Atrp法構(gòu)建高轉(zhuǎn)染類脂質(zhì)體陽離子基因載體的制作方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明屬于非病毒基因載體制備
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，具體涉及一種ATRP法構(gòu)建一系列以脂質(zhì)(膽固醇、磷脂酰肌醇等)為基體，具有高效基因轉(zhuǎn)染效率的類脂質(zhì)體陽離子基因載體?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]基因治療在過去的二十年內(nèi)被人們認(rèn)定為一種全新有效的治療手段，這種方法對于未來醫(yī)療有著舉足輕重的作用，被廣泛的用于治療一系列遺傳性疾病、人類癌癥和心血管疾病等等。整個(gè)基因治療從廣義上講就是通過基因載體將用于治療的外源設(shè)計(jì)基因或者寡聚核苷酸片段引入病體中的病變細(xì)胞，從而表達(dá)以改善病變細(xì)胞的缺陷，從而達(dá)到治療的目的?；蛑委煹恼麄€(gè)流程有三個(gè)重要環(huán)節(jié)，其中包括目的基因的設(shè)計(jì)、基因載體的研發(fā)以及目的基因是否能在細(xì)胞中特異性表達(dá)。其中，基因載體的研發(fā)是重中之重，正是因?yàn)槿狈Π踩咝У幕蜉d體才導(dǎo)致了基因治療實(shí)施的瓶頸。[0003]基因載體作為將外源基因?qū)氲郊?xì)胞的工具，其本身應(yīng)該低毒性并且不會(huì)引起免疫反應(yīng)；其次，其要能跟基因形成具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的復(fù)合物，同時(shí)也不會(huì)導(dǎo)致基因結(jié)構(gòu)的變化；最后，這種載體最好能夠具有一定的靶向和降解作用，這樣可以針對特定的細(xì)胞進(jìn)行治療并且可以降低其由于滯留導(dǎo)致的副作用。目前人們廣泛使用的基因載體包括兩類:病毒載體(viralvector)和非病毒載體(non-viralvector)。病毒載體主要包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒以及單純皰瘆病毒。這種病毒載體一般能夠輕易的克服細(xì)胞屏障和免疫防御機(jī)制，從而其具有很高的轉(zhuǎn)染效率。但是這種載體缺乏安全性，很容易引起致癌作用與自身免疫反應(yīng)(unexpectedimmuneresponse)和白細(xì)胞的病毒變化，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成器官衰竭從而導(dǎo)致死亡。同時(shí)病毒載體還會(huì)引起插入突變的現(xiàn)象，可能導(dǎo)致宿主細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，而且病毒載體攜帶基因的能力有限，不利于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。針對以上病毒載體的缺點(diǎn)，人們將更多的目光投向了非病毒載體。其本身安全性能高，很多具有生物相容性或者具有生物可降解能力的基因載體都是低毒性的，而且具有很低的免疫毒性。相對于病毒載體而言，雖然這種非病毒性載體的轉(zhuǎn)染效率并不是很高，有的時(shí)候很難克服細(xì)胞內(nèi)外的各種屏障，但是其能夠攜帶更多的基因，同時(shí)還能大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，具有很高的商業(yè)潛力。所以其發(fā)展?jié)摿ν苿?dòng)了非病毒載體的研宄與開發(fā)。目前而言陽離子聚合物是人們使用頻率最高的非病毒載體。這種陽離子非病毒性載體可以有效的通過電荷的相互作用絡(luò)合上基因，從而形成帶正電荷納米級(jí)的復(fù)合體(complex)，從而能夠保護(hù)基因穿過細(xì)胞膜以防止被核酸酶所降解，從而保證基因的順利表達(dá)。[0004]近年來，活性/可控自由基聚合(living/controlledradicalpolymerizat1n,LRP)逐漸開始成為聚合物合成的重點(diǎn)手段，其通過在聚合體系中引入特殊的化合物，使其與活性種鏈自由基進(jìn)行可逆的鏈終止或者鏈轉(zhuǎn)移，從而建立活性種與休眠種的動(dòng)態(tài)平衡，以實(shí)現(xiàn)在較低溫度和簡易操作下聚合產(chǎn)品分子量和分子量分布的可控，具有很高的實(shí)用價(jià)值。LRP主要包括以下幾種方式:引發(fā)轉(zhuǎn)移終止劑活性自由基聚合(Initiator-Transferagent-TerminatorLivingRadicalPolymerizat1n)、穩(wěn)定自由基聚合(StableFreeRadicalPolymerizat1n,SFRP)、原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(AtomTransferRadicalPolymerizat1n，ATRP)、可逆加成-裂解鏈轉(zhuǎn)移聚合(ReversibleAddit1n-Fragmentat1nChainTransferPolymerizat1n，RAFT)。其中，ATRP是通過交替的“活化-去活”的可逆反應(yīng)，在降低體系中游離基濃度的情況下盡量的控制不可逆終止反應(yīng)程度，而這個(gè)過程中鏈增長的反應(yīng)則不受到影響，從而實(shí)現(xiàn)“活性”聚合。ATRP的引發(fā)劑一般為常見的鹵化烷烴，其反應(yīng)溫度適中，適用于大部分單體，而且整個(gè)過程不需要復(fù)雜的合成路線，相對于其他的活性聚合具有更多的優(yōu)勢。[0005]隨著高分子科學(xué)的不斷進(jìn)步，如何將其與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)、生物學(xué)以及工程學(xué)等學(xué)科更好的相互交融與滲透成為人們現(xiàn)在重點(diǎn)解決的難題。而在基因治療方面，高分子材料已經(jīng)體現(xiàn)出了很高的利用價(jià)值。目前，文獻(xiàn)報(bào)道過一系列的非病毒陽離子基因載體，包括聚-L-賴氨酸(Poly(L-Lysine)，PLL)、聚乙二胺樹枝狀聚合物(Poly(amidamine)，PAMAM)、聚甲基丙稀酸N,N-二甲氨基乙醋(Poly(2-dimethylaminoethylmethacrylate)，PDMAEMA)、聚乙烯亞胺(Polyethylenimine，PEI)等。其中PEI是陽離子非病毒載體中公認(rèn)的“金標(biāo)”。但是上述的陽離子聚合物仍然具有相當(dāng)高的毒性，并且在體內(nèi)的轉(zhuǎn)染會(huì)受到嚴(yán)重的限制，大大限制了這些非病毒載體在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。所以，開發(fā)低毒而高效陽離子聚合物成為現(xiàn)在研宄非病毒基因載體的核心內(nèi)容。目前比較流行的方案是在陽離子聚合物中插入生物相容性的成分，最常見的是聚乙二醇(PEG)以增加基因載體在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，同時(shí)降低毒性。而另一種常見的思路就是構(gòu)建類脂質(zhì)體的陽離子基因載體，其中向基因載體中引入脂質(zhì)例如膽固醇(Cholesterol)、磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol)、月旨溶性維生素(Fat-solubleVitamin)等。這些脂質(zhì)的引入可以有效的增加生物相容性從而降低自身毒性，同時(shí)脂質(zhì)可以促進(jìn)整個(gè)體系形成類脂質(zhì)體或者脂質(zhì)體從而增加在體內(nèi)的轉(zhuǎn)染。但是，上述報(bào)道的非病毒載體的性能(比如安全性和轉(zhuǎn)染效率)與實(shí)際的臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用的要求還有相當(dāng)大的距離。目前，已經(jīng)商業(yè)化的基因載體只有脂質(zhì)體lipfect2000和lipfect3000，但是其價(jià)格高昂，并且在體內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率也很差，這兩個(gè)缺陷導(dǎo)致了這種基因載體在臨床治療中無法有效應(yīng)用。[0006]近幾年研宄者致力于ATRP理論和應(yīng)用的研宄工作，已經(jīng)能夠熟練的利用這種活性聚合手段得到一系列能夠用于現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)方面的聚合物材料，例如改性過的PEGDMAEMA,PEGMA等等，都是最新的陽離子基因載體研宄成果，同時(shí)促進(jìn)了活性可控聚合在醫(yī)用生物高分子中的應(yīng)用。[0007]脂質(zhì)(Lipid)是指由脂肪酸和醇作用生成的酯及其衍生物，一般不溶于水而能被乙醚、氯仿、苯等非極性有機(jī)溶劑所溶解，包括油脂(甘油三酯)和類脂(磷脂、固醇類)。這類小分子物質(zhì)通?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)有很大的差異，生理功能各不相同，但是都可以在水中相互聚集形成內(nèi)部疏水的聚集體，而這種空腔型的結(jié)構(gòu)就為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的載藥和基因攜帶提供了一定的條件。而且，脂類是人體所需要的重要營養(yǎng)素之一，與蛋白質(zhì)、碳水化合物是產(chǎn)能的三大營養(yǎng)素，在供給人體能量方面起著重要作用。脂類也是人體細(xì)胞組織的組成部分，是細(xì)胞膜的骨架。同時(shí)它在體內(nèi)還有多種作用，例如信號(hào)傳遞，參與免疫等等，是一種很好的生物相容性的分子。膽固醇是構(gòu)成細(xì)胞膜的重要組成成分，利用其與相似相容的特點(diǎn)可以有效的提高細(xì)胞膜的通透性，從而增加細(xì)胞對于基因載體的攝取量，最終實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率的提升。磷脂酰肌醇在細(xì)胞中對于細(xì)胞形態(tài)、代謝調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞的各種生理功能起著非常重要的作用，利用其作為信號(hào)分子的作用可以有效的提高基因載體的轉(zhuǎn)染效率。脂溶性維生素在體內(nèi)大量貯藏，而且本身主要存在于肝臟部分，利用脂溶性維生素可以有效的提高對于肝臟的靶向性，同時(shí)還能夠通過形成脂質(zhì)體增加對于基因的轉(zhuǎn)染。正是因?yàn)樯鲜鲋|(zhì)具有良好的性質(zhì)，并且結(jié)合陽離子非病毒載體能夠有效的構(gòu)建基因載體，同時(shí)可以有效的解決市售的脂質(zhì)體材料不能體內(nèi)轉(zhuǎn)染的缺陷，逐漸成為人們新的研宄重點(diǎn)。[0008]細(xì)胞膜的化學(xué)組成基本相同，主要由脂類、蛋白質(zhì)和糖類組成，而脂質(zhì)的主要成分為磷脂和膽固醇。磷脂雙分子層是構(gòu)成細(xì)胞膜的基本支架，具有一定的通透性和流動(dòng)性。所以一些與細(xì)胞膜相似的脂質(zhì)可以有效的改變細(xì)胞膜的流動(dòng)性與通透性，從而保證細(xì)胞能夠更多的攝取所需的物質(zhì)。[0009]乙醇胺是一種在室溫下無色透明的粘稠液體，有一定的吸濕性和氨臭，被廣泛用作化學(xué)試劑、農(nóng)藥、醫(yī)藥、溶劑、染料中間體、橡膠促進(jìn)劑和表面活性劑等等。[0010]脂質(zhì)在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的研宄中已被引入醫(yī)藥的構(gòu)建，得到了很多治療不同疾病的藥物。而脂質(zhì)在基因載體中的作用還沒有被人們完全的開發(fā)，所以這一研宄方向正逐漸引起人ii3的關(guān)注。[0011]利用活性可控聚合ATRP得到一系列類脂質(zhì)體陽離子基因載體在研宄的過程中還存在很多的問題，例如:這種陽離子載體隨著分子量的增大，響應(yīng)的轉(zhuǎn)染效率更高，但是毒性更大，如何在保證毒性適中的情況下盡量提高轉(zhuǎn)染效率成為人們關(guān)注的重點(diǎn)；不同的單體具有不同的特性，有些轉(zhuǎn)染效率較高，有效毒性較小，如何篩選出高效高性能的單體也是人們需要考慮的問題；當(dāng)然，相同的類脂質(zhì)體基因載體對于不同的細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率并不同，如何針對不同的細(xì)胞選擇最適的基因載體也是需要研宄的問題?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0012]本發(fā)明的目的是提供一種活性可控自由基聚合法(ATRP)構(gòu)建的以脂質(zhì)為基體的類脂質(zhì)體陽離子基因載體，該類脂質(zhì)體陽離子基因載體分子量可控，分布窄，可有效的增加細(xì)胞的攝取量從而增加細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，并且本身毒性較小，幾乎不會(huì)引起免疫反應(yīng)，具有很高的商業(yè)潛能，同時(shí)具備投入臨床試驗(yàn)的可能。[0013]在本發(fā)明的反應(yīng)體系中，引發(fā)劑的合成從脂質(zhì)本身開始，通過將脂質(zhì)體上的羥基或者羧基基團(tuán)進(jìn)行修飾，使其整體上引入溴作為后續(xù)ATRP的引發(fā)點(diǎn)，從而得到一系列脂質(zhì)引發(fā)劑；然后通過原子轉(zhuǎn)移自由基活性聚合(ATRP)將各種單體接枝到脂質(zhì)引發(fā)劑的引發(fā)點(diǎn)上得到具有提高基因轉(zhuǎn)染效率以及生物相容性的基因載體，并且對于這種基當(dāng)前第1頁1 2 3