專利名稱：一種β-葡聚糖鐵復(fù)合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有免疫調(diào)節(jié)功能的補(bǔ)鐵制劑的制備方法，具體是利用真菌來源 的葡聚糖制備高價(jià)鐵葡聚糖復(fù)合物作為補(bǔ)鐵制劑，屬營(yíng)養(yǎng)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)治療缺鐵性貧血(Iron-deficiency Anemia, IDA)的藥物為各種亞鐵鹽制劑， 如無機(jī)鐵劑硫酸亞鐵控釋片、可溶性有機(jī)絡(luò)合鐵劑琥珀酸亞鐵、富馬酸鐵、葡萄糖酸鐵等， 游離的亞鐵離子刺激胃腸，造成惡心、嘔吐、腹瀉、便秘等消化道不良反應(yīng)，且二價(jià)鐵制劑易 產(chǎn)生內(nèi)源性自由基，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化而造成細(xì)胞膜損傷。注射型補(bǔ)鐵劑右旋糖酐鐵 (葡聚糖鐵，F(xiàn)e-Dextran)、山梨醇鐵，通過深部肌肉注射，解決了刺激胃腸，不利于消化吸收 的問題，但可引起局部疼痛，蕁麻疹、發(fā)熱、頭痛、關(guān)節(jié)疼痛、惡心、哮喘等，有部分病人發(fā)生 過敏反應(yīng)和其他過敏性副反應(yīng)。靜脈注射型鐵劑氫氧化鐵蔗糖復(fù)合物通過靜脈輸液治療腎 衰病人的缺鐵性貧血，由于蔗糖鐵不含右旋糖酐，發(fā)生過敏反應(yīng)較少，并且?guī)缀跬耆ㄟ^網(wǎng) 狀內(nèi)皮系統(tǒng)攝取，不沉積在肝內(nèi)，從而避免了肝損傷。另一類補(bǔ)鐵劑為鐵-蛋白絡(luò)合物，在胃內(nèi)酸堿度小于4即酸性時(shí)，鐵離子受蛋白膜 的保護(hù)而不同胃液中的鹽酸和胃蛋白酸發(fā)生反應(yīng)，所以不會(huì)造成胃粘膜損傷，大大提高對(duì) 鐵質(zhì)的耐受性。而在腸腔堿性環(huán)境下(酸堿度7. 5至8)鐵-蛋白絡(luò)合物重新變得可溶，使 蛋白膜為胰蛋白酶所消化而釋放出鐵離子，鐵離子可迅速地在腸絨毛內(nèi)高度被吸收，使療 效大大提高。但是該制劑實(shí)際上是用蛋白膜包覆的琥珀酸鐵，同樣具有其他二價(jià)鐵制劑存 在的上述缺陷。多糖類物質(zhì)的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制被全面揭示之后，以三價(jià)鐵(Fe3+)為核心，多糖 為配合物的復(fù)合鐵制劑成為新的口服補(bǔ)鐵劑，以力蜚能(Mferex)為代表的多糖鐵復(fù)合物 (PIC)制劑迅速在臨床上廣泛應(yīng)用起來，并成為國(guó)內(nèi)補(bǔ)鐵劑市場(chǎng)的主流產(chǎn)品。此類多糖鐵制 劑中的多糖來源于細(xì)菌腸膜明串珠菌的發(fā)酵產(chǎn)物，多糖組分為吡喃型葡萄糖單體構(gòu)成的葡 聚糖，糖苷鍵的95%是a-l，6_D-鍵型，其余為α _1，3-D和其他鍵型。該多糖的結(jié)構(gòu)與右 旋糖酐完全相同，所不同的是分子量更低，實(shí)際為低分子量右旋糖酐。多糖與高價(jià)鐵配合生成的多糖鐵復(fù)合物，用于IDA的治療，不僅具有較理想的穩(wěn) 定性、水溶性和吸收率等，釋放鐵后又繼續(xù)發(fā)揮多糖的免疫促進(jìn)功能，是一種較理想的補(bǔ)鐵 制劑，具有副作用小、配合性穩(wěn)定、溶解度好，含鐵量高的優(yōu)點(diǎn)。多糖鐵中的多糖成分刺激紅 細(xì)胞生成、促進(jìn)造血母細(xì)胞和多能造血干細(xì)胞的增殖和分化、從而提高機(jī)體的造血水平，因 此又是良好的造血促進(jìn)劑。目前比較有臨床應(yīng)用前景的多糖鐵制劑有當(dāng)歸多糖鐵、淮山藥多糖鐵和人參多糖 鐵，均為具有補(bǔ)血作用或免疫調(diào)節(jié)作用的中藥材提取的多糖與鐵制備的復(fù)合物，旨在發(fā)揮 中藥和鐵的雙重補(bǔ)血活血作用。但植物來源的多糖多為各種單糖構(gòu)成的雜多糖，其中，具有 免疫調(diào)節(jié)作用的活性成分葡聚糖的含量較低，多糖與鐵的協(xié)同作用難以充分發(fā)揮。現(xiàn) 有用于藥品或功能食品的真菌多糖多為水提取物，雖然葡聚糖含量有所提高，但同樣存在含有雜多糖和分子量巨大的問題，若以此為原料制備多糖鐵復(fù)合物，其結(jié)果與植物多 糖類似存在較大的缺陷。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明提供了一種利用堿溶性真菌β-葡聚 糖為配體化合物，以三價(jià)鐵為配位中心離子制備的葡聚糖鐵及其制備方法，所制備的 β-葡聚糖鐵復(fù)合物(β-Glucan Iron Complex, β -GIC)含鐵量高，水溶性好，不含游離鐵 離子，體外環(huán)境中穩(wěn)定，體內(nèi)通過胃酸作用，解離出Fe3+被人體吸收，在體內(nèi)被還原成Fe2+利 用，同時(shí)解離出的葡聚糖進(jìn)而發(fā)揮其提高機(jī)體免疫力和生血活血的協(xié)同補(bǔ)血功效。因 此β _葡聚糖鐵絡(luò)合物同時(shí)具有補(bǔ)鐵補(bǔ)血和免疫調(diào)節(jié)的雙重功效。本發(fā)明所述的一種β-葡聚糖鐵復(fù)合物，其重均相對(duì)分子質(zhì)量Μ,為5-20萬 Dalton，對(duì)分子質(zhì)量分步寬度D為1.0-3.0，鐵含量為10-50% (w/w)；所述β-葡聚糖為由 真菌來源提取的β-葡聚糖。與現(xiàn)有各種多糖鐵復(fù)合物相比，本發(fā)明的最大不同就是采用了以真菌為來源提取 的葡聚糖作為配體化合物來進(jìn)行復(fù)合制備多糖鐵，且所制備的多糖鐵為葡聚糖鐵 復(fù)合物，使葡聚糖的免疫調(diào)節(jié)作用得到了更好的發(fā)揮，同時(shí)兼顧了與三價(jià)鐵的協(xié)同作 用，提供了 一種高價(jià)鐵葡聚糖復(fù)合物。所述真菌來源，是由去除了菌絲體的真菌菌絲體發(fā)酵液或包含菌絲體的真菌菌絲 體發(fā)酵液或去除了發(fā)酵液的真菌菌絲體為來源的；或真菌子實(shí)體為來源的；優(yōu)選采用不去 除菌絲體的發(fā)酵液，除此之外，還可以采用去除發(fā)酵液的鮮菌絲體為來源，菌絲體為鮮菌絲體，避免了 發(fā)酵后處理中對(duì)菌絲體的洗滌、干燥和粉碎等過程，既降低能耗，又使工藝過程連貫；一般 來講，可以根據(jù)菌種的選擇來確定采用哪種來源，如產(chǎn)胞外多糖的真菌(如小核菌、核盤 菌、云芝、裂褶菌)采用不去除菌絲體的發(fā)酵液為好，去除菌絲體的發(fā)酵液次之；只產(chǎn)胞內(nèi) 多糖的香菇則采用去除發(fā)酵液的鮮菌絲體為好。本發(fā)明所述的β-葡聚糖為真菌β-葡聚糖，該真菌β-葡聚糖中包括了同一來 源的β-葡聚糖蛋白復(fù)合物，或稱蛋白聚糖。無論是β-葡聚糖還是β-葡聚糖蛋白復(fù)合 物(蛋白聚糖)均包含中性β-葡聚糖、酸性β-葡聚糖和中性蛋白聚糖、酸性蛋白聚糖， 其中，中性蛋白聚糖和酸性蛋白聚糖中的糖均為β-葡聚糖。制備β-葡聚糖的真菌包括 小菌核菌屬真菌(Sclerotium spp.)，又稱小核菌屬真菌，還包括雜色云芝(Polystictus versicolor)，核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)，裂裙菌(Schizophyllum commune)禾口 香菇(Lentinula edodes)。各菌種均通過商業(yè)途徑購(gòu)買獲得，來源如下小菌核菌，保藏于 中國(guó)藥用微生物菌種保藏中心，菌種保藏號(hào)為CPCC 400357 ；核盤菌，保藏于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生 物菌種保藏管理中心，保藏號(hào)ACCC 36079 ；雜色云芝，保藏于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管 理中心，保藏號(hào)ACCC 50435 ；裂褶菌，保藏于中國(guó)林業(yè)微生物菌種保藏中心，菌種保藏號(hào)為 CFCC 82020 ；香菇，保藏于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心，菌種保藏號(hào)為ACCC 50066。除了通過發(fā)酵的方法先制備發(fā)酵液或菌絲體，再制備β-葡聚糖外，還可以市售 的云芝、裂褶菌和香菇的子實(shí)體為原料制備葡聚糖。之所以采用上述的真菌作為來源，是因?yàn)檫@些真菌多糖的特殊結(jié)構(gòu)，決定了其具有特殊的理化特性以及特殊的生物活性和生理功能，具體說明如下小核菌葡聚糖是由小菌核菌屬(Sclerotium spp.)真菌產(chǎn)生的胞外多糖，又稱硬 葡聚糖(Scleroglucan)，是通過液體發(fā)酵培養(yǎng)菌絲體和發(fā)酵液中制備而來。 小核菌葡聚糖呈線性結(jié)構(gòu)，由D-吡喃葡萄糖通過β -1，3-D-糖苷鍵相連形成主 鏈，再與單個(gè)D-吡喃葡萄糖單位以i3-l，6-D-糖苷鍵相連形成支鏈。硬葡聚糖在冷熱水中 均可溶解，溶液具有很高的假塑性，不受溫度、PH和電解質(zhì)變化的影響，穩(wěn)定性也強(qiáng)。在發(fā) 酵時(shí)多糖的分子量受條件的影響較小。此聚合物與水的結(jié)合性、穩(wěn)定性、黏稠性和懸浮性特 性良好。小核菌葡聚糖本身具有重要的免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤、抗病毒、抗感染等功效，具有 明顯的抗補(bǔ)體活性和促進(jìn)巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞增殖的作用，對(duì)提高機(jī)體免疫力具有重要的 作用。小核菌葡聚糖可大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，原料易得、工藝成熟、成本低廉，易于工業(yè)化生產(chǎn)， 對(duì)其進(jìn)行衍生化生成的葡聚糖糖鐵復(fù)合物是一種新型補(bǔ)鐵制劑。核盤菌葡聚糖為核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)產(chǎn)生的胞外多糖(SSG)，也 是以i3-l，6_D-葡聚糖分支的i3-l，3_D-葡聚糖，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與小核菌葡聚糖非常相似，但 相對(duì)分子質(zhì)量要高很多，一般在80萬Dalton以上，在水中溶解緩慢，粘度較高，并具有良好 的流變學(xué)性質(zhì)，其特性粘度幾乎不隨離子強(qiáng)度的變化而改變，在PHI. 8-12. 3之間，特性粘 度值變化不顯著，但當(dāng)PH值為13. 32時(shí)，由于分子構(gòu)象的變化導(dǎo)致特性粘度值急驟下降。溫 度< 90°C和熱處理對(duì)SSG溶液的表觀粘度影響不大?？纱笠?guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，原料易得、工藝 成熟、成本低廉，易于工業(yè)化生產(chǎn)，核盤菌葡聚糖具有潛在的免疫調(diào)節(jié)活力和較強(qiáng)的抑瘤作 用。云芝、裂褶菌和香菇提取的β -葡聚糖均具有和小核菌葡聚糖相似的結(jié)構(gòu)和功 能。以雜色云芝(Polystictus versicolor)、裂裙菌(Schizophyllum commune)禾口香 (Lentinula edodes)為原料制取的β _葡聚糖或糖肽(β _葡聚糖與小分子蛋白結(jié)合的蛋 白聚糖)是目前已應(yīng)用于臨床的葡聚糖藥物，用于抗病毒、增強(qiáng)免疫力和腫瘤輔助治療。由上可知，選擇上述的多種真菌作為β-葡聚糖的來源，有著優(yōu)異的效果，可以獲 得具有較高品質(zhì)的葡聚糖。制備上述β -葡聚糖鐵復(fù)合物的方法，其步驟如下(1)堿溶性β -葡聚糖制備將完成發(fā)酵的菌絲體發(fā)酵液直接用堿在加熱條件下攪拌提取β -葡聚糖；或?qū)㈩A(yù) 處理過的菌絲體加入堿后加熱提取獲得β “葡聚糖，所述的預(yù)處理為將菌絲體經(jīng)脫脂、水 提去除脂溶物和雜多糖；還可以將子實(shí)體經(jīng)脫脂、水提去除脂溶物和雜多糖，再經(jīng)堿提取獲 得β _葡聚糖；(2) β-葡聚糖鐵的合成將步驟(1)所得堿溶性β _葡聚糖溶液加熱至50-10(TC，在攪拌條件下，先連續(xù)滴 加或流加絡(luò)合劑，PH降低至9. 5時(shí)，再同時(shí)滴加絡(luò)合劑和三價(jià)鐵化合物，同時(shí)滴加或流加絡(luò) 合劑和三價(jià)鐵化合物時(shí)起至整個(gè)合成反應(yīng)完成，三價(jià)鐵化合物與絡(luò)合劑總用量的摩爾比為 2 n，其中η= 1-5之間的整數(shù)；通過控制絡(luò)合劑的滴加速度和加入量控制pH在7.0-9.5 的范圍內(nèi)，從PH9. 5逐漸向pH7. O變化，持續(xù)進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)，即可獲得β -葡聚糖鐵復(fù)合物；
(3) β -葡聚糖鐵分離純化β -葡聚糖鐵合成反應(yīng)結(jié)束后，降溫，管式離心機(jī) 6000-14000r/min離心，去除不溶物，用截留相對(duì)分子質(zhì)量6000-100000Dalton的超濾膜超 濾濃縮，冷凍干燥或噴霧干燥；制備方法中，步驟(1)中所述用于制備堿溶性β _葡聚糖的菌絲體發(fā)酵液，是去除 或不去除菌絲體的發(fā)酵液，優(yōu)選不去除菌絲體的發(fā)酵液，用其制備葡聚糖的方法是添 加固堿，使發(fā)酵液的最終堿濃度為0. 01-0. 25mol/L，所用固體堿為NaOH或KOH或Na2CO3，在 溫度為10-60°C下攪拌處理l_3h，離心，收集上清液即為堿溶性β-葡聚糖溶液； 或者是用去除發(fā)酵液的鮮菌絲體按照順序進(jìn)行脫脂、水提和堿提，其中乙醇脫脂， 所用乙醇濃度為70-95%，用量為菌絲體量的10-30倍(v/w)，以浸沒菌絲體為準(zhǔn)；脫脂過程 去除了其中的脂類和類脂和其他醇溶性成分，同時(shí)去除部分單糖、多肽等雜質(zhì)；熱水提取溫 度為90-100°C，目的是將水溶性多糖、低聚糖和單糖去除，所去除的多糖中的主要成分為各 種雜多糖，包括不同單糖組成的雜多糖和α-糖苷鍵連接的多糖；堿提取所用的堿為NaOH 或KOH或Na2CO3溶液，濃度為0. 1-2. 5mol/L，用量為菌絲體量的10-30倍(v/w)，該步驟所 得多糖均為β-葡聚糖，該β-葡聚糖為含蛋白或不含蛋白的葡聚糖，含蛋白的β-葡聚糖 又稱為蛋白聚糖，HPLC檢測(cè)顯示為成分均一組分，且GPC法測(cè)定其中葡聚糖的相對(duì)分 子質(zhì)量介于5-20萬Dalton范圍內(nèi)，相對(duì)分子質(zhì)量分布寬度介于1. 0-3. 0之間；更重要的 是，堿溶性β-葡聚糖溶液中保留了中性β-葡聚糖，也保留了堿溶的酸性β-葡聚糖，使 β-葡聚糖的得率大大提高；所得堿溶性β-葡聚糖提取液，不經(jīng)過濃縮、超濾、醇沉、干燥 等過程，直接用于下一步驟葡聚糖鐵的合成；之所以這樣操作，主要是減少能耗和有機(jī) 溶劑的污染，同時(shí)減少中間環(huán)節(jié)，更重要的是堿提取的β -葡聚糖提取液本身PH值大于12， 高于多糖鐵復(fù)合物制備所需PH值，因此進(jìn)行下一步葡聚糖鐵合成時(shí)，無需再用堿調(diào)PH值， 而需要用酸性物質(zhì)向PH降低方向調(diào)節(jié)；步驟(1)制備堿溶性葡聚糖的方法中，還可采用以市售干燥子實(shí)體或其粉末 為原料，按照上述菌絲體制備制備堿溶性β “葡聚糖的過程進(jìn)行，可得到子實(shí)體來源的堿 溶性葡聚糖；與菌絲體為原料不同的是，脫脂過程中使用的乙醇的濃度和用量有變化， 一般控制在乙醇的濃度為60-80% (ν/ν)，用量為子實(shí)體粉末的10-20倍(v/w)；而步驟(1) 中所提及的發(fā)酵均為現(xiàn)有的發(fā)酵技術(shù)，不再贅述。上述步驟(2)所述用于β -葡聚糖鐵合成的配體化合物，是將步驟(1)中所獲得 的含有β-葡聚糖或含β-葡聚糖的蛋白聚糖堿溶液加熱到50-100°C，以利于充分溶解， 并為下一步的合成反應(yīng)提供條件；在攪拌條件下(10-40r/min)，向溶液中滴加或緩慢流加 絡(luò)合劑，調(diào)節(jié)反應(yīng)的初始PH值至9. 5，再同時(shí)滴加三價(jià)鐵化合物溶液，通過同時(shí)連續(xù)滴加或 流加絡(luò)合劑和三價(jià)鐵化合物，使絡(luò)合反應(yīng)在均相液體中進(jìn)行；同時(shí)滴加或流加絡(luò)合劑和三 價(jià)鐵化合物時(shí)起至整個(gè)合成反應(yīng)完成，三價(jià)鐵化合物與絡(luò)合劑總用量的摩爾比為2 n，其 中η = 1-5之間的整數(shù)；絡(luò)合劑優(yōu)選采用酸性絡(luò)合劑，酸性絡(luò)合劑的加入，使溶液ρΗ值不 斷下降，通過控制流加速度和加入的量，可使溶液PH值穩(wěn)定在一定范圍內(nèi)，使絡(luò)合反應(yīng)得 以在ρΗ7. 0-9.5的范圍內(nèi)進(jìn)行；期間，ρΗ值控制為連續(xù)均勻變化，反應(yīng)開始的ρΗ值控制在 9. 5左右，以提高β -葡聚糖的溶解性(以不出現(xiàn)持續(xù)沉淀為指標(biāo))，隨絡(luò)合反應(yīng)的持續(xù)進(jìn) 行，逐漸降低PH值，最終控制在pH7. 0以上，但低于ρΗ9. 0，直到出現(xiàn)的沉淀不再溶解，停止 流加反應(yīng)物，終止反應(yīng)，繼續(xù)保溫lh。由于原溶液為堿性溶液，ρΗ值大于12，而葡聚糖鐵的絡(luò)合反應(yīng)又必需在中性偏堿的范圍內(nèi)進(jìn)行，所以，不同于其他方法，該過程中所用的PH調(diào) 節(jié)劑為酸性絡(luò)合劑，也就是說，反應(yīng)物中的酸性絡(luò)合劑本身就兼有PH值調(diào)節(jié)劑的功能；上述的酸性絡(luò)合劑為檸檬酸、檸檬酸三鈉鹽、酒石酸、酒石酸鉀鈉、焦磷酸鈉鹽、蘋 果酸、乳酸、草酸、EDTA環(huán)己二胺四乙酸(⑶TA)、二乙三胺五乙酸(DTPA)或氨三乙酸(NTA)、 亞硝基三乙酸鈉中的一種或數(shù)種。

與絡(luò)合劑同時(shí)流加的配位中心離子鐵供體為三價(jià)鐵化合物，具體為氯化鐵、硫酸 鐵、硝酸鐵、磷酸鐵、醋酸鐵中的一種。為了達(dá)到更好的效果，一般經(jīng)過上述兩步處理后，將步驟(2)所獲得的β-葡 聚糖鐵復(fù)合物進(jìn)一步純化，具體的分離方法，不同于其他用乙醇沉淀的方法，該步驟通過 離心去除步驟(2)所獲得的β-葡聚糖鐵復(fù)合物溶液中的不溶物后，用截留相對(duì)分子質(zhì) 量6000-100000Dalton的超濾膜超濾濃縮，同時(shí)脫鹽，去除6000-100000Dalton以下相 對(duì)分子質(zhì)量的小分子物質(zhì)。未反應(yīng)完全的鐵化合物(游離Fe3+)、反應(yīng)過程中新生成的鹽 或其他化合物，均通過超濾脫除。由于堿提取的葡聚糖和蛋白聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量 均小于20萬Dalton(趙峽等.藥物分析雜志.2007，27 (8) :1143_1146)，因此，僅通過 6000-100000Dalton的超濾膜一次超濾濃縮即可，使所得葡聚糖鐵復(fù)合物的分子量控制在 5-20萬Dalton的范圍內(nèi)。對(duì)截留的濃縮液部分進(jìn)行冷凍干燥或噴霧干燥或40-60°C以下 低溫真空干燥，即得棕紅色葡聚糖鐵粉末。所得葡聚糖鐵溶解性能和產(chǎn)量均大大提高。為了檢測(cè)上述獲得的葡聚糖鐵的性能，所得經(jīng)過超濾后獲得的β -葡聚糖鐵中的 葡聚糖含量采用硫酸_苯酚分光光度法測(cè)定；游離Fe3+采用亞鐵氰化鉀分光光度法測(cè)定； 葡聚糖鐵中的鐵含量采用鄰菲啰啉分光光度法測(cè)定。鄰菲啰啉(鄰二氮雜菲)分光光度法測(cè)定鐵含量的原理鄰菲啰啉(鄰二氮雜菲) 在ρΗ值為2-9的溶液中與二價(jià)鐵離子生成穩(wěn)定的紅色配合物。該反應(yīng)中鐵必須是亞鐵狀 態(tài)，因此顯色前還要加入還原劑(如鹽酸羥胺、抗壞血酸)。紅色配合物的最大吸收波長(zhǎng)為 510nm。具體測(cè)定步驟為標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制鐵(II)標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制精密稱取硫酸亞鐵胺 (Fe (NH4)2(SO4)2 · 6H20) 0. 70253g，溶于少量蒸餾水，移入IOOOmL量瓶中，加3mL鹽酸，用蒸 餾水定容至刻度，冷藏備用。鐵(II)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制(使用時(shí)現(xiàn)配)吸取10. OmL鐵(II)標(biāo)準(zhǔn)貯備液，移入 IOOmL量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。取8個(gè)50mL量瓶，分別加入鐵(II)標(biāo)準(zhǔn)使用液0.0、 2. 0,4. 0,6. 0,8. 0,10. 0,12. 0,14. OmL，再分別加入10%抗壞血酸水溶液2. OmL，鄰菲啰啉 水溶液2. 5mL，用蒸餾水定容，搖勻。放入水浴鍋中在37°C下反應(yīng)lOmin，于510nm處測(cè)定吸 光度。計(jì)算出線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)合兩個(gè)現(xiàn)有專利技術(shù)已說明本發(fā)明的技術(shù)進(jìn)步(1)專利CN1147322C中其所做的努力旨在盡可能地降低配體化合物葡聚糖的分 子量和盡可能地取出產(chǎn)物中的極低相對(duì)分子質(zhì)量的低聚糖。此過程須經(jīng)多步酶解、修飾、超 濾、納濾處理，過程復(fù)雜而費(fèi)時(shí)，制備成本巨大。這對(duì)用于注射給藥的補(bǔ)鐵劑來說是必須的， 因?yàn)楦叻肿恿康钠暇厶强赡軐?dǎo)致過敏反應(yīng)和其他過敏性副作用，如休克、呼吸困難等。但對(duì) 于口服途徑即腸道吸收的補(bǔ)鐵劑，主要解決其刺激性問題和在腸道中的吸收利用問題，而 在上述的專利中并沒有提出明確的解決方案；
而本方法制備的β -葡聚糖鐵的鐵與上述的對(duì)比文件含量相當(dāng)，但β “葡聚糖的 相對(duì)分子質(zhì)量要大很多，同時(shí)含有結(jié)合蛋白的β “葡聚糖更容易通過胃液或消化液屏障而 更好地保存其多糖的免疫調(diào)節(jié)功能。與現(xiàn)有技術(shù)相比，過程相對(duì)簡(jiǎn)單，步驟少，且與傳統(tǒng)方 法相比，中間過程物沉淀、干燥處理，大大簡(jiǎn)化了工藝步驟。本方法合成的葡聚糖鐵中 的含鐵量完全能夠滿足特殊條件下的補(bǔ)鐵需求，同時(shí)，由于含有大分子β “葡聚糖，更易于 形成螺旋形空間立體結(jié)構(gòu)，對(duì)人體具有更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)能力，與鐵協(xié)同發(fā)揮生血活血的作 用更強(qiáng)。(2)CN100362021C中使用水溶性山藥多糖為配體化合物，由于山藥多糖為雜合 多糖，溶液中難于形成三重螺旋空間構(gòu)型，加之水提取多糖相對(duì)分子質(zhì)量范圍很大，20萬 Dalton以上相對(duì)分子質(zhì)量的多糖比例高，造成水中溶解度低；

而本發(fā)明除采用鮮菌絲體以減少干燥過程，最大的優(yōu)勢(shì)就是節(jié)約了能源消耗，同 時(shí)減少了中間步驟環(huán)節(jié)，此外，以堿提取的過程獲得的是不含雜多糖而只含葡聚糖的 單一組分葡聚糖，更進(jìn)一步地，對(duì)堿提取的葡聚糖不做中和、醇沉、干燥等處理，進(jìn)行不 溶物分離后，直接用于葡聚糖鐵的合成，這樣做的目的，第一是獲得單純適宜相對(duì)分子質(zhì)量 的構(gòu)型的葡聚糖，第二是使所得葡聚糖的溶解度大大提高，第三，同樣是為了節(jié)約 能耗，減少并降低有機(jī)溶劑的使用。另一方面，現(xiàn)有技術(shù)中的雜多糖作為配體化合物參與絡(luò) 合反應(yīng)時(shí)，由于有效多糖的濃度較低，所形成的多糖鐵復(fù)合物中的多糖含量也低，因此山藥 多糖鐵在釋放鐵離子后，多糖本身難以發(fā)揮其固有的生理活性。與之相比，本發(fā)明的葡 聚糖鐵復(fù)合物具有顯而易見的優(yōu)勢(shì)。臨床應(yīng)用的葡聚糖鐵主要為右旋糖酐鐵，其多糖為α-糖苷鍵構(gòu)型的葡聚糖。本 發(fā)明的葡聚糖多糖鐵是由葡聚糖在一定條件下與三價(jià)鐵離子形成的絡(luò)合物，體外環(huán)境 中穩(wěn)定，在腸胃環(huán)境中通過胃酸作用，解離出Fe3+被人體吸收，在體內(nèi)被還原成Fe2+利用， 達(dá)到補(bǔ)鐵補(bǔ)血的目的；同時(shí)解離出的葡聚糖進(jìn)而發(fā)揮其提高機(jī)體免疫力的功效。因此 β-葡聚糖鐵絡(luò)合物同時(shí)具有補(bǔ)鐵補(bǔ)血和免疫調(diào)節(jié)的雙重功效。以β-葡聚糖與高價(jià)鐵配 合生成的葡聚糖多糖鐵復(fù)合物，可望成為一種新型的、具有協(xié)同補(bǔ)血作用的補(bǔ)鐵劑，既可發(fā) 揮高價(jià)鐵補(bǔ)鐵、治療缺鐵性貧血的作用，又可發(fā)揮β “葡聚糖的免疫調(diào)節(jié)和生血活血的活 性。
具體實(shí)施例方式下面以具體實(shí)施例進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)行說明。本發(fā)明所涉及的內(nèi)容包含但 不限于如下具體實(shí)施例。實(shí)施例1小核菌堿溶性β-葡聚糖的制備。小核菌發(fā)酵液10L，固形物含量為4. 2% (w/ ν)，添加固體NaOH，攪拌，使發(fā)酵液中堿濃度為1. 5mol/L,緩慢加熱至45°C，攪拌處理lh， 6000r/min離心20min，收集上清液即為堿溶性β -葡聚糖溶液。實(shí)施例2香菇發(fā)酵液6L，板框壓濾濾除發(fā)酵液，得濕菌體920g，加入適量95 %的乙醇，使 菌絲體充分淹沒，攪拌均勻后靜置4-8h，壓濾，收集脫脂液，濾餅中加入15倍(ν/ν)蒸餾 水，加熱至微沸，攪拌、保溫3h，趁熱壓濾，去除水提取液；濾餅中加入濃度為0. 1-2. 5mol/L(0.4% -10% )的KOH，加熱至60°C，攪拌、保溫lh，壓濾或離心，收集濾液，即為堿溶性 β-葡聚糖溶液。所得堿溶性β -葡聚糖提取液，不經(jīng)過超濾、濃縮、醇沉、干燥等過程，直接用于下 一步驟β-葡聚糖鐵的合成。實(shí)施例3云芝子實(shí)體堿溶性β -葡聚糖的制備。

云芝干燥子實(shí)體粉末(80目)lKg，加入12倍(v/w) 80 %的乙醇，攪拌均勻后靜置 6-12h，期間，攪拌數(shù)次，壓濾，收集脫脂液，濾餅中加入20倍(ν/ν)蒸餾水，加熱至微沸，攪 拌、保溫2h，趁熱壓濾，去除水提取液；濾餅中加入濃度為0. 1-2. 5mol/L(0. 4% -10% )的 Na2CO3,加熱至40°C，攪拌、保溫lh，壓濾，收集濾液，即為堿溶性β-葡聚糖溶液。所得堿溶性β -葡聚糖提取液，不經(jīng)過超濾、濃縮、醇沉、干燥等過程，直接用于下 一步驟β-葡聚糖鐵的合成。實(shí)施例4小核菌β -葡聚糖鐵復(fù)合物的制備。(1)堿溶性β -葡聚糖制備小核菌發(fā)酵液10L，固形物含量為3. 78% (w/v)，添加 固體Κ0Η，攪拌，使發(fā)酵液中堿濃度為lmol/L，緩慢加熱至30°C，攪拌處理2h，6000r/min離 心20min，收集上清液即為堿溶性β -葡聚糖溶液；(2) β -葡聚糖鐵合成將步驟⑴所得堿溶性β -葡聚糖溶液加熱至80°C，在持 續(xù)攪拌下，先連續(xù)滴加或流加酒石酸，PH降低至9. 5時(shí)，同時(shí)流加酒石酸和氯化鐵溶液，自 同時(shí)流加絡(luò)合劑和三價(jià)鐵化合物至整個(gè)合成反應(yīng)結(jié)束的過程中，氯化鐵與酒石酸的摩爾比 為2 2，控制酒石酸和氯化鐵的流加速度，使初始pH值控制在9. 5，同時(shí)又使出現(xiàn)的沉淀 在攪拌狀態(tài)下能迅速溶解；調(diào)節(jié)酒石酸和氯化鐵的流加速度，逐漸增加酒石酸的流速，使 pH值每IOmin降低0. 2，直到pH值降低至接近7. 0，調(diào)節(jié)酒石酸和氯化鐵的流加速度，使pH 值穩(wěn)定控制在7. 0左右，持續(xù)進(jìn)行反應(yīng)，直到出現(xiàn)的沉淀不再溶解，停止加入酒石酸和氯化 鐵，繼續(xù)攪拌、保溫Ih;(3) β -葡聚糖鐵分離純化β -葡聚糖鐵合成反應(yīng)結(jié)束后，降溫，管式離心機(jī) 14000r/min離心，去除不溶物，用截留相對(duì)分子質(zhì)量50000DaltOn的超濾膜超濾，60°C真空 干燥或噴霧干燥；(4) β-葡聚糖鐵質(zhì)量測(cè)定鄰菲啰啉分光光度法測(cè)定葡聚糖鐵中的鐵含量；硫 酸_苯酚分光光度法測(cè)定葡聚糖含量；亞鐵氰化鉀分光光度法測(cè)定游離Fe3+離子；HPLC法 測(cè)定成分均一性；GPC法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量Mr和相對(duì)分子質(zhì)量分布寬度D。結(jié)果顯示，IOL 小核菌發(fā)酵液，經(jīng)上述各步驟處理，得β _葡聚糖鐵113. 6g，其中鐵含量為32. 45%，葡聚糖 含量為48. 78% ;HPLC法測(cè)定圖譜顯示為單一峰，GPC法測(cè)定Mr為173640DaltOn，相對(duì)分子 質(zhì)量分布寬度D為1. 73 ；所得β -葡聚糖鐵溶液與亞鐵氰化鉀溶液產(chǎn)生反應(yīng)，反應(yīng)液不呈 藍(lán)色，說明葡聚糖鐵溶液中不含游離Fe3+。實(shí)施例5香菇β _葡聚糖鐵復(fù)合物的制備及其理化性質(zhì)。香菇β-葡聚糖鐵復(fù)合物的制備方法中，堿溶性β-葡聚糖溶液的制備同實(shí)施例 2，簡(jiǎn)述為香菇發(fā)酵液經(jīng)板框壓濾得濕菌體，加入適量95%的乙醇，攪拌均勻后靜置過夜，壓濾；濾餅中加入20倍(ν/ν)蒸餾水，加熱至微沸，攪拌提取4h，壓濾；濾餅中加入濃度為 0. 1-2. 5mol/L(0. 4% -10% ) ^ Na2CO3，加熱至40°C，攪拌提取3h，壓濾，收集濾液，即為堿 溶性β-葡聚糖溶液。香菇β _葡聚糖鐵復(fù)合物的合成與分離純化同實(shí)施例3，簡(jiǎn)述為將堿溶性β _葡 聚糖溶液加熱至65°C，在持續(xù)攪拌下，先連續(xù)滴加或流加氨三乙酸(NTA)，pH降低至9. 5時(shí)， 再同時(shí)流加氨三乙酸(NTA)和氯化鐵，自同時(shí)流加絡(luò)合劑和三價(jià)鐵化合物至整個(gè)合成反應(yīng) 結(jié)束的過程中，所滴加反應(yīng)物的摩爾比為NTA FeCl3 = 3 2，控制流加速度，使反應(yīng)過程 中的PH值從9. 5向7. 0均勻變化，pH值降低至接近7. 0，調(diào)節(jié)NTA流加速度，使pH值穩(wěn)定 控制在7.0左右，持續(xù)反應(yīng)，到出現(xiàn)的沉淀不再溶解，停止流加加氨三乙酸(NTA)和氯化鐵， 繼續(xù)反應(yīng)Ih后，6000r/min離心30min，用截留相對(duì)分子質(zhì)量lOOOODalton的超濾膜超濾濃 縮，冷凍干燥。 上述方法所得香菇β-葡聚糖鐵為深棕紅色無定形粉末，可溶于水，在水中呈中 性；水解反應(yīng)，陰性，在ΡΗ7. 0左右的水溶液中不生成氫氧化鐵沉淀，其水溶液為棕紅色透 明溶液；水溶液在敞口條件下長(zhǎng)時(shí)間(IOd)暴露于空氣中，水溶液無明顯變化，粉末長(zhǎng)期 (6m)暴露于空氣中，顏色、光澤無變化，可見在水和空氣中化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定；在生理pH條件 下完全可溶，不水解，不沉淀，因而可以很好地被機(jī)體吸收利用；亞鐵氰化鉀反應(yīng)陰性(不 呈藍(lán)色，不含游離Fe3+)；鐵含量43. 9% ；HPLC法測(cè)定圖譜顯示為單一峰，GPC法測(cè)定Mr為 183122Dalton,相對(duì)分子質(zhì)量分布寬度D為1. 91 ；紅外吸收光譜，在700cm-1和ΘΙΟαιΓ1附近 有特征吸收峰。實(shí)施例6裂褶菌β -葡聚糖鐵復(fù)合物的制備。(1)堿溶性β -葡聚糖制備裂褶菌發(fā)酵液10L，固形物含量為2. 12% (w/v)，添加 固體NaOH，攪拌，使發(fā)酵液中堿濃度為0. 5mol/L，緩慢加熱至50°C，攪拌處理lh，6000r/min 離心20min，收集上清液即為堿溶性β -葡聚糖溶液；所得堿溶性β -葡聚糖提取液，不經(jīng) 過超濾、濃縮、醇沉、干燥等過程，直接用于下一步驟葡聚糖鐵的合成；(2) β -葡聚糖鐵合成將步驟⑴所得堿溶性β -葡聚糖溶液加熱至75°C，在持 續(xù)攪拌下，先連續(xù)滴加或流加檸檬酸三鈉，PH降低至9. 5時(shí)，同時(shí)流加檸檬酸三鈉和硫酸 鐵，控制檸檬酸三鈉和硫酸鐵的流加速度，自同時(shí)流加絡(luò)合劑和三價(jià)鐵化合物至整個(gè)合成 反應(yīng)結(jié)束的過程中，硫酸鐵和檬酸三鈉的摩爾比為2 3，使初始pH值控制在9. 5，同時(shí)又 使出現(xiàn)的沉淀在攪拌狀態(tài)下能迅速溶解；調(diào)節(jié)檸檬酸三鈉和硫酸鐵的流加速度，逐漸增加 檸檬酸三鈉的流速，使PH值每IOmin降低0. 2，直到pH值降低至接近7. 0，調(diào)節(jié)檸檬酸三鈉 和硫酸鐵的流加速度，使PH值穩(wěn)定控制在7. 0左右，持續(xù)進(jìn)行反應(yīng)，直到出現(xiàn)的沉淀不再溶 解，停止加入檸檬酸三鈉和硫酸鐵，繼續(xù)攪拌、保溫Ih ；(3) β -葡聚糖鐵分離純化β -葡聚糖鐵合成反應(yīng)結(jié)束后，降溫，管式離心機(jī) 10000r/min離心，去除不溶物，用截留分子量6000DaltOn的超濾膜超濾，冷凍干燥或噴霧 干燥；(4) β-葡聚糖鐵質(zhì)量測(cè)定鄰菲啰啉分光光度法測(cè)定葡聚糖鐵中的鐵含量；硫 酸-苯酚分光光度法測(cè)定葡聚糖含量用；亞鐵氰化鉀分光光度法測(cè)定游離Fe3+含量。結(jié)果顯 示，10L裂褶菌發(fā)酵液，經(jīng)上述各步驟處理，得β -葡聚糖鐵97. 34g，其中鐵含量為33. 8%，葡聚糖含量為40. 21% ；所得β -葡聚糖鐵中不含游離Fe3+。實(shí)施例7核盤菌β -葡聚糖鐵復(fù)合物的制備。 (1)堿溶性β-葡聚糖制備核盤菌發(fā)酵液10L，固形物含量為2. 67% (w/v)，添 加固體Na2CO3,攪拌，使發(fā)酵液中堿濃度為0. 5mol/L,緩慢加熱至40°C，攪拌處理lh，6000r/ min離心20min，收集上清液即為堿溶性β-葡聚糖溶液；所得堿溶性β -葡聚糖提取液，不 經(jīng)過超濾、濃縮、醇沉、干燥等過程，直接用于下一步驟葡聚糖鐵的合成；(2) β -葡聚糖鐵合成將步驟⑴所得堿溶性β -葡聚糖溶液加熱至75°C，在持 續(xù)攪拌下，先連續(xù)滴加或流加乙二胺四乙酸(EDTA)，pH降低至9. 5時(shí)，同時(shí)流加乙二胺四 乙酸(EDTA)和硝酸鐵，自同時(shí)流加絡(luò)合劑和三價(jià)鐵化合物至整個(gè)合成反應(yīng)結(jié)束的過程中， EDTA和硝酸鐵的摩爾比為2 1，控制乙二胺四乙酸和硝酸鐵的流加速度，使初始pH值控 制在9. 5，同時(shí)又使出現(xiàn)的沉淀在攪拌狀態(tài)下能迅速溶解；調(diào)節(jié)檸檬酸三鈉和硫酸鐵的流 加速度，逐漸增加檸檬酸三鈉的流速，使PH值每IOmin降低0.2，直到pH值降低至接近7.0， 調(diào)節(jié)乙二胺四乙酸(EDTA)和硝酸鐵的流加速度，使pH值穩(wěn)定控制在7.0左右，持續(xù)進(jìn)行 反應(yīng)，直到出現(xiàn)的沉淀不再溶解，停止加入乙二胺四乙酸(EDTA)和硝酸鐵，繼續(xù)攪拌、保溫 lh；(3) β -葡聚糖鐵分離純化β -葡聚糖鐵合成反應(yīng)結(jié)束后，降溫，管式離心機(jī) 8000r/min離心，去除不溶物，用截留相對(duì)分子質(zhì)量lOOOOODalton的超濾膜超濾，冷凍干燥 或噴霧干燥；(4) β-葡聚糖鐵質(zhì)量測(cè)定鄰菲啰啉分光光度法測(cè)定葡聚糖鐵中的鐵含量；硫 酸-苯酚分光光度法測(cè)定葡聚糖含量用；亞鐵氰化鉀分光光度法測(cè)定游離Fe3+含量。結(jié)果顯 示，10L核盤菌發(fā)酵液，經(jīng)上述各步驟處理，得β-葡聚糖鐵118. 0g，其中鐵含量為39. 52%, 葡聚糖含量為43. 73% ；所得β -葡聚糖鐵中不含游離Fe3+。
權(quán)利要求
一種β 葡聚糖鐵復(fù)合物，其特征在于其重均相對(duì)分子質(zhì)量Mr為5 20萬Dalton，相對(duì)分子質(zhì)量分布寬度D為1.0 3.0，鐵含量為10 50％(w/w)；所述β 葡聚糖為真菌來源的β 葡聚糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葡聚糖鐵復(fù)合物，其特征在于所述真菌來源，是由去除 了菌絲體的真菌菌絲體發(fā)酵液或包含菌絲體的真菌菌絲體發(fā)酵液或去除了發(fā)酵液的真菌 菌絲體為來源的；或真菌子實(shí)體為來源的；所述的真菌為小菌核菌屬真菌或核盤菌或雜色 云芝或裂褶菌或香菇。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的β-葡聚糖鐵復(fù)合物，其特征在于所述的β -葡聚糖包括 中性β-葡聚糖或酸性β-葡聚糖或中性蛋白聚糖或酸性蛋白聚糖或其混合物；其中，中性 蛋白聚糖和酸性蛋白聚糖中的糖均為β-葡聚糖。
4.制備如權(quán)利要求1所述的β-葡聚糖鐵復(fù)合物的方法，其步驟如下(1)β-葡聚糖制備向完成發(fā)酵的菌絲體發(fā)酵液直接加入堿并加熱至10-60°C，攪拌 處理l_3h提取β-葡聚糖；或?qū)㈩A(yù)處理過的菌絲體或子實(shí)體加入堿并加熱提取獲得葡 聚糖；所述的預(yù)處理為將菌絲體或子實(shí)體經(jīng)脫脂、水提去除脂溶物和雜多糖；(2)β -葡聚糖鐵的合成將步驟(1)所得β -葡聚糖溶液加熱至50-100°C，先連續(xù)滴 加或流加絡(luò)合劑，PH降低至9. 5時(shí)，再同時(shí)滴加或流加絡(luò)合劑和三價(jià)鐵化合物；通過控制絡(luò) 合劑流加速度和加入量，控制PH在9. 5-7. 0的范圍內(nèi)，持續(xù)進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)；(3)β-葡聚糖鐵的純化超濾濃縮脫鹽，冷凍干燥、噴霧干燥或醇沉后真空干燥。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的葡聚糖鐵復(fù)合物的制備方法，其特征在于步驟(1) β -葡聚糖制備所用的向完成發(fā)酵的菌絲體發(fā)酵液直接加入的堿為固體NaOH或KOH或 Na2CO3，添加堿固體后，整個(gè)溶液中的堿濃度為0. 01-0. 25mol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的葡聚糖鐵復(fù)合物的制備方法，其特征在于步驟(2)中 所述的絡(luò)合劑選用酸性絡(luò)合劑，選自檸檬酸、檸檬酸三鈉、檸檬酸三鉀、酒石酸鉀鈉、焦磷酸 鈉、蘋果酸、乳酸、草酸、乙二胺四乙酸、環(huán)己二胺四乙酸、二乙三胺五乙酸或氨三乙酸中的 一種或數(shù)種。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的葡聚糖鐵復(fù)合物的制備方法，其特征在于通過調(diào)節(jié)酸 性絡(luò)合劑的加入速度和用量，控制反應(yīng)過程中PH值從ρΗ9. 5逐漸向pH7. 0連續(xù)變化，并控 制在ρΗ7. 0-9. 5之間。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的葡聚糖鐵復(fù)合物的制備方法，其特征在于所述的步驟 (2)中三價(jià)鐵化合物選自氯化鐵或硫酸鐵或硝酸鐵或磷酸鐵或醋酸鐵。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的β-葡聚糖鐵復(fù)合物的制備方法，其特征在于步驟⑴所 得的葡聚糖提取液直接用于步驟(2)中。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的葡聚糖鐵復(fù)合物的制備方法，其特征在于步驟(2)中 同時(shí)滴加或流加絡(luò)合劑和三價(jià)鐵化合物時(shí)起至整個(gè)合成反應(yīng)完成，三價(jià)鐵化合物與絡(luò)合劑 總用量的摩爾比為2 η，其中η= 1-5之間的整數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域和食品醫(yī)藥領(lǐng)域，具體提供了一種利用真菌β-葡聚糖為配體化合物，以三價(jià)鐵為配位中心離子制備的β-葡聚糖鐵及其制備方法，所制備的β-葡聚糖鐵復(fù)合物含鐵量高，水溶性好，不含游離鐵離子，體外環(huán)境中穩(wěn)定，體內(nèi)通過胃酸作用，解離出Fe3+被人體吸收，在體內(nèi)被還原成Fe2+利用，同時(shí)解離出的β-葡聚糖進(jìn)而發(fā)揮其提高機(jī)體免疫力和生血活血的協(xié)同補(bǔ)血功效，因此β-葡聚糖鐵絡(luò)合物同時(shí)具有補(bǔ)鐵補(bǔ)血和免疫調(diào)節(jié)的雙重功效。
文檔編號(hào)C08B37/02GK101967205SQ20101050385
公開日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2010年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月12日
發(fā)明者徐澤平, 王寶琴 申請(qǐng)人:濱州學(xué)院;王寶琴