用熱熒光技術(shù)檢測口蹄疫病毒疫苗熱穩(wěn)定性的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種用熱熒光技術(shù)對口蹄疫病毒疫苗進(jìn)行熱穩(wěn)定性檢測的方法及其在口蹄疫病毒疫苗的制備、儲存和運輸中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]口蹄疫
[0003]口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus，F(xiàn)MDV)感染引起的偶蹄動物共患的急性、熱性、接觸性傳染病，最易感染的動物是黃牛、水牛、豬、駱駝、羊、鹿等，黃羊、麝、野豬、野牛等野生動物也易感染此病。該病以牛最易感，羊的感染率低?？谔阋咴趤喼?、非洲和中東以及南美均有流行，在非流行區(qū)也有散發(fā)病例。
[0004]口蹄疫發(fā)病后一般不致死，但會使病獸的口、蹄部出現(xiàn)大量水皰，高燒不退，使實際畜產(chǎn)量銳減。另外，有個別口蹄疫病毒的變種可傳染給人。因此，每次爆發(fā)后只能屠宰和集體焚毀染病牲畜以絕后患。由于口蹄疫傳播迅速、難于防治、補(bǔ)救措施少，被稱為畜牧業(yè)的"頭號殺手"。
[0005]口蹄疫病毒
[0006]口蹄疫病毒(Footand Mouth Disease Virus，F(xiàn)MDV)是偶蹄類動物高度傳染性疾病(口蹄疫)的病原，屬于小RNA病毒科□蹄疫病毒屬，有七個血清型:O型、A型、亞洲I型、C型以及南非1、2、3型。各血清型之間沒有交叉保護(hù)。現(xiàn)階段我國主要流行O型、A型和亞洲I型。在口蹄疫病毒的中心為一條單鏈的正鏈RNA，由大約8000個堿基組成，是感染和遺傳的基礎(chǔ);周圍包裹著蛋白質(zhì)決定了病毒的抗原性、免疫性和血清學(xué)反應(yīng)能力;病毒外殼為對稱的20面體。口蹄疫病毒的免疫是依賴T細(xì)胞的B細(xì)胞應(yīng)答，疫苗接種主要誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生。
[0007]預(yù)防口蹄疫
[0008]接種口蹄疫疫苗是預(yù)防口蹄疫病的有效手段。
[0009]口蹄疫疫苗的種類
[0010]口蹄疫疫苗包括傳統(tǒng)疫苗和新型疫苗。傳統(tǒng)口蹄疫疫苗包括活疫苗(或弱毒疫苗)和滅活疫苗，新型口蹄疫疫苗包括亞單位疫苗、載體疫苗、核酸疫苗、基因缺失疫苗、合成肽疫苗、可飼疫苗和多表位疫苗等。
[0011](I)活疫苗(或弱毒疫苗)
[0012]活疫苗是指經(jīng)充分致弱，尚能在動物體內(nèi)增殖，接種后能夠引起動物發(fā)生無癥狀的感染，從而使機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的生物制劑，又稱為弱毒疫苗。
[0013](2)滅活疫苗
[0014]滅活疫苗是指用物理或化學(xué)方法使口蹄疫病毒喪失感染力而保留抗原性，再添加佐劑后制成的疫苗制劑。
[0015]口蹄疫病毒的實驗室檢驗技術(shù)概況
[0016]目前，口蹄疫病毒的檢測技術(shù)主要有生物學(xué)試驗(包括動物試驗和細(xì)胞培養(yǎng))、血清學(xué)診斷技術(shù)(包括補(bǔ)體結(jié)合試驗、中和試驗、凝集試驗、免疫擴(kuò)散、沉淀反應(yīng)、免疫電泳技術(shù)、放射免疫試驗和免疫電鏡技術(shù)和免疫膠體金快速檢測技術(shù)等)和分子生物學(xué)檢測技術(shù)(包括核酸雜交、等電點聚焦電泳、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及核酸序列分析等)。從動物試驗到血清學(xué)試驗以至分子生物學(xué)診斷技術(shù)，特異性越來越高，靈敏度也越來越高，但是這些檢測技術(shù)都不能對口蹄疫病毒的熱穩(wěn)定性進(jìn)行檢測。
[0017]口蹄疫病毒疫苗生產(chǎn)過程中所用檢驗方法現(xiàn)況
[0018]口蹄疫病毒的熱穩(wěn)定性對于疫苗的研發(fā)、儲存以及運輸至關(guān)重要。這個問題在發(fā)展中國家尤為顯著，因為發(fā)展中國家的疫苗運輸需要更長的時間，而且也沒有一個既定的冷鏈疫苗接種程序的規(guī)劃?，F(xiàn)如今，用于檢測口蹄疫病毒的熱穩(wěn)定性的方法是用樣品對標(biāo)準(zhǔn)品的侵染力來確定每單位體積內(nèi)口蹄疫病毒的數(shù)量(WH0，2006.Expert Committee onB1logical Standardizat1n:Guidelines on Stability Evaluat1n ofVaccines.Adopted 2006.)。
[0019]口蹄疫病毒粒子(146S)
[0020]完整的口蹄疫病毒粒子(146S)是口蹄疫病毒疫苗的有效成分，146S抗原的含量直接決定了口蹄疫病毒疫苗的質(zhì)量，146S抗原的檢測既可以指導(dǎo)疫苗的生產(chǎn)，又能評價疫苗的質(zhì)量。146S病毒粒子是口蹄疫的主要免疫原，生產(chǎn)過程中這種病毒粒子任何形式的降解都會導(dǎo)致疫苗免疫效力的下降。
[0021]相關(guān)技術(shù)
[0022]熱掃描是一種鑒定蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的行之有效的方法，此方法是通過慢慢加熱蛋白樣品并監(jiān)測其狀態(tài)。運用傅里葉變換紅外光譜(FTIR)和圓二色譜(CD)法監(jiān)測，當(dāng)溫度升高時，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)都會改變或遭到破壞。然而，運用熱量和光強(qiáng)散射法進(jìn)行監(jiān)測在現(xiàn)在來說更受歡迎。
[0023]熱焚光(ThermofIuor)也稱為差示掃描焚光法(DSF)或熱轉(zhuǎn)移試驗，現(xiàn)已用來測定改變蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的條件，或者用來尋找更穩(wěn)定的同系物或突變體。熱熒光檢測方法最早出現(xiàn)在2001年。這種方法是用一種能令熒光基團(tuán)與蛋白質(zhì)的疏水結(jié)構(gòu)相結(jié)合的熒光染料(最常用的是SYPRO Orange)來培養(yǎng)蛋白質(zhì)。在培養(yǎng)的蛋白質(zhì)樣品加熱后，隨著溫度的升高，熒光會被檢測出來。展開(去折疊)的蛋白和暴露出的疏水結(jié)構(gòu)，以溫度和熒光升降的比例函數(shù)呈現(xiàn)出來。這種檢測方法可進(jìn)行小劑量檢測，并且能夠在任何定量PCR儀上使用(M.ff.Pantoliano,E.C.Petrella,etc.2001.High-density miniaturized thermal shiftassays as a general strategy for drug discovery.J.B1mol.Screen.,6(2001),pp.429-440)。雖如此，但在面對病毒疫苗熱穩(wěn)定性檢測時，針對病毒熱穩(wěn)定性的具體情況還存在諸如機(jī)理和應(yīng)用條件(如熒光染料的選擇)等需要攻克的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0024]本發(fā)明的目的是提供一種用熱熒光技術(shù)對口蹄疫病毒疫苗進(jìn)行熱穩(wěn)定性檢測的方法。
[0025]本發(fā)明所提供的用熱熒光技術(shù)對口蹄疫病毒疫苗進(jìn)行熱穩(wěn)定性檢測的方法，是使用核酸染料一種熒光染料，或核酸染料和蛋白染料兩種熒光染料，與口蹄疫病毒疫苗結(jié)合，放入定量PCR儀中梯度升溫，通過熔解曲線獲得口蹄疫病毒疫苗的核酸釋放溫度Tr或蛋白去折疊溫度Tm，以較低溫度值確定為口蹄疫病毒疫苗的熱穩(wěn)定溫度。
[0026]所述核酸染料用于檢測核酸釋放溫度Tr，所述核酸染料單獨使用或與蛋白染料組合使用。
[0027]所述核酸染料為SYBR Green II或SYT09，反應(yīng)液濃度為100X。
[0028]所述蛋白染料用于檢測蛋白去折疊溫度Tm。
[0029]所述蛋白染料為SYPRO Orange或SYPRO red，反應(yīng)液濃度為50X。
[0030]所述熔解曲線包括原始熒光信號的曲線(橫坐標(biāo)為溫度，縱坐標(biāo)為熒光量RFU)和對應(yīng)原始熒光曲線的負(fù)導(dǎo)數(shù)曲線(橫坐標(biāo)為溫度，縱坐標(biāo)為對應(yīng)原始熒光的負(fù)導(dǎo)數(shù)值)，負(fù)導(dǎo)數(shù)曲線的波谷對應(yīng)溫度判定為核酸釋放溫度Tr或蛋白去折疊溫度Tm。
[0031]所述結(jié)合是將蛋白染料或核酸染料分別與口蹄疫病毒疫苗混合分別獲得核酸釋放曲線或蛋白去折疊曲線，或?qū)⒌鞍兹玖虾秃怂崛玖贤瑫r與口蹄疫病毒疫苗混合利用定量PCR儀中不同的熒光通道分別獲得核酸釋放曲線或蛋白去折疊曲線。
[0032]所述口蹄疫病毒疫苗為Re-A株、Asia-1/JS株或0/MYA98株。
[0033]用熱熒光技術(shù)對口蹄疫病毒疫苗進(jìn)行熱穩(wěn)定性檢測的方法，具體包括以下步驟:
[0034]I)準(zhǔn)備口蹄疫病毒疫苗樣品:以口蹄疫病毒疫苗中口蹄疫病毒粒子(146S)濃度足以判斷其中有完整病毒粒子的疫苗株為樣品；
[0035]2)將蛋白染液與核酸染液稀釋至可用濃度:蛋白染料為SYP