專(zhuān)利名稱(chēng)：鑒定f18大腸桿菌相關(guān)疾病遺傳抗性豬的方法和組合物的制作方法
本文提供了鑒定對(duì)大腸桿菌相關(guān)疾病，尤其是與具菌毛F18的大腸桿菌菌株相關(guān)的腸道疾病具有遺傳抗性的組合物和非侵害性方法。已鑒定出豬α(1,2)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FUT1)基因中的DNA多態(tài)性，它可將抗性豬和易感豬區(qū)分開(kāi)，從而H為豬養(yǎng)殖人員提供有用的診斷試驗(yàn)。
養(yǎng)豬過(guò)程中的主要問(wèn)題是使豬免患疾病，斷奶后的腸道紊亂是尤其嚴(yán)重的問(wèn)題。有限數(shù)目的毒性大腸桿菌菌株血清型是豬水腫病和斷奶后腹瀉的致病原，它可導(dǎo)致全世界養(yǎng)豬業(yè)遭受?chē)?yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，尤其是4至12周齡幼豬的損失。水腫病典型的臨床癥狀是神經(jīng)學(xué)病征，如運(yùn)動(dòng)失調(diào)，驚厥和麻痹。在隨后的尸檢中發(fā)現(xiàn)，水腫一般存在于特征性位點(diǎn)，如眼瞼和前額，胃壁和結(jié)腸系膜。此疾病分別由定居于小腸表面但不影響腸細(xì)胞(腸中的細(xì)胞)主要形態(tài)變化的大腸桿菌產(chǎn)生的志賀樣毒素-Ⅱ變體和腸毒素LT,Sta,STb導(dǎo)致。在此方面，某些類(lèi)型的大腸桿菌菌株F18,F4和K88是主要的致死性的villain。“豬水腫病是腸毒素血癥，其特征在于延及全身的血管損傷，后者是由某些大腸桿菌菌株產(chǎn)生的毒素，志賀樣毒素-Ⅱ變體導(dǎo)致的”(Bertschinger等，1993)?？梢跃?lèi)型區(qū)分大腸桿菌，相關(guān)的一組粘附菌毛被稱(chēng)為例如K88或F18(Vogeli等，1997)。
不是所有的豬都易感大腸桿菌，定居依賴(lài)于細(xì)菌對(duì)腸細(xì)胞的粘附，這種粘附是由被稱(chēng)為K88或F18的細(xì)菌菌毛介導(dǎo)的。已證實(shí)對(duì)粘附的易感性，即豬中結(jié)合菌毛的受體的表達(dá)受到宿主的遺傳控制，對(duì)F18而言，上述易感性作為顯性性狀被遺傳下來(lái)，B表示易感的等位基因，b表示抗性等位基因(Vogeli等，1996；Meijerink等，1997)。根據(jù)其與染色體6上鹵烷(HAL)連鎖群中的S基因座和其它基因座的緊密遺傳連鎖，將大腸桿菌F18-受體(ECF18R)的基因座作圖至豬染色體6(SSC6),K88大腸桿菌受體位于染色體13。
抗性機(jī)理可能是大腸桿菌未定居于抗性動(dòng)物的腸表面，即細(xì)菌未粘附于抗性豬的腸壁上。某些大腸桿菌粘附和非粘附表型之間的區(qū)別取決于腸刷狀緣膜的糖蛋白受體，因此，宿主豬的基因型決定抗性。另外還研究了帶菌毛的細(xì)菌(WO9413811)。
鑒定F18大腸桿菌相關(guān)疾病的抗性豬的最新方法是1)收集剛被屠宰的豬的腸樣品，在顯微鏡下進(jìn)行粘附試驗(yàn)，2)用強(qiáng)毒性的大腸桿菌攻擊動(dòng)物(“定居試驗(yàn)”)，或3)進(jìn)行AO(S)血型系統(tǒng)血液定型。前兩種方法對(duì)鑒定抗性動(dòng)物以用作繁殖原種來(lái)說(shuō)并不實(shí)用。盡管血液定型法能鑒定抗性動(dòng)物，但此試驗(yàn)不能確定易感動(dòng)物的易感性是純合的還是雜合的。關(guān)于這些等位基因的動(dòng)物基因型知識(shí)(基因狀況)是發(fā)展成功育種計(jì)劃所必需的。育種計(jì)劃的目的是繁殖對(duì)大批殺死斷奶后牲畜的F18大腸桿菌相關(guān)疾病具有抗性的豬。
在一篇文獻(xiàn)中，作者在談及豬水腫病時(shí)說(shuō)到“正在尋找適當(dāng)?shù)倪z傳標(biāo)記”(Bertschinger等，1993,p.87)，并提到Walters和Sellwood,1982繁殖抗性豬是預(yù)防無(wú)法有效被預(yù)防的疾病的好方法，此方法的可行性取決于豬群體中編碼抗性的基因的大量存在，檢測(cè)抗性豬的改良方法，和用此抗性同時(shí)選擇的陰性遺傳性狀的缺乏。
遺傳“標(biāo)記”基因座是靠近所需基因座的編碼或非編碼基因座，但基因座本身并不是必需的?？蓽y(cè)的表型包括連續(xù)的或不連續(xù)的性狀，如限制性長(zhǎng)度片斷多態(tài)性，生產(chǎn)性狀，細(xì)菌粘附性狀，生色或酶促反應(yīng)和抗生素抗性。S基因座控制著A和O血型抗原的表達(dá)。S基因座隱性純合的豬不表達(dá)A或O血型抗原。由于編碼人血型H的α(1,2)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因中具有突變，類(lèi)似的狀況也存在于人中(Kelly等，1994，也見(jiàn)于WO9628967中)。最近測(cè)定了豬α(1,2)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因的序列(Cohney等，1996)，此基因與豬S基因座上存在的基因非常相似。
在遺傳和物理圖譜上，血型H和Se基因座位于人染色體19q13.3,此區(qū)域在進(jìn)化中是保守的，含有與豬基因HAL連鎖群同源的基因。編碼血型H的基因是所謂的FUT1，而Se基因等同于FUT2基因。FUT1決定紅細(xì)胞譜系中的H抗原表達(dá)，而FUT2調(diào)節(jié)分泌上皮和唾液中H抗原的表達(dá)。在如大鼠和兔的低等哺乳動(dòng)物中，F(xiàn)UT1基因是保守的，兔腦組織和大鼠結(jié)腸中顯示出mRNA的表達(dá)。在所有這些物種中，已報(bào)道了兩種類(lèi)型的α(1,2)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因，其結(jié)構(gòu)非常類(lèi)似于人FUT1和FUT2基因，但FUT1同源基因特別地顯示出物種特異性的表達(dá)模式。人FUT1基因負(fù)責(zé)紅細(xì)胞前體中H抗原的合成，然而，豬紅細(xì)胞被動(dòng)地吸附血清中的H樣抗原，此時(shí)為人Lewis抗原。豬中所有的H樣抗原都與外分泌組織相關(guān)，在其它動(dòng)物的分泌組織中也觀察到FUT2(secretor)基因的表達(dá)。因此，F(xiàn)UT2基因可能會(huì)影響到與抗人血型H和A抗體交叉反應(yīng)的豬A-O血型決定簇的表達(dá)。
有關(guān)血型和豬大腸桿菌疾病的其它信息包括血型抗原的碳水化合物結(jié)構(gòu)介導(dǎo)一些病原體微生物與宿主組織的粘附，如幽門(mén)螺桿菌與Lewisb血型抗原的粘附，和導(dǎo)致尿道感染的大腸桿菌與血型P物質(zhì)的粘附。因此，負(fù)責(zé)血型特異性碳水化合物結(jié)構(gòu)形成的糖基轉(zhuǎn)移酶的編碼基因代表著宿主控制細(xì)菌定居的候選基因。這些基因與負(fù)責(zé)豬小腸中F18陽(yáng)性大腸桿菌的粘附/非粘附的基因座定位于相同的染色體區(qū)域。豬直至斷奶后才表達(dá)血型抗原A和O，此時(shí)豬容易感染F18大腸桿菌所致的疾病。
迫切需要診斷和治療豬大腸桿菌相關(guān)腸疾病的新方法，有人建議將基因突變的檢測(cè)作為一些豬疾病(惡性過(guò)熱)的診斷試驗(yàn)(Fujii等，1991；美國(guó)專(zhuān)利5,358,649)，但無(wú)人報(bào)道過(guò)用于診斷的多態(tài)性標(biāo)記。對(duì)大腸桿菌定居產(chǎn)生抗性的疫苗已被描述(美國(guó)專(zhuān)利5,552,144；WO8604604)，但由于給新生豬口服活疫苗的困難和調(diào)節(jié)的限制性，使其不可能成為預(yù)防大腸桿菌疾病的優(yōu)選方法。抗生素可以用于治療，但無(wú)法成功地預(yù)防疾病。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明的組合物和非侵害性的方法可以檢測(cè)和排除易感大腸桿菌相關(guān)疾病的豬。鑒定大腸桿菌F18腸定居的抗性豬的非侵害性方法包括下列步驟測(cè)定豬生物樣品中是否存在與定居抗性相關(guān)的遺傳多態(tài)性；如果豬的多態(tài)性1(1多態(tài)性是種群中存在的核苷酸序列因突變所致的變化)是純合的，則可推斷豬是抗性的。
更具體地說(shuō)，此方法是測(cè)定豬生物樣品中豬α(1,2)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因第307位的含氮堿基僅是腺嘌呤還是僅為鳥(niǎo)嘌呤；如果第307位的含氮堿基僅是腺嘌呤,即可將豬鑒定為抗性。
為了測(cè)定生物樣品中是否存在多態(tài)性，在通過(guò)分子量進(jìn)行分離的凝膠上分析限制性片斷長(zhǎng)度的多態(tài)性。限制性?xún)?nèi)切核酸酶是能在特異性位點(diǎn)再現(xiàn)地切割核酸分子的酶，根據(jù)切割的位置產(chǎn)生不同分子量的核酸片斷。
本發(fā)明還涉及繁殖對(duì)大腸桿菌相關(guān)疾病具有抗性的豬的方法，所述方法包括選擇α(1,2)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶1基因中具有遺傳多態(tài)性因而將其鑒定為對(duì)大腸桿菌相關(guān)腸疾病具有抗性的豬的繁殖豬；并繁殖所選擇的豬。
本發(fā)明的一個(gè)方面是豬α(1,2)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶1基因具有多態(tài)性的DNA分子，尤其是根據(jù)

圖1的序列。本發(fā)明的另一方面是具有與圖1序列互補(bǔ)的核苷酸序列的分子。
本發(fā)明的一個(gè)方面是第307位的鳥(niǎo)嘌呤被腺嘌呤取代的分離的DNA分子，此分子第857位的鳥(niǎo)嘌呤也被腺嘌呤取代。本發(fā)明其它分離的DNA分子包括圖1序列第229位的核苷酸具有突變的分子，其中編碼亮氨酸的密碼子CTT被變?yōu)榫幋a苯丙氨酸的密碼子TTT。第714位核苷酸的突變是由GAT變?yōu)镚AC，但編碼的產(chǎn)物中沒(méi)有相伴隨的氨基酸取代。
由本發(fā)明的DNA分子編碼并具有α(1,2)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽也是本發(fā)明的內(nèi)容。
檢測(cè)豬中大腸桿菌F18受體的分子測(cè)定法是(a)從豬成核細(xì)胞(nucleated cell)中分離DNA；(b)使用與豬α(1,2)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因1的DNA序列互補(bǔ)的寡核苷酸作為引物，在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中擴(kuò)增DNA；(c)用至少一種限制性酶，如CfoI進(jìn)行限制性酶消化；(d)通過(guò)凝膠電泳分離所得片斷；和(e)測(cè)定凝膠上各片斷的數(shù)目和長(zhǎng)度；和(f)由F18片斷的數(shù)目和長(zhǎng)度確定豬細(xì)胞中存在哪一種受體。使用本文公開(kāi)的較大的擴(kuò)增片斷而不是較小的片斷進(jìn)行限制性長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)較為便宜，因?yàn)镈NA帶可在相對(duì)低濃度的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。另外，為了產(chǎn)生一些片斷，與可變?cè)\斷位點(diǎn)相鄰的恒定限制性位點(diǎn)僅需要一種限制性酶。
檢測(cè)與大腸桿菌F18受體相關(guān)的多態(tài)性的試劑盒在各個(gè)獨(dú)立的容器中使用了與豬α(1,2)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因1的DNA序列互補(bǔ)的寡核苷酸，它能將抗性豬和敏感豬區(qū)分開(kāi)來(lái)?？蓪?duì)任何年齡的豬進(jìn)行此試驗(yàn)。
多態(tài)性也可用于開(kāi)發(fā)治療患大腸桿菌相關(guān)疾病的豬的藥物。突變形式的豬α(1,2)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶可以干擾正常的酶，防止其產(chǎn)生F18的腸受體。
附圖簡(jiǎn)述圖1顯示了本發(fā)明的豬α(1,2)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶多態(tài)性的核苷酸序列(FUT1)(下)，并使用單字母氨基酸密碼顯示了推定的氨基酸序列(上)。氨基酸序列下方的雙實(shí)線(xiàn)(=)是推定的跨膜區(qū)；氨基酸序列下方的點(diǎn)線(xiàn)表示3個(gè)潛在的N聯(lián)糖基化位點(diǎn)(…)。
□是抗性豬中鳥(niǎo)嘌呤(G)被腺嘌呤(A)取代的位置。
*表示終止密碼子。
氨基酸殘基的縮寫(xiě)如下A,Ala；C,Cys；D,Asp；E,Glu；F,Phe；G,Gly；H,His；I,Ile；K,Lys；L,Leu；M,Met；N,Asn；P,Pro；Q,Gln；R,Arg；S,Ser；T,Thr；V,Val；W,Trp；和Y,Tyr。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述與豬對(duì)大腸桿菌相關(guān)疾病的抗性有關(guān)的DNA多態(tài)性分子分析便于進(jìn)行選擇繁殖所用抗性豬的診斷試驗(yàn)。通過(guò)本發(fā)明的多態(tài)性標(biāo)記鑒定出抗性豬與敏感豬的大腸桿菌F18受體基因座不同。
本發(fā)明提供了以高水平的敏感性和特異性將在遺傳上對(duì)F18大腸桿菌感染的相關(guān)疾病敏感的豬與抗性豬區(qū)分開(kāi)來(lái)的非侵害性方法和組合物。鑒定出豬α(1,2)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FUT1)基因的DNA多態(tài)性，籍此區(qū)分抗性豬和易感豬。多態(tài)性由核苷酸序列中導(dǎo)致新等位基因的突變(變化)引起。等位基因是基因的一種狀況，在一個(gè)種群中，一個(gè)基因有很多等位基因，其通過(guò)含氮堿基的取代而有所不同，所述取代可能是由親代DNA分子中的突變引起的。一個(gè)種群中共存有一個(gè)以上的等位基因(有時(shí)稱(chēng)之為“變體”)被稱(chēng)為基因的多態(tài)性。在種群中，一個(gè)以上的等位基因作為明顯穩(wěn)定的成分存在的基因座是多態(tài)性基因座。通常，其中一個(gè)多態(tài)性基因座在種群中是低頻的。
由生物樣品，優(yōu)選為血液中測(cè)得抗性豬的基因組具有多態(tài)性，其中在核苷酸序列第307位(見(jiàn)圖1)測(cè)定的唯一堿基是腺嘌呤，而純合易感豬的相同位置的堿基是鳥(niǎo)嘌呤。雜合豬會(huì)顯示出兩種類(lèi)型的DNA，并且會(huì)是易感的。多態(tài)性是Cohney等，1996所報(bào)道的豬基因序列的變異。
對(duì)豬家族進(jìn)行遺傳連鎖分析，測(cè)定FUT1的多態(tài)性和遠(yuǎn)系繁殖豬的疾病抗性之間的遺傳聯(lián)系。根據(jù)本發(fā)明，已在α(1,2)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶1基因(FUT1)中發(fā)現(xiàn)多態(tài)性。第307位具有單個(gè)核苷酸堿基取代的多態(tài)性被用于確定巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因和S-系統(tǒng)，ECF18R基因座和HAL連鎖群的其它基因座之間的緊密連鎖。
檢測(cè)FUT1和ECF18R的突變的緊密連鎖使得分子試驗(yàn)發(fā)展成為可鑒定大腸桿菌F18粘附抗性，雜合(載體)和純合的易感豬。此診斷試驗(yàn)以高敏感性和特異性鑒定出易感水腫病和斷奶后腹瀉的豬。在豬群中，本發(fā)明多態(tài)性的發(fā)生率有差異。據(jù)Vogeli等(1997)報(bào)道，豬群中5只豬的M307等位基因頻率互不相關(guān)。本發(fā)明多態(tài)性診斷試驗(yàn)的可用性為養(yǎng)豬者提供了從豬群中有效消除ECF18R易感等位基因，從而消除導(dǎo)致水腫病和斷奶后腹瀉的必要條件大腸桿菌F18細(xì)菌粘附。
本發(fā)明還包括核苷酸序列，其為α(1,2)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因1的序列的變體，代表bp307處的多種多態(tài)性，本發(fā)明還包括基于診斷分子試驗(yàn)的試劑盒，可用于鑒定α(1,2)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因中的多態(tài)性。
為了得到大腸桿菌F18受體基因座(ECF18R)的候選基因，從豬基因組文庫(kù)中分離出含基因的5個(gè)粘粒和1個(gè)基因組克隆，其含有α(1,2)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因FUT1和FUT2(Meijerink等，1997)。通過(guò)熒光原位雜交作圖將所有這些克隆定位于豬染色體6的q11帶上(SSC6q11)。對(duì)粘粒的序列分析鑒定出(a)開(kāi)放閱讀框(ORF)，其長(zhǎng)度為1098個(gè)堿基對(duì)，與人FUT1序列82.3％相同，和(b)第二個(gè)ORF，其長(zhǎng)度為1023個(gè)堿基對(duì)，與人FUT2序列85％相同。因此，F(xiàn)UT1和FUT2基因座似乎是人血型H和Secretor基因座的豬等同物。對(duì)易感或抗具有F18菌毛的大腸桿菌(ECF18R)的粘附和定居的豬中的兩個(gè)ORF進(jìn)行直接測(cè)序，揭示出FUT1 ORF的堿基對(duì)307(M307)和堿基對(duì)857(M857)處的兩個(gè)多態(tài)性。核苷酸位置是從ATG(編碼甲硫氨酸)開(kāi)始計(jì)數(shù)的。在具有221個(gè)后代的Landrace家族34次交配中分析這些突變，結(jié)果表明與控制對(duì)大腸桿菌F18粘附和定居于小腸的抗性和易感性的基因座(ECF18R)和血型抑制劑S的基因座緊密連鎖。因此，M307突變是標(biāo)記-輔助選擇大腸桿菌F18粘附抗性動(dòng)物的良好標(biāo)記。發(fā)現(xiàn)第229位核苷酸的另一突變也導(dǎo)致多態(tài)性，其中編碼亮氨酸的密碼子(CTT)變?yōu)門(mén)TT(編碼苯丙氨酸)。第714位(編碼天冬氨酸)的突變(GAT變?yōu)镚AC)不產(chǎn)生氨基酸取代。在FUT2中未鑒定出可以區(qū)分易感豬和抗性豬的多態(tài)性。
實(shí)施例下列實(shí)施例提供了本發(fā)明的實(shí)施方案。
實(shí)施例1抗性豬試驗(yàn)使用PCR-RFLP試驗(yàn)可輕易地鑒定本發(fā)明的多態(tài)性，試驗(yàn)的一個(gè)實(shí)施方案使用了下列引物5’CCAACGCCTCCGATTCCTGT3’和5’GTGCATGGCAGGCTGGATGA3’。此實(shí)施方案的優(yōu)選PCR條件是在下列時(shí)間和溫度下進(jìn)行25輪循環(huán)94℃,30秒；60℃,45秒；72℃,90秒。通過(guò)限制性酶HgaⅠ消化抗性豬的擴(kuò)增DNA，但不用限制性酶HinPI消化此DNA。用限制性酶HinPI消化純合易感豬的擴(kuò)增DNA，用上述兩種酶部分消化雜合易感豬的擴(kuò)增DNA。
或者，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法從豬成核細(xì)胞中分離DNA，對(duì)不同ECF18R基因型(Bb,bb)動(dòng)物的豬FUT1和FUT2序列及其側(cè)翼區(qū)直接測(cè)序，結(jié)果鑒定出FUT1 ORF的第307和857位(分別稱(chēng)之為M307和M857)有兩個(gè)G→A的轉(zhuǎn)換。M307轉(zhuǎn)換消除了CfoI限制性位點(diǎn)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，用引物P6和P11擴(kuò)增分離自豬成核細(xì)胞的DNA(95℃3分鐘，然后是95℃,30秒；56℃,30秒；72℃,30秒共30輪循環(huán)，接著是72℃最后延伸7分鐘)，接著進(jìn)行CfoI消化，在3％瓊脂糖凝膠上分離，產(chǎn)生限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)。純合M307AA動(dòng)物顯示出2條帶，純合M307GG動(dòng)物顯示出93-，241-和87bp的片斷，雜合動(dòng)物顯示出所有4個(gè)片斷。
實(shí)施例2使用α(1,2)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)F18大腸桿菌抗性豬的試驗(yàn)的敏感性和特異性研究測(cè)定疾病抗性和FUT1基因第307位多態(tài)性之間的聯(lián)系。183頭斷奶的豬(年齡為2至6個(gè)月)得自6個(gè)不同的豬群。研究開(kāi)始前只知道其中一個(gè)豬群含有抗性動(dòng)物，已知該豬群壓力綜合征的發(fā)病率高，其它5個(gè)豬群沒(méi)有豬壓力綜合征的跡象，疾病抗性的發(fā)生率是未知的。從各豬群中隨機(jī)選擇豬，人為地使其安樂(lè)死，取出脾臟和小腸樣品。從脾組織中提取DNA，并用于實(shí)施例1所述的PCR-RFLP試驗(yàn)。通過(guò)從小腸上刮下粘膜表層，在低滲EDTA溶液中裂解細(xì)胞并通過(guò)離心洗滌以純化腸細(xì)胞。將純化的腸細(xì)胞刷狀緣與F18大腸桿菌一起保溫，通過(guò)相差顯微鏡檢查此混合物，此試驗(yàn)可測(cè)定豬是易感的(腸樣品粘附有細(xì)菌)還是抗性的(腸樣品未粘附細(xì)菌)。在所有53個(gè)抗性豬和130頭易感豬的128頭中，多態(tài)性的PCR-RFLP試驗(yàn)與細(xì)菌-腸細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)相關(guān)。使用細(xì)菌-腸細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)測(cè)定為易感豬的兩頭豬被PCR-RFLP試驗(yàn)不正確地測(cè)定為抗性豬。被檢查的6個(gè)豬群中有2個(gè)含有抗性豬，而只有1個(gè)豬群具有豬壓力綜合征，這表明PCR-RFLP試驗(yàn)可鑒定不具有豬壓力綜合征的動(dòng)物中的疾病抗性動(dòng)物。
實(shí)施例3將FUT1定位于染色體6(SSC6)用得自豬基因組DNA的FUT1核苷酸探針篩選粘粒文庫(kù)之后，用引物P7和P11鑒定粘粒ETHsl,-s2,-s3,-s4和-s6，并通過(guò)FISH和DISH-PCR將其作圖至染色體6的q11帶上。
實(shí)施例4鑒定豬FUT1 ORF將KspI,EcoRI和KspI/EcoRI粘粒消化物與經(jīng)放射性標(biāo)記的豬FUT1片斷P6-P11和P7-P10進(jìn)行雜交以進(jìn)行Southern印跡分析，結(jié)果表明ETHs2,-s4和-s6的放射自顯影信號(hào)相同,而得自粘粒ETHs1和-s3的信號(hào)不同。從粘粒ETHs2 KspI中分離出長(zhǎng)度為940bp和6.2kb的亞克隆，相當(dāng)于Southern印跡上雜交KspI片斷的估計(jì)長(zhǎng)度。結(jié)合兩個(gè)亞克隆的序列結(jié)果，產(chǎn)生1501 bp序列，這與基因組PCR產(chǎn)物直接測(cè)序結(jié)果一致。1501bp序列含有1098bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)，相當(dāng)于人FUT1 ORF，與其具有82.3％的核苷酸和80.8％的氨基酸同一性。ORF編碼多肽。
實(shí)施例5鑒定豬FUT2和假基因FUTPETHs1具有1個(gè)與FUT1序列雜交的DNA片斷(2.7kb)，而ETHs3具有兩個(gè)上述片斷(2.7kb和8.2kb)。對(duì)ETHs1和-s3的2.7kb EcoRI片斷進(jìn)行亞克隆和部分測(cè)序，證實(shí)了這兩個(gè)片斷是相同的。此序列與人FUT2非常相似，但在NH2和-COOH末端區(qū)域顯示出幾個(gè)變化。這些變化導(dǎo)致與保守ORF不相容的移碼，因此，假定得自2.7kb片斷的序列表示假基因(FUT2P)。亞克隆ETHs3 BamHI消化物之后，鑒定8.2kb EcoRI片斷中所含的雜交序列。所得亞克隆序列表示1023bp ORF，它與人FUT2序列在核苷酸水平上85％相同，氨基酸水平上83％相同。在豬FUT2序列和衍生自2.7kb片斷的FUT2P序列之間觀察到NH2和-COOH末端區(qū)域的很多差異。推測(cè)的氨基酸序列相當(dāng)于豬Secretor酶部分測(cè)定的氨基酸序列(Thurin和Blaszcyk-Thurin,1995)。將所得豬FUT1,FUT2和FUTP序列登記于GenBank，登記號(hào)分別為U70883,U70881和U70882。FUT1和FUT2基因具有高度同源性序列。在例如引物開(kāi)發(fā)中已考慮到這一點(diǎn)。另外，在進(jìn)一步的研究中需要區(qū)分FUT1和FUT2酶活性。
實(shí)施例6鑒定M307和M857突變和表征M307根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法從豬成核細(xì)胞中分離DNA，對(duì)不同ECF18R基因型(Bb,bb)的動(dòng)物的豬FUT1和FUT2序列及其側(cè)翼區(qū)直接測(cè)序，結(jié)果鑒定出FUT1ORF的第307和857位(分別稱(chēng)之為M307和M857)有兩個(gè)G→A的轉(zhuǎn)換。M307轉(zhuǎn)換消除了CfoI限制性位點(diǎn)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，用引物P6和P11擴(kuò)增分離自豬成核細(xì)胞的DNA(95℃3分鐘，然后是95℃,30秒；56℃，30秒；72℃,30秒共30輪循環(huán)，接著是72℃最后延伸7分鐘)，接著進(jìn)行CfoI消化，在3％瓊脂糖凝膠上分離，產(chǎn)生限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)。純合M307AA動(dòng)物顯示出2條帶(93-和328-bp片斷)，純合M307GG動(dòng)物顯示出93-,241-和87bp的片斷，雜合動(dòng)物顯示出所有4個(gè)片斷。
實(shí)施例7鑒定突變M857M857突變是消除AciⅠ位點(diǎn)的轉(zhuǎn)換。設(shè)計(jì)引物PBEST以錯(cuò)配第866和872位兩個(gè)多余的AciⅠ位點(diǎn)。用引物P7和PBEST進(jìn)行PCR(95℃3分鐘，然后是95℃,30秒；56℃,30秒；72℃,30秒共30輪循環(huán)，接著是72℃最后延伸7分鐘)，接著進(jìn)行AciⅠ消化，在3％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行PCR-RFLP分析。純合M857AA動(dòng)物顯示出174bp的片斷，而M857GG動(dòng)物的擴(kuò)增產(chǎn)物顯示出136-和38-bp片斷。
實(shí)施例8繪制FUT1基因的遺傳圖譜在Landrace豬家族中，M307和HAL連鎖群(S,ECF18R,RYR1,GPI,PGD)基因座之間的重組事件揭示出重組分?jǐn)?shù)θ＜0.04(表2)。全部重組分?jǐn)?shù)的優(yōu)勢(shì)對(duì)數(shù)評(píng)分Z為24.5至50.6之間，這可以充分證明這些基因座之間的連鎖。這些數(shù)據(jù)可將FUT1基因作圖于HAL連鎖群中與皆受FUT1影響的S和ECR18R緊鄰的位置。在實(shí)驗(yàn)性L(fǎng)andrace豬家族中，發(fā)現(xiàn)了ECF18R和RYR1之間的等位基因聯(lián)合。在水腫病和斷奶后腹瀉的抗性豬(基因型ECF18Rb/b(表3))中觀察到RYR1第1843位有過(guò)量的基因型RYR1TT(鹵烷易感基因型)。這種等位基因聯(lián)合是連鎖不平衡的結(jié)果，即在獨(dú)立分類(lèi)等位基因時(shí)，所觀察到的單元型頻率與預(yù)期的單元型頻率有偏差的結(jié)果。因此，連鎖不平衡設(shè)計(jì)了屬于相連基因座的等位基因的非隨機(jī)聯(lián)合。然而由于低重組率的緣故，無(wú)法確定某種基因座順序顯著優(yōu)于另一種基因座順序。
實(shí)施例9:M307A與ECF18b和M307G與ECF18RB的聯(lián)合在Landrace(SL)豬和親代Large White(LW)豬中，ECF18Rb(水腫病和斷奶后腹瀉抗性等位基因)與M307A100％聯(lián)合，而ECF18RB(水腫病和斷奶后腹瀉易感等位基因)與M307G100％聯(lián)合(其中A=腺嘌呤；G=鳥(niǎo)嘌呤)。在SL豬中，88％(30/34)的Ss分別是ECF18Rb和M307A單元型。在Large White豬中，Ss-ECF18Rb和Ss-M307A單元型的相應(yīng)值為82％(9/11)。在實(shí)驗(yàn)性SL家族中，F(xiàn)UT1基因座的M857A等位基因的發(fā)生率低，在LW豬中甚至為零。因此，未觀察到M857等位基因和側(cè)翼基因的等位基因之間的顯著配子聯(lián)合。在Duroc,Hampshire和Pietrain豬中發(fā)現(xiàn)FUT1307和FUT1857位的G→A轉(zhuǎn)換具有可變的頻率，使其它豬群中也出現(xiàn)這種轉(zhuǎn)換成為可能。
實(shí)施例10:FUT1基因型的分布表4顯示出ECF18R型中的FUT1基因型分布于核苷酸第307位，這與這兩者為獨(dú)立的假說(shuō)中預(yù)期的比例顯著不同。在119頭水腫病和斷奶后腹瀉的抗性ECF18Rbb動(dòng)物中，在基于DNA的試驗(yàn)中測(cè)定其中的118頭具有基因型M307AA,1頭抗性動(dòng)物的基因型為M307A/G。在131頭易感豬中，130頭為M307A/G或M307G/G。通過(guò)DNA試驗(yàn)顯示出1頭對(duì)大腸桿菌粘附易感的動(dòng)物為純合的M307A/A。本實(shí)施例和實(shí)施例2的數(shù)據(jù)與過(guò)去的研究結(jié)果一起表明FUT1基因是存在于豬S基因座和ECF18基因座上的基因。盡管本實(shí)施例和實(shí)施例2中有4頭動(dòng)物同此假說(shuō)相矛盾，但這可能是因?yàn)檫@些動(dòng)物在疾病抗性/易感性方面被錯(cuò)誤地劃定表型的緣故。
實(shí)施例11:α(1,2)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶中的氨基酸交換α(1,2)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶1中bp+307和bp+857處的G→變化導(dǎo)致推測(cè)的氨基酸取代，即蘇氨酸(中性-極性)取代丙氨酸(中性-非極性)和谷氨酰胺(中性-極性)取代精氨酸(堿性)，其分別對(duì)編碼產(chǎn)物產(chǎn)生功能上的影響。bp229處的C→T變化導(dǎo)致的氨基酸取代為亮氨酸(中性-非極性)取代苯并氨酸(中性-非極性)。
表1正向(F)和反向(R)引物的序列及其相對(duì)于豬FUT1和FUT2起始密碼子2的位置引物名稱(chēng)引物序列 位置FUT1 P6 (R) 5＇-CTTCAGCCAGGGCTCCTTTAAG-3＇ +489FUT1 P7 (F) 5＇-TTACCTCCAGCAGGCTATGGAC-3＇ +720FUT1 P10 (R) 5＇-TCCAGAGTGGAGACAAGTCTGC-3＇ +1082FUT1 P11 (F) 5＇-CTGCCTGAACGTCTATCAAGATC-3＇ +69FUT1 P16 (F) 5＇-AGAGTTTCCTCATGCCCACAGG-3＇ -90FUT1 P18 (R) 5＇-CTGCTACAGGACCACCAGCATC-3＇ +1203FUT1 PBEST (R) 5＇-ACCAGCAGCGCAAAGTCCCTGACGGGCACGGCCTC-3＇+893FUT2 P16 (R) 5＇-CTCCCTGTGCCTTGGA AGTGAT-3＇ +1094FUT2 P17 (F) 5＇-AACTGCACTGCCAGCTTCATGC-3＇ -832引物FUT1 P10和FUT1 P11衍生自FUT1基因表2在Landrace實(shí)驗(yàn)群體中，M307和HAL連鎖群基因座的全部重組分?jǐn)?shù)(θ)，優(yōu)勢(shì)對(duì)數(shù)評(píng)分(Z)和提供數(shù)據(jù)的動(dòng)物數(shù)(N)基因座對(duì) NθzS-ECF18R183 0.01 50.6M307-S 183 0.01 50.6M307-ECF18R 216 0.01 57.1M307-RYRl 198 0.02 47.2M307-GPI147 0.03 34.2M307-PGD147 0.04 24.5
表3在Landrace(SL)實(shí)驗(yàn)群體和隨機(jī)選擇的Large White(LW)豬中，4個(gè)基因座[S-FUT1(M307,M857)-ECF18R-RYR1]處的單元型頻率品系 S,FUT1(M307,M857)，頻率4(數(shù)目)ECF18R,RYR1處的單元型3SL sAGbT 70(28)sAGbC 5(2)sGGBC 15(6)sGABC 10(4)LW sAGbC 56(9)sGGBC 31(5)sGGBC 13(2)3S:A和O血型抑制基因(S和s)的基因座。
FUT1(M307):α(1,2)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FUT1)基因中核苷酸307處的腺嘌呤(A)改變?yōu)轼B(niǎo)嘌呤(G)。FUT1(M857):FUT1基因中核苷酸857處的腺嘌呤(A)改變?yōu)轼B(niǎo)嘌呤(G)。ECF18R大腸桿菌F18受體。B表示顯性易感等位基因，b表示抗性等位基因。RYR1骨骼肌ryanodine受體。C(胞嘧啶)是惡性過(guò)熱的顯性抗性等位基因而T(胸腺嘧啶)是易感等位基因。
4單元型頻率以％表示，括號(hào)中為單元型的絕對(duì)數(shù)目。
表4:Landrace(SL)實(shí)驗(yàn)群體和隨機(jī)選擇的Large White(LW)豬中相關(guān)多態(tài)性的FUT1(M307)和ECF18R基因座的基因型分布，tetrachoric相關(guān)性(R)和聯(lián)合的顯著性(X2和w×X2)5FUTI/M307品系基因座 基因型A/GA/ArX2X2xw5SL ECF18R6b/b 1 113 0.98 213.1 42.6***B/b 106 1基因型 A/G,G/G A/ALW ECF18R6b/b 0 51.00 29.0 11.6***B/b,B/B 24 05根據(jù)Cotterman(1947)，將重量因子w=0.2(SL)和0.4(LW)用于校正因數(shù)據(jù)中包括相關(guān)動(dòng)物而失去的精確性，***p＜0.001。
6ECF18R基因座處的基因型為b/b的動(dòng)物對(duì)F18ab大腸桿菌細(xì)菌的粘附具有抗性，而基因型為B/b和B/B的動(dòng)物對(duì)上述粘附是易感的。
方法1．引物使用衍生自人FUT1基因的引物從基因組DNA中擴(kuò)增其豬對(duì)應(yīng)物。由所得豬序列設(shè)計(jì)特異性引物，將該引物用于進(jìn)一步的擴(kuò)增和測(cè)序反應(yīng)中(表1)。
2．篩選豬基因組文庫(kù)用引物P7和P10得到豬FUT1探針，用該探針或豬FUT1 cDNA篩選豬基因組文庫(kù)。用引物P7和P10從豬基因組DNA中得到FUT1探針，用經(jīng)α32P dATP標(biāo)記的(Prime ItⅡ,Stratagene)該探針篩選構(gòu)建于SuperCos 1(Stragene,La Jolla,Ca,USA)中的豬基因組文庫(kù)。于42℃將復(fù)本濾膜雜交15小時(shí)(50％甲酰胺，6×SSC,5×Denhardt’s,0.5％SDS,0.1mg/ml鮭精DNA),65℃洗滌兩次達(dá)30分鐘(1×SSC,0.1％SDS)之后，暴露于(15h,-80℃)X射線(xiàn)膠片后鑒定陽(yáng)性菌落。
3．豬中期染色體原位雜交對(duì)粘?？寺THs1,ETHs2,ETHs3,ETHs4和ETHs6進(jìn)行熒光原位雜交(FISH)(Solinas Toldo等，1993)或?qū)ωi中期染色體進(jìn)行直接原位染色體PCT(DISC PCR)。雜交前對(duì)中期染色體進(jìn)行Q-顯帶和照相。使用生物素-16-dUTP通過(guò)隨機(jī)引物法標(biāo)記探針。使用親和素-FITC和生物素化的抗親和素進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)和擴(kuò)增。用4,6-diamidino-2-phenylindole負(fù)染染色體，按Solinas Toldo,1993所述測(cè)定粘粒的相對(duì)位置。
4．亞克隆在瓊脂糖凝膠上分離探針陽(yáng)性基因組菌落的酶消化物，轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，將探針陽(yáng)性帶亞克隆至質(zhì)粒中以進(jìn)行FUT1測(cè)序。由此方法得到的FUT1序列示于圖1。
在0.8％瓊脂糖凝膠上分離所有粘粒的KspI-,EcoRI-和KspI/EcoRI消化物，轉(zhuǎn)移至Hybond N尼龍膜上(Meijerink等，1997)。將此印跡與經(jīng)α32P dATP標(biāo)記的豬FUT1 PCR產(chǎn)物(引物P6-P11和P7-P10)雜交。根據(jù)放射自顯影信號(hào)，將ETHs1,-s2和-s3進(jìn)一步亞克隆至pBluescriptSK-(Stratagene)，由亞克隆測(cè)定FUT序列。通過(guò)直接測(cè)序PCR產(chǎn)物，比較ECF18R陽(yáng)性(BB/Bb)和陰性(bb)動(dòng)物得自粘粒ETHs2和-s3的兩個(gè)FUT-樣開(kāi)放閱讀框(ORF)(FUT1和FUT2)的序列。
5．聚合酶鏈反應(yīng)和直接測(cè)序使用Perkin Elmer Ready Reaction Dye Terminator試劑盒(PerkinElmer Cetus,Norwalk,CT,USA)和10pmol引物，用由95℃起始變性5分鐘，接著95℃30秒，50℃15秒和60℃4分鐘進(jìn)行25輪循環(huán)組成的熱程序進(jìn)行循環(huán)測(cè)序。用于豬α(1,2)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因擴(kuò)增和測(cè)序的引物示于表1?？紤]到因FUT1,FUT2和FUT2假基因的高度相似性所致的引物交叉退火的可能性，設(shè)計(jì)了其它的引物。在373A ABI測(cè)序儀(Applied Biosystems公司)上分析樣品，用GCG程序包(Devereux,1984)進(jìn)行序列分析。
6．產(chǎn)生可提供資料的后代在由4頭公豬和16頭母豬產(chǎn)生的221頭Landrace豬和由不相關(guān)的豬之間9次交配產(chǎn)生的29頭Large White豬中分析單個(gè)核苷酸的多態(tài)性。為了產(chǎn)生大量可提供資料的后代以檢查編碼ECF18受體的豬基因和選定多態(tài)性基因座之間的連鎖，僅進(jìn)行了B/b×b/b型可提供資料的Landrace交配。
7．定居試驗(yàn)在Bertschinger等，1993的研究中，也在定居試驗(yàn)中檢測(cè)了上述Landrace豬的ECF18易感性。為此，斷奶后立即用血清型為0139:K12(B):H1:F18的大腸桿菌菌株124/76接種豬(Rippinger等，1995)。每天監(jiān)測(cè)豬糞便中排出的細(xì)菌。將定居的程度計(jì)算為兩個(gè)最高糞便評(píng)分的平均值。平均糞便評(píng)分為3.5，相當(dāng)于菌落形成單位(CFU)/g的對(duì)數(shù)為6.7或更高被認(rèn)為是對(duì)定居敏感。此界限的根據(jù)是低于此值即無(wú)死亡率和得自完全抗性小豬的評(píng)分。
8．核苷酸多態(tài)性的連鎖分析將單個(gè)核苷酸多態(tài)性的結(jié)果與Vgeli等(1996)所述的體外粘附試驗(yàn)中鑒定的ECF18R定型數(shù)據(jù)和Vogeli等(1996)所述的GPI-,PGD-,α-1-B-糖蛋白-(AIBG),ryanodine受體(RYR1),EAH-和S-基因座的定型數(shù)據(jù)比較。使用CRI-MAP 2.4版本的程序(Green等，1990)進(jìn)行成對(duì)連鎖分析并計(jì)算重組分?jǐn)?shù)。通過(guò)將上述基因座依次插入圖譜中以進(jìn)行多點(diǎn)連鎖分析。計(jì)算Landrace家族的親代動(dòng)物和8頭親代Large White豬的單元型頻率，所述動(dòng)物的ECF18R單元型是由得自后代的資料確定的。計(jì)算所有Landrace和Large White豬后代的ECF18R和FUT1(FUT1/M307)中的突變(多態(tài)性)的四氯相關(guān)性。
9．Southern印跡分析用KspI(1,4,7),EcoRI(2,5,8)和KspI/EcoRI(3,6,9)消化并在0.8％的瓊脂糖凝膠上分離之后，對(duì)粘粒ETHs1(1-3),ETHs2(4-6)和ETHs3(7-9)進(jìn)行Southern印跡分析。與經(jīng)α32P dATP標(biāo)記的5’FUT1片斷(引物P6-P11)的雜交導(dǎo)致KspI消化物(泳道4)和KspI/EcoRI消化物(泳道6)中有相同的940bp雜交帶。然而，與3’FUT1片斷(引物P7-P10)(表1)的雜交在泳道4顯示出6.2kb KspI片斷和在泳道6顯示出1.1kb KspI/EcoRI帶。5’和3’FUT1片斷都與泳道5中相同的4.6kb EcoRI片斷雜交。這表明粘粒ETHs2中含有的FUT1基因中存在KspⅠ位點(diǎn)。3’FUT1片斷的交叉雜交檢測(cè)到2.7kb(泳道2,3,8和9)和8.2kb(泳道8和9)的帶，分別鑒定出FUT2假基因(不完全的ORF)和FUT2基因序列。
10．限制性片斷的多態(tài)性使用多種限制性酶通過(guò)限制性長(zhǎng)度多態(tài)性分析檢測(cè)到豬FUT1基因中的(A)M307 G至A和(B)M857 G至A的突變。用CfoI(A)和AciI(B)消化擴(kuò)增的FUT1片斷導(dǎo)致限制性片斷的多態(tài)性。第一泳道是100bp的標(biāo)記物，片斷長(zhǎng)度以堿基對(duì)表示。(A)M307A/A基因型(泳道2)產(chǎn)生了328和93bp的限制性片斷，而M307G/G基因型(泳道4)產(chǎn)生了93,241和87bp的片斷，雜合的M307A/G基因型(泳道3)顯示出所有4個(gè)片斷。
(B)M857A/A基因型(泳道2)的消化產(chǎn)生了174bp的片斷，而M857G/G基因型(泳道4)產(chǎn)生了136和38bp的片斷，M857A/G基因型(泳道3)產(chǎn)生了所有3個(gè)片斷。
11．豬的來(lái)源Swiss Landrace實(shí)驗(yàn)群體的數(shù)據(jù)得自?xún)蓚€(gè)種，這兩個(gè)種是蘇黎世大學(xué)獸醫(yī)細(xì)菌學(xué)研究所建立的。Large White,Swiss Landrace,Duroc,Hampshire和Pietrain豬群的其它豬得自瑞士的不同豬群。其它豬隨機(jī)得自美國(guó)中西部的農(nóng)場(chǎng)。
參考文獻(xiàn)Bertschinger等(1993)，獸醫(yī)微生物學(xué)35:79-89Cohney等(1996)免疫遺傳學(xué)44:76-79Devereux等(1984)核酸研究1:387-395Fujii等(1991)科學(xué)253:448-451Green等(1990)CRI-MAP,2.4版本的文獻(xiàn)，St.Louis:華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院Kelly等(1994),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:5843-5847Meijerink等(1997)動(dòng)物遺傳學(xué)第25次國(guó)際研討會(huì)P44Rippinger(1995)獸醫(yī)微生物學(xué)，45:281-295Solinas Toldo等(1993)Mamm.Genome 4:720-727Thurin和Blaszczyk-Thurin(1995)生物化學(xué)雜志270(44):26577-26580Vogeli等(1996)動(dòng)物遺傳學(xué)27:321-328Vogeli等(1997)Schweiz Arch.Tierheilk 139:479-484美國(guó)專(zhuān)利5,358,648,Maclennon等美國(guó)專(zhuān)利5,552,144,Valery等WO 8604604 987P，發(fā)明人PetersonWO 9628967，發(fā)明人Koike,CWO 9413811，發(fā)明人Imberechts和LintermansTW 266264，發(fā)明人Jeng和Liou
權(quán)利要求
1．鑒定大腸桿菌腸定居的抗性豬的方法，所述方法包括a．測(cè)定豬生物樣品中是否存在與定居抗性相關(guān)的遺傳多態(tài)性；和b．如果豬的多態(tài)性是純合的，則可推斷豬是抗性的。
2．鑒定大腸桿菌相關(guān)腸紊亂的抗性豬的方法，所述方法包括a．測(cè)定豬生物樣品中豬α(1,2)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因1第307位的含氮堿基是否僅是腺嘌呤；和b．如果第307位的含氮堿基僅是腺嘌呤，即可將豬鑒定為抗性。
3．繁殖對(duì)大腸桿菌相關(guān)疾病具有抗性的豬的方法，所述方法包括a．選擇α(1,2)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶1基因中具有遺傳多態(tài)性因而將其鑒定為對(duì)大腸桿菌相關(guān)腸疾病具有抗性的豬的繁殖豬；和b．繁殖所選擇的豬。
4．權(quán)利要求1,2或3的方法，其中大腸桿菌是菌株F18。
5．分離的DNA分子，其中豬α(1,2)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶1基因具有多態(tài)性。
6．分離的DNA分子，其具有根據(jù)圖1的核苷酸序列。
7．權(quán)利要求6的分離的DNA分子，其中第307位的鳥(niǎo)嘌呤被腺嘌呤取代。
8．分離的DNA分子，其與權(quán)利要求6的核苷酸序列互補(bǔ)。
9．權(quán)利要求6的分離的DNA分子，其中第857位的鳥(niǎo)嘌呤被腺嘌呤取代。
10．權(quán)利要求6的分離的DNA分子，其第229位的核苷酸為蘇氨酸。
11．由權(quán)利要求5或6的DNA分子編碼的多肽，所述分子具有α(1,2)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性。
12．權(quán)利要求5或6的分離的DNA分子的部分，所述部分包括將大腸桿菌定居抗性豬和敏感豬區(qū)分開(kāi)的核苷酸序列。
13．檢測(cè)大腸桿菌F18受體的分子測(cè)定法，所述測(cè)定法包括從豬成核細(xì)胞中分離DNA；使用與豬α(1,2)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因1的DNA序列互補(bǔ)的寡核苷酸作為引物，在聚合酶鏈反應(yīng)中擴(kuò)增所述DNA；用至少一種限制性酶進(jìn)行限制性酶消化；通過(guò)凝膠電泳分離所得片斷；測(cè)定各片斷的數(shù)目和長(zhǎng)度；和由片斷的數(shù)目和長(zhǎng)度確定存在哪一種受體。
14．權(quán)利要求14的分子測(cè)定法，其中限制性酶是CfoI。
15．檢測(cè)大腸桿菌F18受體的試劑盒，所述試劑盒在獨(dú)立的容器中含有與豬α(1,2)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因1的多態(tài)性DNA序列互補(bǔ)的寡核苷酸。
16．豬多肽，其具有α(1,2)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性和第103位的氨基酸取代。
17．權(quán)利要求17的多肽，其進(jìn)一步的特征在于第286位具有氨基酸取代。
18．豬α(1,2)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的多態(tài)性在開(kāi)發(fā)治療患有大腸桿菌相關(guān)疾病的豬的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了以高水平的敏感性和特異性將在基因上對(duì)F18大腸桿菌感染的相關(guān)疾病敏感的豬與抗性豬區(qū)分開(kāi)來(lái)的非侵害性方法和組合物。使用α(1,2)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FUT1)基因的DNA多態(tài)性區(qū)分抗性豬和易感豬。本發(fā)明包括由核苷酸多態(tài)性編碼的具有氨基酸取代的多肽,區(qū)分大腸桿菌F18－粘附抗性,雜合(載體)和純合易感豬的分子診斷試驗(yàn)和試劑盒。分子試驗(yàn)以高敏感性和特異性鑒定豬對(duì)水腫病和斷奶后腹瀉的易感性,因此豬飼養(yǎng)者可利用該試驗(yàn)提高豬的抗性。本發(fā)明多態(tài)性的有關(guān)資料可以讓人們深入了解大腸桿菌相關(guān)腸紊亂的病因和治療方法。
文檔編號(hào)A61P1/00GK1314953SQ98807387
公開(kāi)日2001年9月26日 申請(qǐng)日期1998年5月20日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月20日
發(fā)明者B·T·波斯沃斯, P·沃格利 申請(qǐng)人:生物技術(shù)研究及發(fā)展公司, 美國(guó)農(nóng)業(yè)部, 蘇黎世瑞士聯(lián)邦技術(shù)協(xié)會(huì)