專利名稱：重組人表皮生長(zhǎng)因子陽離子脂質(zhì)體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白多肽的制劑和制備方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重組人表皮生長(zhǎng)因子陽離子脂質(zhì)體及其制備方法。
背景技術(shù)：
表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Epidermal Growth Factor,EGF)是人體內(nèi)的一種重要的活性蛋白多肽物質(zhì)，是由53個(gè)氨基酸組成、分子量為6. 2KD的活性多肽。美國科學(xué)家Cohen博士在人體中發(fā)現(xiàn)了 EGF，并證明了 EGF對(duì)皮膚的影響，揭開人體皮膚衰老的秘密。EGF在臨床上的應(yīng)用主要在①加速燒傷、創(chuàng)傷、外科手術(shù)、潰瘍等造成的創(chuàng)面愈合，尤其可促進(jìn)難以治療的糖尿病性潰瘍的愈合加速角膜損傷、潰瘍的愈合用于皮 膚和角膜移植手術(shù)加速胃、十二指腸潰瘍的愈合。另外，隨著年齡增加人表皮細(xì)胞活性降低，逐漸引起皮膚的老化，而EGF可刺激表皮細(xì)胞生長(zhǎng)起抗衰老作用，會(huì)明顯使皮膚紅潤(rùn)、光滑、細(xì)嫩、有彈性、幫助衰老表皮細(xì)胞脫落，加速新表皮細(xì)胞的合成。1992年，美國詹姆士藥物實(shí)驗(yàn)室將EGF添加到化妝品中，開創(chuàng)運(yùn)用EGF進(jìn)行袪皺抗衰的生物美容新領(lǐng)域，標(biāo)志著生物基因美容時(shí)代的到來。目前，市場(chǎng)上的EGF產(chǎn)品均存在著一定的缺陷，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面①EGF作為多肽、蛋白類藥物，具有穩(wěn)定性差、易于酶解、且藥物體內(nèi)半衰期短的缺點(diǎn)，為此，臨床上常采用反復(fù)大劑量給藥的方法來克服EGF的這些缺點(diǎn)，這不僅增加了患者的用藥不便和痛苦，還增加用藥成本EGF在常溫下易失活性，需要在2-8°C條件下冷藏保存(rhEGF液體制劑即使在4°C下，也只能維持兩個(gè)月)，這也增加了藥物的儲(chǔ)運(yùn)和使用成本；③做為皮膚夕卜用的rhEGF常規(guī)制劑(如外用溶液劑)普遍存在易流失、生物利用度低、細(xì)胞及組織相溶性較差等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實(shí)施例所要解決的技術(shù)問題在于，提供一種重組人表皮生長(zhǎng)因子陽離子脂質(zhì)體及其制備方法，以獲得穩(wěn)定性好，藥物體內(nèi)半衰期長(zhǎng)，生物利用度高且易儲(chǔ)存的EGF產(chǎn)品O為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案一種重組人表皮生長(zhǎng)因子陽離子脂質(zhì)體，包括重組人表皮生長(zhǎng)因子、陽離子脂質(zhì)體及生長(zhǎng)因子保護(hù)劑，部分的重組人表皮生長(zhǎng)因子由所述陽離子脂質(zhì)體包封住。進(jìn)一步地，所述生長(zhǎng)因子保護(hù)劑為肝素鈉、右旋糖酐或人血白蛋白。進(jìn)一步地，所述重組人表皮生長(zhǎng)因子陽離子脂質(zhì)體包封率在40%以上。進(jìn)一步地，所述重組人表皮生長(zhǎng)因子陽離子脂質(zhì)體的粒徑為15_200nm。另一方面，本發(fā)明還提供一種制備上述重組人表皮生長(zhǎng)因子陽離子脂質(zhì)體的方法，制備步驟如下
步驟SI :以無水乙醇溶解脂膜材料和陽離子附加劑，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，揮盡乙醇，形成均勻脂膜，再加入檸檬酸緩沖液并水化處理，得到脂質(zhì)體粗懸液；
步驟S2 :超聲分散處理脂質(zhì)體粗懸液，再以微孔濾膜整粒，得到空白脂質(zhì)體；
步驟S3 :將重組人表皮生長(zhǎng)因子溶液與生長(zhǎng)因子保護(hù)劑溶液混合后加入空白脂質(zhì)體溶液，調(diào)節(jié)PH至6. (Γ8. O，再溫育處理得到重組人表皮生長(zhǎng)因子陽離子脂質(zhì)體。進(jìn)一步地，所述步驟SI中，所述脂膜材料為大豆卵磷脂和膽固醇的混合物，且大豆卵磷脂和膽固醇的質(zhì)量比等于2:1-7:1 ;陽離子附加劑為十八烷胺，陽離子附加劑的用量為脂膜材料總質(zhì)量的1%_6% ;無水乙醇脂膜材料等于I :4(Tl :10，單位為毫升毫克；所述檸檬酸鹽緩沖液的濃度為O. 01-0. 05 moL/L,且脂膜材料檸檬酸鹽緩沖液等于10 1-40 :1，單位為毫克毫升；所述水化處理是在3(T45°C水浴條件下水化處理O. 5-4h。
進(jìn)一步地，所述步驟S2中，超聲分散處理時(shí)間為2-10min。進(jìn)一步地，所述步驟S3中，重組人表皮生長(zhǎng)因子與生長(zhǎng)因子保護(hù)劑的質(zhì)量比為I :1-10 :1。進(jìn)一步地，所述步驟S3中，以濃度為O. 05moL/L-0. 2 moL/L的磷酸緩沖溶液調(diào)節(jié)pH。進(jìn)一步地,所述步驟S3中，在25-45°C溫度條件下溫育10_40min。通過采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有如下有益效果本發(fā)明在制劑中加入了陽離子脂質(zhì)體，利用脂質(zhì)體的緩釋作用，以脂質(zhì)體作為經(jīng)皮局部給藥載體，rhEGF可以在表皮和真皮形成藥物貯庫，緩釋藥物，持久地對(duì)病變部位起作用。而且脂質(zhì)體本身類似生物膜的凝脂雙分子層結(jié)構(gòu)可顯著提高rhEGF的組織相溶性和細(xì)胞親和性，降低毒副作用，提高療效。rhEGF脂質(zhì)體以脂質(zhì)體作為rhEGF的載體，藥物包裹在脂質(zhì)小球中，可減少rhEGF與外界環(huán)境的直接接觸，降低了溫度、酸堿度、紫外線等因素的影響，也提高了 rhEGF在使用時(shí)的穩(wěn)定性。rhEGF在酸性環(huán)境下顯負(fù)電荷，而陽離子脂質(zhì)體還帶有正電荷，通過靜電作用可增加電性相反的藥物離子的包封率及穩(wěn)定性。同時(shí)，制備工藝上采用PH梯度主動(dòng)載藥法，可避免酸堿、溫度及超聲波等劇烈外界條件對(duì)表皮生長(zhǎng)因子活性的影響。


圖I是本發(fā)明重組人表皮生長(zhǎng)因子陽離子脂質(zhì)體的透射電鏡照片。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種重組人表皮生長(zhǎng)因子陽離子脂質(zhì)體，包括重組人表皮生長(zhǎng)因子、陽離子脂質(zhì)體及生長(zhǎng)因子保護(hù)劑，部分的重組人表皮生長(zhǎng)因子由所述陽離子脂質(zhì)體包封住。所述生長(zhǎng)因子保護(hù)劑為肝素鈉、右旋糖酐或人血白蛋白。所述重組人表皮生長(zhǎng)因子陽離子脂質(zhì)體包封率在40%以上。所述重組人表皮生長(zhǎng)因子陽離子脂質(zhì)體的粒徑為15_200nm。重組人表皮生長(zhǎng)因子陽離子的形狀如圖I所示。本發(fā)明還提供一種制備上述重組人表皮生長(zhǎng)因子陽離子脂質(zhì)體的方法，制備步驟如下步驟SI :以無水乙醇溶解脂膜材料和陽離子附加劑，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，揮盡乙醇，再加入檸檬酸緩沖液并水化處理，得到脂質(zhì)體粗懸液；
步驟S2 :超聲分散處理脂質(zhì)體粗懸液，再以微孔濾膜整粒，得到空白脂質(zhì)體；
步驟S3 :將重組人表皮生長(zhǎng)因子溶液與生長(zhǎng)因子保護(hù)劑溶液混合后加入空白脂質(zhì)體溶液，調(diào)節(jié)PH至6. (Γ8. O，再溫育處理得到重組人表皮生長(zhǎng)因子陽離子脂質(zhì)體。所述步驟SI中，所述脂膜材料優(yōu)選為大豆卵磷脂和膽固醇的混合物，且大豆卵磷脂和膽固醇的質(zhì)量比等于2:1-7:1 ;陽離子附加劑優(yōu)選為十八烷胺，陽離子附加劑的用量為脂膜材料總質(zhì)量的1%_6% ;無水乙醇脂膜材料等于I :4(Tl :10，單位為毫升毫克；所述水化處理是在3(T45°C水浴條件下水化處理O. 5-4h。所述步驟S2中，超聲分散處理時(shí)間優(yōu)選為2-10min。
所述步驟S3中，重組人表皮生長(zhǎng)因子與生長(zhǎng)因子保護(hù)劑的質(zhì)量比為I :1-10 :1。所述步驟S3中，優(yōu)選以濃度為O. 05moL/L-0. 2 moL/L的磷酸緩沖溶液調(diào)節(jié)pH。所述步驟S3中，在25-45°C溫度條件下溫育10_40min。本發(fā)明，測(cè)定包封率的方法如下
采用超濾離心分離法分離rhEGF脂質(zhì)體與游離藥物精密量取rhEGF脂質(zhì)體樣品溶液300 μ L，加PBS稀釋至3. OmL，后加入超濾離心管中。待樣品穩(wěn)定平衡后，于離心機(jī)中離心分離，轉(zhuǎn)速5000 r/min,離心時(shí)間20min。取I體積單位的下層超濾液測(cè)定其中的rhEGF含星，為游尚rhEGF含星(C游離)。取脂質(zhì)體樣品溶液30 μ L，PBS (ρΗ=6. 8)稀釋至300 μ L，加入過量的NaCl，震搖。后加入氯仿900 μ L震搖混合均勻，離心分離,轉(zhuǎn)速為8000rpm,時(shí)間IOmin,取I體積單位的上層清液，雙蒸水稀釋至濃度范圍，測(cè)定其中的rhEGF含量，為脂質(zhì)體中rhEGF總量(C總)。按如下公式計(jì)算脂質(zhì)體包封率
脂質(zhì)體包封率(En %)= (C總-C游離)/C總 C游離未包入脂質(zhì)體中rhEGF的量；
C總制劑中rhEGF的總量。下面結(jié)合幾個(gè)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明不局限于如下闡述的這些實(shí)施例。以下實(shí)施例中，所使用的人表皮生長(zhǎng)因子購于廣州暨鵬生物有限公司(純度>95%)。實(shí)施例I
按處方量IOmL單位計(jì)，處方如下
人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子O. 5mg
大豆卵磷脂300mg
膽固醇IOOmg
十八燒胺50mg
無水乙醇IOmL
O. 03moL/L檸檬酸緩沖液 7mL O. ImoL/L磷酸鹽緩沖液 ImL O. 5mg/mL肝素鈉溶液ImL
制備過程如下按照以上處方用量稱取大豆卵磷脂、膽固醇和十八烷胺，溶于IOmL無水乙醇中，于50°C水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，抽至無水乙醇揮盡，形成均勻薄膜；加入7mLO. 03moL/L的檸檬酸溶液，50°C恒溫水浴溫育，超聲分散處理lOmin，以O(shè). 22 μ m微孔濾膜整粒；然后再將I. OmL的rhEGF原液(O. 5mg/mL)與I. OmL肝素鈉溶液混合后加入，并以磷酸鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)PH值至7. 2，40°C孵育lOmin，即得為淡黃色均一液體的成品制劑。經(jīng)檢測(cè)，包封率為50. 42% ;且4°C保存I個(gè)月后，包封率為50. 21%。實(shí)施例2
按處方量IOmL單位計(jì)，處方如下
人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子O. 5mg
大豆卵磷脂500mg
膽固醇IOOmg
十八燒胺50mg
無水乙醇IOmL
O. 03moL/L檸檬酸緩沖液 7mL O. ImoL/L磷酸鹽緩沖液 3mL O. 5mg/mL肝素鈉溶液ImL
制備過程如下按照以上處方用量稱取大豆卵磷脂、膽固醇和十八烷胺，溶于IOmL無水乙醇中，于50°C水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，抽至無水乙醇揮盡，形成均勻薄膜；加入7mLO. 03moL/L的檸檬酸溶液，50°C恒溫水浴溫育，超聲分散處理lOmin，以O(shè). 22 μ m微孔濾膜整粒；然后再將I. OmL的rhEGF原液(O. 5mg/mL)與I. OmL肝素鈉溶液混合后加入,并以磷酸鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)PH值至6. 8，40°C孵育20min，即得為淡黃色均一液體的成品制劑。經(jīng)檢測(cè)，包封率為62. 54% ;且4°C保存I個(gè)月后，包封率為62. 16%。實(shí)施例3
按處方量IOmL單位計(jì)，處方如下
人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子O. 5mg
大豆卵磷脂400mg
膽固醇IOOmg
十八燒胺50mg
無水乙醇IOmL
O. 02moL/L檸檬酸緩沖液 7mL O. ImoL/L磷酸鹽緩沖液 ImL 0. 5mg/mL右旋糖酐溶液 ImL
制備過程如下按照以上處方用量稱取大豆卵磷脂、膽固醇和十八烷胺，溶于IOmL無水乙醇中，于50°C水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，抽至無水乙醇揮盡，形成均勻薄膜；加入7mL0. 02moL/L的檸檬酸溶液，50°C恒溫水浴溫育，超聲分散處理lOmin，過0. 22 μ m微孔濾膜整粒；然后再將I. OmL的rhEGF原液(0. 5mg/mL)與I. OmL右旋糖酐溶液混合后加入，并以磷酸鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)PH值至7. 2，40°C孵育lOmin，即得為淡黃色均一液體的成品制劑。經(jīng)檢測(cè)，包封率為55. 13% ;且4°C保存I個(gè)月后，包封率為50. 14%。實(shí)施例4
按處方量IOmL單位計(jì)，處方如下
人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子0. 5mg大豆卵磷脂400mg
膽固醇IOOmg
十八燒胺50mg
無水乙醇IOmL
O. 02moL/L檸檬酸緩沖液 7mL O. ImoL/L磷酸鹽緩沖液 ImL 20mg/L人血白蛋白溶液 50 μ L
制備過程如下按照以上處方用量稱取大豆卵磷脂、膽固醇和十八烷胺，溶于IOmL無水乙醇中，于50°C水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，抽至無水乙醇揮盡，形成均勻薄膜；加入7mLO. 02moL/L的檸檬酸溶液，50°C恒溫水浴溫育，超聲分散處理lOmin，過O. 22 μ m微孔濾膜整粒；然后再將I. OmL的rhEGF原液(O. 5mg/mL)與50 μ L人血白蛋白溶液混合后加入，并以磷酸鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)PH值至7. 2，40°C孵育lOmin，即得為淡黃色均一液體的成品制劑。經(jīng)檢測(cè)，包封率為58. 66% ;且4°C保存I個(gè)月后，包封率為58. 25%。
權(quán)利要求
1.一種重組人表皮生長(zhǎng)因子陽離子脂質(zhì)體，其特征在于，其包括重組人表皮生長(zhǎng)因子、陽離子脂質(zhì)體及生長(zhǎng)因子保護(hù)劑，部分的重組人表皮生長(zhǎng)因子由所述陽離子脂質(zhì)體包封住。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組人表皮生長(zhǎng)因子陽離子脂質(zhì)體，其特征在于所述生長(zhǎng)因子保護(hù)劑為肝素鈉、右旋糖酐或人血白蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組人表皮生長(zhǎng)因子陽離子脂質(zhì)體，其特征在于所述重組人表皮生長(zhǎng)因子陽離子脂質(zhì)體包封率在40%以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組人表皮生長(zhǎng)因子陽離子脂質(zhì)體，其特征在于所述重組人表皮生長(zhǎng)因子陽離子脂質(zhì)體的粒徑為15-200nm。
5.一種制備如權(quán)利要求f 4任一項(xiàng)所述的重組人表皮生長(zhǎng)因子陽離子脂質(zhì)體的方法，其特征在于，制備步驟如下 步驟SI :以無水乙醇溶解脂膜材料和陽離子附加劑，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，揮盡乙醇，形成均勻脂膜，再加入檸檬酸緩沖液并水化處理，得到脂質(zhì)體粗懸液； 步驟S2 :超聲分散處理脂質(zhì)體粗懸液，再以微孔濾膜整粒，得到空白脂質(zhì)體； 步驟S3 :將重組人表皮生長(zhǎng)因子溶液與生長(zhǎng)因子保護(hù)劑溶液混合后加入空白脂質(zhì)體溶液，調(diào)節(jié)PH至6. (Γ8. 0，再溫育處理得到重組人表皮生長(zhǎng)因子陽離子脂質(zhì)體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備重組人表皮生長(zhǎng)因子陽離子脂質(zhì)體的方法，其特征在于所述步驟SI中，所述脂膜材料為大豆卵磷脂和膽固醇的混合物，且大豆卵磷脂和膽固醇的質(zhì)量比等于2:1-7:1 ;陽離子附加劑為十八烷胺，陽離子附加劑的用量為脂膜材料總質(zhì)量的1%-6% ;無水乙醇脂膜材料等于I :4(Tl :10，單位為毫升毫克；所述檸檬酸鹽緩沖液的濃度為O. 01-0. 05 moL/L，且脂膜材料檸檬酸鹽緩沖液等于10 1-40 :1，單位為毫克毫升；所述水化處理是在3(T45°C水浴條件下水化處理O. 5-4h。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備重組人表皮生長(zhǎng)因子陽離子脂質(zhì)體的方法，其特征在于所述步驟S2中，超聲分散處理時(shí)間為2-10min。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備重組人表皮生長(zhǎng)因子陽離子脂質(zhì)體的方法，其特征在于所述步驟S3中，重組人表皮生長(zhǎng)因子與生長(zhǎng)因子保護(hù)劑的質(zhì)量比為I :1-10 :1。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備重組人表皮生長(zhǎng)因子陽離子脂質(zhì)體的方法，其特征在于所述步驟S3中，以濃度為O. 05moL/L-0. 2 moL/L的磷酸緩沖溶液調(diào)節(jié)pH。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備重組人表皮生長(zhǎng)因子陽離子脂質(zhì)體的方法，其特征在于，所述步驟S3中，在25-45°C溫度條件下溫育10-40min。
全文摘要
一種重組人表皮生長(zhǎng)因子陽離子脂質(zhì)體及其制備方法，所述重組人表皮生長(zhǎng)因子陽離子脂質(zhì)體包括重組人表皮生長(zhǎng)因子、陽離子脂質(zhì)體及生長(zhǎng)因子保護(hù)劑，部分的重組人表皮生長(zhǎng)因子由所述陽離子脂質(zhì)體包封住。所述制備方法包括步驟S1以無水乙醇溶解脂膜材料和陽離子附加劑，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，揮盡乙醇形成均勻脂膜，加入檸檬酸緩沖液并水化，得脂質(zhì)體粗懸液；步驟S2超聲分散處理脂質(zhì)體粗懸液，以微孔濾膜整粒，得空白脂質(zhì)體；步驟S3將重組人表皮生長(zhǎng)因子溶液與生長(zhǎng)因子保護(hù)劑溶液混合后加入空白脂質(zhì)體溶液，調(diào)節(jié)pH至6.0~8.0，溫育處理得重組人表皮生長(zhǎng)因子陽離子脂質(zhì)體。本發(fā)明以陽離子脂質(zhì)體包封人表皮生長(zhǎng)因子，可提高rhEGF的穩(wěn)定性、組織相溶性和細(xì)胞親和性。
文檔編號(hào)A61K38/18GK102949345SQ20121019913
公開日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2012年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月15日
發(fā)明者王金林 申請(qǐng)人:深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院