專利名稱：一種hcv多表位肽疫苗及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于HCV疫苗技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種HCV多表位肽疫苗及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒Q^patitis C virus, HCV)，為黃病毒屬的單股正鏈?zhǔn)雀蜶NA病毒，是引發(fā)慢性肝病的主要病原體，全球約有I. 7億感染者，發(fā)病人數(shù)以每年三百萬(wàn)速度遞增。慢性HCV感染與肝硬化和肝癌直接相關(guān)，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。由于HCV標(biāo)準(zhǔn)治療方案費(fèi)用高昂，療效不理想使得發(fā)展中國(guó)家大多數(shù)HCV感染患者難以承受。因此研發(fā)HCV疫苗成為降低HCV所引發(fā)的肝硬化，肝癌發(fā)生率最為有效的策略之一。HCV基因組分別編碼核心蛋白C，包膜蛋白El、E2，p7和6種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS2、NS3，·NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。但由于HCV病毒RNA聚合酶缺乏校對(duì)功能，病毒變異率高，尤其·是位于包膜糖蛋白E2的中和抗原位點(diǎn)存在高變區(qū)，傳統(tǒng)的以產(chǎn)生保護(hù)性抗體為主的疫苗研發(fā)面臨重重困難。研究表明，急性病患體內(nèi)多特異性CTL可以使病情逐漸轉(zhuǎn)歸、自愈。慢性HCV病人T細(xì)胞應(yīng)答雖然具有多克隆以及多特異性，但強(qiáng)度遠(yuǎn)不如急性病人的免疫應(yīng)答強(qiáng)烈，相對(duì)較弱的抗HCV免疫應(yīng)答導(dǎo)致病毒難以被清除。與此同時(shí)，肝內(nèi)大量的HCV特異性CD8+T細(xì)胞分泌Y干擾素的水平受到抑制，因此，慢性HCV感染時(shí)CD8+T細(xì)胞功能障礙是造成免疫系統(tǒng)不能控制HCV復(fù)制，導(dǎo)致疾病慢性化的主要原因。近10年來(lái)，對(duì)HCV感染發(fā)病機(jī)制、保護(hù)性免疫應(yīng)答和病毒持續(xù)感染機(jī)制的認(rèn)識(shí)取得了較大進(jìn)展。中和抗體以及CD4+和CD8+T細(xì)胞所引發(fā)強(qiáng)烈的T細(xì)胞免疫應(yīng)答已被證明與HCV的清除相關(guān)，這將是研制丙型肝炎疫苗的希望所在。大量證據(jù)表明，HCV非結(jié)構(gòu)蛋白介導(dǎo)的持續(xù)性、強(qiáng)烈的、多特異性的Thl型細(xì)胞免疫應(yīng)答水平直接關(guān)系到病毒是否能被清除以及疾病的預(yù)后。由于大多數(shù)慢性患者HCV亞型的差異，成功的疫苗應(yīng)該誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)烈的多特異性免疫應(yīng)答，包括CD4+及CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答。因此，HCV表位疫苗更傾向于選取保守區(qū)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供一種HCV多表位肽疫苗及其應(yīng)用，將HCV多表位肽連接可以誘導(dǎo)出特異性的T細(xì)胞免疫應(yīng)答，包括⑶4+T細(xì)胞和⑶8+T細(xì)胞，T細(xì)胞經(jīng)過(guò)特異性抗原刺激以后可迅速產(chǎn)生IFN-Y和IL-2。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)一種丙型肝炎病毒的多表位多肽，包括以下多表位多肽其氣基酸殘基序列如SEQ. ID. NO. I所不；或者其氨基酸殘基序列如SEQ. ID. NO. 2所示。所述的丙型肝炎病毒的多表位多肽在制備針對(duì)丙型肝炎病毒的預(yù)防性/治療性疫苗的應(yīng)用。
所述的丙型肝炎病毒的多表位多肽在制備抗丙型肝炎病毒的藥物的應(yīng)用。所述的藥物為刺激⑶4+T、⑶8+T淋巴細(xì)胞增殖的藥物。所述的藥物為刺激分泌IFN- y和IL-2的細(xì)胞增殖的藥物。所述的藥物為誘發(fā)針對(duì)丙型肝炎病毒的細(xì)胞免疫應(yīng)答的藥物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明提供的丙型肝炎病毒的多表位多肽，篩選出的2個(gè)HCV保守CTL表位，進(jìn)一步為了使所設(shè)計(jì)的疫苗可以刺激CD4+和CD8+T細(xì)胞，弓I發(fā)強(qiáng)烈的T細(xì)胞免疫應(yīng)答，特將2個(gè)CTL表位輔以一個(gè)Th表位進(jìn)行串聯(lián)。在保證各自獨(dú)立性的基礎(chǔ)上，該多表位多肽表現(xiàn)出了強(qiáng)的免疫原性，表現(xiàn)出了良好的免疫效果包括
刺激淋巴細(xì)胞增殖、不僅可以刺激⑶4+T、⑶8+T淋巴細(xì)胞的增殖，而且可以刺激較高比例的⑶8+T淋巴細(xì)胞增殖；可以誘導(dǎo)出特異性的T細(xì)胞免疫應(yīng)答；經(jīng)過(guò)特異性抗原刺激以后可以迅速產(chǎn)生IFN- Y和IL-2 ；該HCV多表位多肽疫苗可能是較理想的HCV預(yù)防/治療性候選疫苗。通過(guò)體外試驗(yàn)，所構(gòu)建的多肽疫苗可以刺激10例中的3例慢性丙型肝炎病毒感染者 PBMC 分泌 IFN- y。


圖I為多表位多肽免疫HHD-2小鼠后淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果；圖2為多表位多肽免疫HHD-2小鼠后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)⑶4+T、⑶8+T淋巴細(xì)胞結(jié)果;圖3為多表位多肽免疫HHD-2小鼠后經(jīng)LDH釋放法檢測(cè)CTL活性結(jié)果；圖4為多表位多肽免疫HHD-2小鼠后經(jīng)ELISP0T法檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-Y以及IL_2結(jié)果;圖5為多表位多肽刺激HCV患者PBMC分泌IFN- y檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。在HCV的表位中篩選多個(gè)表位串聯(lián)，以此作為疫苗進(jìn)行免疫，以達(dá)到針對(duì)HCV的的免疫效果，從而達(dá)到預(yù)防/治療性丙型肝炎的目的，這些免疫效果包括引發(fā)包括CD4+和⑶8+T細(xì)胞的T細(xì)胞免疫應(yīng)答、引發(fā)分泌IFN-Y、IL-2細(xì)胞因子為主的Thl型細(xì)胞免疫應(yīng)答。I、鑒于上述目的，首先進(jìn)行多表位的篩選及多表位多肽的串聯(lián)或構(gòu)建具體的HCV多表位多肽VL-20、VAL-44的構(gòu)建為從HCV表位肽當(dāng)中篩選具有抗原性好，能夠刺激免疫細(xì)胞的表位進(jìn)行串聯(lián)，根據(jù)HCV中的CTL表位與HLA-A2親和力測(cè)試以及與慢性HCV病人PBMC反應(yīng)情況，篩選出兩個(gè)HCV CTL表位進(jìn)行多表位的串聯(lián)NS5A(1991-1999)，其氨基酸序列為VLSDFKVWL ；
NS4B (1793-1801)，其氨基酸序列為SMMAFSAAL ；為保證各自獨(dú)立性，避免產(chǎn)生新的接合表位，在上述兩個(gè)表位之間加入KK的間隔序列，從而得到VL-20多表位多肽NS5A-KK-NS4B，其氨基酸序列如SEQ. ID. NO. I所示。進(jìn)一步，為了使多表位多肽既可以刺激⑶4+T細(xì)胞，又可以刺激⑶8+T細(xì)胞，以引發(fā)強(qiáng)烈的T細(xì)胞免疫應(yīng)答，還在NS5A與NS4B之間插入一個(gè)Th表位，其氨基酸序列為KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRL，同樣的兩個(gè)表位之間加入KK的間隔序列，從而得到VL-44多表位多肽NS5A-KK-Th表位-KK-NS4B，其氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。上述VL-20、VL-44多表位多肽根據(jù)其序列人工來(lái)合成，具體的委托上海強(qiáng)耀生物科技有限公司利用多肽合成儀合成2條多肽，純度均在95%以上。并用高效液相色譜(highperformance liquid chromatography,HPLC)分析合成多肽的純度及氨基酸的正確性。結(jié)果顯示合成多表位純度> 95%;多表位多肽中各氨基酸 的比率與預(yù)期的一致，說(shuō)明多肽合成正確。2、以HHD-2小鼠作為免疫對(duì)象，將篩選出的多表位多肽進(jìn)行免疫以觀察其所能引發(fā)的免疫效果，具體的免疫方案為選用6-8周齡HHD-2雄性小鼠18只，分為多表位多肽VL-20，多表位多肽VAL-44以及PBS皮下給藥組，每組各6只。多表位多肽或PBS與弗氏佐劑充分混勻后皮下注射小鼠，第一次用弗氏完全佐劑，之后用弗氏不完全佐劑。給藥時(shí)，分別皮下注射IOOiU (IP g/U I于生理鹽水)多肽VL-20，多肽VAL-44，PBS與佐劑I: I等體積充分乳化。間隔2周加強(qiáng)免疫一次，共免疫3次。3、免疫后的免疫效果的檢測(cè)3. I脾細(xì)胞增殖的檢測(cè)多表位多肽免疫和對(duì)照組小鼠在第三次免疫后10天處死，取小鼠脾臟置鋼網(wǎng)上研磨成單細(xì)胞懸液，紅細(xì)胞裂解液，室溫5min去除紅細(xì)胞后，用RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為I X IO5細(xì)胞/ml，置96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孔200 yl，同時(shí)每孔加入VL-20或VAL-44(10i! g/ml)，設(shè)刀豆蛋白A(ConA)陽(yáng)性對(duì)照孔、陰性對(duì)照孔，每只均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。置5%C02 孵箱中 37°C培養(yǎng) 54h 后，每孔加入 20 u I MTT (5mg/ml，溶于 PBS，pH7. 2，過(guò)濾除菌)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)，棄盡上清，每孔加入DMSO 150 Ul，震蕩10分鐘，測(cè)0D490nm值,結(jié)果用增殖刺激指數(shù)(stimulation index, SI)=刺激組OD/未刺激組OD表示。SI>2說(shuō)明具有刺激淋巴細(xì)胞增殖的作用。檢測(cè)結(jié)果如圖I所示,其中橫坐標(biāo)為VL-20，VAL-44以及PBS免疫的不同組別，縱坐標(biāo)為SI，結(jié)果顯示多肽VL-20免疫組SI與PBS組相比，雖有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但其數(shù)值< 2，無(wú)實(shí)際意義。多肽VAL-44免疫組的SI最高，且>2為3. 25 ±0. 14，與VL-20免疫組以及PBS組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P〈0. 05)，說(shuō)明所構(gòu)建的多表位多肽VAL-44在免疫后能夠顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖。3. 2免疫小鼠⑶4+T、⑶8+T淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)免疫程序結(jié)束后，常規(guī)無(wú)菌取脾臟，將小鼠脾臟置鋼網(wǎng)上研磨成單細(xì)胞懸液，加入5ml紅細(xì)胞裂解液，室溫5min去除紅細(xì)胞后，調(diào)整細(xì)胞濃度為IXlO6 / ml，取Iml細(xì)胞懸液于EP管中，無(wú)鈣鎂離子的PBS洗滌2次，加入FITC-⑶8或PE-⑶4單抗，室溫避光孵育30min, PBS洗滌后加入固定液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)⑶4+T、⑶8+T細(xì)胞亞群百分比。
檢測(cè)結(jié)果如圖2所示,其中橫坐標(biāo)為VL-20，VAL-44以及PBS免疫的不同組別，縱坐標(biāo)為具體⑶4+T、⑶8+T細(xì)胞亞群百分比，結(jié)果顯示多肽VAL-44由于包含了 2個(gè)CTL表位和一個(gè)Th表位可以引起⑶4+T、⑶8+T淋巴細(xì)胞增殖，⑶4+T、⑶8+T淋巴細(xì)胞百分比分別為36. 8%和10. 93%，高于多肽VL-20以及PBS免疫組，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p〈0. 05)。此外，還計(jì)算了 CD4+/CD8+比值，PBS組為4. 36，而多肽VAL-44，多肽VL-20分別為3. 36，4. 05，說(shuō)明多肽VAL-44不僅可以刺激⑶4+T、⑶8+T淋巴細(xì)胞的增殖，而且可以刺激較高比例的⑶8+T淋巴細(xì)胞增殖。3.3CTL 殺傷性用LDH (乳酸脫氫酶)細(xì)胞殺傷檢測(cè)試劑盒(具體操作流程按照說(shuō)明書)檢測(cè)CTL活性。最后一次免疫后10天處死小鼠，取脾細(xì)胞，用VAL-44、VL-20(10iig/ml)刺激5天的T淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，用負(fù)載VAL-44、VL-20(終濃度10 u g/ml)的ClR. AAD細(xì)胞(該細(xì)胞系是一種常被使用的重組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染了 HLA-A2的a I和a 2結(jié)構(gòu)域基因和鼠H_2Db的a 3結(jié)構(gòu)域基因，在CTL殺傷實(shí)驗(yàn)中，適合用作評(píng)價(jià)HLA-A2分子限制性表位的靶細(xì)胞)做靶 細(xì)胞。設(shè)培養(yǎng)液背景孔、體積校正孔、靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔、靶細(xì)胞最大釋放孔、效應(yīng)細(xì)胞自然釋放孔、LDH陽(yáng)性對(duì)照孔以及實(shí)驗(yàn)孔(按效靶比分別為50.0:1, 25.0:1, 12. 5:1以及6. 25:1比例將靶細(xì)胞、效應(yīng)細(xì)胞加載至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔總體積為100 ill)。試驗(yàn)過(guò)程如下按上述將細(xì)胞或培養(yǎng)液加入96孔板中，37°C，5% C02孵箱中培養(yǎng)4h，培養(yǎng)結(jié)束后，吹打每孔lmin，吸取每孔上清50iU，轉(zhuǎn)移到新的96孔板(每孔加入50 yl檢測(cè)試劑)，室溫反應(yīng)lh。測(cè)定每孔490nm的吸光度(A)值，計(jì)算每個(gè)效/靶比時(shí)殺傷百分比。
殺傷活性(％)=檢測(cè)結(jié)果如圖3所示,其中橫坐標(biāo)為VL-20，VAL-44以及PBS免疫的不同組別不同效/靶比，(分別為50. 0:1，25. 0:1，12. 5:1以及6. 25:1)，縱坐標(biāo)為殺傷活性(％)，結(jié)果顯示，當(dāng)效/靶比為50. 0:1時(shí)VAL-44免疫組的殺傷率達(dá)到最高，為44%，顯著高于相同效/靶比的VL-20免疫組和PBS免疫組(p〈0. 05)。從而證實(shí)了所構(gòu)建的多表位多肽VAL-44在免疫后可以在HHD-2小鼠體內(nèi)誘發(fā)特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。3. 4、檢測(cè)分泌IFN- y和IL_2的細(xì)胞數(shù)量使用ELISP0T試劑盒檢測(cè)(分別為檢測(cè)小鼠IFN- y和IL-2ELISP0T試劑盒)分泌IFN- y和IL-2的細(xì)胞。96孔濾膜板中加入2. 5 ii g/ml抗鼠的IL-2 (抗鼠的IFN- y為預(yù)包被)，4°C過(guò)夜，洗板，10%完全RPMI-1640培養(yǎng)液200 iil/孔，I小時(shí)封閉。脾細(xì)胞(I X IO6/孔)加入10 u g/ml VAL-44、VL-20或ConA4 u g/ml (陽(yáng)性對(duì)照)每只設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24小時(shí)，取出后PBST洗滌緩沖液洗板，加入1:2500稀釋的生物素標(biāo)記的抗IFN- y或抗IL-2，室溫孵育2小時(shí)。PBST (0.05%吐溫20)洗滌5次，加入1:1000稀釋的鏈霉親和素-HRP孵育I小時(shí)。加入底物溶液(TMB)，直至斑點(diǎn)清晰可見，去離子水沖洗，陰干。使用自動(dòng)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)讀數(shù)儀計(jì)數(shù)。IO6個(gè)脾細(xì)胞中斑點(diǎn)數(shù)目大于30為陽(yáng)性。檢測(cè)結(jié)果如圖4所示,其中橫坐標(biāo)為VL-20，VAL-44以及PBS免疫的不同組別，縱坐標(biāo)為分泌IFN- y或IL-2的細(xì)胞均數(shù)，結(jié)果顯示，多表位多肽VAL-44免疫后引發(fā)的分泌IFN- y或IL-2細(xì)胞均高于VL-20免疫組(p〈0. 05)，分泌IFN- y和IL-2平均細(xì)胞數(shù)分別達(dá)到65個(gè)/IO6以及57個(gè)/106，說(shuō)明多表位多肽VAL-44主要引發(fā)Thl型的細(xì)胞因子分泌。4、ELISP0T檢測(cè)HCV感染者外周IFN- y的細(xì)胞選取10例2011年唐都醫(yī)院住院HCV感染患者以及2例健康志愿者抗凝外周靜脈血，無(wú)菌PBS I :1稀釋，將其輕柔用滴管沿管壁緩慢注于人淋巴細(xì)胞分離液面上層，室溫2000rpm / min離心25min，輕輕吸取白膜層(PBMC)，采用人IFN-Y ELI SPOT試劑盒(預(yù)包被的PVDF膜96孔板)檢測(cè)HCV感染者PBMC中分泌IFN- y的細(xì)胞數(shù)目。操作過(guò)程如下每孔加入I X IO6PBMC,設(shè)立陰性對(duì)照孔(加PBMC而不加多肽)多肽刺激孔(加入終濃度為IOy g/ml的合成多肽)以及陽(yáng)性對(duì)照孔(按照I :1000稀釋的CD-32刺激PBMC)每個(gè)樣品均設(shè)三個(gè)復(fù)孔。板置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。洗滌4次。每孔加入IOOyl生物素化抗 IFN-Y的檢測(cè)抗體，37°C孵育lh。吸除孔中液體，洗滌4次。每孔加入100 ill辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈酶親和素，37°C孵育Ih (避光)。洗滌4次。每孔加入100 U I新鮮配制的ACE顯色液，37°C孵育30min (避光)。去離子水沖洗，陰干。使用自動(dòng)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)讀數(shù)儀計(jì)數(shù)。IO6個(gè)PBMC中斑點(diǎn)數(shù)目大于50或試驗(yàn)組至少為陰性對(duì)照的2倍以上為陽(yáng)性。檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，其中橫坐標(biāo)為3例HCV PBMC,縱坐標(biāo)為分泌IFN- y的細(xì)胞均數(shù)，結(jié)果顯示，VAL-44多肽可以引發(fā)3例HCV PBMC發(fā)生較高水平的肽特異性分泌IFN- y的細(xì)胞，斑點(diǎn)數(shù)分別為151個(gè)/IO6PBMC, 78以及51個(gè)斑點(diǎn)/IO6。而VL-20所引發(fā)3例HCVPBMC肽特異性分泌IFN-Y的細(xì)胞的斑點(diǎn)數(shù)分別為54，32以及18個(gè)斑點(diǎn)/106。綜合以上結(jié)果，所構(gòu)建的兩個(gè)HCV多表位多肽VL-20、VAL_44，尤其是VAL-44表現(xiàn)出良好的免疫效果能夠顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖、不僅可以刺激cd4+t、CD8+T淋巴細(xì)胞的增殖，而且可以刺激較高比例的CD8+T淋巴細(xì)胞增殖；可以在HHD-2小鼠體內(nèi)誘發(fā)特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答；引發(fā)分泌IFN- y和IL-2為主的Thl型細(xì)胞免疫應(yīng)答，該HCV多表位多肽是較理想的HCV預(yù)防/治療性候選疫苗。VAL-44多肽疫苗可以刺激10例中的3例慢性丙型肝炎病毒感染者PBMC分泌IFN- y。這表明VL-20、VAL-44可以作為疫苗或抗HCV病毒藥物的制備。
權(quán)利要求
1.一種丙型肝炎病毒的多表位多肽，其特征在于，包括以下多表位多肽 其氨基酸殘基序列如SEQ. ID. NO. I所示； 或者其氨基酸殘基序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
2.權(quán)利要求I所述的丙型肝炎病毒的多表位多肽在制備針對(duì)丙型肝炎病毒的預(yù)防性/治療性疫苗的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求I所述的丙型肝炎病毒的多表位多肽在制備抗丙型肝炎病毒的藥物的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物為刺激CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞增殖的藥物。
5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物為刺激分泌IFN-y和IL-2的細(xì)胞增殖的藥物。
6.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物為誘發(fā)針對(duì)丙型肝炎病毒的細(xì)胞免疫應(yīng)答的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種HCV多表位肽疫苗及其應(yīng)用，包括以下多表位多肽其氨基酸殘基序列如SEQ.ID.NO.1所示；或者其氨基酸殘基序列如SEQ.ID.NO.2所示。多肽VAL-44 HCV可以誘導(dǎo)出特異性的T細(xì)胞免疫應(yīng)答，包括CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，T細(xì)胞經(jīng)過(guò)特異性抗原刺激以后可以迅速產(chǎn)生IFN-γ和IL-2，該HCV多肽疫苗可以刺激10例中的3例慢性丙型肝炎病毒感染者PBMC分泌IFN-γ，該HCV多表位多肽可能是較理想的HCV預(yù)防/治療性候選疫苗。
文檔編號(hào)A61K39/29GK102757484SQ20121023375
公開日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2012年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月6日
發(fā)明者蘭海云, 呂欣, 姚敏, 尹文, 張建敏, 張瑞國(guó), 徐志凱, 楊敬, 賈戰(zhàn)生, 雷迎峰, 黃小軍 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)