊。該方法依賴于將用DNA包被的微射彈加速到高速?gòu)亩试S其穿透細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞而不殺死它們的能力。已開(kāi)發(fā)了幾種用于加速小顆粒的裝置。一種這類裝置依賴于高伏特電荷來(lái)生成電流，其相應(yīng)地提供原動(dòng)力。使用的微射彈由生物惰性物質(zhì)如鎢或金珠組成。已在體內(nèi)轟擊大鼠和小鼠的選定器官，包括肝、皮膚和肌組織。這可能需要組織或細(xì)胞的手術(shù)暴露以消除任何在槍和靶器官之間的介入組織，即離體處理。同樣，編碼特定的感興趣多核苷酸(即miR-133家族成員的激動(dòng)劑)的DNA可經(jīng)由此方法遞送且仍然涵蓋在本發(fā)明中。[0072]在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，可將所述表達(dá)構(gòu)建體包載于脂質(zhì)體中。脂質(zhì)體是小泡結(jié)構(gòu)，其特征是磷脂雙層膜和內(nèi)部水性介質(zhì)。多復(fù)層脂質(zhì)體具有多個(gè)由水性介質(zhì)分開(kāi)的脂質(zhì)層。當(dāng)磷脂懸浮于過(guò)量水性溶液中時(shí)，它們自發(fā)形成。在形成閉合結(jié)構(gòu)并在脂質(zhì)雙層之間包載水和溶解的溶質(zhì)之前，脂質(zhì)組分經(jīng)歷自身重排。還涵蓋Iipofectamine-DNA復(fù)合物。[0073]在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可將脂質(zhì)體與紅血球凝聚病毒(HVJ)復(fù)合。已顯示其有助于與細(xì)胞膜的融合并促進(jìn)脂質(zhì)體包裹的DNA的細(xì)胞進(jìn)入。在其他實(shí)施方案中，可將脂質(zhì)體與核非組蛋白染色體蛋白(HMG-1)復(fù)合或組合使用。在別的實(shí)施方案中，可將脂質(zhì)體與HVJ和HMG-1復(fù)合或組合使用。由于已在核酸的體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)移和表達(dá)中成功采用了這類表達(dá)構(gòu)建體，因此它們適用于本發(fā)明。當(dāng)在DNA構(gòu)建體中采用細(xì)菌啟動(dòng)子時(shí)，可期望將適宜的細(xì)菌聚合酶包含在脂質(zhì)體內(nèi)。[0074]可采用以將編碼特定miR-133家族成員激動(dòng)劑的核酸遞送到細(xì)胞中的其他表達(dá)構(gòu)建體是受體介導(dǎo)的遞送媒介物。這些利用幾乎所有真核細(xì)胞中存在的受體介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)行的大分子的選擇性攝取。由于各種受體的細(xì)胞類型特異性分布，遞送可能是高度特異性的。受體介導(dǎo)的基因靶向性媒介物一般由兩組分組成:細(xì)胞受體特異性配體和DNA結(jié)合劑。已將數(shù)種配體用于受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。本發(fā)明涵蓋已大量表征的配體無(wú)唾液酸血清類黏蛋白(asialoorosomucoid)(ASOR)和運(yùn)鐵蛋白。已將一種合成的擬糖蛋白(neoglycoprotein)(其與ASOR識(shí)別相同的受體)用作基因遞送媒介物,而且還已將表皮生長(zhǎng)因子(EGF)用于將基因遞送到鱗癌細(xì)胞中，這均涵蓋用于本文中。[0075]在其他實(shí)施方案中，所述遞送媒介物可包含配體和脂質(zhì)體。例如，已將乳糖基神經(jīng)酰胺酶(一種半乳糖末端的無(wú)唾液酸神經(jīng)節(jié)苷酯)摻入脂質(zhì)體中并觀察到通過(guò)肝細(xì)胞的胰島素基因攝取中的增加。如此，以下是可行的，即還可通過(guò)任何數(shù)目的有或無(wú)脂質(zhì)體的受體-配體系統(tǒng)將編碼特定基因的核酸特定地遞送到一種細(xì)胞類型中。[0076]在一個(gè)具體的例子中，寡核苷酸可與陽(yáng)離子脂質(zhì)組合施用。陽(yáng)離子脂質(zhì)的例子包括但不限于lipofectin、D0TMA、D0PE和D0TAP。通過(guò)提述具體并入的W00071096的公開(kāi)內(nèi)容描述了不同的制劑，如D0TAP:膽固醇或膽固醇衍生物制劑，其能有效用于基因療法。其他公開(kāi)還論述了包含納米顆粒的不同脂質(zhì)或脂質(zhì)體制劑以及施用方法；這些包括但不限于美國(guó)專利公開(kāi)文本N0.20030203865,20020150626,20030032615和20040048787，其通過(guò)提述以其披露制劑和關(guān)于施用和核酸遞送的其他相關(guān)方面的程度具體地并入。用于形成顆粒的方法還披露于美國(guó)專利N0.5，844，107,5,877，302,6,008，336,6,077，835,5,972，901、6，200，801和5，972，900，其各自通過(guò)提述完整并入。[0077]在某些實(shí)施方案中，遞送可更容易地在離體條件下實(shí)施。離體指從動(dòng)物分離細(xì)胞，核酸在體外到細(xì)胞中，然后將經(jīng)修飾的細(xì)胞返回到動(dòng)物中。這可能牽涉組織/器官?gòu)膭?dòng)物的手術(shù)移出或細(xì)胞和組織的原`代培養(yǎng)。[0078]在某些實(shí)施方案中，要鑒定含有本發(fā)明核酸構(gòu)建體的細(xì)胞?？赏ㄟ^(guò)在表達(dá)構(gòu)建體中納入標(biāo)志物在體外或體內(nèi)鑒定細(xì)胞。這類標(biāo)志物會(huì)賦予細(xì)胞已可識(shí)別的變化，從而允許對(duì)含有表達(dá)構(gòu)建體的細(xì)胞的容易的鑒定。通常，納入藥物選擇標(biāo)志協(xié)助克隆和轉(zhuǎn)化體的選擇,例如賦予對(duì)新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和組氨醇抗性的基因是可用的可選擇標(biāo)志?；蛘?，可采用酶如單純皰疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)。還可以采用免疫學(xué)標(biāo)志。不認(rèn)為采用的可選擇標(biāo)志是重要的，只要它能與編碼感興趣多核苷酸(即miR-133家族成員的激動(dòng)劑)的核酸同時(shí)表達(dá)即可。可選擇標(biāo)志的其他例子是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。[0079]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種治療或預(yù)防受試者中的骨骼肌病的方法。“骨骼肌病”指其中存在并非由神經(jīng)病癥所導(dǎo)致的骨骼肌疾病的狀況。肌病可由遺傳的基因缺陷(例如肌營(yíng)養(yǎng)不良)導(dǎo)致，或由內(nèi)分泌、炎性(例如多肌炎)和代謝性病癥導(dǎo)致。癥狀可包括但不限于，骨骼肌如近端肌或遠(yuǎn)端肌的無(wú)力和萎縮。一些肌病如肌營(yíng)養(yǎng)不良在早期年齡段形成，而其他在生命后期形成。[0080]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種治療或預(yù)防中央核性肌病(CNM)的方法，包括施用miR-133家族成員的激動(dòng)劑。CNM是一組先天性肌病，其特征在于肌無(wú)力和肌纖維中細(xì)胞核的異常中心化(1，2)。CNM可分類成3種主要形式:具有嚴(yán)重的新生期表型的隱性X連鎖的肌管性肌病(XLMTM)，其由肌微管素基因(MTMl)中的突變導(dǎo)致；具有輕度、中度或嚴(yán)重表型的經(jīng)典常染色體顯性形式，其由發(fā)動(dòng)蛋白2基因(.Μ2)中的突變導(dǎo)致；和呈現(xiàn)嚴(yán)重和中度表型的常染色體隱性形式，其由雙載蛋白2基因(BINl)中的突變導(dǎo)致(1，2)。如此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種治療或預(yù)防受試者中XLMTM、CNM的經(jīng)典常染色體顯性形式、或CNM的常染色體隱性形式的方法。所述方法可包括施用miR-133家族成員的激動(dòng)劑，如miR-133a或miR-133b的激動(dòng)劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，治療或預(yù)防CNM的方法包括對(duì)在MTMl、D匪2、或BINl基因中具有突變的受試者施用miR-133家族成員，如miR_133a或miR-133b的激動(dòng)劑。[0081]CNM的特征通常包括以下常見(jiàn)的病理學(xué)特征:(a)I型肌纖維占優(yōu)勢(shì)和較小的纖維大??；(b)異常的NADH-四唑還原酶(NADH-TR)染色模式，指示線粒體異常；和(c)缺乏壞死、肌纖維死亡或再生(2)。如此，本文中還提供一種在受試者中維持骨骼肌結(jié)構(gòu)或功能，抑制快到慢的肌纖維轉(zhuǎn)化，和預(yù)防或治療線粒體功能障礙的方法，包括施用miR-133家族成員的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施方案中，所述受試者是哺乳動(dòng)物，如人、小鼠、馬或犬。[0082]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，涵蓋與其他治療藥征組合使用miR-133家族成員的激動(dòng)劑。如此，除了本文中描述的本發(fā)明的miRNA激動(dòng)劑以外，還可以向受試者提供“標(biāo)準(zhǔn)”的藥物治療。這類標(biāo)準(zhǔn)治療將取決于要治療的具體骨骼肌病，但可包括藥物治療、物理治療、支具療法(bracing)、手術(shù)、按摩和針刺療法。[0083]可通過(guò)使骨骼肌細(xì)胞與包含兩種藥劑的單一組合物或藥理學(xué)制劑接觸，或通過(guò)使所述細(xì)胞與兩種不同的組合物或制劑(其中一種組合物包含miR-133家族成員的激動(dòng)劑，而另一種包含第二藥劑)同時(shí)接觸來(lái)實(shí)現(xiàn)組合?；蛘?，使用miRNA激動(dòng)劑的治療可在施用其他藥劑之前或之后，其相差數(shù)分鐘到數(shù)周的時(shí)間間期。在其中分別對(duì)細(xì)胞應(yīng)用其他藥劑和miRNA激動(dòng)劑的實(shí)施方案中，一般會(huì)確保每次遞送時(shí)間之間不會(huì)相隔相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，從而使得該藥劑和miRNA激動(dòng)劑還會(huì)能夠?qū)?xì)胞`施加有利組合的影響。在這類情況下，通常用兩種藥征在彼此的約12-24小時(shí)內(nèi)、更優(yōu)選在彼此的約6-12小時(shí)內(nèi)、最優(yōu)選在僅約12小時(shí)的延遲時(shí)間內(nèi)接觸細(xì)胞。然而，在一些情況下，可能期望將治療的時(shí)間段顯著延長(zhǎng)，其中在分別的施用之間有數(shù)天(2、3、4、5、6或7)至數(shù)周(1、2、3、4、5、6、7或8)時(shí)間流逝。[0084]還涵蓋會(huì)期望miRNA激動(dòng)劑或其他藥劑的超過(guò)一次施用。在此方面，可采用各種組合。舉例而言，當(dāng)miRNA激動(dòng)劑是〃A〃而另一種藥劑/治療是"B"時(shí)，例示基于3和4次總施用的以下排列:A/B/A,B/A/B,B/B/A,A/A/B,B/A/A,A/B/B,B/B/B/A,B/B/A/B,A/A/B/B,A/B/A/B,A/B/B/A,B/B/A/A,B/A/B/A,B/A/A/B,B/B/B/A,A/A/A/B,B/A/A/A,A/B/A/A,A/A/B/A,A/B/B/B,B/A/B/B和B/B/A/B。類似地涵蓋其他組合。[0085]本發(fā)明還涵蓋在治療后凈化或清除miR-133家族成員激動(dòng)劑的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括在骨骼肌細(xì)胞中使用肌特異性啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)miR-133家族成員的結(jié)合位點(diǎn)區(qū)。所述結(jié)合位點(diǎn)區(qū)優(yōu)選含有miR-133家族成員的種子區(qū)的序列，跨越堿基2-8的miRNA5’部分。在一些實(shí)施方案中，所述結(jié)合位點(diǎn)可含有來(lái)自miR-133家族成員一個(gè)或多個(gè)靶物3’UTR的序列。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，針對(duì)miR-133a家族成員的結(jié)合位點(diǎn)含有D匪2的3’UTR。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可在miR-133家族成員激動(dòng)劑之后施用miR-133家族成員的抑制劑以減弱或停止該微RNA的功能。這類抑制劑可包括Antagomir、反義或抑制性RNA分子(例如siRNA或shRNA)。[0086]本發(fā)明還涵蓋包含miR-133家族成員激動(dòng)劑和藥學(xué)可接受載體，如miR_133a激動(dòng)劑和藥學(xué)可接受載體，或miR-133b激動(dòng)劑和藥學(xué)可接受載體的藥物組合物。當(dāng)涵蓋臨床應(yīng)用時(shí)，藥物組合物將以適于意圖應(yīng)用的形式制備。一般而言，這就必須制備基本無(wú)致熱原以及其他可能對(duì)人或動(dòng)物有害雜質(zhì)的組合物。[0087]膠體分散系統(tǒng)如大分子復(fù)合物、納米膠囊、微球、珠和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)(包含水包油乳劑)、微團(tuán)、混合的微團(tuán)、和脂質(zhì)體可用作本文所述微RNA功能激動(dòng)劑的遞送媒介物。適于將本發(fā)明核酸遞送到組織如骨骼肌組織的商品化脂肪乳劑包括IntralipidTM，Liposyn?,Liposyn?II,Liposyn?III,Nutrilipid和其他類似的脂質(zhì)乳劑。優(yōu)選的用作體內(nèi)遞送媒介物的膠體系統(tǒng)是一種脂質(zhì)體(即人工膜小泡)。這類系統(tǒng)的制備和使用是本領(lǐng)域中公知的。例示性制劑還披露于美國(guó)專利N0.5，981，505;美國(guó)專利N0.6，217，900;美國(guó)專利N0.6，383，512;美國(guó)專利N0.5，783，565;美國(guó)專利N0.7，202，227;美國(guó)專利N0.6，379，965;美國(guó)專利N0.6，127，170;美國(guó)專利N0.5，837，533;美國(guó)專利N0.6，747，014;和W003/093449，其通過(guò)提述完整并入本文。[0088]一般會(huì)期望采用適宜的鹽和緩沖物以使得載體穩(wěn)定并允許通過(guò)靶細(xì)胞攝取。當(dāng)將重組細(xì)胞引入患者中時(shí)，也將采用緩沖物。本發(fā)明的水性組合物包含有效量的遞送媒介物，其溶解或分散在藥學(xué)可接受載體或水性介質(zhì)中。短語(yǔ)“藥學(xué)可接受”或“藥理學(xué)可接受”指在對(duì)動(dòng)物或人施用時(shí)不產(chǎn)生不利、過(guò)敏或其它不當(dāng)反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。如本文中使用的，“藥學(xué)可接受載體”包括溶劑、緩沖物、溶液、分散介質(zhì)、涂料、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延緩劑等，可接受將其用于配制藥物如適用于對(duì)人施用的藥物。將這類介質(zhì)和藥劑用于藥學(xué)活性物質(zhì)是本領(lǐng)域中公知的。除非在任何常規(guī)介質(zhì)或藥劑與本發(fā)明的活性成分不相容的情況下，否則均涵蓋其在治療組合物中的使用。補(bǔ)充性活性成分也可包含在組合物中，只要它們不使組合物的核酸失活。[0089]本發(fā)明的活性組合物可包含經(jīng)典藥物制備物。依照本發(fā)明的這些組合物的施用可經(jīng)由任何常見(jiàn)路徑，只要可經(jīng)由該路徑到達(dá)靶組織。這包括經(jīng)口、鼻、或含服?；蛘?，施用可通過(guò)皮內(nèi)、經(jīng)皮、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈注射，或通過(guò)直接注射到骨骼肌組織。正常地，這類組合物會(huì)作為如上文所述的藥學(xué)可接受的組合物施用。[0090]所述活性化合物還可以胃腸外或腹膜內(nèi)施用。舉例而言，活性化合物作為游離堿或藥理學(xué)可接受鹽的溶液可在與表面活性劑如羥丙基纖維素適宜混合的水中制備。分散體也可在甘油、液體聚乙二醇及其混合物和油中配制。在普通的儲(chǔ)存和使用條件下，這些制備物一般含有防腐劑以防止微生物的生長(zhǎng)。[0091]適用于注射使用的藥物形式包括，例如無(wú)菌水性溶液或分散體和用于即時(shí)制備無(wú)菌可注射溶液或分散體的無(wú)菌粉末。一般地，這些制備物是無(wú)菌的，且流動(dòng)性達(dá)到可容易注射的程度。制備物在制備和存儲(chǔ)條件下應(yīng)是穩(wěn)定的，且應(yīng)當(dāng)免于微生物如細(xì)菌和真菌的污染行為而保存。合適的溶劑或分散介質(zhì)可含有，例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、其合適的混合物和植物油。適宜的流動(dòng)性可例如通過(guò)使用涂層如卵磷月旨，通過(guò)在分散情況下維持要求的顆粒大小和通過(guò)使用表面活性劑維持。可通過(guò)各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑例如尼泊金類(parabens)、氯丁醇、苯酹、山梨酸、硫柳萊(thimerosal)等進(jìn)行對(duì)微生物作用的阻止。在許多情況下，優(yōu)選包含等滲劑，例如糖或氯化鈉。可注射組合物的延長(zhǎng)吸收可通過(guò)在組合物中使用延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鋁和明膠進(jìn)行。[0092]可通過(guò)將活性化合物以適宜量與任何其他成分(例如如上文列舉的)一起(如期望的)納入溶劑中來(lái)制備無(wú)菌可注射溶液，接著進(jìn)行過(guò)濾滅菌。一般地，通過(guò)將各種已滅菌的活性成分納入含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和期望的其它成分(例如如上文列舉的)的無(wú)菌媒介中來(lái)制備分散體。在用于制備無(wú)菌可注射溶液的無(wú)菌粉末的情況中，優(yōu)選的制備方法包括真空干燥和凍干技術(shù)，該技術(shù)從先前其無(wú)菌過(guò)濾的溶液得到活性成分加上任何其它期望成分的粉末。[0093]本發(fā)明的組合物一般可以中性或鹽形式配制。藥學(xué)可接受的鹽包括，例如自無(wú)機(jī)酸(例如鹽酸或磷酸)或有機(jī)酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)衍生的酸加成鹽(與蛋白質(zhì)的游離氨基基團(tuán)形成)。與蛋白質(zhì)的游離羧基基團(tuán)形成的鹽還可以自無(wú)機(jī)堿(例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵)或有機(jī)堿(例如異丙胺、三甲胺、組氨酸或普魯卡因(procaine)等)衍生。[0094]在配制時(shí)，優(yōu)選地，以與劑量配制相容的方式和治療有效的量施用溶液。配制物可容易地以多種劑量形式如可注射溶液、藥物釋放膠囊等施用。對(duì)于水性溶液中的胃腸外施用，例如，溶液一般是適宜緩沖的且將液體稀釋劑首先用例如充足的鹽水或葡萄糖使其等滲?？蓪⑦@類水性溶液例如用于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、和腹膜內(nèi)施用。優(yōu)選地，如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，特別是根據(jù)本公開(kāi)來(lái)采用無(wú)菌水性介質(zhì)。舉例而言，單劑可溶解于Iml等滲NaCl溶液中，并添加至1000ml皮下灌注流體或在提出的輸注位點(diǎn)注射(參見(jiàn)例如"Remington，sPharmaceuticalSciences"第15版，第1035-1038和1570-1580頁(yè))。藥理學(xué)治療劑和施用方法、劑量等是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(參見(jiàn)例如，"PhysiciansDeskReference,〃Klaassen的〃ThePharmacologicalBasisofTherapeutics,^^Remington'sPharmaceuticalSciences,〃和〃TheMerckIndex,EleventhEdition〃，通過(guò)提述以相關(guān)部分并入本文)，而且根據(jù)本文公開(kāi)可與本發(fā)明組合。合適的劑量包括約20mg/kg至約200mg/kg,約40mg/kg至約160mg/kg,或約80mg/kg至約100mg/kg。根據(jù)所治療的受試者的狀況，必要地將在劑量中進(jìn)行一些變更。負(fù)責(zé)施用的人無(wú)論如何會(huì)確定個(gè)體受試者的合適劑量，而且這類個(gè)體確定將在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的技能之內(nèi)。而且，對(duì)于人施用，制備物應(yīng)當(dāng)滿足FDA生物標(biāo)準(zhǔn)部門(FDAOfficeofBiologicalStandards)要求的無(wú)菌性、熱原性(pyrogenicity)、一般安全性和純度標(biāo)準(zhǔn)。[0095]可將本文中描述的任一種組合物納入試劑盒中。在一個(gè)非限制性例子中，將miR-133a和/或miR_133b激動(dòng)劑納入試劑盒。所述試劑盒還可包含水和雜交緩沖液以協(xié)助miRNA兩條鏈的雜交。試劑盒還可包含一種或多種轉(zhuǎn)染試劑以協(xié)助多核苷酸激動(dòng)劑到細(xì)胞的遞送。[0096]可將試劑盒的組分以水性介質(zhì)或凍干形式包裝。容器意指所述試劑盒一般會(huì)包含至少一個(gè)管形瓶(vial)、試管、燒瓶、頸口瓶(bottle)、注射器或其他容器工具，其中可置有組分，而且優(yōu)選經(jīng)過(guò)適宜等分。在試劑盒中有超過(guò)一種組分的情況下(標(biāo)記試劑和標(biāo)記物可包裝在一起)，所述試劑盒一般還將含有第二、第三或其他另外的容器，其中可分開(kāi)放置另外的組分。然而，可將組分的各種組合包含在小瓶中。本發(fā)明的試劑盒通常還將包含含有核酸的工具以及任何其他緊密限制用于商業(yè)銷售的試劑容器。這類容器可包括注射或成形模塑料容器，其中持有期望的小瓶。[0097]當(dāng)試劑盒的組分在一種和/或多種液體溶液中提供時(shí)，所述液體溶液是水性溶液，特別優(yōu)選無(wú)菌水性溶液。然而，試劑盒的組分可以干燥后粉末提供。當(dāng)試劑和/或組分以干燥粉末提供時(shí)，所述粉末可通過(guò)添加適宜的溶劑而重構(gòu)。涵蓋所述溶劑還可在另一個(gè)容器工具中提供。[0098]所述容器工具一般將包含至少一個(gè)管形瓶、試管、燒瓶、頸口瓶、注射器和/或其他容器工具，其中放置核酸配制物，優(yōu)選是經(jīng)過(guò)適宜分配的。所述試劑盒還可包含用于含有無(wú)菌的藥學(xué)可接受緩沖物和/或其他稀釋劑的第二容器。[0099]這類試劑盒還可包含保存或維持miRNA/多核苷酸或保護(hù)其免于降解的組分。這類組分可以是無(wú)RNA酶的或保護(hù)免于RNA酶。這類試劑盒一般將在合適的工具中包含用于每種分別的試劑或溶液的不同容器。[0100]試劑盒還將包含用于使用試劑盒組分以及使用任何其他不包含在試劑盒中的藥劑的用法說(shuō)明書。用法說(shuō)明書可包含可執(zhí)行的變更。試劑盒還可包含用于通過(guò)各種施用路徑如胃腸外或肌內(nèi)施用來(lái)施用miRNA激動(dòng)劑的器具或裝置。[0101]本發(fā)明還包括用于診斷受試者中的骨骼肌病的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括(a)從受試者獲得骨骼肌組織樣品；(b)評(píng)估m(xù)iR-133家族成員在該樣品中的活性或表達(dá)；并(c)將步驟(b)中的活性或表達(dá)與正常組織樣品中miR-133家族成員的活性或表達(dá)比較，其中相比于正常組織樣品中miR-133家族成員的活性或表達(dá)，miR-133家族成員活性或表達(dá)中的增加診斷為骨骼肌病。所述miR-133家族成員可以是miR-133a或miR-133b。在一些實(shí)施方案中，評(píng)估m(xù)iR-133a和miR-133b兩者的活性或表達(dá)。所述骨骼肌病可以是CNM。`[0102]在一個(gè)實(shí)施方案中，評(píng)估m(xù)iR-133家族成員的活性包括評(píng)估由miR-133家族成員調(diào)節(jié)的一種或多種基因的活性，如由miR-133a和/或miR_133b調(diào)節(jié)的一種或多種基因的活性。例如，在一些實(shí)施方案中，由miR-133a調(diào)節(jié)的一種或多種基因是.Μ2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括對(duì)受試者施用針對(duì)骨骼肌病的治療并再評(píng)估m(xù)iR-133a和/或miR-133b的表達(dá)或活性?？稍谥委熀螳@得miR-133a和/或miR_133b的表達(dá)或活性并與這些miRNA在正常組織樣品或先前從受試者獲得的組織樣品(例如在治療前)中的表達(dá)進(jìn)行比較。[0103]本發(fā)明還包括用于鑒定骨骼肌功能調(diào)控物的方法。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于鑒定骨骼肌中miR-133家族成員的調(diào)控物的方法。所鑒定的miR-133家族成員功能的激動(dòng)劑可用于治療或預(yù)防骨骼肌病如CNM?？蓪iR-133a和/或miR_133b的調(diào)控物(例如激動(dòng)劑)包含在依照本發(fā)明的藥物組合物中用于治療或預(yù)防CNM、維持骨骼肌結(jié)構(gòu)或功能、抑制快到慢的肌纖維轉(zhuǎn)化、或預(yù)防或治療線粒體功能障礙。[0104]用于鑒定調(diào)控物的測(cè)定法可包括隨機(jī)篩選候選物質(zhì)的大庫(kù)；或者，所述測(cè)定可用于集中在特定的化合物類上，該類的選擇是留心于認(rèn)為使其更可能抑制或促進(jìn)miR-133家族成員活性或表達(dá)的結(jié)構(gòu)屬性而得到的。[0105]為了鑒定miR-133家族成員的調(diào)控物，一般可在存在或缺乏候選化合物的情況下測(cè)定miR-133家族成員的功能或活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括:(a)使骨骼肌細(xì)胞與候選化合物接觸；(b)評(píng)估m(xù)iR-133家族成員的活性或表達(dá)；并(c)將步驟(b)中的活性或表達(dá)與缺少該候選化合物情況下的活性或表達(dá)比較，其中測(cè)量的活性或表達(dá)之間的差異指示該候選化合物是miR-133家族成員的調(diào)控物，且因此是骨骼肌功能或維持的調(diào)控物。還可以在分離的細(xì)胞、器官或在活生物體中進(jìn)行測(cè)定。[0106]評(píng)估m(xù)iR-133家族成員的活性或表達(dá)可包括評(píng)估m(xù)iR-133家族成員的表達(dá)水平，如miR-133a和/或miR_133b的表達(dá)水平。本領(lǐng)域技術(shù)人員將熟悉多種用于評(píng)估RNA表達(dá)水平的方法，包括例如Northern印跡或RT-PCR。評(píng)估m(xù)iR-133家族成員的活性或表達(dá)可包括評(píng)估m(xù)iR-133家族成員的活性，如miR-133a和/或miR_133b的活性。在其他實(shí)施方案中，評(píng)估m(xù)iR-133家族成員的活性包括評(píng)估由miR-133家族成員調(diào)節(jié)的，如由miR_133a和/或miR-133b調(diào)節(jié)的基因如D匪2的表達(dá)或活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員將熟悉多種用于評(píng)估由miR-133家族成員調(diào)節(jié)的基因的表達(dá)或活性的方法。這類方法包括例如，Northern印跡、RT-PCR、ELISA、或Western印跡。[0107]在一些實(shí)施方案中，評(píng)估m(xù)iR-133家族成員的活性或表達(dá)可包括評(píng)估T小管構(gòu)造、線粒體功能、D匪2蛋白或基因表達(dá)、或I型肌纖維組成。本領(lǐng)域技術(shù)人員將熟悉多種方法，如但不限于，記載于以下例子中的那些。例如，T小管構(gòu)造可通過(guò)以下評(píng)估:電子顯微鏡、免疫組化和/或檢查編碼對(duì)于興奮-收縮偶聯(lián)重要的T小管和SR組分的基因的表達(dá)，所述組分包括二氫吡卩定受體(DHPR)的α1、βI和YI亞基(分別由Cacnals、Cacnbl和Cacngl編碼)，斯里蘭卡肉桂堿(ryanodine)受體I(Ryrl),I和2型SERCA泵(Atp2al和Atp2a2)，Sarcolipin和肌集鈣蛋白I和2(Casql和Casq2)。線粒體功能可通過(guò)線粒體呼吸和/或脂肪酸氧化評(píng)估。對(duì)線粒體功能的評(píng)估可包括但不限于:(a)呼吸控制比率(RCR)，氧化磷酸化與ATP合成之間的偶聯(lián)；(b)ADP刺激的3態(tài)呼吸，線粒體產(chǎn)生ATP期間的呼吸速率；和(c)羰基氰化物-P-三氟甲氧基苯腙刺激的(FCCP刺激的)呼吸。纖維組成可通過(guò)異染性ATP酶染色和/或免疫組化分析。纖維組成還可通過(guò)對(duì)編碼每種MHC同等型，如I型MHC(MHC-1)和II型MHC(MHC-1Ia、MHC-1Ix/d和MHC-1Ib)的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)的定量實(shí)時(shí)RT-PCR分析來(lái)評(píng)估。[0108]當(dāng)然，會(huì)理解本發(fā)明的所有篩選方法本身均可用，盡管事實(shí)上可能未發(fā)現(xiàn)有效的候選物。本發(fā)明提供用于篩選這類候選物的方法，而非僅僅是發(fā)現(xiàn)它們的方法。[0109]如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“候選化合物”指任何可能通過(guò)miR-133家族成員潛在調(diào)控骨骼肌維持和功能的分子。可在“強(qiáng)力”鑒定可用化合物的努力中從多種商業(yè)性來(lái)源獲得認(rèn)為滿足可用藥物的基本標(biāo)準(zhǔn)的分子庫(kù)。對(duì)這類庫(kù)(包括組合生成的庫(kù))的篩選是一種快速和有效的篩選大量相關(guān)(和不相關(guān))化合物活性的方式。組合性辦法還適合通過(guò)創(chuàng)建在有活性但不想要的化合物上建模的第二、第三和第四生成化合物來(lái)進(jìn)行到潛在藥物的快速進(jìn)化?？梢勒毡景l(fā)明方法篩選的候選化合物的非限制性例子是蛋白質(zhì)、肽、多肽、多核苷酸、寡核苷酸或小分子。miR-133家族成員的調(diào)控物還可以是miR-133家族成員上游調(diào)控物的激動(dòng)劑或抑制劑。[0110]運(yùn)行的一種快速、便宜且簡(jiǎn)單的測(cè)定法是體外測(cè)定法。這類測(cè)定法一般使用分離的分子，可快速并以大量運(yùn)行，由此增加可在短時(shí)段內(nèi)獲得的信息量。可使用多種容器來(lái)運(yùn)行該測(cè)定法，包括試管、板、皿和其他表面如浸潰片(dipstick)或珠。例如，可評(píng)估寡核苷酸對(duì)靶miRNA的雜交。用于高通量篩選化合物的一種技術(shù)記載于W084/03564。可在固體基質(zhì)如膠針(plasticpin)或一些其他表面上合成大量小化合物。可快速篩選這類分子與miR-133a和/或miR_133b雜交的能力。[0111]本發(fā)明還涵蓋篩選化合物在細(xì)胞中調(diào)控miR-133家族成員表達(dá)或功能的能力?？蓪⒍喾N細(xì)胞系，包括源自骨骼肌細(xì)胞的那些(例如C2C12細(xì)胞)用于這類篩選測(cè)定法，包括特定工程化以用于該目的的細(xì)胞。[0112]體內(nèi)測(cè)定法牽涉使用各種動(dòng)物模型，如在實(shí)施例中描述的miR_133a+小鼠。由于其個(gè)頭、易于操作和關(guān)于其生理學(xué)和遺傳構(gòu)成的信息，小鼠是優(yōu)選的實(shí)施方案，特別是對(duì)轉(zhuǎn)基因而言。然而，其他動(dòng)物也是合適的，包括大鼠、家兔、倉(cāng)鼠、豚鼠、沙鼠、土撥鼠(woodchuck)、貓、犬、綿羊、山羊、豬、牛、馬和猴(包括黑猩猩、長(zhǎng)臂猿和狒狒)。調(diào)控物的測(cè)定可使用源自這些物種中任意一種的動(dòng)物，包括經(jīng)修飾以提供骨骼肌病模型的那些動(dòng)物來(lái)進(jìn)行。[0113]用測(cè)試化合物來(lái)治療動(dòng)物將牽涉以合適的形式將所述化合物施用給動(dòng)物。施用將通過(guò)任何可用于臨床目的的路徑。測(cè)定化合物的體內(nèi)有效性可牽涉多種不同的標(biāo)準(zhǔn)，包括但不限于改變突觸體系或信號(hào)傳導(dǎo)。還有，測(cè)量毒性和劑量應(yīng)答可在動(dòng)物中以比體外或胞內(nèi)測(cè)定更有意義的方式實(shí)施。[0114]本發(fā)明包括一種調(diào)節(jié)細(xì)胞中D匪2表達(dá)的方法，包括使細(xì)胞與miR-133家族成員的調(diào)控物接觸。在一個(gè)實(shí)施方案中，在施用miR-133(即miR-133a)激動(dòng)劑后，D匪2在細(xì)胞中的表達(dá)降低。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在施用miR-133(即miR-133a)抑制劑后，D匪2在細(xì)胞中的表達(dá)升高。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是骨骼肌細(xì)胞。[0115]納入以下實(shí)施例以進(jìn)一步例示本發(fā)明的各個(gè)方面。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)領(lǐng)會(huì)下面實(shí)施例中公開(kāi)的技術(shù)代表發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明實(shí)踐中作用良好的技術(shù)和/或組合物，如此可視為構(gòu)成其實(shí)踐的優(yōu)選模式。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本公開(kāi)應(yīng)領(lǐng)會(huì)到，可在公開(kāi)的特定實(shí)施方案中進(jìn)行許多改變且仍然獲得類似或相似的結(jié)果，而不背離本發(fā)明的精神和范圍。實(shí)施例[0116]實(shí)施例1.miR-133在骨骼肌中的表達(dá)[0117]MiR-133a-l和miR-133a_2對(duì)于心臟的形成和功能是重要的(18)。缺少miR-133a-l或miR-133a_2的小鼠是正常的，而缺少這兩種miRNA的約50%雙敲除(dKO)小鼠在胚胎或新生時(shí)死于心室-間隔缺陷(18)。為了探索miR-133a在骨骼肌中的功能，研究了存活的miR-133adKO小鼠。[0118]通過(guò)Northern印跡分析測(cè)定了miR-133在幾種具有不同肌纖維含量的骨骼肌中的表達(dá)。氧化性I型(慢縮)肌纖維富集于比目魚肌，而糖分解II型(快縮)肌纖維富集于其他肌組，如腓腸肌和跖肌(G/P)、脛骨前肌(TA)和趾長(zhǎng)伸肌(EDL)。miR-133a在所有這些肌組中以等同水平表達(dá)(圖1A)，這指示其在I型和II型肌纖維中的可比水平。MiR-133b與miR-206共轉(zhuǎn)錄且在主要含有I型纖維的比目魚肌中富集(17)。[0119]通過(guò)雜種繁殖miR-133a-l+/-miR-133a2+/-小鼠生成MiR_133a+(即dKO)小鼠，如先前描述的(18)，且通過(guò)定量實(shí)時(shí)RT-PCR確認(rèn)dKO骨骼肌中miR-133a表達(dá)的喪失(圖1B)。在dKO骨骼肌中檢測(cè)的低水平miR-133表達(dá)代表miR-133b的存在，其由miR_133a探針檢測(cè)。基于來(lái)自實(shí)時(shí)RT-PCR的結(jié)果，估算WT小鼠中miR-133a對(duì)miR-133b的相對(duì)豐度在比目魚肌中為約15:1，而在G/P、EDL和TA肌中為約50:1，這確認(rèn)了miR_133b在骨骼肌中豐度低于miR-133a，且富集于比目魚肌中。[0120]實(shí)施例2.中央核性肌纖維在dKO骨骼肌中的積累[0121]dKO小鼠在活動(dòng)性中未顯示明顯的異常。在4周齡時(shí)，dKO肌由組織學(xué)分析和針對(duì)核纖層蛋白和DAPI的免疫染色表現(xiàn)為正常，而且肌纖維大小與WT肌的那些可比(圖2k-O。然而，到6周齡時(shí)，具有中央細(xì)胞核的肌纖維開(kāi)始出現(xiàn)于dKO小鼠中，且具有中心細(xì)胞核的肌纖維在EDL、G/P和TA肌中的百分?jǐn)?shù)隨著年齡進(jìn)行性增加(圖3A)。到12周齡時(shí)，dKO小鼠TA肌中幾乎60%的肌纖維含有中心化的細(xì)胞核(圖4，A-C)。相比之下，dKO比目魚肌具有相對(duì)少的中心化細(xì)胞核(圖4，A和C)。這些發(fā)現(xiàn)表明dKO小鼠中位于中央的細(xì)胞核的表型是對(duì)于II型肌纖維特異性的。另外，在12周齡時(shí)，dKO小鼠在體重和各種肌組的重量(當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化于脛骨長(zhǎng)度時(shí))顯著更小(圖3B)。dKO小鼠的TA肌纖維在此年齡也具有比正常更小的直徑(圖3C)。[0122]作為對(duì)肌異常性的進(jìn)一步評(píng)估，通過(guò)NADH-TR染色分析了12周時(shí)dKO肌纖維中的線粒體和肌質(zhì)網(wǎng)(SR)分布。dKO纖維在G/P、EDL和TA肌中比WT肌纖維顯示更多的氧化性酶活性(圖5A)，這可能反映了這些肌中快到慢的肌纖維轉(zhuǎn)化(即II型到I型)。在各纖維內(nèi)的氧化性酶活性也是不均一分布的，而且一些肌纖維顯示輻射狀肌原纖維間網(wǎng)絡(luò)(圖4D)。在NADH-TR染色時(shí)也偶爾觀察到環(huán)樣纖維(圖4D)。在dKO和WT同窩出生者之間在比目魚肌中沒(méi)有NADH-TR染色中的顯著差異(圖5A)。有趣的是，在4周齡dKO肌中當(dāng)不存在位于中央的細(xì)胞核時(shí)觀察到正常的NADH-TR染色模式(圖5B)。[0123]中央細(xì)胞核的累積通常指示應(yīng)答疾病或損傷的肌再生(21-23)。如此，檢查4周齡dKO肌纖維中肌損傷和再生的跡象。通過(guò)在受損細(xì)胞中累積的伊文思藍(lán)染料(Evansbluedye(EBD))的攝取來(lái)監(jiān)測(cè)肌膜完整性，其顯示非常少的染料陽(yáng)性纖維(少于4根每橫切面)(圖4E)。檢查來(lái)自形成肌營(yíng)養(yǎng)不良的mdx小鼠的肌肉用于比較；這些小鼠顯示大量的EBD攝取(圖4E)。分析肌酸激酶(CK)活性的血清水平(指示肌膜滲漏)，且觀察到在3月齡dKO小鼠中僅稍微升高(2倍)的CK水平(數(shù)據(jù)未顯示)。另外，dKO肌纖維未顯示營(yíng)養(yǎng)不良肌纖維特征性的炎癥、纖維化或細(xì)胞凋亡的跡象(數(shù)據(jù)未顯示)。在12月齡，未觀察到dKO肌纖維中肌纖維形態(tài)學(xué)的惡化或炎癥、纖維化或細(xì)胞死亡的指征(圖5C)。[0124]為了測(cè)定肌再生，分析編碼再生的幾種肌原性標(biāo)志物的mRNA的表達(dá)。Myog(其編碼成肌素(myogenin))的表達(dá)在dKOTA肌中上調(diào)7倍,但在其他肌原性標(biāo)志物如Pax3、Pax7和MyoD的表達(dá)水平中沒(méi)有變化(圖4F)。盡管在TA肌中通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR在胚胎(Myh3)和圍產(chǎn)期MHC(Mhy8)mRNA水平兩者中有強(qiáng)烈提高(圖4F)，但胚胎MHC蛋白很少通過(guò)免疫組化在dKO肌纖維中檢測(cè)到(數(shù)據(jù)未顯示)。這些數(shù)據(jù)指示在dKO小鼠中僅有稀有的肌再生，其不足以解釋在這些小鼠中觀察到的大量中央核性纖維。如此，dKO小鼠中無(wú)明顯壞死、肌纖維死亡或顯著再生的中央核性肌纖維是令人聯(lián)想到人CNM的病理學(xué)特征(1，2)。[0125]實(shí)施例3.dKO小鼠肌纖維中的T小管解體[0126]在骨骼肌中，興奮-收縮偶聯(lián)發(fā)生于三聯(lián)征，其由橫向小管(T小管)和SR的2個(gè)終池構(gòu)成(24)。在Mtml缺陷性小鼠中，肌纖維具有降低的三聯(lián)征數(shù)和異常的T小管構(gòu)造(3)。T小管解體也在人CNM患者中報(bào)告過(guò)(6，25)。[0127]為了評(píng)估T小管構(gòu)造是否在dKO肌中受影響，檢查編碼T小管和SR中對(duì)于興奮-收縮偶聯(lián)重要的組分的基因的表達(dá)，所述組分包括二氫吡啶受體(DHPR)的α1、β1和YI亞基(分別由Cacnals、CacnbI和Cacngl編碼)，斯里蘭卡肉桂堿受體I(Ryrl),I和2型SERCA泵(Atp2al和Atp2a2)和肌集鈣蛋白I和2(Casql和Casq2)。在mRNA水平上，大多數(shù)基因的表達(dá)未變化，除了Cancngl中2.5倍的增加以外(圖6A)。還檢查了RyRl、DHPRa、肌集鈣蛋白和SERCA2在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)并觀察到最小變化(圖7)。相比之下，觀察到Sln的mRNA水平中35倍的增加，伴有Sarcolipin蛋白中的可比增加(圖6A和圖7)。Sarcolipin上調(diào)是骨骼肌肌病的普遍特征(26)，但該上調(diào)的顯著性未知。受磷蛋白的表達(dá)在dKO肌中稍微上調(diào)，但磷酸化的受磷蛋白在蛋白質(zhì)水平上稍微降低(圖7)。[0128]還分析了三聯(lián)征的構(gòu)造，其通過(guò)針對(duì)DHPRα(一種T小管的標(biāo)志物)和RyRl(一種SR終池的標(biāo)志物)的免疫組化。在WT肌纖維的橫切面中，T小管和SR的終池均展現(xiàn)出沿肌纖維均衡分布的點(diǎn)樣染色模式(圖6Β)，這反映了三聯(lián)征相對(duì)于肌節(jié)的橫向取向。然而，在dKO肌纖維中，T小管和SR均顯示聚集的染色、在一些區(qū)域染色的缺失、和各纖維中不規(guī)則的分布(圖6B)。另外，在WT肌中，臨近肌纖維顯示相同的染色模式。然而，在dKO肌中，臨近肌纖維經(jīng)常展現(xiàn)出不同的染色模式(圖6B)，表明在臨近纖維中三聯(lián)征的不同取向。在4周齡當(dāng)dKO小鼠未形成CNM時(shí)，T小管結(jié)構(gòu)正常，如由DHPRa染色顯示的(圖OT)。[0129]進(jìn)一步通過(guò)電子顯微鏡分析了三聯(lián)征在超微結(jié)構(gòu)水平上的形態(tài)學(xué)(圖6，C-J)。在成年dKOTA肌纖維中，一些T小管(用鐵氰化鉀染黑)顯示異常形態(tài)學(xué)和與肌原纖維方向排列的縱向取向；這些是很少在WT肌纖維中觀察到的(圖6，G-J)。還觀察到沿肌纖維和在dKO肌纖維中三聯(lián)征處電子致密膜狀結(jié)構(gòu)的積累(圖6，D-F)。總之，這些發(fā)現(xiàn)指示miR-133a對(duì)于T小管和三聯(lián)征的構(gòu)造是重要的，而且其缺乏導(dǎo)致T小管解體。[0130]實(shí)施例4.dKO骨骼肌中的線粒體功能障礙[0131]為了確定miR_133a的缺乏是否改變骨骼肌中的線粒體功能，從來(lái)自dKO和WT小鼠的腓腸肌的紅色和白色部分分離線粒體。緊接分離后，評(píng)估線粒體呼吸和脂肪酸氧化。對(duì)線粒體功能的評(píng)估包括:(a)呼吸控制比率(RCR)，氧化性磷酸化與ATP合成之間的偶聯(lián)；(b)ADP刺激的3態(tài)呼吸，其中線粒體產(chǎn)生ATP期間的呼吸速率；和(c)羰基氰化物-p-三氟甲氧基苯腙刺激的(FCCP刺激的)呼吸，當(dāng)氧化性磷酸化從ATP合成解偶聯(lián)時(shí)的最大呼吸速率。這些測(cè)量中任一種的降低均表明電子傳遞鏈、Krebs循環(huán)或ATP合酶活性中的缺陷。miR-133a的缺乏導(dǎo)致紅色和白色肌中RCR、ADP刺激的3態(tài)呼吸、和FCCP刺激的最大呼吸中的顯著衰退，盡管對(duì)FCCP刺激的最大呼吸的影響似乎在紅色肌中更突出(圖8A)。另外，總脂肪酸氧化在從來(lái)自dKO動(dòng)物腓腸肌的紅色和白色部分分離的線粒體中也顯著更低(圖SB)。在紅色四頭肌而非白色四頭肌中的檸檬酸合酶中也有降低(圖SB)。總之，這些結(jié)果證明miR-133a的缺乏導(dǎo)致紅色和白色骨骼肌兩者中更低的內(nèi)在線粒體功能和脂肪酸氧化。[0132]實(shí)施例5.miR-133a靶向發(fā)動(dòng)蛋白2(C^的一種調(diào)節(jié)物)[0133]為了探索dKO小鼠中骨骼肌異常性的機(jī)制基礎(chǔ)，尋找在CNM中具有潛在作用的miR-133a的祀物。強(qiáng)預(yù)測(cè)的miR_133a祀物之一是Dnm2,—種牽涉胞吞作用、膜運(yùn)輸、和肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)以及微管細(xì)胞骨架的大GTP酶(11)。認(rèn)為以顯性陰性方式作用的人.Μ2基因中的點(diǎn)突變導(dǎo)致CNM的常染色體顯性形式(7，8，27，28)。Dnm2mRNA的3'UTR含有進(jìn)化上保守的miR-133a結(jié)合位點(diǎn)(圖9A)。miR-133a抑制連接于Dnn^mRNAS'UTR的螢光素酶報(bào)告基因，而3'UTR中預(yù)測(cè)的miR-133a結(jié)合位點(diǎn)中的突變阻止抑制(圖9B)，從而確認(rèn)了Dnm2mRNA為miR_133a的靶物。而且，與WT小鼠相比，觀察到通過(guò)定量實(shí)時(shí)RT-PCR的Dnm2mRNA中的2倍增加和通過(guò)Western印跡分析的dKOTA肌中發(fā)動(dòng)蛋白2蛋白中的約7倍增加(圖9，C和D)。這些結(jié)果指示miR-133在mRNA和蛋白質(zhì)水平上均抑制發(fā)動(dòng)蛋白2表達(dá)。[0134]實(shí)施例6.發(fā)動(dòng)蛋白2在骨骼肌中的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致II型肌纖維中的CNM[0135]為了檢查如在dKO肌纖維中觀察到的升高的發(fā)動(dòng)蛋白2表達(dá)是否足以導(dǎo)致CNM，生成其中在肌CK(MCK)啟動(dòng)子控制下表達(dá)發(fā)動(dòng)蛋白2蛋白(在C末端具有myc標(biāo)簽)的轉(zhuǎn)基因小鼠(本文中稱為MCK-DYN2小鼠)(29，30)。通過(guò)Western印跡使用針對(duì)發(fā)動(dòng)蛋白2以及myc表位標(biāo)簽的抗體來(lái)確認(rèn)轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼肌中發(fā)動(dòng)蛋白2蛋白的過(guò)表達(dá)(圖10A)。觀察到兩種MCK-DYN2轉(zhuǎn)基因小鼠系Tgl和Tg2相比于WT水平分別顯示3倍和6倍的發(fā)動(dòng)蛋白2過(guò)表達(dá)。在7周齡時(shí)，兩種轉(zhuǎn)基因系展現(xiàn)中央核性肌纖維的累積(圖10B)。有趣的是，在類似于dKO小鼠的水平過(guò)表達(dá)發(fā)動(dòng)蛋白2的Tg2小鼠在TA肌中展現(xiàn)出與dKO小鼠的那些可比的年齡依賴性中央核性肌纖維(圖10C)。[0136]在11周齡時(shí)，Tg2小鼠展現(xiàn)出肌萎縮的跡象，在TA和G/P肌兩者中肌重量均降低(圖11A)。在Tg2和WT同窩出生者之間的體重中沒(méi)有差異(圖11A)。對(duì)TA肌的組織學(xué)分析顯示異質(zhì)的纖維大小和中央核性纖維在Tg2小鼠中的存在(圖10D)。中央核性肌纖維在Tg2小鼠TA肌中的百分?jǐn)?shù)在該年齡時(shí)為約23%(數(shù)據(jù)未顯示)。NADH-TR染色揭示氧化性酶活性和輻射狀肌原纖維間網(wǎng)絡(luò)的異常聚集(圖10D)。還在Tg2TA肌中觀察到T小管的異常構(gòu)造，如通過(guò)針對(duì)DHPRa的免疫組化檢測(cè)到的(圖11B)。[0137]發(fā)動(dòng)蛋白2蛋白未在Tg2小鼠的比目魚肌或心臟中顯著過(guò)表達(dá)(圖11C)，這與II型肌纖維中MCK啟動(dòng)子的優(yōu)先表達(dá)一致(29，30)。因此，不令人驚訝地觀察到在Tg2小鼠的比目魚肌或心臟功能中沒(méi)有`異常(圖1lC且數(shù)據(jù)未顯示)。[0138]為了評(píng)估肌性能，小鼠進(jìn)行下坡踏車跑動(dòng)并分析到力竭時(shí)的跑動(dòng)時(shí)間和距離。在10周齡時(shí)，Tg2小鼠跑動(dòng)的時(shí)間顯著短于WT小鼠(圖10E)，指示肌無(wú)力。dKO小鼠顯示在跑動(dòng)能力中更急劇的降低(圖10E)。然而，dKO小鼠中受損的心功能也可能是運(yùn)動(dòng)能力降低的作用因素。[0139]最近在人DW2有關(guān)的CNM患者以及攜帶R456WDnm2突變的雜合小鼠中報(bào)告了Dysferlin的胞內(nèi)累積(9)。還分析了Dysferlin在dKO肌和Tg2肌中的定位。有趣的是，在dKO和Tg2肌纖維兩者中均觀察到肌纖維內(nèi)Dysferlin的實(shí)質(zhì)性累積(圖12，A和B)。此外，至少一些胞內(nèi)Dysferlin與發(fā)動(dòng)蛋白2在dKO肌纖維中共定位(圖12A)。[0140]這些結(jié)果證明骨骼肌中升高的Dnm2表達(dá)導(dǎo)致CNM，主要在II型纖維中，其模擬dKO表型。因此，可至少部分通過(guò)Dnm2的失調(diào)來(lái)解釋dKO肌中的CNM。[0141]實(shí)施例8.dKO小鼠在比目魚肌中顯示增加的I型肌纖維[0142]除了CNM以外，dKO小鼠還在不顯示CNM的比目魚肌中顯示增加的I型纖維數(shù)。分析來(lái)自成年dKO小鼠的比目魚肌的纖維類型組成，其通過(guò)異染性ATP酶染色和針對(duì)I型肌球蛋白重鏈(MHC)的免疫組化，由深褐色染色顯示。WT小鼠的比目魚肌包含約43%的I型纖維(圖13，A和B)。dKO小鼠的比目魚肌顯示I型纖維數(shù)中的2倍增加(圖13，A和B)。[0143]對(duì)編碼各MHC同等型的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)的定量實(shí)時(shí)RT-PCR分析揭示，dKO比目魚肌中相比于WT小鼠I型MHC(MHC-1)的增加和II型MHC(MHC-1Ia,MHC-1Ix/d和MHC-1Ib)中的降低(圖13C)。通過(guò)對(duì)甘油凝膠的銀染色檢查比目魚肌、EDL和TA肌中MHC同等型的蛋白質(zhì)組成:有3條帶存在于從WT小鼠分離的比目魚肌的蛋白質(zhì)提取物中，對(duì)應(yīng)于MHCIIa/IIx,MHC-1Ib和MHC-1蛋白；2條帶存在于來(lái)自WT小鼠的TA和EDL肌的蛋白質(zhì)提取物中，代表MHC-1Ib和MHC-1Ia/IIx(圖13C)。與來(lái)自定量實(shí)時(shí)RT-PCR的結(jié)果一致，dKO小鼠的比目魚肌展現(xiàn)出MHC-1蛋白中的增加和MHCIIa/IIx蛋白中的降低。未在dKO比目魚肌中觀察到MHC-1Ib蛋白。有趣的是，在dKO小鼠TA和EDL肌中相比于WT小鼠氧化性MHCIIa/IIx蛋白增加而糖分解性MHC-1Ib蛋白降低，其指示這些肌組還展現(xiàn)出朝向更氧化性(IIa型)纖維的纖維類型轉(zhuǎn)移。[0144]為了確定miR_133a的喪失是否在胚胎發(fā)育期間影響I型纖維的形成，通過(guò)免疫組化在Pl檢查MHC-1表達(dá)。在PldKO小鼠的比目魚肌或EDL肌的MHC-1陽(yáng)性肌纖維數(shù)中沒(méi)有明顯差異(圖14A)，其指示miR-133a不影響I型肌纖維的胚胎發(fā)育。為了確定dKO小鼠中何時(shí)發(fā)生纖維類型轉(zhuǎn)換，通過(guò)異染性ATP酶染色分析2周齡和4周齡小鼠兩者中的纖維類型組成。在這兩種年齡處，dKO小鼠比目魚肌中I型纖維的百分?jǐn)?shù)增加了幾乎2倍(圖14B)。因此，miR-133a在胚胎發(fā)育期間不影響I型肌纖維的規(guī)范。相反，miR_133a在出生后抑制I型肌纖維，從而miR-133a的缺失導(dǎo)致成年小鼠I型肌纖維中的增加。[0145]本實(shí)施例顯示缺少miR_133a的成年小鼠形成進(jìn)行性CNM，其伴隨有線粒體功能障礙和快到慢的肌纖維轉(zhuǎn)化。如此，miR-133a的缺失導(dǎo)致CNM、線粒體功能障礙、肌三聯(lián)征混亂和快到慢的肌纖維轉(zhuǎn)化(II型到I型)。這些肌異常至少可部分歸因于發(fā)動(dòng)蛋白2(—種由miR-133a-l和miR-133a-2抑制的靶物)的上調(diào)。如此，所述發(fā)現(xiàn)例示了miR_133a在維持成年骨骼肌結(jié)構(gòu)和功能中的必要作用，以及作為CNM調(diào)控物。MiR-133a在維持成年骨骼肌的正常結(jié)構(gòu)和功能中具有作用。[0146]dKO小鼠中的骨骼肌異常與人CNM的那些非常相似，指示該miRNA在調(diào)控此病癥中的重要作用。dKO肌的組織學(xué)特征，包括中央核性纖維的存在和壞死或肌纖維死亡的缺失，顯示了與人CNM的類似性。dKO纖維中的NADH-TR染色模式模擬D匪有關(guān)CNM的典型NADH-TR染色模式，其顯示肌質(zhì)鏈的徑向分布(2)。然而，與人CNM相反，在dKO小鼠的II型纖維而非I型纖維中觀察到中央核性纖維。小鼠骨骼肌中miR-133a的喪失僅在II型纖維中導(dǎo)致CNM，這與人EMC有關(guān)的CNM患者中I型纖維占優(yōu)勢(shì)相反。很可能是因?yàn)樵谛∈笾?，比目魚肌受到保護(hù)免于肌損傷。然而，我們不能排除比目魚肌富集的miR-133b(與miR-133a高度同源)保護(hù)比目魚肌免于CNM的可能性。dKO小鼠比目魚肌中CNM的缺乏可能是由于在比目魚肌中富集的miR-133b的表達(dá)?；蛘?，小鼠和人之間中央化細(xì)胞核的肌纖維分布中的差異可能反映肌功能中的物種差異。[0147]發(fā)明人先前報(bào)告了缺少Srpk3基因的小鼠中的II型纖維特異性CNM，Srpk3基因編碼受MEF2調(diào)節(jié)的肌特異性絲氨酸、精氨酸蛋白激酶(SRPK)(31)。鑒于本研究中Srpk3-空(null)小鼠和dKO小鼠的骨骼肌之間的組織學(xué)相似性，可能miR-133a和Srpk3經(jīng)由通用機(jī)制作用于影響肌結(jié)構(gòu)和功能。[0148]已將.Μ2基因內(nèi)的許多錯(cuò)義突變與常染色體顯性CNM關(guān)聯(lián)(7，8，27，28)。有趣的是，這些突變是雜合的錯(cuò)義突變或小缺失，其不影響D匪2轉(zhuǎn)錄本水平、蛋白質(zhì)表達(dá)或定位(8，28)。然而，CNM有關(guān)的突變?nèi)绾斡绊慏W2細(xì)胞功能的機(jī)制未知。[0149]實(shí)施例顯示miR-133a直接調(diào)節(jié)Dnm2mRNA和發(fā)動(dòng)蛋白2蛋白表達(dá)。此外，骨骼肌中升高的Dnm2表達(dá)(以與dKO小鼠中的那些可比的水平)導(dǎo)致CNM，其指示骨骼肌功能依賴于準(zhǔn)確的D匪2表達(dá)水平。盡管確切的機(jī)制未知，但可能增加的發(fā)動(dòng)蛋白2蛋白導(dǎo)致異常的強(qiáng)發(fā)動(dòng)蛋白裝配并破壞有效裝配和解體的能量平衡，該平衡是骨骼肌中適宜的D匪2功能所需要的。在此方面，已報(bào)告人中CNM相關(guān)性D匪2突變以顯性-陰性方式作用于消弱膜運(yùn)輸、細(xì)胞骨架有關(guān)的過(guò)程和中心體功能(8，28)。[0150]不清楚dKO小鼠和MCK-DW2轉(zhuǎn)基因小鼠中Dnm2獲得功能如何也導(dǎo)致CNM。然而，最近的一項(xiàng)研究顯示特定的CNM相關(guān)的D匪2突變導(dǎo)致增加的GTP酶活性并促進(jìn)發(fā)動(dòng)蛋白寡聚化而不改變脂質(zhì)結(jié)合(32)。另一項(xiàng)研究還顯示CNM相關(guān)的D匪2突變?cè)鰪?qiáng)發(fā)動(dòng)蛋白聚合物的穩(wěn)定性而不損害其結(jié)合和/或水解GTP的能力(33)。在另一項(xiàng)研究中，表達(dá)最頻繁的Dnm2突變R456W的雜合小鼠形成具有肌萎縮和無(wú)力但并非CNM的肌病(9)。表明發(fā)動(dòng)蛋白2對(duì)收縮特性和核定位的影響是獨(dú)立的。有趣的是，實(shí)施例顯示Dnm2在骨骼肌中的過(guò)表達(dá)影響肌功能和核位置兩者。這些表型中的差異可由使用的不同模型系統(tǒng)解釋(即過(guò)表達(dá)對(duì)敲入)。但是，實(shí)施例證明骨骼肌對(duì)發(fā)動(dòng)蛋白2蛋白水平敏感且升高的發(fā)動(dòng)蛋白2表達(dá)在小鼠中導(dǎo)致CNM。[0151]還預(yù)測(cè)miR-133a革巴向其他基因，如那些編碼肌動(dòng)蛋白抑制蛋白(profiling)2、鈣調(diào)蛋白UFGFRl和mastermind樣I的基因。螢光素酶報(bào)告測(cè)定了這些mRNA的3'UTR并確認(rèn)其在體外被miR-133a靶向；然而，miR_133a在體內(nèi)對(duì)它們的調(diào)節(jié)在骨骼肌中不那么突出(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，盡管miR-133a靶向骨骼肌中的多個(gè)基因，但主要影響來(lái)自其對(duì)D匪2的調(diào)節(jié)。[0152]骨骼肌由具有獨(dú)特收縮和代謝特性的異質(zhì)性肌纖維構(gòu)成(34)。成年肌纖維是高度可塑性的，且可應(yīng)答工作加載、激素刺激和疾病在I型和II型表型之間轉(zhuǎn)換。dKO小鼠的表型指示miR-133a抑制I型肌纖維基因程序。認(rèn)為I型肌纖維比II型纖維對(duì)疾病或損傷更具抗性(35)。在許多肌肉疾病如迪謝內(nèi)肌營(yíng)養(yǎng)不良中，存在向I型的纖維類型轉(zhuǎn)換，其可能充當(dāng)保護(hù)性機(jī)制(36，37)?？赡躣KO肌中纖維類型中的變化繼發(fā)于CNM表型。[0153]線粒體功能障礙牽連于許多肌病，包括迪謝內(nèi)肌營(yíng)養(yǎng)不良和代謝性和神經(jīng)學(xué)病癥(38-40)，以及老化過(guò)程(41，42)。來(lái)自實(shí)施例的結(jié)果與先前的發(fā)現(xiàn)，即線粒體異常與.Μ2相關(guān)的CNM有關(guān)一致(43)。然而，該結(jié)果可能似乎與dKO小鼠中快到慢的肌纖維轉(zhuǎn)化不相容，因?yàn)檎J(rèn)為I型纖維具有更多的氧化性酶活性。然而，不清楚在該差異下的確切機(jī)制且有幾種可能的解釋。到I型纖維的轉(zhuǎn)換可能是不影響線粒體含量的肌球蛋白組成中變化的結(jié)果。另外，快到慢的肌纖維轉(zhuǎn)化與毛細(xì)管和線粒體密度中的增加有關(guān)。這并未考慮各線粒體的功能能力。最后，線粒體功能中的損傷導(dǎo)致肌肉的降低的ATP可獲性。如此，可能dKO肌中的纖維類型轉(zhuǎn)化是針對(duì)線粒體功能障礙和降低的ATP可獲性的保護(hù)機(jī)制(35)。[0154]來(lái)自實(shí)施例的結(jié)果證明，在心臟和骨骼肌兩者中均表達(dá)的miR_133a在這些組織中起著不同作用。在心臟中，miR-133a在心臟形成期間調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞增殖并抑制平滑肌基因程序(18)。miR-133a是骨骼肌發(fā)育不必要的，因?yàn)閐KO小鼠直至4周齡后才展現(xiàn)出任何骨骼肌異常。dKO小鼠的骨骼肌在4周齡后形成CNM，而心臟在更后的年齡形成擴(kuò)張型心肌病，其在一小組小鼠中導(dǎo)致心力衰竭和猝死(18)。有趣的是，dKO小鼠的心臟在4月齡時(shí)顯示突出的肌節(jié)解體和受破壞的Z盤，以及嚴(yán)重的線粒體異常(18)。在另一方面，肌節(jié)結(jié)構(gòu)和線粒體形態(tài)在dKO骨骼肌中很大程度上未受影響(圖3)。更確切地，miR-133a特定地影響骨骼肌纖維中的三聯(lián)征。不清楚為何心臟和骨骼肌應(yīng)答miR-133a的損失顯示不同的異常性。它可能反映了miR-133a對(duì)骨骼肌(如發(fā)動(dòng)蛋白2)和心臟(如細(xì)胞周期蛋白D2和SRF)中不同靶基因的調(diào)節(jié)。另一個(gè)原因可能是以下事實(shí)，即在dKO骨骼肌中而非dKO心臟中表達(dá)高度同源的miR-133b，雖然以較低的水平。盡管可想到dKO小鼠中的心肌病可能有作用，但CNM與其他心肌病小鼠模型不相關(guān)。因此，所述結(jié)果指示，認(rèn)為dKO小鼠中由miR-133a調(diào)節(jié)的骨骼肌異常主要由miR-133a在骨骼肌中的細(xì)胞自發(fā)(autonomous)功能導(dǎo)致。[0155]dKO小鼠和人CNM患者中骨骼肌異常的相似性表明，miR-133a在人肌病中起著調(diào)控作用。在這一方面,本發(fā)明提供了用于調(diào)控miR-133amRNA靶物如.Μ2的組合物和方法，其通過(guò)施用miR-133a激動(dòng)劑如miR_133a多核苷酸。[0156]^[0157]MCK-DNM2轉(zhuǎn)某閔小鼠的牛成。MCK-DNM2轉(zhuǎn)基因通過(guò)將C末端帶myc標(biāo)簽的大鼠Dnm2cDNA(來(lái)自J.Albanesi,UniversityofTexasSouthwesternMedicalCenter,Dallas,Texas,USA的贈(zèng)禮)置于4.8_kbMCK啟動(dòng)子下游生成。該構(gòu)建體含有下游人生長(zhǎng)激素聚(A)信號(hào)。轉(zhuǎn)基因小鼠如先前描述的生成(44，45)。分析兩個(gè)稱為Tgl和Tg2的Fl系。[0158]Northern印跡分析。從小鼠骨盤肌組織分離總RNA,其使用miRNeasy迷你試劑盒(QIAGEN)。如先前描述的實(shí)施Northern印跡來(lái)檢測(cè)miR_133a和U6(18)。在雜交中使用用32P標(biāo)記的Star-Fire寡核苷酸探針(IDT)對(duì)成熟miR_133a和U6探針。[0159]RT-PCR和實(shí)時(shí)分析。將RNA用TurboRNase-freeDNase(AmbionInc.)處理，接著進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄步驟。使用隨機(jī)六聚體引物(Invitrogen)實(shí)施RT-PCR。使用TaqMan探針(ABI)或SybrGreen探針實(shí)施定量實(shí)時(shí)RT-PCR。圖6中使用的SybrGreen引物(如(3)描述的):[0160]CacnalsFor引物:5，—tccagctactgccatgctgat-3，(SEQIDNO:5)[0161]CacnalsRev引物5，_tcgacttcctctggttccat_3’(SEQIDNO:6)[0162]CacnblFor引物5，-ctttgcctttgagctagacc-3’(SEQIDNO:7)[0163]CacnblRev引物5，-gcacgtgctctgtcttctta-3’(SEQIDNO:8)[0164]CacnglFor引物5，-catctgcgcatttctgtcct-3，(SEQIDNO:9)[0165]CacnglRev引物5，-atcatacgcttcaccgactg-3，(SEQIDNO:10)[0166]RyrlFor引物5，-gttatcgtcattctgctggc-3，(SEQIDNO:11)[0167]RyrlRev引物5，-gcctattccacagatgaagc-3，(SEQIDNO:12)[0168]Atp2alFor引物5，-tggctcatggtcctcaagat-3，(SEQIDNO:13)[0169]Atp2alRev引物5，-cctcagctttggctgaagat-3’(SEQIDNO:14)[0170]Atp2a2For引物5，-agcttggagcaggtcaagaa-3，(SEQIDNO:15)[0171]Atp2a2Rev引物5，-gctctacaaaggctgtaatcg-3，(SEQIDNO:16)[0172]CasqlFor引物5，-actcagagaaggatgcagct-3，(SEQIDNO:17)[0173]CasqlRev引物5，-ctctacagggtcttctagga-3’(SEQIDNO:18)[0174]Casq2For引物5，-gtgtcttcagacaaggtctc-3’(SEQIDNO:19)[0175]Casq2Rev引物5，-acccttcagaacatacaggc-3’(SEQIDNO:2。)。[0176]圖13中使用的SybrGreen引物(如(52)中描述的):[0177]MHC-1For引物5，-CCTTGGCACCAATGTCCCGGCTC-3，(SEQIDN0:21)[0178]MHC-1Rev引物5，-GAAGCGCAATGCAGAGTCGGTG-3’(SEQIDNO:22)[0179]MHC-1IaFor引物5，-ATGAGCTCCGACGCCGAG-3’(SEQIDNO:23)[0180]MHC-1IaRev引物5，-TCTGTTAGCATGAACTGGTAGGCG-3，(SEQIDNO:24)[0181]MHC-1IxFor引物5，-AAGGAGCAGGACACCAGCGCCCA-3，(SEQIDNO:25)[0182]MHC-1IxRev引物5，-ATCTCTTTGGTCACTTTCCTGCT-3’(SEQIDNO:26)[0183]MHC-1IbFor引物5，-GTGATTTCTCCTGTCACCTCTC-3’(SEQIDNO:27)[0184]MHC-1IbRev引物5，-GGAGGACCGCAAGAACGTGCTGA-3’(SEQIDNO:28)。[0185]依照制造商方案使用Taq-ManmiRNA測(cè)定試劑盒(ABI)來(lái)實(shí)施miRNA上的定量實(shí)時(shí)RT-PCR。[0186]骨骼肌的組織學(xué)分析。收獲各種肌肉組，速凍于含有TissueFreezingMedium(TriangleBiomedicalSciences)和黃苗膠(Sigma-Aldrich)的3:1混合物的包埋培養(yǎng)基，或固定在4%多聚甲醒(paraformaldehyde)中，并加工用于常規(guī)石臘組織學(xué)。將冷凍的切片在低溫切片機(jī)(cryotome)上切割并用H&E染色，如先前描述的(45)。依照標(biāo)準(zhǔn)方案實(shí)施在冷凍切片上的NADH-TR染色。如先前描述的實(shí)施在冷凍切片上的異染性ATP酶染色(44，45)。為了測(cè)定具有中央化細(xì)胞核的肌纖維的數(shù)目，在每只小鼠中對(duì)TA和G/P肌計(jì)算超過(guò)500根肌纖維，而對(duì)比目魚肌和EDL肌計(jì)算超過(guò)300根肌纖維。使用ImageJ測(cè)定肌纖維橫截面面積，并檢查超過(guò)200根纖維每肌肉切面。[0187]電子顯微鏡。將小鼠麻醉，然后用0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.3)接著是0.1M二甲胂酸鈉緩沖液中2.5%戍二醒和2%多聚甲醒經(jīng)心臟(transcardially)灌注。將TA肌切開(kāi)并加工用于T小管的選擇性染色，如先前描述的(3)。[0188]EBD攝取。如先前描述的實(shí)施EBD攝取(46)。簡(jiǎn)言之，對(duì)小鼠腹膜內(nèi)施用(0.1ml每IOg體重)EBD(10mg/ml于PBS)。使用轉(zhuǎn)動(dòng)車輪過(guò)夜讓小鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)(所有小鼠均經(jīng)歷車輪跑動(dòng))，并在約18小時(shí)后收獲肌肉。將腓腸肌和TA肌速凍于包埋介質(zhì)中。將冷凍的切片用一抗家兔抗核纖層蛋白(Sigma-Aldrich,1:200),接著是二抗綴合AlexaFluor488的山羊抗家兔IgG(Invitrogen，1:400)免疫染色。EBD使用熒光顯微鏡檢測(cè)為紅色自體熒光。[0189]免疫組化。將冷凍的切片在新鮮制備的4%多聚甲醛中在冰上固定20分鐘，然后用PBS中0.3%TritonX-100在室溫處理20分鐘。將切片與在PBS中0.01%TritonX-100中稀釋的小鼠IgG`封閉溶液(來(lái)自M.0.M.試劑盒(VectorLab))于室溫溫育I小時(shí)。然后將切片與M.0.M.蛋白稀釋劑中5%山羊血清(Sigma-Aldrich)溫育30分鐘。將切片與在M.0.M.蛋白稀釋劑中稀釋的一抗于4°C過(guò)夜溫育。第二天早上，將載玻片用PBS清洗并與在M.0.M.蛋白稀釋劑中稀釋的二抗于室溫溫育45分鐘。然后，清洗切片并用VectoShieldMountingMedium和DAPI封固。用Zeiss共聚焦顯微鏡取圖像。一抗和二抗如下:DHPRa(ThermoScientific,1:100)、RyRl(克隆34C,Sigma-Aldrich,1:100)、核纖層蛋白(Sigma-Aldrich,1:200)、MHC-1(克HN0Q7.5.4D,Sigma-Aldrich,1:5,000)>Dysferlin(Hamlet,Novocastra,1:40)>發(fā)動(dòng)蛋白2(Abeam,1:400)、綴合AlexaFluor594的山羊抗小鼠IgGl(Invitrogen,1:400)、綴合AlexaFluor488的山羊抗家兔IgG(Invitrogen，1:400)。如先前描述的實(shí)施小麥胚凝集素染色(46)。將MHC-1(克隆N0Q7.5.4D,Sigma-Aldrich,1:5,000)用于I型肌球蛋白的初級(jí)檢測(cè)，而將綴合HRP的二抗(A8924,Sigma-Aldrich)接著是DAB發(fā)色團(tuán)反應(yīng)(DAKO)用于檢測(cè)。然后將樣品用蘇木精復(fù)染色。[0190]Western印跡分析。從骨骼肌組織提取總細(xì)胞裂解物并在SDS-PAGE上解析。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行Western印跡。使用針對(duì)發(fā)動(dòng)蛋白2(SantaCruzBiotechnology,1:100)、c-Myc(SantaCruzBiotechnology,1:1,000)>DHPRa(ThermoScientific,1:100)、RyRl(克隆34C,Sigma-Aldrich,1:100)、SERCA2(BDBiosciences,1:1,000),sarcolipin(來(lái)自M.Periasamy,OhioStateUniversity,Columbus,Ohio,USA的贈(zèng)禮，1:1，000)、受磷蛋白(Upstate,1:1,000)、磷酸受磷蛋白(Millipore,1:1,000)、肌集鈣蛋白2(SantaCruz,1:1,000)、微管蛋白(Sigma-Aldrich,1:5,000)和α-肌動(dòng)蛋白(Sigma-Aldrich,1:2，000)的抗體。對(duì)Western印跡的定量通過(guò)密度計(jì)量使用PhosphoImager實(shí)施。[0191]細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和帝光素酶測(cè)定。將含有miR-133a結(jié)合位點(diǎn)的Dnm23'UTRl-kb片段克隆到pMIRREPORT載體(Ambion)中。如先前描述的實(shí)施miR_133a結(jié)合位點(diǎn)的誘變、細(xì)胞培養(yǎng)和螢光素酶測(cè)定(18)。[0192]踏車測(cè)試。使用Exer_6M(ColumbusInstruments)在15。下坡實(shí)施踏車測(cè)試。在踏車上以5m/min5分鐘訓(xùn)練小鼠達(dá)2個(gè)連續(xù)日。接下來(lái)的一天，小鼠在踏車上以5m/min2分鐘，以7m/min2分鐘，8m/min2分鐘,和10m/min5分鐘跑動(dòng)。其后，速度以lm/min增加至最終速度20m/min。力竭定義為盡管電刺動(dòng)物也不能保持在踏車上。[0193]MHC同等型的電泳。從骨骼肌分離肌球蛋白并通過(guò)在甘油-SDS-PAGE凝膠上電泳分開(kāi)，如先前描述的(47)。將凝膠用硝酸銀染色試劑盒(Bio-Rad)染色。[0194]從腓腸肌分離線`粒體。線粒體分離自從腓腸肌切開(kāi)的紅色和白色骨骼肌，如先前描述的(48)，但有修改。將組織樣品收集在含67mM蔗糖、50mMTris/HCl、50mMKClUOmMEDTA/Tris和10%牛血清清蛋白的緩沖液中。將樣品切碎并在0.05%胰蛋白酶中消化30分鐘。然后，將樣品勻漿，通過(guò)差速離心分離線粒體。[0195]分離的線粒體中的呼吸。使用XF24胞外通量分析儀(extracellularfluxanalyzer)(SeahorseBioscience)來(lái)實(shí)施對(duì)分離的線粒體的呼吸測(cè)量。在分離和蛋白定量后，立即將線粒體以5μg/孔鋪板于Seahorse細(xì)胞培養(yǎng)板上，其在存在IOmM丙酮酸鹽和5mM蘋果酸鹽的情況下。實(shí)驗(yàn)組成為25秒混合和4至7分鐘的測(cè)量周期。在基礎(chǔ)條件、ADP刺激的(5mM)3態(tài)呼吸、寡霉素誘導(dǎo)的(2μM)4態(tài)呼吸和在存在FCCP(0.3μM)情況下的解偶聯(lián)呼吸測(cè)量氧消耗以評(píng)估最大氧化性能力。RCR計(jì)算為3態(tài)/4態(tài)呼吸比率。所有實(shí)驗(yàn)均在37°C實(shí)施。[0196]脂肪酸代謝。在分離的線粒體中通過(guò)測(cè)量并加總來(lái)自[1-14C]-棕櫚酸氧化的14CO2產(chǎn)生和用14C標(biāo)記的酸可溶性代謝物來(lái)評(píng)估脂肪酸氧化，如先前描述的(49，50)。如先前描述的測(cè)量檸檬酸合酶活性(51)。[0197]動(dòng)物護(hù)理。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)規(guī)程均由InstitutionalAnimalCareandUseCommitteesofUniversityofTexasSouthwesternMedicalCenter評(píng)審和批準(zhǔn)。[0198]統(tǒng)計(jì)。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為均倌土SEM。使用不配對(duì)雙加尾的Student’st檢驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)組間差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。低于0.05的P值視為顯著的。[0199]參考文獻(xiàn)[0200]1.JungbluthH,Wallgren-PetterssonC，LaporteJ.Centronuclear(myotubular)myopathy.0rphanetJRareDis.2008;3:26.[0201]2.RomeroNB.Centronuclearmyopathies:awideningconcept.NeuromusculDisord.2010;20(4):223-228.[0202]3.Al-QusairiL等，T_tubuledisorganizationanddefectiveexcitation-contractioncouplinginmusclefiberslackingmyotubularinlipidphosphatase.ProcNatlAcadSciUSA.2009;106(44):18763-18768.[0203]4.Buj-Bel1A等，AAV-mediatedintramuscuIardeliveryofmyotubularincorrectsthemyotubularmyopathyphenotypeintargetedmurinemuscleandsuggestsafunctioninplasmamembranehomeostasis.HumMolGenet.2008;17(14):2132-2143.[0204]5.Buj-BelloA等，Thelipidphosphatasemyotubularinisessentialforskeletalmusclemaintenancebutnotformyogenesisinmice.ProcNatlAcadSciUSA.2002;99(23):15060-15065.[0205]6.DowlingJJ等，LossofmyotubularinfunctionresultsinT—tubuledisorganizationinzebrafishandhumanmyotubularmyopathy.PLoSGenet.2009;5(2):el000372.[0206]7.BitounM等，Dynamin2mutationscausesporadiccentronuclearmyopathywithneonatalonset.AnnNeurol.2007;62(6):666-670.[0207]8.BitounM等,Mutationsindynamin2causedominantcentronuclearmyopathy.NatGenet.2005;37(11):1207-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