專利名稱：河蜆糖胺聚糖及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種來源于河蜆的糖胺聚糖及其超聲輔助制備方法和用途；屬于生物技術(shù)天然活性物質(zhì)提取領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
糖胺聚糖(glycosaminoglycan),曾稱為黏多糖，為雜多糖的一種，由重復(fù)的二糖單位構(gòu)成的長(zhǎng)鏈多糖，其二糖單位之一是氨基己糖(氨基葡萄糖或氨基半乳糖)，故稱糖胺聚糖；另一個(gè)是糖醛酸。通常分為4類(I)透明質(zhì)酸(HA)、⑵硫酸角質(zhì)素、(3)硫酸軟骨素(CS)和硫酸皮膚素(DS)、(4)肝素(Hep)和硫酸乙酰肝素(HS)。糖胺聚糖是細(xì)胞間質(zhì)的重要組成部分，細(xì)胞間質(zhì)絕大部分都是糖胺聚糖。因此，在自然界中有廣泛的分布，在動(dòng)物界、植物界以及細(xì)菌界均有相關(guān)報(bào)道。高血壓、高血脂、糖尿病、冠心病、惡性腫瘤等所謂現(xiàn)代“文明病”的發(fā)病率居高不下，時(shí)刻威脅著地球上每一個(gè)人的身心健康。研究表明糖胺聚糖具有抗凝血、抗腫瘤、抗病毒、增強(qiáng)免疫等多種活性并且對(duì)以上“文明病”有一定的治療效果，在治療以上現(xiàn)代病尤其是在抑制惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的治療中效果極其顯著。如海參糖胺聚糖可以使腫瘤內(nèi)毛細(xì)血管量減少，出血壞死區(qū)變小，癌周淋巴細(xì)胞反應(yīng)明顯，癌細(xì)胞浸潤減輕或無，電鏡觀察可發(fā)現(xiàn)瘤細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器減少，線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張和脫顆粒，以及多聚核糖體解聚等， 因此，近年來在臨床病理及藥學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注。糖胺聚糖分布廣泛，對(duì)不同種類的無脊椎動(dòng)物的綜合研究發(fā)現(xiàn)，不同的物種同樣存在著硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素、肝素、硫酸乙酰肝素類似物。之前的研究也表明不同的軟體動(dòng)物都存在著肝素。如Mercenaria mercenaria存在著一類肝素類似物。Anomalocardia brasiliana, Ti ela mactroides, Tapes phylippinarum 中分離到具有抗凝血活性的肝素類似物。此外，從其它的軟體動(dòng)物門中也分離到了 DS，CS以及硫酸角質(zhì)素。然而，商業(yè)上的硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素及肝素主要是以脊椎動(dòng)物為原料的。然而近年來發(fā)現(xiàn)，以脊椎動(dòng)物為原料存在著各種各樣的問題，如存在病原體污染(瘋牛病)及一些地區(qū)的宗教限制(豬硫酸角質(zhì)素)。再者，非動(dòng)物來源的糖胺聚糖如化學(xué)合成、酶解合成及重組體合成不能作為藥物被運(yùn)用。種種原因需要我們?nèi)フ业叫碌奶前肪厶莵碓?。河蜆是一種淡水貝類，外殼或呈黃綠色、棕黃色，或呈黑褐色。河蜆營養(yǎng)豐富，內(nèi)臟可同食，故人體很容易吸收河蜆?biāo)械拟}、鐵、碘等元素，是高蛋白質(zhì)低脂肪的食物。據(jù)有關(guān)專家測(cè)定，每100克蜆肉含蛋白質(zhì)15克，脂肪僅3克，還含有多種維生素、碳水化合物和鈣、磷、鐵、硒等人體所需的營養(yǎng)物質(zhì)。有較高的藥用價(jià)值和食用功效?！侗静菥V目》稱“蜆肉能下濕氣，利小便”?，F(xiàn)代有關(guān)資料也記載河蜆有清熱解毒、明目利尿、利濕等功效。適量食用蜆肉可以治療疔瘡腫毒、濕熱黃疸、小便不利等癥，還能促進(jìn)產(chǎn)婦乳汁分泌。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種河蜆糖胺聚糖及其制備方法和用途。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種河蜆糖胺聚糖的制備方法，包括以下步驟I)、河蜆預(yù)處理將新鮮的河蜆冷凍干燥后粉碎，得河蜆粉末；2)、河蜆脫脂將河蜆粉末于2 6°C的丙酮中浸泡20 28h，室溫抽濾至干燥，得脫脂后河蜆粉末；3)、超聲波處理向脫脂后河蜆粉末中加入醋酸-醋酸鈉緩沖液(O. ΙΜ,ρΗ 6. O)，于190 475W的超聲功率下超聲10 30min，得超聲處理液；所述河蜆粉末與醋酸-醋酸鈉緩沖液的料液比為lg/25 35ml ；4)、木瓜蛋白酶酶解向超聲處理液中加入乙二胺四乙酸(EDTA)和L-半胱氨酸，從而使乙二胺四乙酸 (EDTA)和L-半胱氨酸的終濃度均分別為4. 8 5. 2mM ;混勻后升溫至55 65°C，再加入木瓜蛋白酶保溫水解30 110min(較佳為70 IlOmin),木瓜蛋白酶是河蜆粉末質(zhì)量的
I.4 I. 6%;最后再加入用以沉淀蛋白的三氯乙酸(TCA)至終濃度50g/L;于3 5°C靜置 20 40min ；5)、沉淀:將步驟4)所得的酶解液離心，收集上清，向上清中加2. 8 3. 2體積倍的質(zhì)量濃度為5%的乙酸鉀乙醇溶液，于3 5°C靜置10 14小時(shí)；6)、溶解將步驟5)所得的溶液離心，所得的沉淀先用無水乙醇洗滌，烘干至恒重后，得干燥后沉淀；在干燥后沉淀中加入摩爾濃度為O. 2M的NaCl溶液,所述干燥后沉淀與NaCl溶液的料液比為lg/30 50ml ;再次離心，收集上清；7)、CPC 沉淀:向步驟6)所得的上清中加入質(zhì)量濃度為5%的氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液，離心收集沉淀；所述氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液與上述步驟6)中的干燥后沉淀的料液比為 lg/0. 4 O. 6ml ；8)、鹽溶步驟7)所得的沉淀用2. 5M的NaCl溶液溶解，所述NaCl溶液與上述步驟6)中的干燥后沉淀的料液比為lg/8 12ml ；9)、醇沉向步驟8)所得的溶液中加入4. 5 5. 5體積倍的無水乙醇，直至沉淀出現(xiàn)后離心，收集沉淀；10)、透析將步驟9)所得的沉淀加水溶解后，經(jīng)截留分子量7000Da的透析袋透析后冷凍干燥，得凍干后的河蜆糖胺聚糖粗品。作為本發(fā)明的河蜆糖胺聚糖的制備方法的改進(jìn)將凍干后的河蜆糖胺聚糖粗品依次進(jìn)行以下步驟
①、DEAE-celluloseDE-52 離子交換柱層析DEAE-cellulose DE-52層析柱(15cmX5cm)用醋酸_醋酸鈉緩沖液(O. 1Μ，ρΗ6· O) 以10ml/min流速平衡體系90min后(柱體積約500ml),將凍干后的糖胺聚糖粗品5g用8 12ml上述醋酸-醋酸鈉緩沖液(O. 1M，pH6. O)溶解后加入層析柱中，再次用醋酸-醋酸鈉緩沖液(O. 1M，pH6. O)平衡體系90min后，用洗液進(jìn)行均勻洗脫；洗液為以NaCl和醋酸-醋酸鈉緩沖液(O. 1M，pH6. O)配制而得；所述NaCl在洗脫液中的線性梯度濃度為0M-1. 5M ；②、檢測(cè)洗脫后所收集的液體中有糖醛酸特有吸收峰(硫酸-咔唑法)和硫酸化糖胺聚糖(二甲基亞甲基藍(lán)法，DMB)特有吸收峰的樣品，3體積倍醇沉，沉淀收集透析后，冷凍干燥，得河蜆糖胺聚糖的精糖。作為本發(fā)明的河蜆糖胺聚糖的制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)將河蜆糖胺聚糖的精糖進(jìn)行 Sephacryl_300HR 柱層析將Ig河蜆糖胺聚糖的精糖溶于I 2ml，0. 2M NaCl溶液后，加入 S印hacryl-300HR層析柱中，以醋酸-醋酸鈉緩沖液(O. 1M，ρΗ6· O)為洗液，O. 2ml/min流速，收集洗脫液；用硫酸-苯酚法檢測(cè)收集的洗脫液中糖的特征吸收峰，收集各洗脫峰 ’得河蜆糖胺聚糖的精糖成分CFGS-2。注洗脫液用自動(dòng)部分收集器收集，一般每管4ml。本發(fā)明還同時(shí)公開了利用上述制備方法所得的河蜆糖胺聚糖的用途用于抑制胃癌細(xì)胞或卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)活性。作為本發(fā)明的河蜆糖胺聚糖的用途的改進(jìn)胃癌細(xì)胞為SGC7901，卵巢癌細(xì)胞為 A2780 或 SK0V3。本發(fā)明解決的一個(gè)技術(shù)問題彌補(bǔ)了現(xiàn)有存在技術(shù)中提取率較低，提取時(shí)間過長(zhǎng)的不足，提出一種新的可作為抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的糖胺聚糖，它來源于河蜆，藥效好，無毒害及其它不良副作用。本發(fā)明解決的一個(gè)技術(shù)問題彌補(bǔ)了現(xiàn)有存在技術(shù)的不足，提供了一種超聲波輔助制備河蜆糖胺聚糖的新方法，以便有效快速地提取河蜆糖胺聚糖，并提高其純度，平衡河蜆糖胺聚糖得率、制備時(shí)間和純度之間的關(guān)系。本發(fā)明提供了一種新的來源于河蜆的糖胺聚糖，并建立了一種有效的制備河蜆糖胺聚糖的方法，在對(duì)河蜆組織進(jìn)行酶解作用之前，結(jié)合超聲波提取技術(shù)，即首先采用超聲波處理河蜆組織，再用木瓜蛋白酶酶解，這樣大大縮短了酶解時(shí)間，增強(qiáng)了酶解的效率。同時(shí)為了提高河蜆糖胺聚糖的純度，本發(fā)明綜合運(yùn)用了三氯乙酸去除蛋白質(zhì)、氯化十六烷基吡啶(CPC)沉淀法和乙醇沉淀法。本發(fā)明能夠平衡河蜆糖胺聚糖制備效率和純度的關(guān)系，大大縮短了提取時(shí)間，提高了純度。在本發(fā)明中，原料能通過市購的方式獲得，新鮮的河蜆冷凍干燥后的蜆干可購自湖州凡人食品公司；木瓜蛋白酶可購自杭州昊天生物公司產(chǎn)品；氯化十六烷基吡啶(CPC)、 氯化鈉、EDTA、L-半胱氨酸、醋酸鈉、無水乙醇、丙酮、三氯乙酸、硫酸、咔唑、二甲基亞甲基藍(lán)可購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；透析袋7000Da (杭州越欣)；DEAE-Cellulose-DE52(上海索萊寶生物科技有限公司)本發(fā)明所涉及的儀器中Scientz-IID型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)購自寧波新芝生物科技股份有限公司；TSK-GEL G3000SWXL(北京綠百草科技發(fā)展有限公司)；恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；冷凍干燥機(jī)(thermo SuperModulyo) ;pH劑(TP-311,北京時(shí)代新維測(cè)控設(shè)備股份有限公司);離心機(jī)(Hitachi CPIOOffX)。本發(fā)明所得的河蜆糖胺聚糖黏性較強(qiáng)，粗糖呈棕黃色，精糖呈現(xiàn)亮白色，如圖I所示。最終所得的河蜆糖胺聚糖CFGS-2的分子量在12000Da，單糖組成分析表明該糖胺聚糖含葡萄糖醛酸、葡萄糖等。其純度檢測(cè)圖如圖3所示，其單糖組成分析圖如圖4所示。其對(duì)胃癌細(xì)胞(SGC7901)的 IC50 為 O. 028mg/ml、卵巢癌細(xì)胞(A2780)的 IC50 為 O. 364mg/ml、 卵巢癌細(xì)胞(SK0V3)的 IC50 為 O. 157mg/ml。特別要指出的是，本發(fā)明所得的河蜆糖胺聚糖對(duì)胃癌細(xì)胞(SGC7901)、卵巢癌細(xì)胞 (A2780/A2780)也具有很好的抑制效果；因此，河蜆糖胺聚糖的發(fā)現(xiàn)將對(duì)胃癌及卵巢癌細(xì)胞抑制藥物的開發(fā)打開一扇新的大門。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖I是過Cellulose DE-52柱(A前，B后)河蜆糖胺聚糖(即，A為河蜆糖胺聚糖粗品，B為河蜆糖胺聚糖的精糖)。圖2是河蜆精糖(河蜆糖胺聚糖的精糖)經(jīng)S印hacryl-300HR柱層析(硫酸-苯酚法檢測(cè))。圖3是河蜆糖胺聚糖的精糖成分CFGS-2的純度檢測(cè)(TSK Gel G3000SffxL)；圖4是河蜆糖胺聚糖CFGS-2單糖組成分析PMP柱前衍生高效液相色譜法檢測(cè)河蜆糖胺聚糖CFGS-2的單糖組成，以乳糖為內(nèi)標(biāo);A :不同單糖標(biāo)準(zhǔn)品的PMP衍生；I甘露糖，2氨基葡萄糖，3鼠李糖，4葡萄糖醛酸，5半乳糖醛酸，6乳糖，7氨基半乳糖，8葡萄糖，9半乳糖，10木糖，11阿拉伯糖，12巖藻糖。B :河蜆糖胺聚糖CFGS-2的單糖分析其中還有(2氨基葡萄糖，6乳糖，7氨基半乳糖，8葡萄糖，9 半乳糖，12巖藻糖)；各單糖組成的摩爾質(zhì)量比為氨基葡萄糖乳糖氨基半乳糖葡萄糖半乳糖巖藻糖=2 : 17 : 2 : 17 : 5 : 5。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施案例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明實(shí)施例I、一種河蜆糖胺聚糖的制備方法，依次進(jìn)行以下步驟I)、原料預(yù)處理將新鮮河蜆經(jīng)_80°C冷凍過夜(12小時(shí))后置于冷凍干燥機(jī)_50°C干燥24h，再經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過篩(40目)，得河蜆粉末；2)、脫脂稱取Ig的河蜆粉末于4°C丙酮中浸泡24h，室溫抽濾至干燥(恒重);得脫脂后河蜆粉末；3)、超聲處理向步驟2)所得的脫脂后河蜆粉末中加入醋酸-醋酸鈉緩沖液(O. 1M，pH
6.O) 30ml (即，物料比W V = I 30)超聲時(shí)間30min，功率190W。4)、酶解
向步驟3)所得的超聲處理液中加入EDTA(乙二胺四乙酸)和L-半胱氨酸，從而使EDTA和L-半胱氨酸的終濃度均分別為5mM ;混勻后升溫至60°C，再加入15mg木瓜蛋白酶于振蕩水浴鍋(200rpm)保溫水解IlOmin ;最后再加入TCA (從而使TCA的終濃度為50g/ L)用以沉淀蛋白，于4°C靜置30min。5)、沉淀:將步驟4)所得的酶解液離心(8000rpm，20min)去除沉淀后收集上清，向上清中加 3倍體積的質(zhì)量濃度為5%的乙酸鉀乙醇溶液，4°C過夜靜置(即靜置12小時(shí))。6)、溶解將步驟5)所得的溶液離心(8000rpm, 30min)收集沉淀。用無水乙醇洗漆并于50°C 烘箱中烘干(至恒重)沉淀后，得干燥后沉淀。向干燥后沉淀中加入濃度為O. 2M的NaCl溶液(干燥后沉淀與該NaCl溶液的質(zhì)量/體積=Ig 40ml) ο再次離心(8000rpm，30min)棄去沉淀中不溶解的物質(zhì)；同時(shí)收集上清。7)、CPC 沉淀向步驟6)收集的上清中加入質(zhì)量濃度為5%的氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液，會(huì)出現(xiàn)沉淀，離心(8000rpm, 30min),收集沉淀。氯化十六烷基吡啶溶液與上述步驟6)中的干燥后沉淀的料液比為lg/0. 5ml。8)、鹽溶將步驟7)所得的沉淀用2. 5M的NaCl溶液溶解，NaCl溶液與上述步驟6)中的干燥后沉淀的料液比為lg/10ml ；9)、醇沉:向步驟8)所得的溶液中加入5倍體積的無水乙醇，沉淀出現(xiàn)后，離心(lOOOOrpm， 30min),收集沉淀。10)、透析步驟9)所得的沉淀加水溶解(水的用量只需能溶解該沉淀即可，約Iml)后，經(jīng)透析袋(截留分子量7000Da，扁寬IOmm)透析后，得透析溶液。透析溶液經(jīng)_80°C冷凍過夜后置于冷凍干燥機(jī)于_50°C干燥24h，得凍干后的河蜆糖胺聚糖粗品240mg。注提取率以此處的粗糖(河蜆糖胺聚糖粗品)與河蜆干粉(即，步驟2)的河蜆粉末)計(jì)算。改變實(shí)施例I的步驟3)中的超聲功率⑵、超聲時(shí)間(Ut)、步驟4)中的水解時(shí)間 (Et)，從而得到不同的案例。具體如表I所示，每個(gè)案例所對(duì)應(yīng)的收率也同表I所示。表I、不同超聲頻率、時(shí)間、不同水解時(shí)間對(duì)糖胺聚糖得率的影響
權(quán)利要求
1.河蜆糖胺聚糖的制備方法，其特征是包括以下步驟1)、河蜆預(yù)處理將新鮮的河蜆冷凍干燥后粉碎，得河蜆粉末；2)、河蜆脫脂將河蜆粉末于2 6°C的丙酮中浸泡20 28h，室溫抽濾至干燥，得脫脂后河蜆粉末；3)、超聲波處理向脫脂后河蜆粉末中加入醋酸-醋酸鈉緩沖液(O. ΙΜ,ρΗ 6. O)，于190 475W的超聲功率下超聲10 30min，得超聲處理液；所述河蜆粉末與醋酸-醋酸鈉緩沖液的料液比為 lg/25 35ml ；4)、木瓜蛋白酶酶解向超聲處理液中加入乙二胺四乙酸和L-半胱氨酸，從而使乙二胺四乙酸和L-半胱氨酸的終濃度均分別為4. 8 5. 2mM ;混勻后升溫至55 65°C，再加入木瓜蛋白酶保溫水解 30 IIOmin,所述木瓜蛋白酶是河蜆粉末質(zhì)量的I. 4 1.6% ;最后再加入用以沉淀蛋白的三氯乙酸至終濃度50g/L ;于3 5°C靜置20 40min ；5)、沉淀將步驟4)所得的酶解液離心，收集上清，向上清中加2. 8 3. 2體積倍的質(zhì)量濃度為 5%的乙酸鉀乙醇溶液，于3 5°C靜置10 14小時(shí)；6)、溶解將步驟5)所得的溶液離心，所得的沉淀先用無水乙醇洗滌，烘干至恒重后，得干燥后沉淀；在干燥后沉淀中加入摩爾濃度為O. 2M的NaCl溶液,所述干燥后沉淀與NaCl溶液的料液比為lg/30 50ml ;再次離心，收集上清；7)、CPC沉淀向步驟6)所得的上清中加入質(zhì)量濃度為5%的氯化十六烷基吡啶溶液，離心收集沉淀；所述氯化十六烷基吡啶溶液與上述步驟6)中的干燥后沉淀的料液比為lg/0.4 O.6ml ；8)、鹽溶步驟7)所得的沉淀用2. 5M的NaCl溶液溶解，所述NaCl溶液與上述步驟6)中的干燥后沉淀的料液比為lg/8 12ml ;9)、醇沉向步驟8)所得的溶液中加入4. 5 5. 5體積倍的無水乙醇，直至沉淀出現(xiàn)后離心，收集沉淀；10)、透析將步驟9)所得的沉淀加水溶解后，經(jīng)截留分子量7000Da的透析袋透析后冷凍干燥，得凍干后的河蜆糖胺聚糖粗品。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的河蜆糖胺聚糖的制備方法，其特征是將凍干后的河蜆糖胺聚糖粗品依次進(jìn)行以下步驟①、DEAE-cellulose DE-52離子交換柱層析DEAE-cellulose DE-52 層析柱(15cmX5cm)用醋酸-醋酸鈉緩沖液(O. 1Μ,ρΗ6. O)以 10ml/min流速平衡體系后，將凍干后的糖胺聚糖粗品5g用8 12ml上述醋酸-醋酸鈉緩沖液(O. 1M，ρΗ6· O)溶解后加入層析柱中，再次用醋酸-醋酸鈉緩沖液(O. 1Μ，ρΗ6· O)平衡體系90min后,用洗液進(jìn)行均勻洗脫；所述洗液為以NaCl和醋酸-醋酸鈉緩沖液(O. 1Μ，ρΗ6. O)配制而得；所述NaCl在洗脫液中的線性梯度濃度為0M-1. 5M ；②、檢測(cè)洗脫后所收集的液體中有糖醛酸特有吸收峰和硫酸化糖胺聚糖特有吸收峰的樣品，3體積倍醇沉，沉淀收集透析后，冷凍干燥，得河蜆糖胺聚糖的精糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的河蜆糖胺聚糖的制備方法，其特征是將河蜆糖胺聚糖的精糖進(jìn)行Sephacryl_300HR柱層析將1g河蜆糖胺聚糖的精糖溶于I 2ml，O. 2M NaCl溶液后，加入S印hacryl-300HR層析柱中，以醋酸-醋酸鈉緩沖液(O. 1M，pH6. O)為洗液，.O. .2ml/min流速，收集洗脫液；用硫酸-苯酚法檢測(cè)收集的洗脫液中糖的特征吸收峰，收集各洗脫峰；得河蜆糖胺聚糖的精糖成分 CFGS-2。
4.利用如權(quán)利要求1、2或3所述的制備方法所得的河蜆糖胺聚糖的用途，其特征是: 用于抑制胃癌細(xì)胞或卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的河蜆糖胺聚糖的用途，其特征是所述胃癌細(xì)胞為SGC7901， 所述卵巢癌細(xì)胞為A2780或SK0V3。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種河蜆糖胺聚糖的制備方法，包括下列步驟(1)河蜆預(yù)處理；(2)河蜆脫脂；(3)超聲波處理；(4)木瓜蛋白酶酶解；(5)TCA沉淀；(6)溶解；(7)離心取上清后，氯化十六烷基吡啶(CPC)沉淀多糖；(8)鹽溶去除CPC；(9)乙醇沉淀，干燥；(10)、經(jīng)截留分子量7000Da的透析袋透析后冷凍干燥，得凍干后的河蜆糖胺聚糖粗品。上述河蜆糖胺聚糖粗品經(jīng)DEAE-Cellulose陰離子交換柱層析，能近一步純化河蜆糖胺聚糖粗品，從而得河蜆糖胺聚糖的精糖。本發(fā)明方法制備而得的河蜆糖胺聚糖能用于抑制胃癌細(xì)胞或卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)活性。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102603911SQ20121006286
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月12日
發(fā)明者劉東紅, 葉興乾, 廖寧波, 陳士國 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)