作為缺血性腦損傷的有效神經(jīng)保護(hù)劑并用于治療疼痛的psd-95的高親和力的二聚抑制劑的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了nNOS、PSD-95、和NMDA受體的三元蛋白復(fù)合物的新穎有效抑制劑以及用于預(yù)防和/或治療受試者的與興奮性毒素相關(guān)的疾病和慢性疼痛癥狀的包含此抑制劑的醫(yī)藥組合物。所述抑制劑是二聚PSD-95抑制劑，其包含通過(guò)連接子連接第二肽或肽類(lèi)似物的第一肽或肽類(lèi)似物，其中第一肽或肽類(lèi)似物和第二肽或肽類(lèi)似物包含至少四個(gè)酰胺鍵合的具有序列YTXV或YSXV的殘基，其中a.Y選自E、Q、和A，或其類(lèi)似物，以及b.X選自A、Q、D、N、N-Me-A、N-Me-Q、N-Me-D、和N-Me-N或其類(lèi)似物，其中細(xì)胞穿透肽(CPP)連接到連接子或第一和第二肽或肽類(lèi)似物的氨基酸側(cè)鏈。所述連接子可為PEG或NPEG連接子。
【專(zhuān)利說(shuō)明】作為缺血性腦損傷的有效神經(jīng)保護(hù)劑并用于治療疼痛的PSD-95的高親和力的二聚抑制劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]支架蛋白PSD-95是一種用于治療缺血性中風(fēng)和創(chuàng)傷性腦損傷以及用于慢性疼痛癥狀(例如，神經(jīng)性及炎性疼痛)的潛在標(biāo)靶。本發(fā)明涉及用作與PSD-95-相關(guān)的蛋白-蛋白相互作用的抑制劑的二聚肽類(lèi)似物的供應(yīng)。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白-蛋白相互作用(PPI)對(duì)于重要細(xì)胞過(guò)程至關(guān)重要，并涉及多種病理生理學(xué)狀態(tài)，其中它們作為治療干預(yù)的潛在標(biāo)祀。PPI已普遍被認(rèn)為難以成為治療分子的標(biāo)祀，因?yàn)樗麄兂＞哂写蟆⑵教?、及疏水性界面的特征?br> [0003]一類(lèi)PPI為涉及PDZ域的一類(lèi)[PDZ是突觸后密度蛋白-95(PSD_95)、果蠅同源盤(pán)狀巨大腫瘤抑制劑(DlgA)和閉鎖小帶-1蛋白(Z0-1)的縮寫(xiě)]。PDZ域常用作細(xì)胞中大蛋白復(fù)合物組裝所涉及的支架蛋白的模塊，并且富含于真核生物中。PDZ域包含約90個(gè)氨基酸并常與相互作用蛋白的C-端相互作用。PSD-95含有三個(gè)PDZ域(H)Zl-3)，其結(jié)合具有共有序列 Glu/Gln-Ser/Thr-X-Val-COOH 的肽配體。
[0004]PDZ域與C-端肽的相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)先通過(guò)與天然肽配體CRIPT(序列:YKQTSV)復(fù)合的PSD-95的H)Z3的X-射線結(jié)晶結(jié)構(gòu)闡明。TOZ3含有六個(gè)反向平行的(6-折疊(PA-PF)和兩個(gè)a-螺旋UA和a B)，C-端肽配體以另一個(gè)反向平行的P -折疊結(jié)合到PB折疊與aB螺旋之間的凹槽中。肽配體的兩個(gè)殘基被認(rèn)為對(duì)親和力和特異性特別重要，第一個(gè)(P°)和第三個(gè)(P—2)氨基酸(從C-端數(shù)起)。將P°位置的氨基酸的側(cè)鏈伸入疏水性袋中并需要具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸(Val、I Ie和Leu)。在H)Z3-CRIPT結(jié)構(gòu)中，Thr(P_2)中羥基氧與His372的咪唑側(cè)鏈中的氮形成氫鍵。保守Gly-Leu-Gly-Phe (PDZ3的322-325位)基序和PDZ域中帶正電的殘基(PDZ3中Arg318)調(diào)節(jié)與C-端羧酸基團(tuán)的結(jié)
八
口 o
[0005]PSD-95中rozi和H)Z2域與多種蛋白相互作用，包括同時(shí)結(jié)合N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)型親離子谷氨酸受體和一氧化氮產(chǎn)生酶、神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)(圖1)。NMDA受體是涉及神經(jīng)退化性疾病和急性腦損傷的興奮毒性的主要介質(zhì)，但是NMDA受體的拮抗劑通過(guò)阻止谷氨酸介導(dǎo)的離子流來(lái)有效降低興奮毒性，它們也阻止重要的生理過(guò)程。因此，NMDA受體拮抗劑因?yàn)榈湍褪苄圆⑷狈πЯΧ茨苡糜谥酗L(fēng)臨床試驗(yàn)。但是，可利用PSD-95抑制劑擾亂細(xì)胞內(nèi)nNOS/PSD-95/NMDA受體復(fù)合物對(duì)興奮毒性特異地抑制(圖1)。PSD-95通過(guò)TOZl和TOZ2同時(shí)地結(jié)合NMDA受體(主要是GluN2A和GluN2B亞單位)和nNOS。使NMDA受體活化產(chǎn)生鈣離子內(nèi)流，其使nNOS活化，進(jìn)而產(chǎn)生一氧化氮(NO)。因此，PSD-95介導(dǎo)NMDA受體活化與NO產(chǎn)生之間的特定關(guān)聯(lián)，如果NO產(chǎn)生持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間，會(huì)對(duì)細(xì)胞有害，并且PSD-95為一種谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)中毒的關(guān)鍵促進(jìn)劑(圖1)。通過(guò)靶向PSD-95抑制nNOS/PSD-95/NMDA受體三元復(fù)合物相互作用被認(rèn)為通過(guò)損害鈣離子進(jìn)入與NO產(chǎn)生之間的功能性聯(lián)系來(lái)阻止小鼠的缺血性腦損傷，而NMDA受體的生理功能(例如，離子流和促生存信號(hào)傳導(dǎo)通道)仍完整。
[0006]先前利用九肽實(shí)現(xiàn)了對(duì)nNOS/PSD-95/NMDA受體復(fù)合物的抑制，所述九肽對(duì)應(yīng)于GluN2B的C-端并融合至HIV-1Tat肽，已知HIV-1Tat肽能夠利于其對(duì)膜和血腦屏障的穿透。此20肽(Tat-NR2B9c ;序列:YGRKKRRQRRRKLSSIESDV)在患有缺血性腦損傷的大鼠模型中表現(xiàn)出有前景的神經(jīng)保護(hù)性質(zhì)(Aarts等，Science298，2002，846-850頁(yè)，2002 ；Sun等，Stroke39，2008，2544-2553頁(yè))并且目前在臨床試驗(yàn)中作為治療缺血性腦血管的潛在藥物，如中風(fēng)。但是，此化合物因與PSD-95中H)Zl-2的低親和力(1=4.6^;參見(jiàn)后文)，可能使其成為無(wú)效的非選擇性化合物。
[0007]W02010/004003描述了通過(guò)聚乙二醇連接子(PEG)連接的二聚肽配體，其同時(shí)結(jié)合psd-95的rozi和roz2域，以及其用于治療缺血性腦血管的用途。仍需要與rozi和roz2域具有更高親和力的PSD-95抑制劑，其對(duì)治療缺血性中風(fēng)和創(chuàng)傷性腦損傷具有改善的體內(nèi)療效。
[0008]神經(jīng)性疼痛因創(chuàng)傷性損傷、手術(shù)、或例如糖尿病或自體免疫疾病的疾病對(duì)周?chē)蛑袠猩窠?jīng)系統(tǒng)造成的損傷引起。這些損傷產(chǎn)生急性相反應(yīng)，其特征在于‘傷害性疼痛’和發(fā)炎。在大多數(shù)患者中，盡管傷口愈合，但疼痛仍持續(xù)，出現(xiàn)了慢性神經(jīng)性疼痛的狀態(tài)。除了神經(jīng)損傷后所涉及的炎癥，慢性疼痛也可因?yàn)槊庖呒?xì)胞所釋放的介質(zhì)引起的炎癥引發(fā)，所述介質(zhì)使疼痛通道敏化。脊髓感覺(jué)神經(jīng)元的敏化(‘止揚(yáng)’)是神經(jīng)性疼痛與慢性炎性疼痛的共同特征，并通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間活化傷害感受器引起。此癥狀表現(xiàn)為自發(fā)性燒灼痛、對(duì)疼痛刺激的夸大反應(yīng)(痛覺(jué)過(guò)敏)、和對(duì)常見(jiàn)的非疼痛性刺激所反應(yīng)的疼痛(痛覺(jué)異常)。慢性疼痛，尤其因?yàn)樯窠?jīng)損傷導(dǎo)致的慢性疼痛，不能通過(guò)當(dāng)前藥物(例如類(lèi)鴉片和非留體抗炎藥(NSAID))很好地處理。NMDA受體拮抗劑在動(dòng)物模型和臨床環(huán)境中阻斷疼痛反應(yīng)的敏化并表現(xiàn)出良好的止痛性，但它們出現(xiàn)不可接受的副作用并因此不能臨床使用。因此，需要可改善疼痛治療(尤其與NMDA受體相關(guān)的疼痛癥狀)但避免當(dāng)前藥物不可接受的副作用的替代性藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案提供了一種化合物，其包含通過(guò)連接子連接第二肽或肽類(lèi)似物的第一肽或肽類(lèi)似物，其中所述第一和所述第二肽或肽類(lèi)似物包含至少四個(gè)酰胺鍵合的具有序列YTXV或YSXV的殘基，其中[0010]a.Y選自E、Q、和A、或其類(lèi)似物，以及
[0011]b.X 選自 A、Q、D、N、N-Me-A, N-Me-Q, N_Me_D、和 N-Me-N 或其類(lèi)似物，以及
[0012]其中具有細(xì)胞穿透肽(CPP)功能的第三肽被連接到所述連接子，其中所述第三肽包含至少4個(gè)選自精氨酸和/或賴(lài)氨酸的氨基酸殘基。優(yōu)選地，所述連接子包含PEG，其中所述PEG中至少一個(gè)氧原子被氮原子取代得到NPEG，優(yōu)選地，所述第三肽連接到所述NPEG連接子的氮原子，優(yōu)選地通過(guò)酰胺鍵連接。
[0013]本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案提供了一種化合物，其包含通過(guò)連接子連接第二肽或肽類(lèi)似物的第一肽或肽類(lèi)似物，其中該連接子包含PEG，其中所述第一肽或肽類(lèi)似物和所述第二肽或肽類(lèi)似物包含至少4個(gè)酰胺鍵合的具有序列YTXV或YSXV的殘基，其中
[0014]a.Y選自E、Q、和A、或其類(lèi)似物，以及[0015]b.X 選自 A、Q、D、N、N-Me-A、N-Me-Q、N-Me_D、和 N_Me_N 或其類(lèi)似物，其特征在于所述第三肽連接到所述第一肽或肽類(lèi)似物和所述第二肽或肽類(lèi)似物的一個(gè)殘基的側(cè)鏈，其中所述第三肽包含至少4個(gè)選自精氨酸和/或賴(lài)氨酸的氨基酸殘基并具有細(xì)胞穿透肽(CPP)功能。
[0016]在本發(fā)明的上述化合物的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述連接子是包含1-28個(gè)乙二醇部分(N=l-28)，優(yōu)選地，4至12個(gè)乙二醇部分(N=4-12)，更優(yōu)選地，4-6個(gè)乙二醇部分(N=4-6)的PEG連接子。在本發(fā)明化合物的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述連接子是PEG-二酸或NPEG-二酸，其中所述連接子中每個(gè)羧基通過(guò)酰胺鍵連接到所述第一肽或肽類(lèi)似物或所述第二肽或肽類(lèi)似物中末端殘基的末端氨基。
[0017]在本發(fā)明的上述化合物的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第三肽(CPP)包括逆倒轉(zhuǎn)肽。在本發(fā)明的上述化合物的另一個(gè) 實(shí)施方案中，所述第三肽(CPP)是Tat肽(YGRKKRRQRRR)或逆倒轉(zhuǎn)-D-Tat 肽(rrrqrrkkr)。
[0018]在本發(fā)明的上述化合物的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽或肽類(lèi)似物是長(zhǎng)度達(dá)5至10個(gè)酰胺鍵合的殘基。在本發(fā)明的上述化合物的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽由至少4個(gè)L-氨基酸殘基組成。在本發(fā)明的上述化合物的另一個(gè)實(shí)施方案中，X選自A、Q和D。在本發(fā)明的上述化合物的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽或肽類(lèi)似物被N-烷基化。
[0019]本發(fā)明又提供了一種包含PEG-二酸的連接子化合物，其中所述PEG中一個(gè)氧原子被氮原子取代得到NPEG- 二酸。在本發(fā)明的連接子化合物的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述氮原子連接保護(hù)基團(tuán)。
[0020]本發(fā)明又提供了一種用作藥物的醫(yī)藥組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的以上任一個(gè)實(shí)施方案的化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將包含根據(jù)本發(fā)明的以上任一個(gè)實(shí)施方案的化合物的醫(yī)藥組合物用于預(yù)防和/或治療受試者的與興奮性毒素相關(guān)的疾病。
[0021]本發(fā)明又提供了一種用于預(yù)防和/或治療受試者疼痛的包含根據(jù)本發(fā)明的上述任一個(gè)實(shí)施方案的化合物的醫(yī)藥組合物。
[0022]本發(fā)明又包括一種提供預(yù)防和/或治療受試者的與興奮性毒素相關(guān)的疾病或疼痛的方法，其包括對(duì)受試者施用上述醫(yī)藥組合物，其中所述疾病可為CNS的缺血性或創(chuàng)傷性損傷。
[0023]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防和/或治療受試者疼痛的醫(yī)藥組合物，該組合物包含一種活性化合物，該活性化合物包含通過(guò)連接子連接到第二肽或肽類(lèi)似物的第一肽或肽類(lèi)似物，其中所述第一肽或肽類(lèi)似物和所述第二肽或肽類(lèi)似物包含至少四個(gè)酰胺鍵合的具有序列YTXV或YSXV的殘基，其中(a)Y選自E、Q、和A、或其類(lèi)似物，而(b) X選自A、Q、D、N、N-Me-A, N-Me-Q, N-MeUP N-Me-N或其類(lèi)似物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該活性化合物中的連接子是PEG連接子或NPEG連接子并且包含4至28個(gè)乙二醇部分(N=4-28)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該活性化合物中的連接子的羧基連接到所述第一肽或肽類(lèi)似物或所述第二肽或肽類(lèi)似物的末端殘基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該活性化合物選自PEG4 (IETAV)2、NPEG4 (IETAV)2、PEG6 (IESDV) 2、和 PEG4 (IESDV) 2。
[0024]該活性化合物可另外具有第三肽，其包含至少4個(gè)選自精氨酸和/或賴(lài)氨酸的氨基酸殘基，并具有CPP功能，其中所述第三肽連接到連接子或連接到所述第一肽或肽類(lèi)似物和所述第二肽或肽類(lèi)似物的氨基酸側(cè)鏈。【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1.PSD-95通過(guò)其PDZl和PDZ2域同時(shí)結(jié)合NMDA受體和nNOS。進(jìn)而，PSD-95利于NMDA受體活化與NO產(chǎn)生之間的功能性聯(lián)系，因?yàn)閬?lái)自NMDA受體的鈣(Ca2+)進(jìn)入活化nNOS。PSD-95抑制劑(例如所說(shuō)明的靶向PSD-95中TOZ1-2的二聚配體)抑制三元nNOS/PSD-95/NMDA受體復(fù)合物的形成并解除NMDA受體活化與NO產(chǎn)生之間的聯(lián)系，從而對(duì)興奮中毒起到神經(jīng)保護(hù)作用。
[0026]圖2.PEG4- 二酸和NPEG4- 二酸連接子，以及二聚化合物AB125和AB141的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0027]圖3.二聚配體AB144和AB147的化學(xué)結(jié)構(gòu)，提供了它們的完整結(jié)構(gòu)，以及其替代性的展示，其中五肽部分、Tat-序列和逆倒轉(zhuǎn)-D-Tat序列采用1_字母氨基酸密碼表示。
[0028]圖4.熒光二聚配體AB143和AB145的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其在熒光偏振試驗(yàn)中用作探針，和/或用于研究CNS穿透性。
[0029]圖5.通過(guò)熒光偏振測(cè)定的與PSD-95的TOZ1-2的親和力(左)以及在人血漿中在37°C下的體外穩(wěn)定性(右)。將Ki親合常數(shù)和穩(wěn)定性半衰期(T1/2)列在表格中。表格及熒光偏振圖(左)中數(shù)據(jù)表示>3獨(dú)立測(cè)定值，而來(lái)自一個(gè)試驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)顯示在血漿圖(右圖)中。
[0030]圖6.游離 AB140(等高線:11、E2、T3、A4、V5)和與 PSD-95 的 PDZ1-2 復(fù)合的AB140 (其余a/b等高線)的1H-15N相關(guān)光譜(NMR)。歸屬(assignment)顯示在光譜中。對(duì)于結(jié)合形式的二肽，未能確定‘a(chǎn)’峰和‘b’峰分別結(jié)合哪個(gè)PDZ域。
[0031]圖7.利用程序SSP計(jì)算的結(jié)合形式的AB140的二級(jí)結(jié)構(gòu)偏向性。值一表明完整形成的a-螺旋而值負(fù)一表明完整延伸結(jié)構(gòu)，而值接近零表明無(wú)規(guī)則卷曲。黑條對(duì)應(yīng)于圖6中標(biāo)識(shí)‘a(chǎn)’的殘基而灰色條對(duì)應(yīng)于標(biāo)識(shí)‘b’的殘基。
[0032]圖8.未經(jīng)操作的小鼠的熒光類(lèi)似物的血-腦屏障穿透率。(A)靜脈(1.V.)注射2小時(shí)后，經(jīng)5-FAM(F)-標(biāo)記的化合物的平均熒光強(qiáng)度的條形圖，并與經(jīng)鹽水處理的小鼠比較。(B)F-Tat-NPEG4(IETDV)2(AB145) (n=2)、F-逆倒轉(zhuǎn)-D_Tat_NPEG4(IETDV)2(AB148)(n=2)、和 F-Tat-NR2B9c (MS23) (n=2)而非 F-NPEG4 (IETAV) 2 (AB143) (n=2)的檢測(cè)結(jié)果，并與經(jīng)鹽水處理的小鼠(n=2)比較。F=5-FAM;Re=逆倒轉(zhuǎn)。將數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM ;*/**/***:p < 0.05/0.01/0.001 (非參數(shù) Mann-Whitney)。比例尺:100um。
[0033]圖9.pMCAO試驗(yàn)的時(shí)間曲線。手術(shù)30分鐘后，靜脈施用所有化合物(3nmol/g)，然后存活5.5或47.5小時(shí)。
[0034]圖10.手術(shù)存活6小時(shí)后，化合物的神經(jīng)保護(hù)效果。條形圖顯示了 pMCA06小時(shí)后的平均梗死體積。與經(jīng)鹽水處理的對(duì)照小鼠相比，AB144處理顯著地降低了缺血性腦損傷，而通過(guò)單體Tat-NR2B9c處理(n=16_19)不能達(dá)到此效果。數(shù)據(jù)顯示為平均值土SEM;*/**/***:p < 0.05/0.01/0.001 ;非參數(shù) Mann-Whitney 檢驗(yàn)。
[0035]圖11.手術(shù)存活48小時(shí)后，化合物的神經(jīng)保護(hù)效果。甲苯胺藍(lán)染色顯示出PMCA048小時(shí)后的缺血性腦損傷。比例尺:1mm。
[0036]圖12.手術(shù)存活48小時(shí)后，化合物的神經(jīng)保護(hù)效果。條形圖顯示了，與經(jīng)鹽水處理的對(duì)照小鼠相比，AB144持續(xù)更長(zhǎng)時(shí)間的降低梗死效果，并且與經(jīng)單體Tat-NR2B9c (n=16_19)處理的小鼠相比，梗死體積明顯更小。同樣，AB147得到與AB144類(lèi)似的持續(xù)更長(zhǎng)時(shí)間的梗死降低效果。將數(shù)據(jù)表示成平均值土SEM ;*/**/***:p
<0.05/0.01/0.001 ;非參數(shù) Mann-whitney 檢驗(yàn)。
[0037]圖13.pMCAO前后(48小時(shí)試驗(yàn))，記錄生理參數(shù)，例如(左)溫度和(右)體重。時(shí)間點(diǎn)(X-軸)表示相對(duì)手術(shù)(Oh)的時(shí)間。(左)圖顯示了 PMCA030分鐘后，體溫因麻醉降低，但是在靜脈注射前有此記錄了。手術(shù)I和3小時(shí)后，每組未出現(xiàn)藥物引起的差異。(右)圖顯示了 pMCAO(Oh)前3天以及pMCAO后24和48小時(shí)，每組體重沒(méi)有差異。將數(shù)據(jù)表示成平均值土 SEM。雙向方差分析。
[0038]圖14.對(duì)術(shù)后存活48小時(shí)的小鼠的運(yùn)動(dòng)功能的評(píng)價(jià)。⑷條形圖顯示了 pMCAO前(基線)和后，兩前爪的平均握力。經(jīng)鹽水和Tat-NR2B9c處理的小鼠顯示了 pMCA048小時(shí)后，與基線相比，握力顯著降低。經(jīng)AB144和AB147處理的小鼠與基線相比，未發(fā)現(xiàn)差異。(B)條形圖顯示了前爪因缺血引起的不對(duì)稱(chēng)，在經(jīng)鹽水和單體Tat-NR2B9c處理的小鼠中都有此發(fā)現(xiàn)，但是在經(jīng)AB144和AB147處理的小鼠中未發(fā)現(xiàn)到。(C)四次試驗(yàn)(T1-T4)的轉(zhuǎn)桿性能測(cè)試顯示了 PMCA048小時(shí)后，小鼠短期的運(yùn)動(dòng)學(xué)習(xí)技能。數(shù)據(jù)表示出每組小鼠試驗(yàn)的學(xué)習(xí)成分，但是經(jīng)AB144和AB147處理后得到比鹽水處理更顯著的改善(參照T2)，與Tat-NR2B9c相比耐受性增強(qiáng)(參見(jiàn)文本)。(A-C)將所有數(shù)據(jù)顯示成平均值土SEM ；*/**/***:p < 0.05/0.01/0.001，(A-B)配對(duì)學(xué)生 t 檢驗(yàn)；(C)Wilcoxon 配對(duì)檢驗(yàn)。
[0039]圖 15.AB144 類(lèi)似物的化學(xué)結(jié)構(gòu):AB144_B、AB144_C、AB144_D、AB144_E、AB144_H、AB144_I ;相同類(lèi)型的結(jié)構(gòu)式如圖3所示。
[0040]圖16.方案1.合成經(jīng)N保護(hù)(Ns)形式的NPEG-連接子A_C (Ns_NPEG4- 二酸-連接子)，其用于制造NPEG基的二聚化合物的二聚法。將NS-NPEG4- 二酸-連接子A用于AB141、AB144、AB147、AB144_D、AB144_E、AB143、AB145、和 AB148。將 Ns_NPEG4_ 二酸-連接子B用于AB144_B。將Ns-NPEG`4- 二酸-連接子C用于AB144_C。
[0041]圖17.AB125在炎性疼痛的完全弗氏佐劑模型中的效果。在測(cè)試前24小時(shí)，使動(dòng)物經(jīng)跖內(nèi)CFA和腹膜內(nèi)AB125(0、3、10、或30mg/kg)處理。通過(guò)von Frey法測(cè)量機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏/痛覺(jué)異常。將數(shù)據(jù)表示成平均值土SEM，顯示出相對(duì)于基線值的縮爪閾值(也就是，< 1.0對(duì)應(yīng)于痛覺(jué)過(guò)敏/痛覺(jué)異常)。經(jīng)鹽水處理的小鼠表現(xiàn)出對(duì)CFA的明顯反應(yīng)，機(jī)械閾值降到基線的36% (### ；p < 0.001)。在經(jīng)3、10、或30mg/kg AB125處理的小鼠中未觀察到此下降。經(jīng)3、10、或30mg/kg AB125處理的小鼠的閾值明顯不同于經(jīng)鹽水處理的小鼠(***:p < 0.001)。
[0042]圖18.在同時(shí)施用CFA下，AB125(a)和MK_801(b)對(duì)CFA引起的痛覺(jué)過(guò)敏的影響。對(duì)于AB125，ANCOVA表現(xiàn)出基線的顯著主效應(yīng)(F1，47=4.61 ；p=0.037)，處理的顯著主效應(yīng)(F3，47=5.00 ；p=0.004)，時(shí)間的顯著主效應(yīng)(F1,48=42.02 ；p < 0.001)，而沒(méi)有處理和時(shí)間的顯著相互作用(F3，48=0.71 ；p=0.552)。既定比較表現(xiàn)出AB125在3mg/kg(p=0.012)和10mg/kg(p=0.03)下I小時(shí)后顯著逆轉(zhuǎn)了 CFA引起的痛覺(jué)過(guò)敏。在3mg/kg(p=0.008)和10mg/kg(p=0.003)處理組中，24小時(shí)后仍觀察到顯著的逆轉(zhuǎn)。對(duì)于MK-801，ANCOVA表現(xiàn)出沒(méi)有基線的顯著主效應(yīng)(Fl，27=0.03 ；p=0.86)，而表現(xiàn)出處理的顯著主效應(yīng)(F3，27=9.60 ；P < 0.001)，時(shí)間的顯著主效應(yīng)(Fl，28=31.14 ；p < 0.001)，但是沒(méi)有處理和時(shí)間的顯著相互作用(F3，28=0.90 ；p=0.452)。既定比較揭示 MK-801 在 0.lmg/kg(p=0.004)下 I 小時(shí)后顯著逆轉(zhuǎn)CFA引起的痛覺(jué)過(guò)敏。在0.lmg/kg(p < 0.001)處理組中，24小時(shí)后仍觀察到顯著的逆轉(zhuǎn)。
[0043]圖19.0?么注射24小時(shí)后，施用么8125的效果。ANCOVA表現(xiàn)出基線的顯著主效應(yīng)(F1，34=15，67 ；p < 0.001)，處理的顯著主效應(yīng)(F4，34=7.98 ；p < 0.001)，時(shí)間的顯著主效應(yīng)(F2, 70=24.41 ；p < 0.001)，但是沒(méi)有處理和時(shí)間的顯著相互作用(F1，70=1.31 ；P=0.253)。既定比較揭示 3mg/kg(p=0.002)和 10mg/kg(p=0.001)在 I 小時(shí)后對(duì) CFA 引起的痛覺(jué)過(guò)敏的逆轉(zhuǎn)。在3mg/kg(p=0.015)和10mg/kg(p < 0.001)處理組中，24小時(shí)后仍觀察到顯著的逆轉(zhuǎn)。72小時(shí)后，所有劑量(1、3、和10mg/kg)對(duì)痛覺(jué)過(guò)敏產(chǎn)生顯著逆轉(zhuǎn)(p
<0.001)。
[0044]圖20.在長(zhǎng)期參考記憶的食物偏好的社會(huì)傳遞試驗(yàn)中，AB125和MK-801對(duì)食物攝取(a-b)和鑒別指數(shù)(c-d)的影響。對(duì)于AB125，鑒別指數(shù)的單向ANOVA未顯示處理的顯著主效應(yīng)(F2,22=0.108 ；p=0.898)。既定比較顯示所測(cè)試的AB125劑量(所示的30和60mg/kg)沒(méi)有顯著效果。對(duì)于MK-801，單向ANOVA顯示出處理的顯著主效應(yīng)(F2，21=5.28 ；p=0.014)。預(yù)計(jì)平均值的既定比較顯示出0.lmg/kg MK-801明顯降低鑒別指數(shù)(p=0.005)。
[0045]圖21.AB125和MK-801對(duì)在修改的Y-迷宮的熟悉臂和新穎臂中所耗時(shí)間的影響(a-b)，以及對(duì)鑒別指數(shù)(DI=(新穎-熟悉)/(新穎+熟悉))的影響(c-d)。對(duì)于AB125，單向ANOVA揭示AB125對(duì)鑒別指數(shù)沒(méi)有顯著主效應(yīng)(F3，29=0.85 ；p=0.478)。既定比較顯示所測(cè)試的AB125劑量(所示的30和60mg/kg)沒(méi)有顯著影響。對(duì)于MK-801，單向ANOVA顯示出處理的顯著效果(F3, 23=15.43 ；p < 0.001)。既定比較顯示出0.05 (p=0.019)和0.1mg/kg MK-801均降低鑒別指數(shù)(p < 0.001)。
[0046]圖22.在轉(zhuǎn)桿試驗(yàn)中，AB125和MK-801對(duì)運(yùn)動(dòng)性能的效果。對(duì)于AB125(所示的30和60mg/kg)，雙向RM ANOVA顯示沒(méi)有處理的顯著主效應(yīng)(F2，48=1.18 ；p=0.333)，沒(méi)有時(shí)間的顯著主效應(yīng)(F3，48=0.84 ；p=479),以及沒(méi)有處理和時(shí)間的顯著相互作用(F6, 48=1.26 ；p=0.293)。對(duì)于MK-801，雙向 ANOVA表現(xiàn)出處理的顯著主效應(yīng)(F2, 66=55.72 ；P < 0.001)，時(shí)間的顯著主效應(yīng)(F3, 66=3.69 ；p=0.016)、以及處理和時(shí)間的顯著相互作用(F6, 66=2.25 ；p=0.049)。既定比較顯示出 0.lmg/kg MK-801 在 15 分鐘(p < 0.001)、30 分鐘(p < 0.001)、45分鐘(p < 0.001)、和60分鐘(p=0.006)后在轉(zhuǎn)桿上的時(shí)間明顯減少。
[0047]圖23.AB144在炎性疼痛的完全弗氏佐劑模型中的效果。使動(dòng)物同時(shí)經(jīng)跖內(nèi)CFA和腹膜內(nèi)AB144 (O、3、10、或30mg/kg)處理，并在I和24小時(shí)后，通過(guò)von Frey法測(cè)量機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏/痛覺(jué)異常。將數(shù)據(jù)表示成平均值土SEM，顯示出相對(duì)于基線值的縮爪閾值(也就是，< 1.0對(duì)應(yīng)痛覺(jué)過(guò)敏/痛覺(jué)異常)。經(jīng)鹽水處理的小鼠表現(xiàn)出對(duì)CFA明顯的反應(yīng)，機(jī)械閾值降至基線的25% (### ；p < 0.001)。此降低在經(jīng)30mg/kgAB144處理的小鼠中施用AB144/CFA1小時(shí)后，以及在經(jīng)10和30mg/kg AB144處理的小鼠中施用AB144/CFA24小時(shí)后并未發(fā)現(xiàn)到(* =P < 0.05)。
【具體實(shí)施方式】
[0048]1.縮寫(xiě)和術(shù)語(yǔ) 的定義:
[0049]如文中定義，“a ( — ) ”可意指一個(gè)或多個(gè)，取決于其所使用的語(yǔ)境。
[0050]酰胺鍵是由羧酸與胺之間發(fā)生的反應(yīng)(并移除水)形成。當(dāng)反應(yīng)在兩個(gè)氨基酸殘基之間進(jìn)行時(shí)，將因反應(yīng)形成的鍵稱(chēng)為肽鍵；
[0051 ] 氨基酸，具有產(chǎn)蛋白質(zhì)性，在文中，根據(jù)IUPAC推薦，利用其I個(gè)字母或3個(gè)字母密碼命名，參見(jiàn)例如http://www.chem.qmw.ac.uk/iUpac0如果不特指，氨基酸可為D或L-形式。在說(shuō)明書(shū)中(但不在序列表中)，以大寫(xiě)字母開(kāi)始的3個(gè)字母密碼表示L-形式的氨基酸，而采用小寫(xiě)字母的3個(gè)字母密碼表示D-形式的氨基酸；
[0052]“包括(包含)”應(yīng)以包含性的方式理解。因此，舉例來(lái)說(shuō)，包括(包含)化合物X的組合物可包括(包含)化合物X和視需要的其它化合物；
[0053]CFA，完全弗氏佐劑；
[0054]CNS，中樞神經(jīng)系統(tǒng)；
[0055]CPP，細(xì)胞穿透肽；其特征在于穿過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)膜的能力，進(jìn)而可細(xì)胞內(nèi)遞送貨物分子，例如其所連接的肽、蛋白、寡核苷酸；
[0056]DCM，二氯甲烷；
[0057]二聚PSD-95抑制劑，其為一種包括兩個(gè)肽或肽類(lèi)似物的PSD-95抑制劑，所述兩個(gè)肽或肽類(lèi)似物通過(guò)連接子共價(jià)連接，因此，可同時(shí)結(jié)合到PSD-95的rozi和roZ2，或同時(shí)與PSD-95 的 PDZl 和 PDZ2 反應(yīng)；
[0058]P0,定義為對(duì)應(yīng)于肽/肽類(lèi)似物的C-端氨基酸的第一個(gè)氨基酸殘基或類(lèi)似物；
[0059]P'定義為從肽/肽類(lèi)似物的C-端氨基酸數(shù)起的第二個(gè)氨基酸殘基或其類(lèi)似物；
[0060]P_2，定義為從肽/肽類(lèi)似物的C-端氨基酸數(shù)起的第三個(gè)氨基酸殘基或其類(lèi)似物；
[0061]P—3，定義為從肽/肽類(lèi)似物的C-端氨基酸數(shù)起的第四個(gè)氨基酸殘基或其類(lèi)似物；
[0062]P_4，定義為從肽/肽類(lèi)似物的C-端氨基酸數(shù)起的第五個(gè)氨基酸殘基或其類(lèi)似物；
[0063]P—5，定義為從肽/肽類(lèi)似物的C-端氨基酸數(shù)起的第六個(gè)氨基酸殘基或其類(lèi)似物；
[0064]DIPEA，二異丙基乙胺；
[0065]DMF, N，N- 二甲基甲酰胺；
[0066]乙二醇部分，文中指構(gòu)成PEG或NPEG連接子的結(jié)構(gòu)單元?！叶疾糠帧母鼘?zhuān)業(yè)名稱(chēng)是‘氧亞乙基’，此單元的化學(xué)式如下:
[0067]
【權(quán)利要求】
1.一種化合物，其包含通過(guò)連接子連接第二肽的第一肽，其中所述第一肽和所述第二肽包含至少4個(gè)酰胺鍵合的具有序列YTXV或YSXV的殘基，其中 a.Y選自E、Q和A，以及
b.X 選自 A、Q、D、N、N-Me-A, N-Me-Q, N_Me_D、和 N_Me_N，以及 其中所述連接子包含PEG，其中所述PEG中至少一個(gè)氧原子被氮原子取代得到NPEG， 其中細(xì)胞穿透肽(CPP)通過(guò)酰胺鍵連接到所述連接子的氮原子，以及 其中所述CPP包含至少4個(gè)選自精氨酸和/或賴(lài)氨酸的氨基酸殘基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述連接子包含4至28個(gè)乙二醇部分(N=4-28)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的化合物，其中所述連接子是NPEG-二酸連接子，其中所述連接子中每個(gè)羧基連接所述第一肽或肽類(lèi)似物或所述第二肽或肽類(lèi)似物的末端殘基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的化合物，其中所述CPP包括逆倒轉(zhuǎn)肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的化合物，其中所述CPP是具有氨基酸序列YGRKKRRQRRR的Tat肽或具有氨基酸序列rrrqrrkkr的逆倒轉(zhuǎn)-d_Tat肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的化合物，其中所述第一肽和/或所述第二肽為長(zhǎng)度5-10個(gè)酰胺鍵合的殘基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的化合物，其中所述第一肽和/或所述第二肽由至少4個(gè)L-氨基酸殘基組成。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的化合物，其中X選自A、Q和D。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的化合物，其中所述第一肽和/或所述第二肽被N-烷基化。
10.一種用作藥物的醫(yī)藥組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的化合物。
11.一種醫(yī)藥組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的化合物，其用于預(yù)防和/或治療受試者的與興奮性毒素相關(guān)的疾病。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的醫(yī)藥組合物，其中所述疾病是CNS的缺血性或創(chuàng)傷性損傷。
13.—種醫(yī)藥組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的化合物，其用于預(yù)防和/或治療受試者疼痛。
14.一種試劑盒，其包含根據(jù)權(quán)利要求11至13中任一項(xiàng)所述的醫(yī)藥組合物，還包含將所述組合物遞送給受試者的裝置。
15.一種用于預(yù)防和/或治療受試者疼痛的醫(yī)藥組合物，其包含化合物，該化合物包含通過(guò)連接子連接第二肽的第一肽，其中所述第一肽和所述第二肽包含至少4個(gè)酰胺鍵合的具有序列YTXV或YSXV的殘基，其中 a.Y選自E、Q和A，以及
b.X 選自 A、Q、D、N、N-Me-A, N-Me-Q, N_Me_D、和 N_Me_N。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的醫(yī)藥組合物，其中所述連接子是PEG連接子并包含4至28個(gè)乙二醇部分(N=4-28)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的醫(yī)藥組合物，其中所述連接子是PEG-二酸連接子并且所述連接子中每個(gè)羧基連接所述第一肽或所述第二肽的末端殘基。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的醫(yī)藥組合物，所述化合物選自PEG4(IETAV) 2、bo S / ? nr\r-1-r \ T r/~r t 1-1 I/ V S / ? nr\r-f-r \ r\r\r-1 t vS / ?TTT/~rx \ T r/~r TkT
【文檔編號(hào)】A61P25/00GK103533949SQ201280023754
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2012年5月11日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月13日
【發(fā)明者】A·巴赫, K·斯特羅姆戈德 申請(qǐng)人:哥本哈根大學(xué)