專利名稱：鴨大腸桿菌病區(qū)域優(yōu)勢(shì)血清型疫苗、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鴨大腸桿菌病區(qū)域優(yōu)勢(shì)血清型疫苗、制備方法及其應(yīng)用，屬于生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鴨大腸桿菌是一種潛在的人畜共患病病原，在我國不同類型的養(yǎng)鴨場(chǎng)中普遍存在，流行廣泛，血清型眾多，不同地區(qū)差異較大，發(fā)病率和死亡率較高。該病在臨床剖檢上主要表現(xiàn)為纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎。各種年齡的鴨均可感染，雛鴨最易感，2 - 6周齡多發(fā)，發(fā)病率和死亡率較高，在商品肉鴨中死亡率可高達(dá)50%左右，而且常常與鴨傳染性漿膜炎混合感染，成年鴨和種鴨主要表現(xiàn)為零星死亡。天氣變化、高溫高濕發(fā)病率較高，雛鴨溫度過低也可增加本病的發(fā)生。隨著養(yǎng)鴨業(yè)的日益發(fā)展和集約化程度的提高，鴨大腸桿菌病的發(fā)生日趨嚴(yán)重，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前國內(nèi)無有效的疫苗上市，只是通過抗菌藥物控制本病。雖然抗菌藥物能迅速控制本病，但停藥后極易復(fù)發(fā)，且易產(chǎn)生耐藥性。食源性動(dòng)物耐藥菌可通過多種途徑將耐藥基因傳遞給人類致病菌，危害人類健康，還可引起禽產(chǎn)品中藥物殘留、食品安全問題。由于鴨大腸桿菌的血清型眾多，即使同一地區(qū)甚至是同一鴨場(chǎng)就存在多種血清型，且無交叉保護(hù)性，說明了使用疫苗進(jìn)行免疫接種預(yù)防本病的困難性，所以篩選出致病性大腸桿菌的優(yōu)勢(shì)血清型菌株生產(chǎn)滅活疫苗防治該地的鴨大腸桿菌病效果好，可大大減少藥物應(yīng)用，對(duì)避免細(xì)菌耐藥菌株的產(chǎn)生、減少藥物殘留、保證畜產(chǎn)品安全、促進(jìn)人類的健康具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前，有關(guān)鴨大腸桿菌病滅活疫苗國內(nèi)外較少報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的問題是提供一種鴨大腸桿菌病區(qū)域優(yōu)勢(shì)血清型疫苗、制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明通過以分離鑒定篩選得到大腸桿菌優(yōu)勢(shì)血清型菌株鴨大腸桿菌菌株ECHB-3(Escherichia coli ECHB-3)、鴨大腸桿菌菌株ECHB-9 (Escherichia coli ECHB-9)、鴨大腸 桿菌菌株ECHB-40 (Escherichia coli ECHB-40)，然后制備而得的鴨大腸桿菌病區(qū)域優(yōu)勢(shì)血清型疫苗安全性強(qiáng)，免疫效果好，可克服由于血清型眾多且無交叉保護(hù)帶來的預(yù)防本病的困難性，減少鴨大腸桿菌病的發(fā)生率。本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題而采取的技術(shù)方案為
鴨大腸桿菌病區(qū)域優(yōu)勢(shì)血清型疫苗，其特征在于它含有鴨大腸桿菌菌株ECHB-3(Escherichia coli ECHB-3)、鴨大腸桿菌菌株 ECHB-9 (Escherichia coli ECHB-9)、鴨大腸桿菌菌株ECHB-40 (Escherichia coli ECHB-40)的滅活菌液，所述滅活菌液中的活菌總數(shù)為30 60億cfu/mL ;其中所述的鴨大腸桿菌菌株ECHB-3 (Escherichia coli ECHB-3)已于2011年12月2日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中國，武漢，武漢大學(xué),保藏號(hào)為CCTCC NO :M2011438，分類命名為大腸桿菌ECHB-3 (Escherichia coliECHB-3);所述的鴨大腸桿菌菌株 ECHB-9 (Escherichia coli ECHB-9)已于 2011 年 12 月2日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中國，武漢，武漢大學(xué)，保藏號(hào)為 CCTCC NO :M2011439，分類命名為大腸桿菌 ECHB-9 (Escherichia coli ECHB-9);所述的鴨大腸桿菌菌株ECHB-40 (Escherichia coli ECHB-40)已于2011年12月2日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中國，武漢，武漢大學(xué)，保藏號(hào)為CCTCC NO M2011440，分類命名為大腸桿菌 ECHB-40 (Escherichia coli ECHB-40)。按上述方案，所述滅活菌液中鴨大腸桿菌ECHB-3的個(gè)數(shù)為1(Γ20億cfu/mL，鴨大腸桿菌ECHB-9的個(gè)數(shù)為10 20億cfu/mL，鴨大腸桿菌ECHB-40的個(gè)數(shù)為10 20億cfu/mL。按上述方案，所述的鴨大腸桿菌病區(qū)域優(yōu)勢(shì)血清型疫苗還包括佐劑和防腐劑。按上述方案，所述的佐劑為氫氧化鋁膠生理鹽水，按體積比計(jì)，所述的佐劑量以每5份制苗用混合菌液加入I份進(jìn)行計(jì)量；所述的防腐劑為硫柳汞，所述的防腐劑以加入佐劑后的體系總量的O. 005wt%進(jìn)行計(jì)量。
所述的鴨大腸桿菌菌株ECHB-3、鴨大腸桿菌菌株ECHB-9和鴨大腸桿菌菌株ECHB-40系對(duì)湖北省鴨大腸桿菌病進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查以獲得鴨大腸桿菌病的優(yōu)勢(shì)血清型，然后對(duì)湖北省不同地區(qū)分離的154株鴨大腸桿菌，經(jīng)培養(yǎng)特性、形態(tài)特征、生化特性、血清型鑒定、動(dòng)物致病性試驗(yàn)和免疫原性試驗(yàn)，篩選而獲得的三株致病性強(qiáng)、免疫原性好的優(yōu)勢(shì)血清型菌株。所述各鴨大腸桿菌菌種的分離方法如下無菌操作取病、死亡鴨肝臟、心臟和氣囊直接劃線于麥康凱瓊脂上，37°C培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。從其中挑取紅色、圓形隆起、光滑的菌落，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，并劃線于伊紅美藍(lán)瓊脂上，觀察菌體形態(tài)及染色特征。革蘭氏染色鏡檢可見到陰性、兩端鈍圓的短桿菌，在伊紅美藍(lán)瓊脂上形成紫黑色、具有金屬光澤的小菌落。細(xì)菌的純培養(yǎng)從麥康凱瓊脂上挑取紅色、圓形隆起、光滑的菌落在新的麥康凱瓊脂上劃線，37°C培養(yǎng)24h，再次染色、鏡檢。若菌體形態(tài)和染色特性符合大腸桿菌的形態(tài)和染色特性時(shí)，挑取剩余的半個(gè)菌落接種于麥康凱斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24h，即為分離純化細(xì)菌。所述的鴨大腸桿菌菌株ECHB-3、鴨大腸桿菌菌株ECHB-9和鴨大腸桿菌菌株ECHB-40菌株的特性如下
形態(tài)和生化特性均為革蘭氏陰性桿菌，生化特性符合細(xì)菌分類學(xué)中本菌的特性。培養(yǎng)特性分別接種于麥康凱培養(yǎng)基平板上，36 37°C培養(yǎng)24小時(shí)，肉眼觀察均呈粉紅色或磚紅色，菌落隆起，表面光滑。低倍顯微鏡下45°折光觀察，邊緣整齊，呈鮮艷的金光。血清學(xué)特性鴨大腸桿菌菌株ECHB-3 (Escherichia ECHB-3)為078、鴨大腸桿菌菌株 ECHB-9 (Escherichia ECHB-9)為 045、鴨大腸桿菌菌株 ECHB-40 (EscherichiaECHB-40)菌株為 08。毒力將鴨大腸桿菌菌株ECHB-3、鴨大腸桿菌菌株ECHB-9和鴨大腸桿菌菌株ECHB-40菌株分別于馬丁肉湯單獨(dú)培養(yǎng)2(Γ24小時(shí)得到各菌株的菌液O. 5ml(含活菌2飛億cfu)，然后將各菌液于肌肉或腹腔分別注射2周齡健康易感蛋鴨10只，觀察可得皆出現(xiàn)明顯臨床癥狀，14日內(nèi)死亡或活鴨內(nèi)臟有明顯病變。免疫原性用2周齡健康易感鴨10只，每只頸部皮下注射疫苗O. 5ml，21日后連同條件相同的對(duì)照鴨10只，各肌肉或腹腔注射鴨大腸桿菌菌株ECHB-3、ECHB-9、ECHB-40的混合菌液O. 5ml (含活菌2飛億cfu)，所述的混合菌液是將鴨大腸桿菌菌株ECHB-3、鴨大腸桿菌菌株ECHB-9和鴨大腸桿菌菌株ECHB-40菌株分別于馬丁肉湯單獨(dú)培養(yǎng)2(Γ24小時(shí)得到的菌液混合得到的。觀察14日，對(duì)照鴨全部發(fā)病或死亡，剖檢后全部具有典型病變(反應(yīng)在++以上)；免疫鴨至少保護(hù)8只，對(duì)在觀察期內(nèi)出現(xiàn)“ + ”以上明顯臨床反應(yīng)的存活鴨，在觀察結(jié)束時(shí)進(jìn)行剖檢，內(nèi)臟無纖維素滲出性炎癥。鴨大腸桿菌病區(qū)域優(yōu)勢(shì)血清型疫苗的制備方法，其特征在于它包括以下步驟
(1)疫苗種子液的制備
一級(jí)種子繁殖各菌株凍干菌種分別接種于馬丁肉湯中，36 37°C培養(yǎng)24小時(shí)，然后劃線接種于麥康凱瓊脂平板上培養(yǎng)，選取符合標(biāo)準(zhǔn)的典型菌落10個(gè)，混合于少量馬丁肉湯中，接種馬丁瓊脂斜面若干支，置36 37°C培養(yǎng)2(Γ24小時(shí)，作為一級(jí)種子；
二級(jí)種子繁殖取一級(jí)種子接種于馬丁肉湯中，36 37°C培養(yǎng)2(Γ24小時(shí)，進(jìn)行純粹檢 驗(yàn)，純粹，獲得二級(jí)種子液；
(2)制苗用混合囷液的制備
將大腸桿菌菌株ECHB-3、大腸桿菌菌株ECHB-9、大腸桿菌菌株ECHB-40分別培養(yǎng)得到的二級(jí)種子液以體積比為1:1 1混合，按培養(yǎng)基量的29Γ4%(ν/ν)接種于馬丁肉湯中，36 37°C培養(yǎng)20 24小時(shí)，得到混合菌液；
(3)滅活菌液制備
滅活，得滅活菌液，所述滅活菌液中的活菌總數(shù)為3(Γ60億cfu/mL,后經(jīng)滅活檢驗(yàn)合格后即得。按上述方案，所述的鴨大腸桿菌病區(qū)域優(yōu)勢(shì)血清型疫苗的制備方法還包括以下后處理步驟按體積計(jì)，以每5份制苗用混合菌液加入I份氫氧化鋁膠生理鹽水佐劑，然后按加入佐劑后體系總量的O. 005被％加防腐劑硫柳汞，充分振蕩，于疒8°C靜置2 3日，抽棄上清濃縮成全量的60%(v/v);然后經(jīng)無菌檢驗(yàn)合格后進(jìn)行混合分裝，分裝時(shí)隨時(shí)攪拌使其混合均勻。按上述方案，所述步驟(I)中的一級(jí)種子液置于2 8°C保存，使用期不超過21日；所述的二級(jí)種子液置于疒8°C保存，使用期不超過3日。按上述方案，所述步驟(2)得到混合菌液中鴨大腸桿菌ECHB-3的個(gè)數(shù)為1(Γ20億cfu/mL,鴨大腸桿菌ECHB-9的個(gè)數(shù)為10 20億cfu/mL，鴨大腸桿菌ECHB-40的個(gè)數(shù)為10 20億 cfu/mLο按上述方案，所述步驟(3)的滅活為按體積比為O. 4%加入甲醛溶液，經(jīng)38°C滅活48 72小時(shí),期間每隔4 6小時(shí)振搖一次。上述鴨大腸桿菌病區(qū)域優(yōu)勢(shì)血清型疫苗在鴨大腸桿菌病防治中的應(yīng)用。該疫苗的物理性狀為靜置后，上層為淺黃色澄明液體，下層為灰白色沉淀物，振搖后為均勻混懸液。根據(jù)《中華人民共和國獸藥典(2010年版)》附錄42標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)該疫苗取樣經(jīng)無菌檢驗(yàn)合格，應(yīng)無菌生長(zhǎng)。另，分別按《中華人民共和國獸藥典(2010年版)》附錄20、附錄10進(jìn)行甲醛、硫柳汞含量測(cè)定，得甲醛殘留量不超過O. 2wt%，硫柳汞殘留量不超過O. 01wt%o本發(fā)明通過調(diào)查湖北省規(guī)?；B(yǎng)鴨場(chǎng)，對(duì)湖北省鴨大腸桿菌病進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，并對(duì)不同地區(qū)不同養(yǎng)鴨場(chǎng)采集樣品分離了 154株鴨大腸桿菌，經(jīng)培養(yǎng)特性、形態(tài)特征、生化特性、血清型鑒定、動(dòng)物致病性試驗(yàn)和免疫原性試驗(yàn)，篩選出了三株致病性強(qiáng)、免疫原性好的優(yōu)勢(shì)血清型菌株鴨大腸桿菌菌株ECHB-3、ECHB-9、ECHB-40用于制備疫苗，制得的鴨大腸桿菌病區(qū)域優(yōu)勢(shì)血清型疫苗經(jīng)物理性質(zhì)檢驗(yàn)、無菌檢驗(yàn)、甲醛、汞類防腐劑殘留量測(cè)定，檢驗(yàn)結(jié)果合格。并經(jīng)安全性、免疫效力試驗(yàn)，證明此疫苗效果較好，疫苗保護(hù)力達(dá)80%以上，可覆蓋湖北大部分地區(qū)，預(yù)防本地的大腸桿菌病，克服由于血清型眾多且無交叉保護(hù)帶來的預(yù)防本病的困難性，以減少本地該病的發(fā)生率，減少抗生素的使用量、減少藥物殘留、保證禽產(chǎn)品安全、促進(jìn)人類的健康。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)
1、該疫苗經(jīng)效力試驗(yàn)證明該疫苗保護(hù)力強(qiáng)，保護(hù)率達(dá)80%以上；
2、該疫苗經(jīng)安全性試驗(yàn)證明該疫苗安全性高，為該疫苗的臨床應(yīng)用提供了基本保障，并容易吸收，成本低廉，較易被用戶接受，易于推廣；
3、該疫苗制備用菌株來源于湖北地區(qū)免疫性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)血清型菌株，可以覆蓋湖北大部 分地區(qū)，針對(duì)性強(qiáng)。
具體實(shí)施例方式 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例1
鴨大腸桿菌病區(qū)域優(yōu)勢(shì)血清型疫苗的制備1、制苗用菌株對(duì)湖北省鴨大腸桿菌病進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，對(duì)湖北省不同地區(qū)分離得到的154株鴨大腸桿菌中，經(jīng)培養(yǎng)特性、形態(tài)特征、生化特性、血清型鑒定、動(dòng)物致病性試驗(yàn)和免疫原性試驗(yàn)，篩選得到三株致病性強(qiáng)、免疫原性好的優(yōu)勢(shì)血清型菌株鴨大腸桿菌菌株ECHB-3、ECHB-9、ECHB-40用于制備疫苗，作為制備疫苗用菌株。所述各鴨大腸桿菌菌種的分離方法如下無菌操作取病、死亡鴨肝臟、心臟和氣囊直接劃線于麥康凱瓊脂上，37°C培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。從其中挑取紅色、圓形隆起、光滑的菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢，并劃線于伊紅美藍(lán)瓊脂上，觀察菌體形態(tài)及染色特征。革蘭氏染色，鏡檢可見到革蘭氏陰性、兩端鈍圓的短桿菌，在伊紅美藍(lán)瓊脂上形成紫黑色、具有金屬光澤的小菌落。細(xì)菌的純培養(yǎng)從麥康凱瓊脂上挑取紅色、圓形隆起、光滑的菌落在新的麥康凱瓊脂上劃線，37°C培養(yǎng)24h，再次染色、鏡檢。若菌體形態(tài)和染色特性符合大腸桿菌的形態(tài)和染色特性時(shí)，挑取剩余的半個(gè)菌落接種于麥康凱斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24h，即為分離純化細(xì)菌。2、制苗用培養(yǎng)基馬丁肉湯
1000ml 溶液
牛肉湯500ml
豬胃消化液500ml
氯化鈉2. 5g
具體配制方法如下
A將上列成分混合后，以氫氧化鈉溶液調(diào)整PH為7. 6 7. 8，煮沸20 40分鐘，補(bǔ)足失去的水分。B冷卻沉淀，抽取上清液，經(jīng)濾紙或紗布濾過，濾液應(yīng)為澄清、淺黃色，經(jīng)116°C滅菌30分鐘。3、制苗用佐劑氫氧化鋁膠生理鹽水配制按《中華人民共和國獸藥典(2010年版)》附錄33進(jìn)行。4、制備疫苗
(O 一級(jí)種子繁殖將各菌株凍干菌種分別接種于馬丁肉湯中，36 37°C培養(yǎng)24小時(shí)，然后劃線接種麥康凱瓊脂平板上培養(yǎng)，選取符合標(biāo)準(zhǔn)的典型菌落10個(gè)混合于少量馬丁肉湯中，接種馬丁瓊脂斜面若干支、置36 37°C培養(yǎng)2(Γ24小時(shí)，作為一級(jí)種子。在2 8°C保存，使用期不超過21日。二級(jí)種子繁殖取一級(jí)種子接種于馬丁肉湯中，36 37°C培養(yǎng)2(Γ24小時(shí)，進(jìn)行純粹檢驗(yàn)，純粹。置疒8°C保存，使用期不超過3日。(2)制苗用菌液制備將大腸桿菌菌株ECHB-3、大腸桿菌菌株ECHB-9、大腸桿菌菌株ECHB-40分別培養(yǎng)得到的二級(jí)種子液以體積比為1:1 :1混合，按培養(yǎng)基量的29Γ4%(ν/ν)接種于馬丁肉湯中，36 37°C培養(yǎng)2(Γ24小時(shí)，得到混合菌液。菌液培養(yǎng)完成后取樣作純粹檢驗(yàn)，按《中華人民共和國獸藥典(2010年版)》附錄42進(jìn)行，應(yīng)純粹。進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，按 《中華人民共和國獸藥典(2010年版)》附錄19進(jìn)行，得；每毫升混合菌液中的活菌個(gè)數(shù)為30^60億cfu，其中鴨大腸桿菌ECHB-3的個(gè)數(shù)為10 20億cfu/mL，鴨大腸桿菌ECHB-9的個(gè)數(shù)為10 20億cfu/mL，鴨大腸桿菌ECHB-40的個(gè)數(shù)為10 20億cfu/mL。(3)滅活按體積比為O. 4%加入甲醛溶液，經(jīng)38°C滅活48 72小時(shí)，期間每隔4 6小時(shí)振搖一次，作滅活檢驗(yàn)。(4)濃縮配苗按體積比每5份制苗用菌液加I份氫氧化鋁膠生理鹽水作佐劑，同時(shí)按加入佐劑后體系總量的O. 005wt%加硫柳汞做防腐劑，充分振蕩，于2l°C靜置2 3日，抽棄上清濃縮成全量的60% (v/v)0(5)檢驗(yàn)分裝根據(jù)《中華人民共和國獸藥典(2010年版)》附錄42，取樣進(jìn)行無菌檢驗(yàn)，得無菌檢驗(yàn)合格，應(yīng)無菌生長(zhǎng)，后混合分裝，分裝時(shí)隨時(shí)攪拌使其混合均勻。成品檢驗(yàn)
(I)物理性狀本品靜置后，上層為淺黃色澄明液體，下層為灰白色沉淀物，振搖后均勻混懸液。(2)無菌檢驗(yàn)按《中華人民共和國獸藥典(2010年版)》附錄42進(jìn)行，應(yīng)無菌生長(zhǎng)。(3)甲醛或硫柳汞含量測(cè)定分別按《中華人民共和國獸藥典(2010年版)》附錄20、附錄10進(jìn)行，甲醛殘留量不超過O. 2wt%，硫柳汞殘留量不超過O. 01wt%。鴨大腸桿菌病區(qū)域優(yōu)勢(shì)血清型疫苗的安全性及免疫效果試驗(yàn)1.安全檢驗(yàn)
一次單劑量接種的安全試驗(yàn)用單劑量頸部皮下、肌肉兩種免疫途徑接種7日齡雛鴨10只，O. 5ml/只，同時(shí)設(shè)5只不接種雛鴨作對(duì)照，觀察14日，無不良反應(yīng)，精神食欲正常，剖檢無任何肉眼可見病變。單劑量重復(fù)接種安全試驗(yàn)每批疫苗用單劑量O. 5ml/只頸部皮下、肌肉兩種免疫途徑接種7日齡雛鴨10只，第I次接種后14日，以相同方法再接種一次，同時(shí)設(shè)5只不接種雛鴨作對(duì)照，觀察14日，無不良反應(yīng)，精神食欲正常，剖檢無任何肉眼可見病變。一次超劑量接種的安全試驗(yàn)每批疫苗用2倍使用量即Iml/只，頸部皮下、肌肉兩種免疫途徑接種7日齡雛鴨10只，同時(shí)設(shè)5只不接種雛鴨作對(duì)照，觀察14日，無不良反應(yīng)，精神食欲正常，剖檢無任何肉眼可見病變。這一結(jié)果為該疫苗的臨床應(yīng)用提供基本保障。2、效力試驗(yàn)用2周齡健康易感鴨10只，每只頸部皮下注射疫苗O. 5ml，21日后連同條件相同的對(duì)照鴨10只，各肌肉或腹腔注射鴨大腸桿菌菌株ECHB-3、ECHB-9、ECHB-40的混合菌液O. 5ml (含活菌2飛億cfu)，所述的混合菌液是將鴨大腸桿菌菌株ECHB-3、鴨·大腸桿菌菌株ECHB-9和鴨大腸桿菌菌株ECHB-40分別于馬丁肉湯各培養(yǎng)2(Γ24小時(shí)得到的菌液混合得到的。觀察14日，對(duì)照鴨全部發(fā)病或死亡，剖檢后全部具有典型病變(反應(yīng)在++以上);免疫鴨至少保護(hù)8只，并且對(duì)在觀察期內(nèi)出現(xiàn)“ + ”以上明顯臨床反應(yīng)的存活鴨，在觀察結(jié)束時(shí)進(jìn)行剖檢，內(nèi)臟無纖維素滲出性炎癥。鴨大腸桿菌病攻毒保護(hù)率為80%以上。判定標(biāo)準(zhǔn)
土有輕微臨床反應(yīng)，減食、排白色糞便廣3日，內(nèi)臟無肉眼可見病變。+臨床減食4日以上或停食I日以上，排黃白色糞便4日以上，剖檢見心臟或肝臟有輕度纖維素滲出性炎癥。++臨床同( + )，可見明顯心包積液及纖維素滲出性炎癥。+++臨床同( + )，有嚴(yán)重心包膜炎，并與肝或胸膜發(fā)生粘連。++++試驗(yàn)鴨死亡,其他同(+++)。
權(quán)利要求
1.鴨大腸桿菌病區(qū)域優(yōu)勢(shì)血清型疫苗，其特征在于它含有鴨大腸桿菌菌株ECHB-3(Escherichia coli ECHB-3)、鴨大腸桿菌菌株 ECHB-9 (Escherichia coli ECHB-9)、鴨大腸桿菌菌株ECHB-40 (Escherichia coli ECHB-40)的滅活菌液，所述滅活菌液中的活菌總數(shù)為30 60億cfu/mL ;其中所述的鴨大腸桿菌菌株ECHB-3 (Escherichia coli ECHB-3)已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中國，武漢，武漢大學(xué)，保藏號(hào)為CCTCC NO :M2011438，分類命名為大腸桿菌 ECHB-3 (Escherichia coli ECHB-3);所述的鴨大腸桿菌菌株ECHB-9 (Escherichia coli ECHB-9)已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中國，武漢，武漢大學(xué)，保藏號(hào)為CCTCC NO :M2011439，分類命名為大腸桿菌ECHB-9 (Escherichia coli ECHB-9);所述的鴨大腸桿菌菌株ECHB-40 (Escherichiacoli ECHB-40)已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中國，武漢，武漢大學(xué)，保藏號(hào)為CCTCC NO :M2011440，分類命名為大腸桿菌ECHB-40 (Escherichia coliECHB-40)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨大腸桿菌病區(qū)域優(yōu)勢(shì)血清型疫苗，其特征在于所述滅活菌液中鴨大腸桿菌ECHB-3的個(gè)數(shù)為1(Γ20億cfu/mL，鴨大腸桿菌ECHB-9的個(gè)數(shù)為1(Γ20億cfu/mL，鴨大腸桿菌ECHB-40的個(gè)數(shù)為10 20億cfu/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨大腸桿菌病區(qū)域優(yōu)勢(shì)血清型疫苗，其特征在于所述的鴨大腸桿菌病區(qū)域優(yōu)勢(shì)血清型疫苗還包括佐劑和防腐劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鴨大腸桿菌病區(qū)域優(yōu)勢(shì)血清型疫苗，其特征在于所述的佐劑為氫氧化鋁膠生理鹽水，按體積比計(jì)，所述的佐劑量以每5份制苗用混合菌液加入I份進(jìn)行計(jì)量；所述的防腐劑為硫柳汞，所述的防腐劑以加入佐劑后的體系總量的O. 005wt%進(jìn)行計(jì)量。
5.鴨大腸桿菌病區(qū)域優(yōu)勢(shì)血清型疫苗的制備方法，其特征在于它包括以下步驟 (1)疫苗種子液的制備 一級(jí)種子繁殖各菌株凍干菌種分別接種于馬丁肉湯中，36 37°C培養(yǎng)24小時(shí)，然后劃線接種于麥康凱瓊脂平板上培養(yǎng)，選取符合標(biāo)準(zhǔn)的典型菌落10個(gè)，混合于少量馬丁肉湯中，接種馬丁瓊脂斜面若干支，置36 37°C培養(yǎng)2(Γ24小時(shí)，作為一級(jí)種子； 二級(jí)種子繁殖取一級(jí)種子接種于馬丁肉湯中，36 37°C培養(yǎng)2(Γ24小時(shí)，進(jìn)行純粹檢驗(yàn)，純粹，獲得二級(jí)種子液； (2)制苗用混合囷液的制備 將大腸桿菌菌株ECHB-3、大腸桿菌菌株ECHB-9、大腸桿菌菌株ECHB-40分別培養(yǎng)得到的二級(jí)種子液以體積比為1:1 1混合，按培養(yǎng)基量的29Γ4%(ν/ν)接種于馬丁肉湯中，36 37°C培養(yǎng)20 24小時(shí)，得到混合菌液； (3)滅活菌液制備 滅活，得滅活菌液，所述滅活菌液中的活菌總數(shù)為3(Γ60億cfu/mL,后經(jīng)滅活檢驗(yàn)合格后即得。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鴨大腸桿菌病區(qū)域優(yōu)勢(shì)血清型疫苗的制備方法，其特征在于它還包括后續(xù)步驟按體積計(jì)，以每5份制苗用混合菌液加入I份氫氧化鋁膠生理鹽水佐劑，然后按加入佐劑后體系總量的O. 005被％加防腐劑硫柳汞，充分振蕩，于2 8°C靜置2^3日，抽棄上清濃縮成全量的60%(v/v);然后經(jīng)無菌檢驗(yàn)合格后進(jìn)行混合分裝，分裝時(shí)隨時(shí)攪拌使其混合均勻。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鴨大腸桿菌病區(qū)域優(yōu)勢(shì)血清型疫苗的制備方法，其特征在于所述步驟(I)中的一級(jí)種子液置于2 8°C保存，使用期不超過21日；所述的二級(jí)種子液置于疒8°C保存，使用期不超過3日。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鴨大腸桿菌病區(qū)域優(yōu)勢(shì)血清型疫苗的制備方法，其特征在于所述步驟(3)的滅活為按體積比為O. 4%加入甲醛溶液，經(jīng)38°C滅活48 72小時(shí)，期間每隔4 6小時(shí)振搖一次。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鴨大腸桿菌病區(qū)域優(yōu)勢(shì)血清型疫苗的制備方法，其特征在于所述滅活菌液中鴨大腸桿菌ECHB-3的個(gè)數(shù)為1(Γ20億cfu/mL，鴨大腸桿菌ECHB-9的個(gè)數(shù)為10 20億cfu/mL，鴨大腸桿菌ECHB-40的個(gè)數(shù)為10 20億cfu/mL。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的鴨大腸桿菌病區(qū)域優(yōu)勢(shì)血清型疫苗在鴨大腸桿菌病防治中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及鴨大腸桿菌病區(qū)域優(yōu)勢(shì)血清型疫苗、制備方法及其應(yīng)用。它包含鴨大腸桿菌菌株ECHB-3、鴨大腸桿菌菌株ECHB-9、鴨大腸桿菌菌株ECHB-40的滅活菌液，所述滅活菌液中的活菌總數(shù)為30~60億cfu/mL；所述鴨大腸桿菌菌株ECHB-3已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCNOM2011438；所述鴨大腸桿菌菌株ECHB-9已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCNOM2011439；所述鴨大腸桿菌菌株ECHB-40已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCNOM2011440。該疫苗保護(hù)力強(qiáng)，保護(hù)率達(dá)80%以上；安全性高；針對(duì)性強(qiáng)。
文檔編號(hào)A61K39/116GK103007266SQ20121043593
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月6日
發(fā)明者羅玲, 艾地云, 邵華斌, 溫國元, 羅青平, 王紅琳, 楊峻, 張蓉蓉 申請(qǐng)人:湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所