專利名稱：一種鴨大腸桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，更具體是涉一種鴨大腸桿菌及其應(yīng)用，即一株可引起鴨大腸桿菌性敗血癥的特征病變?nèi)缧呐K或肝臟有纖維素滲出性炎癥、心包膜炎或胸膜發(fā)生粘連的細(xì)菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鴨大腸桿菌病是由致病性鴨大腸桿菌引起，其癥狀常與鴨疫里默氏桿菌感染的癥狀和病變相似，國(guó)內(nèi)教學(xué)科研單位常分離鑒定出的血清型有01、02、03、078等。近幾年，國(guó)內(nèi)特別是山東、河南、廣東、福建、廣西等省份隨著肉鴨飼養(yǎng)的快速發(fā)展，大腸桿菌病的發(fā)生十分頻繁，嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。當(dāng)前，鴨疫里默氏桿菌對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的危害除直接引起動(dòng)物發(fā)病、死亡外，感染耐過(guò)鴨疫里默氏桿菌的鴨因飼料轉(zhuǎn)化率降低、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩而帶來(lái)的間接經(jīng)濟(jì)損失也十分嚴(yán)重，鴨疫里默氏桿菌對(duì)部分抗菌藥物敏感，但難于清除，尤其是該菌侵入氣囊后，藥物難以到達(dá)，由于不合理的用藥方案，鴨疫里默氏桿菌耐藥現(xiàn)象普遍存在，耐藥率高且廣泛，同時(shí)造成一定的藥物殘留等問(wèn)題。因此，研制針對(duì)鴨大腸桿菌病及由鴨疫里默氏桿菌引起的鴨傳染性漿膜炎兩種病的二聯(lián)疫苗具有廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一株鴨大腸桿菌及其應(yīng)用，即一種可有效防治以引起鴨大腸桿菌性敗血癥的特征病變?nèi)缧呐K或肝臟有纖維素滲出性炎癥、心包膜炎或胸膜發(fā)生粘連為特征的鴨大腸桿菌病，同時(shí)將篩選出的鴨大腸桿菌和鴨疫里默氏桿菌制成二聯(lián)滅活疫苗，為鴨大腸桿菌病及鴨傳染性漿膜炎的預(yù)防和治療提供了有效的免疫產(chǎn)品。本發(fā)明一個(gè)方面提供一株致病力強(qiáng)、免疫原性好的鴨大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)EC BYT01，該菌株已于2012年11月15日保藏于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院中科院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為 CGMCC N0.6831。本發(fā)明的鴨大腸桿菌用于制備滅活疫苗。本發(fā)明提供一種二聯(lián)滅活疫苗，包括有疫苗佐劑和抗原，所述的抗原為保藏編號(hào)為CGMCC N0.6831的鴨大腸桿菌和保藏編號(hào)為CGMCC N0.6832的鴨疫里默氏桿菌。本發(fā)明制備的鴨大腸桿菌、鴨疫里默氏桿菌二聯(lián)滅活疫苗，能夠預(yù)防以引起鴨只大腸桿菌性敗血癥的特征病變?nèi)缧呐K或肝臟有纖維素滲出性炎癥、心包膜炎或胸膜發(fā)生粘連為特征的鴨大腸桿菌病，并可以預(yù)防以神經(jīng)癥狀、纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征的鴨傳染性漿膜炎的發(fā)生，具有良好的市場(chǎng)推廣前景。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明對(duì)山東、廣東、福建、廣西等地的疑似鴨大腸桿菌病死鴨進(jìn)行病原分離、鑒定，獲得56株病原為鴨大腸桿菌，對(duì)其進(jìn)行血清型鑒定表明，其中有12株為血清078型；動(dòng)物回歸及毒力試驗(yàn)表明EC BYT06株毒力最強(qiáng)，可致鴨只10/10發(fā)病且其中7只死亡；免疫原性試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)免疫劑量為0.25mL (抗原含量達(dá)到1.0X 108CFU/mL)時(shí)即可使攻毒保護(hù)達(dá)到9/10。以上結(jié)果表明，篩選得到一株血清078型鴨大腸桿菌，其致病力最強(qiáng)、免疫原性好、制備的油苗攻毒保護(hù)效果好，確定為生產(chǎn)用菌株，該菌株已于2012年11月15日保藏于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院中科院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.6831。在本發(fā)明中，大腸埃希氏菌等同于大腸桿菌，兩者可以互換使用。對(duì)疑似鴨疫里默氏桿菌病死鴨進(jìn)行病原分離、鑒定，獲得38株病原為鴨疫里默氏桿菌，對(duì)其進(jìn)行血清型鑒定表明，其中有7株為血清2型；動(dòng)物回歸及毒力試驗(yàn)表明RABYT06株毒力最強(qiáng)，可致鴨只10/10發(fā)病且其中5只死亡；免疫原性試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)免疫劑量為0.25mL (抗原含量達(dá)到1.0X 108CFU/mL)時(shí)即可使攻毒保護(hù)達(dá)到9/10。以上結(jié)果表明，篩選得到一株血清2型鴨疫里默氏桿菌，其致病力最強(qiáng)、免疫原性好、制備的油苗攻毒保護(hù)效果好，確定為生產(chǎn)·用菌株，于2012年11月15日保藏于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院中科院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCN0.6832。下面對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。一、鴨大腸桿菌的分離及鑒定:⑴將從山東、廣東、福建、廣西等地收集的病死鴨進(jìn)行無(wú)菌操作，取病死鴨心血、肝或腦組織劃線接種于麥康凱瓊脂平板、鮮血瓊脂平板上，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)特性。結(jié)果如下:分離到56株疑似為大腸桿菌。這些菌株在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上菌落約1.5毫米左右，有閃光，呈奶油狀；在麥康凱瓊脂上菌落約2毫米左右，圓形，突起，光滑，邊緣整齊，粉紅色。56株分離菌分別命名為RA BYTOURA BYTO2至RA BYT56。⑵取純培養(yǎng)的細(xì)菌的單個(gè)菌落涂于干凈的載玻片上，然后用革蘭氏染色，鏡檢，觀察其形態(tài)特征。革蘭氏染色，為革蘭氏陰性細(xì)小桿菌，呈單個(gè)或成對(duì)分布，偶爾呈鏈狀排列，不運(yùn)動(dòng)，無(wú)芽胞。⑶取純培養(yǎng)物分別進(jìn)行葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、乳糖、阿拉伯糖、甘露醇、衛(wèi)矛醇、三糖鐵試驗(yàn)、M.R.試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、枸椽酸鹽利用試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)。37°C培養(yǎng)，連續(xù)觀察3天。結(jié)果表明所得菌株生化反應(yīng)相似，發(fā)酵絕大多數(shù)的碳水化合物，不產(chǎn)生硫化氫，三糖鐵試驗(yàn)、M.R.試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性，枸椽酸鹽利用試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)陰性符合鴨大腸桿菌的生化反應(yīng)特征。⑷取被檢細(xì)菌純培養(yǎng)物用滅菌生理鹽水離心洗滌兩次，稀釋成1.0X IO8CFU/毫升的菌液，作為被檢抗原，121°C高壓2h破壞其莢膜抗原，用標(biāo)準(zhǔn)“O”抗原單因子血清作玻片凝集反應(yīng)鑒定細(xì)菌O抗原種類，以確定其血清型。結(jié)果顯示其中12株為血清型078，12株為血清型02，9株為血清型01，5株為血清型088，4株為血清型08，血清型05、027各3株，血清型065、0135各2株，血清型045、010、07、039各I株，血清型078為優(yōu)勢(shì)血清型。(5) 12株血清078型鴨大腸桿菌毒力測(cè)定試驗(yàn)分別取純培養(yǎng)的12株血清078型鴨大腸桿菌單個(gè)菌落劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)12h，刮取平板上所有菌落混于滅菌生理鹽水中制成細(xì)菌懸液，將其濃度稀釋到1.0X 106CFU/mL，以0.5mL/只劑量肌肉注射19日齡健康易感鴨10只，同時(shí)設(shè)立滅菌生理鹽水注射對(duì)照組10只。攻毒后連續(xù)觀察10天，每日記錄鴨子的精神、食欲、飲水、糞便、運(yùn)動(dòng)及死亡情況，并對(duì)死亡鴨進(jìn)行病理剖檢、細(xì)菌分離及鑒定。結(jié)果表明，結(jié)果表明各菌株的致病性有差別，12株078型菌株中，EC BYTOl株毒力最強(qiáng)，EC BYTOl株接種鴨，40h后部分鴨開(kāi)始出現(xiàn)精神萎靡，行動(dòng)遲緩或俯臥不起，10天內(nèi)10/10發(fā)病且其中7只死亡，其余株發(fā)病在50h以后，詳見(jiàn)表I ;剖檢可見(jiàn)典型的心包炎、肝周炎、氣囊炎；取心血涂片和肝組織印片經(jīng)染色后鏡檢，可見(jiàn)短小的小桿菌，單個(gè)或成對(duì)存在，并能從心血和肝組織在麥康凱平板培養(yǎng)基上分離出接種菌，其生化及培養(yǎng)特征與EC BYTOl株鑒定結(jié)果一致，因此本研究選用EC BYTOl株作為疫苗用強(qiáng)毒菌株。并送中科院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)為CGMCC N0.6831。表I 12株血清078型鴨大腸桿菌的毒力測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果

權(quán)利要求
1.一株鴨大腸桿菌，其保藏編號(hào)為CGMCC N0.6831。
2.權(quán)利要求1所述的鴨大腸桿菌在制備疫苗中的應(yīng)用。
3.一種二聯(lián)滅活疫苗，包括有疫苗佐劑和抗原，所述的抗原為權(quán)利要求1所述的鴨大腸桿菌和保藏編號(hào)為CGMCC N0.6832的鴨疫里默氏桿菌。
4.權(quán)利要求3所述的二 聯(lián)滅活疫苗，用于預(yù)防鴨大腸桿菌病和鴨傳染性漿膜炎。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株致病力強(qiáng)、免疫原性好的鴨大腸桿菌，該菌株的保藏編號(hào)為CGMCC No.6831。本發(fā)明還提供一種二聯(lián)滅活疫苗，包括有疫苗佐劑和抗原，所述的抗原為保藏編號(hào)為CGMCC No.6831的鴨大腸桿菌和保藏編號(hào)為CGMCC No.6832的鴨疫里默氏桿菌。本發(fā)明制備的鴨大腸桿菌、鴨疫里默氏桿菌二聯(lián)滅活疫苗，能夠預(yù)防以引起鴨只大腸桿菌性敗血癥的特征病變?nèi)缧呐K或肝臟有纖維素滲出性炎癥、心包膜炎或胸膜發(fā)生粘連為特征的鴨大腸桿菌病，并可以預(yù)防以神經(jīng)癥狀、纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征的鴨傳染性漿膜炎的發(fā)生，具有良好的市場(chǎng)推廣前景。
文檔編號(hào)A61P31/04GK103074274SQ20121057397
公開(kāi)日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2012年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月26日
發(fā)明者蔣皓靜, 凌紅麗, 叢雁方, 蔣貽海, 孫海新 申請(qǐng)人:青島康地恩藥業(yè)股份有限公司, 青島寶依特生物制藥有限公司