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一種β-葡聚糖鐵復(fù)合物及其制備方法

文檔序號(hào):3691054閱讀:628來源:國(guó)知局
專利名稱:一種β-葡聚糖鐵復(fù)合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種具有免疫調(diào)節(jié)功能的補(bǔ)鐵制劑的制備方法,具體是利用真菌來源 的葡聚糖制備高價(jià)鐵葡聚糖復(fù)合物作為補(bǔ)鐵制劑,屬營(yíng)養(yǎng)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)
傳統(tǒng)治療缺鐵性貧血(Iron-deficiency Anemia, IDA)的藥物為各種亞鐵鹽制劑, 如無機(jī)鐵劑硫酸亞鐵控釋片、可溶性有機(jī)絡(luò)合鐵劑琥珀酸亞鐵、富馬酸鐵、葡萄糖酸鐵等, 游離的亞鐵離子刺激胃腸,造成惡心、嘔吐、腹瀉、便秘等消化道不良反應(yīng),且二價(jià)鐵制劑易 產(chǎn)生內(nèi)源性自由基,導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化而造成細(xì)胞膜損傷。注射型補(bǔ)鐵劑右旋糖酐鐵 (葡聚糖鐵,F(xiàn)e-Dextran)、山梨醇鐵,通過深部肌肉注射,解決了刺激胃腸,不利于消化吸收 的問題,但可引起局部疼痛,蕁麻疹、發(fā)熱、頭痛、關(guān)節(jié)疼痛、惡心、哮喘等,有部分病人發(fā)生 過敏反應(yīng)和其他過敏性副反應(yīng)。靜脈注射型鐵劑氫氧化鐵蔗糖復(fù)合物通過靜脈輸液治療腎 衰病人的缺鐵性貧血,由于蔗糖鐵不含右旋糖酐,發(fā)生過敏反應(yīng)較少,并且?guī)缀跬耆ㄟ^網(wǎng) 狀內(nèi)皮系統(tǒng)攝取,不沉積在肝內(nèi),從而避免了肝損傷。另一類補(bǔ)鐵劑為鐵-蛋白絡(luò)合物,在胃內(nèi)酸堿度小于4即酸性時(shí),鐵離子受蛋白膜 的保護(hù)而不同胃液中的鹽酸和胃蛋白酸發(fā)生反應(yīng),所以不會(huì)造成胃粘膜損傷,大大提高對(duì) 鐵質(zhì)的耐受性。而在腸腔堿性環(huán)境下(酸堿度7. 5至8)鐵-蛋白絡(luò)合物重新變得可溶,使 蛋白膜為胰蛋白酶所消化而釋放出鐵離子,鐵離子可迅速地在腸絨毛內(nèi)高度被吸收,使療 效大大提高。但是該制劑實(shí)際上是用蛋白膜包覆的琥珀酸鐵,同樣具有其他二價(jià)鐵制劑存 在的上述缺陷。多糖類物質(zhì)的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制被全面揭示之后,以三價(jià)鐵(Fe3+)為核心,多糖 為配合物的復(fù)合鐵制劑成為新的口服補(bǔ)鐵劑,以力蜚能(Mferex)為代表的多糖鐵復(fù)合物 (PIC)制劑迅速在臨床上廣泛應(yīng)用起來,并成為國(guó)內(nèi)補(bǔ)鐵劑市場(chǎng)的主流產(chǎn)品。此類多糖鐵制 劑中的多糖來源于細(xì)菌腸膜明串珠菌的發(fā)酵產(chǎn)物,多糖組分為吡喃型葡萄糖單體構(gòu)成的葡 聚糖,糖苷鍵的95%是a-l,6_D-鍵型,其余為α _1,3-D和其他鍵型。該多糖的結(jié)構(gòu)與右 旋糖酐完全相同,所不同的是分子量更低,實(shí)際為低分子量右旋糖酐。多糖與高價(jià)鐵配合生成的多糖鐵復(fù)合物,用于IDA的治療,不僅具有較理想的穩(wěn) 定性、水溶性和吸收率等,釋放鐵后又繼續(xù)發(fā)揮多糖的免疫促進(jìn)功能,是一種較理想的補(bǔ)鐵 制劑,具有副作用小、配合性穩(wěn)定、溶解度好,含鐵量高的優(yōu)點(diǎn)。多糖鐵中的多糖成分刺激紅 細(xì)胞生成、促進(jìn)造血母細(xì)胞和多能造血干細(xì)胞的增殖和分化、從而提高機(jī)體的造血水平,因 此又是良好的造血促進(jìn)劑。目前比較有臨床應(yīng)用前景的多糖鐵制劑有當(dāng)歸多糖鐵、淮山藥多糖鐵和人參多糖 鐵,均為具有補(bǔ)血作用或免疫調(diào)節(jié)作用的中藥材提取的多糖與鐵制備的復(fù)合物,旨在發(fā)揮 中藥和鐵的雙重補(bǔ)血活血作用。但植物來源的多糖多為各種單糖構(gòu)成的雜多糖,其中,具有 免疫調(diào)節(jié)作用的活性成分葡聚糖的含量較低,多糖與鐵的協(xié)同作用難以充分發(fā)揮。現(xiàn) 有用于藥品或功能食品的真菌多糖多為水提取物,雖然葡聚糖含量有所提高,但同樣存在含有雜多糖和分子量巨大的問題,若以此為原料制備多糖鐵復(fù)合物,其結(jié)果與植物多 糖類似存在較大的缺陷。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題,本發(fā)明提供了一種利用堿溶性真菌β-葡聚 糖為配體化合物,以三價(jià)鐵為配位中心離子制備的葡聚糖鐵及其制備方法,所制備的 β-葡聚糖鐵復(fù)合物(β-Glucan Iron Complex, β -GIC)含鐵量高,水溶性好,不含游離鐵 離子,體外環(huán)境中穩(wěn)定,體內(nèi)通過胃酸作用,解離出Fe3+被人體吸收,在體內(nèi)被還原成Fe2+利 用,同時(shí)解離出的葡聚糖進(jìn)而發(fā)揮其提高機(jī)體免疫力和生血活血的協(xié)同補(bǔ)血功效。因 此β _葡聚糖鐵絡(luò)合物同時(shí)具有補(bǔ)鐵補(bǔ)血和免疫調(diào)節(jié)的雙重功效。本發(fā)明所述的一種β-葡聚糖鐵復(fù)合物,其重均相對(duì)分子質(zhì)量Μ,為5-20萬 Dalton,對(duì)分子質(zhì)量分步寬度D為1.0-3.0,鐵含量為10-50% (w/w);所述β-葡聚糖為由 真菌來源提取的β-葡聚糖。與現(xiàn)有各種多糖鐵復(fù)合物相比,本發(fā)明的最大不同就是采用了以真菌為來源提取 的葡聚糖作為配體化合物來進(jìn)行復(fù)合制備多糖鐵,且所制備的多糖鐵為葡聚糖鐵 復(fù)合物,使葡聚糖的免疫調(diào)節(jié)作用得到了更好的發(fā)揮,同時(shí)兼顧了與三價(jià)鐵的協(xié)同作 用,提供了 一種高價(jià)鐵葡聚糖復(fù)合物。所述真菌來源,是由去除了菌絲體的真菌菌絲體發(fā)酵液或包含菌絲體的真菌菌絲 體發(fā)酵液或去除了發(fā)酵液的真菌菌絲體為來源的;或真菌子實(shí)體為來源的;優(yōu)選采用不去 除菌絲體的發(fā)酵液,除此之外,還可以采用去除發(fā)酵液的鮮菌絲體為來源,菌絲體為鮮菌絲體,避免了 發(fā)酵后處理中對(duì)菌絲體的洗滌、干燥和粉碎等過程,既降低能耗,又使工藝過程連貫;一般 來講,可以根據(jù)菌種的選擇來確定采用哪種來源,如產(chǎn)胞外多糖的真菌(如小核菌、核盤 菌、云芝、裂褶菌)采用不去除菌絲體的發(fā)酵液為好,去除菌絲體的發(fā)酵液次之;只產(chǎn)胞內(nèi) 多糖的香菇則采用去除發(fā)酵液的鮮菌絲體為好。本發(fā)明所述的β-葡聚糖為真菌β-葡聚糖,該真菌β-葡聚糖中包括了同一來 源的β-葡聚糖蛋白復(fù)合物,或稱蛋白聚糖。無論是β-葡聚糖還是β-葡聚糖蛋白復(fù)合 物(蛋白聚糖)均包含中性β-葡聚糖、酸性β-葡聚糖和中性蛋白聚糖、酸性蛋白聚糖, 其中,中性蛋白聚糖和酸性蛋白聚糖中的糖均為β-葡聚糖。制備β-葡聚糖的真菌包括 小菌核菌屬真菌(Sclerotium spp.),又稱小核菌屬真菌,還包括雜色云芝(Polystictus versicolor),核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum),裂裙菌(Schizophyllum commune)禾口 香菇(Lentinula edodes)。各菌種均通過商業(yè)途徑購(gòu)買獲得,來源如下小菌核菌,保藏于 中國(guó)藥用微生物菌種保藏中心,菌種保藏號(hào)為CPCC 400357 ;核盤菌,保藏于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生 物菌種保藏管理中心,保藏號(hào)ACCC 36079 ;雜色云芝,保藏于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管 理中心,保藏號(hào)ACCC 50435 ;裂褶菌,保藏于中國(guó)林業(yè)微生物菌種保藏中心,菌種保藏號(hào)為 CFCC 82020 ;香菇,保藏于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心,菌種保藏號(hào)為ACCC 50066。除了通過發(fā)酵的方法先制備發(fā)酵液或菌絲體,再制備β-葡聚糖外,還可以市售 的云芝、裂褶菌和香菇的子實(shí)體為原料制備葡聚糖。之所以采用上述的真菌作為來源,是因?yàn)檫@些真菌多糖的特殊結(jié)構(gòu),決定了其具有特殊的理化特性以及特殊的生物活性和生理功能,具體說明如下小核菌葡聚糖是由小菌核菌屬(Sclerotium spp.)真菌產(chǎn)生的胞外多糖,又稱硬 葡聚糖(Scleroglucan),是通過液體發(fā)酵培養(yǎng)菌絲體和發(fā)酵液中制備而來。 小核菌葡聚糖呈線性結(jié)構(gòu),由D-吡喃葡萄糖通過β -1,3-D-糖苷鍵相連形成主 鏈,再與單個(gè)D-吡喃葡萄糖單位以i3-l,6-D-糖苷鍵相連形成支鏈。硬葡聚糖在冷熱水中 均可溶解,溶液具有很高的假塑性,不受溫度、PH和電解質(zhì)變化的影響,穩(wěn)定性也強(qiáng)。在發(fā) 酵時(shí)多糖的分子量受條件的影響較小。此聚合物與水的結(jié)合性、穩(wěn)定性、黏稠性和懸浮性特 性良好。小核菌葡聚糖本身具有重要的免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤、抗病毒、抗感染等功效,具有 明顯的抗補(bǔ)體活性和促進(jìn)巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞增殖的作用,對(duì)提高機(jī)體免疫力具有重要的 作用。小核菌葡聚糖可大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn),原料易得、工藝成熟、成本低廉,易于工業(yè)化生產(chǎn), 對(duì)其進(jìn)行衍生化生成的葡聚糖糖鐵復(fù)合物是一種新型補(bǔ)鐵制劑。核盤菌葡聚糖為核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)產(chǎn)生的胞外多糖(SSG),也 是以i3-l,6_D-葡聚糖分支的i3-l,3_D-葡聚糖,結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與小核菌葡聚糖非常相似,但 相對(duì)分子質(zhì)量要高很多,一般在80萬Dalton以上,在水中溶解緩慢,粘度較高,并具有良好 的流變學(xué)性質(zhì),其特性粘度幾乎不隨離子強(qiáng)度的變化而改變,在PHI. 8-12. 3之間,特性粘 度值變化不顯著,但當(dāng)PH值為13. 32時(shí),由于分子構(gòu)象的變化導(dǎo)致特性粘度值急驟下降。溫 度< 90°C和熱處理對(duì)SSG溶液的表觀粘度影響不大??纱笠?guī)模發(fā)酵生產(chǎn),原料易得、工藝 成熟、成本低廉,易于工業(yè)化生產(chǎn),核盤菌葡聚糖具有潛在的免疫調(diào)節(jié)活力和較強(qiáng)的抑瘤作 用。云芝、裂褶菌和香菇提取的β -葡聚糖均具有和小核菌葡聚糖相似的結(jié)構(gòu)和功 能。以雜色云芝(Polystictus versicolor)、裂裙菌(Schizophyllum commune)禾口香 (Lentinula edodes)為原料制取的β _葡聚糖或糖肽(β _葡聚糖與小分子蛋白結(jié)合的蛋 白聚糖)是目前已應(yīng)用于臨床的葡聚糖藥物,用于抗病毒、增強(qiáng)免疫力和腫瘤輔助治療。由上可知,選擇上述的多種真菌作為β-葡聚糖的來源,有著優(yōu)異的效果,可以獲 得具有較高品質(zhì)的葡聚糖。制備上述β -葡聚糖鐵復(fù)合物的方法,其步驟如下(1)堿溶性β -葡聚糖制備將完成發(fā)酵的菌絲體發(fā)酵液直接用堿在加熱條件下攪拌提取β -葡聚糖;或?qū)㈩A(yù) 處理過的菌絲體加入堿后加熱提取獲得β “葡聚糖,所述的預(yù)處理為將菌絲體經(jīng)脫脂、水 提去除脂溶物和雜多糖;還可以將子實(shí)體經(jīng)脫脂、水提去除脂溶物和雜多糖,再經(jīng)堿提取獲 得β _葡聚糖;(2) β-葡聚糖鐵的合成將步驟(1)所得堿溶性β _葡聚糖溶液加熱至50-10(TC,在攪拌條件下,先連續(xù)滴 加或流加絡(luò)合劑,PH降低至9. 5時(shí),再同時(shí)滴加絡(luò)合劑和三價(jià)鐵化合物,同時(shí)滴加或流加絡(luò) 合劑和三價(jià)鐵化合物時(shí)起至整個(gè)合成反應(yīng)完成,三價(jià)鐵化合物與絡(luò)合劑總用量的摩爾比為 2 n,其中η= 1-5之間的整數(shù);通過控制絡(luò)合劑的滴加速度和加入量控制pH在7.0-9.5 的范圍內(nèi),從PH9. 5逐漸向pH7. O變化,持續(xù)進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng),即可獲得β -葡聚糖鐵復(fù)合物;
(3) β -葡聚糖鐵分離純化β -葡聚糖鐵合成反應(yīng)結(jié)束后,降溫,管式離心機(jī) 6000-14000r/min離心,去除不溶物,用截留相對(duì)分子質(zhì)量6000-100000Dalton的超濾膜超 濾濃縮,冷凍干燥或噴霧干燥;制備方法中,步驟(1)中所述用于制備堿溶性β _葡聚糖的菌絲體發(fā)酵液,是去除 或不去除菌絲體的發(fā)酵液,優(yōu)選不去除菌絲體的發(fā)酵液,用其制備葡聚糖的方法是添 加固堿,使發(fā)酵液的最終堿濃度為0. 01-0. 25mol/L,所用固體堿為NaOH或KOH或Na2CO3,在 溫度為10-60°C下攪拌處理l_3h,離心,收集上清液即為堿溶性β-葡聚糖溶液; 或者是用去除發(fā)酵液的鮮菌絲體按照順序進(jìn)行脫脂、水提和堿提,其中乙醇脫脂, 所用乙醇濃度為70-95%,用量為菌絲體量的10-30倍(v/w),以浸沒菌絲體為準(zhǔn);脫脂過程 去除了其中的脂類和類脂和其他醇溶性成分,同時(shí)去除部分單糖、多肽等雜質(zhì);熱水提取溫 度為90-100°C,目的是將水溶性多糖、低聚糖和單糖去除,所去除的多糖中的主要成分為各 種雜多糖,包括不同單糖組成的雜多糖和α-糖苷鍵連接的多糖;堿提取所用的堿為NaOH 或KOH或Na2CO3溶液,濃度為0. 1-2. 5mol/L,用量為菌絲體量的10-30倍(v/w),該步驟所 得多糖均為β-葡聚糖,該β-葡聚糖為含蛋白或不含蛋白的葡聚糖,含蛋白的β-葡聚糖 又稱為蛋白聚糖,HPLC檢測(cè)顯示為成分均一組分,且GPC法測(cè)定其中葡聚糖的相對(duì)分 子質(zhì)量介于5-20萬Dalton范圍內(nèi),相對(duì)分子質(zhì)量分布寬度介于1. 0-3. 0之間;更重要的 是,堿溶性β-葡聚糖溶液中保留了中性β-葡聚糖,也保留了堿溶的酸性β-葡聚糖,使 β-葡聚糖的得率大大提高;所得堿溶性β-葡聚糖提取液,不經(jīng)過濃縮、超濾、醇沉、干燥 等過程,直接用于下一步驟葡聚糖鐵的合成;之所以這樣操作,主要是減少能耗和有機(jī) 溶劑的污染,同時(shí)減少中間環(huán)節(jié),更重要的是堿提取的β -葡聚糖提取液本身PH值大于12, 高于多糖鐵復(fù)合物制備所需PH值,因此進(jìn)行下一步葡聚糖鐵合成時(shí),無需再用堿調(diào)PH值, 而需要用酸性物質(zhì)向PH降低方向調(diào)節(jié);步驟(1)制備堿溶性葡聚糖的方法中,還可采用以市售干燥子實(shí)體或其粉末 為原料,按照上述菌絲體制備制備堿溶性β “葡聚糖的過程進(jìn)行,可得到子實(shí)體來源的堿 溶性葡聚糖;與菌絲體為原料不同的是,脫脂過程中使用的乙醇的濃度和用量有變化, 一般控制在乙醇的濃度為60-80% (ν/ν),用量為子實(shí)體粉末的10-20倍(v/w);而步驟(1) 中所提及的發(fā)酵均為現(xiàn)有的發(fā)酵技術(shù),不再贅述。上述步驟(2)所述用于β -葡聚糖鐵合成的配體化合物,是將步驟(1)中所獲得 的含有β-葡聚糖或含β-葡聚糖的蛋白聚糖堿溶液加熱到50-100°C,以利于充分溶解, 并為下一步的合成反應(yīng)提供條件;在攪拌條件下(10-40r/min),向溶液中滴加或緩慢流加 絡(luò)合劑,調(diào)節(jié)反應(yīng)的初始PH值至9. 5,再同時(shí)滴加三價(jià)鐵化合物溶液,通過同時(shí)連續(xù)滴加或 流加絡(luò)合劑和三價(jià)鐵化合物,使絡(luò)合反應(yīng)在均相液體中進(jìn)行;同時(shí)滴加或流加絡(luò)合劑和三 價(jià)鐵化合物時(shí)起至整個(gè)合成反應(yīng)完成,三價(jià)鐵化合物與絡(luò)合劑總用量的摩爾比為2 n,其 中η = 1-5之間的整數(shù);絡(luò)合劑優(yōu)選采用酸性絡(luò)合劑,酸性絡(luò)合劑的加入,使溶液ρΗ值不 斷下降,通過控制流加速度和加入的量,可使溶液PH值穩(wěn)定在一定范圍內(nèi),使絡(luò)合反應(yīng)得 以在ρΗ7. 0-9.5的范圍內(nèi)進(jìn)行;期間,ρΗ值控制為連續(xù)均勻變化,反應(yīng)開始的ρΗ值控制在 9. 5左右,以提高β -葡聚糖的溶解性(以不出現(xiàn)持續(xù)沉淀為指標(biāo)),隨絡(luò)合反應(yīng)的持續(xù)進(jìn) 行,逐漸降低PH值,最終控制在pH7. 0以上,但低于ρΗ9. 0,直到出現(xiàn)的沉淀不再溶解,停止 流加反應(yīng)物,終止反應(yīng),繼續(xù)保溫lh。由于原溶液為堿性溶液,ρΗ值大于12,而葡聚糖鐵的絡(luò)合反應(yīng)又必需在中性偏堿的范圍內(nèi)進(jìn)行,所以,不同于其他方法,該過程中所用的PH調(diào) 節(jié)劑為酸性絡(luò)合劑,也就是說,反應(yīng)物中的酸性絡(luò)合劑本身就兼有PH值調(diào)節(jié)劑的功能;上述的酸性絡(luò)合劑為檸檬酸、檸檬酸三鈉鹽、酒石酸、酒石酸鉀鈉、焦磷酸鈉鹽、蘋 果酸、乳酸、草酸、EDTA環(huán)己二胺四乙酸(⑶TA)、二乙三胺五乙酸(DTPA)或氨三乙酸(NTA)、 亞硝基三乙酸鈉中的一種或數(shù)種。

與絡(luò)合劑同時(shí)流加的配位中心離子鐵供體為三價(jià)鐵化合物,具體為氯化鐵、硫酸 鐵、硝酸鐵、磷酸鐵、醋酸鐵中的一種。為了達(dá)到更好的效果,一般經(jīng)過上述兩步處理后,將步驟(2)所獲得的β-葡 聚糖鐵復(fù)合物進(jìn)一步純化,具體的分離方法,不同于其他用乙醇沉淀的方法,該步驟通過 離心去除步驟(2)所獲得的β-葡聚糖鐵復(fù)合物溶液中的不溶物后,用截留相對(duì)分子質(zhì) 量6000-100000Dalton的超濾膜超濾濃縮,同時(shí)脫鹽,去除6000-100000Dalton以下相 對(duì)分子質(zhì)量的小分子物質(zhì)。未反應(yīng)完全的鐵化合物(游離Fe3+)、反應(yīng)過程中新生成的鹽 或其他化合物,均通過超濾脫除。由于堿提取的葡聚糖和蛋白聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量 均小于20萬Dalton(趙峽等.藥物分析雜志.2007,27 (8) :1143_1146),因此,僅通過 6000-100000Dalton的超濾膜一次超濾濃縮即可,使所得葡聚糖鐵復(fù)合物的分子量控制在 5-20萬Dalton的范圍內(nèi)。對(duì)截留的濃縮液部分進(jìn)行冷凍干燥或噴霧干燥或40-60°C以下 低溫真空干燥,即得棕紅色葡聚糖鐵粉末。所得葡聚糖鐵溶解性能和產(chǎn)量均大大提高。為了檢測(cè)上述獲得的葡聚糖鐵的性能,所得經(jīng)過超濾后獲得的β -葡聚糖鐵中的 葡聚糖含量采用硫酸_苯酚分光光度法測(cè)定;游離Fe3+采用亞鐵氰化鉀分光光度法測(cè)定; 葡聚糖鐵中的鐵含量采用鄰菲啰啉分光光度法測(cè)定。鄰菲啰啉(鄰二氮雜菲)分光光度法測(cè)定鐵含量的原理鄰菲啰啉(鄰二氮雜菲) 在ρΗ值為2-9的溶液中與二價(jià)鐵離子生成穩(wěn)定的紅色配合物。該反應(yīng)中鐵必須是亞鐵狀 態(tài),因此顯色前還要加入還原劑(如鹽酸羥胺、抗壞血酸)。紅色配合物的最大吸收波長(zhǎng)為 510nm。具體測(cè)定步驟為標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制鐵(II)標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制精密稱取硫酸亞鐵胺 (Fe (NH4)2(SO4)2 · 6H20) 0. 70253g,溶于少量蒸餾水,移入IOOOmL量瓶中,加3mL鹽酸,用蒸 餾水定容至刻度,冷藏備用。鐵(II)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制(使用時(shí)現(xiàn)配)吸取10. OmL鐵(II)標(biāo)準(zhǔn)貯備液,移入 IOOmL量瓶中,用蒸餾水定容至刻度。取8個(gè)50mL量瓶,分別加入鐵(II)標(biāo)準(zhǔn)使用液0.0、 2. 0,4. 0,6. 0,8. 0,10. 0,12. 0,14. OmL,再分別加入10%抗壞血酸水溶液2. OmL,鄰菲啰啉 水溶液2. 5mL,用蒸餾水定容,搖勻。放入水浴鍋中在37°C下反應(yīng)lOmin,于510nm處測(cè)定吸 光度。計(jì)算出線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)合兩個(gè)現(xiàn)有專利技術(shù)已說明本發(fā)明的技術(shù)進(jìn)步(1)專利CN1147322C中其所做的努力旨在盡可能地降低配體化合物葡聚糖的分 子量和盡可能地取出產(chǎn)物中的極低相對(duì)分子質(zhì)量的低聚糖。此過程須經(jīng)多步酶解、修飾、超 濾、納濾處理,過程復(fù)雜而費(fèi)時(shí),制備成本巨大。這對(duì)用于注射給藥的補(bǔ)鐵劑來說是必須的, 因?yàn)楦叻肿恿康钠暇厶强赡軐?dǎo)致過敏反應(yīng)和其他過敏性副作用,如休克、呼吸困難等。但對(duì) 于口服途徑即腸道吸收的補(bǔ)鐵劑,主要解決其刺激性問題和在腸道中的吸收利用問題,而 在上述的專利中并沒有提出明確的解決方案;
而本方法制備的β -葡聚糖鐵的鐵與上述的對(duì)比文件含量相當(dāng),但β “葡聚糖的 相對(duì)分子質(zhì)量要大很多,同時(shí)含有結(jié)合蛋白的β “葡聚糖更容易通過胃液或消化液屏障而 更好地保存其多糖的免疫調(diào)節(jié)功能。與現(xiàn)有技術(shù)相比,過程相對(duì)簡(jiǎn)單,步驟少,且與傳統(tǒng)方 法相比,中間過程物沉淀、干燥處理,大大簡(jiǎn)化了工藝步驟。本方法合成的葡聚糖鐵中 的含鐵量完全能夠滿足特殊條件下的補(bǔ)鐵需求,同時(shí),由于含有大分子β “葡聚糖,更易于 形成螺旋形空間立體結(jié)構(gòu),對(duì)人體具有更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)能力,與鐵協(xié)同發(fā)揮生血活血的作 用更強(qiáng)。(2)CN100362021C中使用水溶性山藥多糖為配體化合物,由于山藥多糖為雜合 多糖,溶液中難于形成三重螺旋空間構(gòu)型,加之水提取多糖相對(duì)分子質(zhì)量范圍很大,20萬 Dalton以上相對(duì)分子質(zhì)量的多糖比例高,造成水中溶解度低;

而本發(fā)明除采用鮮菌絲體以減少干燥過程,最大的優(yōu)勢(shì)就是節(jié)約了能源消耗,同 時(shí)減少了中間步驟環(huán)節(jié),此外,以堿提取的過程獲得的是不含雜多糖而只含葡聚糖的 單一組分葡聚糖,更進(jìn)一步地,對(duì)堿提取的葡聚糖不做中和、醇沉、干燥等處理,進(jìn)行不 溶物分離后,直接用于葡聚糖鐵的合成,這樣做的目的,第一是獲得單純適宜相對(duì)分子質(zhì)量 的構(gòu)型的葡聚糖,第二是使所得葡聚糖的溶解度大大提高,第三,同樣是為了節(jié)約 能耗,減少并降低有機(jī)溶劑的使用。另一方面,現(xiàn)有技術(shù)中的雜多糖作為配體化合物參與絡(luò) 合反應(yīng)時(shí),由于有效多糖的濃度較低,所形成的多糖鐵復(fù)合物中的多糖含量也低,因此山藥 多糖鐵在釋放鐵離子后,多糖本身難以發(fā)揮其固有的生理活性。與之相比,本發(fā)明的葡 聚糖鐵復(fù)合物具有顯而易見的優(yōu)勢(shì)。臨床應(yīng)用的葡聚糖鐵主要為右旋糖酐鐵,其多糖為α-糖苷鍵構(gòu)型的葡聚糖。本 發(fā)明的葡聚糖多糖鐵是由葡聚糖在一定條件下與三價(jià)鐵離子形成的絡(luò)合物,體外環(huán)境 中穩(wěn)定,在腸胃環(huán)境中通過胃酸作用,解離出Fe3+被人體吸收,在體內(nèi)被還原成Fe2+利用, 達(dá)到補(bǔ)鐵補(bǔ)血的目的;同時(shí)解離出的葡聚糖進(jìn)而發(fā)揮其提高機(jī)體免疫力的功效。因此 β-葡聚糖鐵絡(luò)合物同時(shí)具有補(bǔ)鐵補(bǔ)血和免疫調(diào)節(jié)的雙重功效。以β-葡聚糖與高價(jià)鐵配 合生成的葡聚糖多糖鐵復(fù)合物,可望成為一種新型的、具有協(xié)同補(bǔ)血作用的補(bǔ)鐵劑,既可發(fā) 揮高價(jià)鐵補(bǔ)鐵、治療缺鐵性貧血的作用,又可發(fā)揮β “葡聚糖的免疫調(diào)節(jié)和生血活血的活 性。
具體實(shí)施例方式下面以具體實(shí)施例進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)行說明。本發(fā)明所涉及的內(nèi)容包含但 不限于如下具體實(shí)施例。實(shí)施例1小核菌堿溶性β-葡聚糖的制備。小核菌發(fā)酵液10L,固形物含量為4. 2% (w/ ν),添加固體NaOH,攪拌,使發(fā)酵液中堿濃度為1. 5mol/L,緩慢加熱至45°C,攪拌處理lh, 6000r/min離心20min,收集上清液即為堿溶性β -葡聚糖溶液。實(shí)施例2香菇發(fā)酵液6L,板框壓濾濾除發(fā)酵液,得濕菌體920g,加入適量95 %的乙醇,使 菌絲體充分淹沒,攪拌均勻后靜置4-8h,壓濾,收集脫脂液,濾餅中加入15倍(ν/ν)蒸餾 水,加熱至微沸,攪拌、保溫3h,趁熱壓濾,去除水提取液;濾餅中加入濃度為0. 1-2. 5mol/L(0.4% -10% )的KOH,加熱至60°C,攪拌、保溫lh,壓濾或離心,收集濾液,即為堿溶性 β-葡聚糖溶液。所得堿溶性β -葡聚糖提取液,不經(jīng)過超濾、濃縮、醇沉、干燥等過程,直接用于下 一步驟β-葡聚糖鐵的合成。實(shí)施例3云芝子實(shí)體堿溶性β -葡聚糖的制備。

云芝干燥子實(shí)體粉末(80目)lKg,加入12倍(v/w) 80 %的乙醇,攪拌均勻后靜置 6-12h,期間,攪拌數(shù)次,壓濾,收集脫脂液,濾餅中加入20倍(ν/ν)蒸餾水,加熱至微沸,攪 拌、保溫2h,趁熱壓濾,去除水提取液;濾餅中加入濃度為0. 1-2. 5mol/L(0. 4% -10% )的 Na2CO3,加熱至40°C,攪拌、保溫lh,壓濾,收集濾液,即為堿溶性β-葡聚糖溶液。所得堿溶性β -葡聚糖提取液,不經(jīng)過超濾、濃縮、醇沉、干燥等過程,直接用于下 一步驟β-葡聚糖鐵的合成。實(shí)施例4小核菌β -葡聚糖鐵復(fù)合物的制備。(1)堿溶性β -葡聚糖制備小核菌發(fā)酵液10L,固形物含量為3. 78% (w/v),添加 固體Κ0Η,攪拌,使發(fā)酵液中堿濃度為lmol/L,緩慢加熱至30°C,攪拌處理2h,6000r/min離 心20min,收集上清液即為堿溶性β -葡聚糖溶液;(2) β -葡聚糖鐵合成將步驟⑴所得堿溶性β -葡聚糖溶液加熱至80°C,在持 續(xù)攪拌下,先連續(xù)滴加或流加酒石酸,PH降低至9. 5時(shí),同時(shí)流加酒石酸和氯化鐵溶液,自 同時(shí)流加絡(luò)合劑和三價(jià)鐵化合物至整個(gè)合成反應(yīng)結(jié)束的過程中,氯化鐵與酒石酸的摩爾比 為2 2,控制酒石酸和氯化鐵的流加速度,使初始pH值控制在9. 5,同時(shí)又使出現(xiàn)的沉淀 在攪拌狀態(tài)下能迅速溶解;調(diào)節(jié)酒石酸和氯化鐵的流加速度,逐漸增加酒石酸的流速,使 pH值每IOmin降低0. 2,直到pH值降低至接近7. 0,調(diào)節(jié)酒石酸和氯化鐵的流加速度,使pH 值穩(wěn)定控制在7. 0左右,持續(xù)進(jìn)行反應(yīng),直到出現(xiàn)的沉淀不再溶解,停止加入酒石酸和氯化 鐵,繼續(xù)攪拌、保溫Ih;(3) β -葡聚糖鐵分離純化β -葡聚糖鐵合成反應(yīng)結(jié)束后,降溫,管式離心機(jī) 14000r/min離心,去除不溶物,用截留相對(duì)分子質(zhì)量50000DaltOn的超濾膜超濾,60°C真空 干燥或噴霧干燥;(4) β-葡聚糖鐵質(zhì)量測(cè)定鄰菲啰啉分光光度法測(cè)定葡聚糖鐵中的鐵含量;硫 酸_苯酚分光光度法測(cè)定葡聚糖含量;亞鐵氰化鉀分光光度法測(cè)定游離Fe3+離子;HPLC法 測(cè)定成分均一性;GPC法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量Mr和相對(duì)分子質(zhì)量分布寬度D。結(jié)果顯示,IOL 小核菌發(fā)酵液,經(jīng)上述各步驟處理,得β _葡聚糖鐵113. 6g,其中鐵含量為32. 45%,葡聚糖 含量為48. 78% ;HPLC法測(cè)定圖譜顯示為單一峰,GPC法測(cè)定Mr為173640DaltOn,相對(duì)分子 質(zhì)量分布寬度D為1. 73 ;所得β -葡聚糖鐵溶液與亞鐵氰化鉀溶液產(chǎn)生反應(yīng),反應(yīng)液不呈 藍(lán)色,說明葡聚糖鐵溶液中不含游離Fe3+。實(shí)施例5香菇β _葡聚糖鐵復(fù)合物的制備及其理化性質(zhì)。香菇β-葡聚糖鐵復(fù)合物的制備方法中,堿溶性β-葡聚糖溶液的制備同實(shí)施例 2,簡(jiǎn)述為香菇發(fā)酵液經(jīng)板框壓濾得濕菌體,加入適量95%的乙醇,攪拌均勻后靜置過夜,壓濾;濾餅中加入20倍(ν/ν)蒸餾水,加熱至微沸,攪拌提取4h,壓濾;濾餅中加入濃度為 0. 1-2. 5mol/L(0. 4% -10% ) ^ Na2CO3,加熱至40°C,攪拌提取3h,壓濾,收集濾液,即為堿 溶性β-葡聚糖溶液。香菇β _葡聚糖鐵復(fù)合物的合成與分離純化同實(shí)施例3,簡(jiǎn)述為將堿溶性β _葡 聚糖溶液加熱至65°C,在持續(xù)攪拌下,先連續(xù)滴加或流加氨三乙酸(NTA),pH降低至9. 5時(shí), 再同時(shí)流加氨三乙酸(NTA)和氯化鐵,自同時(shí)流加絡(luò)合劑和三價(jià)鐵化合物至整個(gè)合成反應(yīng) 結(jié)束的過程中,所滴加反應(yīng)物的摩爾比為NTA FeCl3 = 3 2,控制流加速度,使反應(yīng)過程 中的PH值從9. 5向7. 0均勻變化,pH值降低至接近7. 0,調(diào)節(jié)NTA流加速度,使pH值穩(wěn)定 控制在7.0左右,持續(xù)反應(yīng),到出現(xiàn)的沉淀不再溶解,停止流加加氨三乙酸(NTA)和氯化鐵, 繼續(xù)反應(yīng)Ih后,6000r/min離心30min,用截留相對(duì)分子質(zhì)量lOOOODalton的超濾膜超濾濃 縮,冷凍干燥。 上述方法所得香菇β-葡聚糖鐵為深棕紅色無定形粉末,可溶于水,在水中呈中 性;水解反應(yīng),陰性,在ΡΗ7. 0左右的水溶液中不生成氫氧化鐵沉淀,其水溶液為棕紅色透 明溶液;水溶液在敞口條件下長(zhǎng)時(shí)間(IOd)暴露于空氣中,水溶液無明顯變化,粉末長(zhǎng)期 (6m)暴露于空氣中,顏色、光澤無變化,可見在水和空氣中化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定;在生理pH條件 下完全可溶,不水解,不沉淀,因而可以很好地被機(jī)體吸收利用;亞鐵氰化鉀反應(yīng)陰性(不 呈藍(lán)色,不含游離Fe3+);鐵含量43. 9% ;HPLC法測(cè)定圖譜顯示為單一峰,GPC法測(cè)定Mr為 183122Dalton,相對(duì)分子質(zhì)量分布寬度D為1. 91 ;紅外吸收光譜,在700cm-1和ΘΙΟαιΓ1附近 有特征吸收峰。實(shí)施例6裂褶菌β -葡聚糖鐵復(fù)合物的制備。(1)堿溶性β -葡聚糖制備裂褶菌發(fā)酵液10L,固形物含量為2. 12% (w/v),添加 固體NaOH,攪拌,使發(fā)酵液中堿濃度為0. 5mol/L,緩慢加熱至50°C,攪拌處理lh,6000r/min 離心20min,收集上清液即為堿溶性β -葡聚糖溶液;所得堿溶性β -葡聚糖提取液,不經(jīng) 過超濾、濃縮、醇沉、干燥等過程,直接用于下一步驟葡聚糖鐵的合成;(2) β -葡聚糖鐵合成將步驟⑴所得堿溶性β -葡聚糖溶液加熱至75°C,在持 續(xù)攪拌下,先連續(xù)滴加或流加檸檬酸三鈉,PH降低至9. 5時(shí),同時(shí)流加檸檬酸三鈉和硫酸 鐵,控制檸檬酸三鈉和硫酸鐵的流加速度,自同時(shí)流加絡(luò)合劑和三價(jià)鐵化合物至整個(gè)合成 反應(yīng)結(jié)束的過程中,硫酸鐵和檬酸三鈉的摩爾比為2 3,使初始pH值控制在9. 5,同時(shí)又 使出現(xiàn)的沉淀在攪拌狀態(tài)下能迅速溶解;調(diào)節(jié)檸檬酸三鈉和硫酸鐵的流加速度,逐漸增加 檸檬酸三鈉的流速,使PH值每IOmin降低0. 2,直到pH值降低至接近7. 0,調(diào)節(jié)檸檬酸三鈉 和硫酸鐵的流加速度,使PH值穩(wěn)定控制在7. 0左右,持續(xù)進(jìn)行反應(yīng),直到出現(xiàn)的沉淀不再溶 解,停止加入檸檬酸三鈉和硫酸鐵,繼續(xù)攪拌、保溫Ih ;(3) β -葡聚糖鐵分離純化β -葡聚糖鐵合成反應(yīng)結(jié)束后,降溫,管式離心機(jī) 10000r/min離心,去除不溶物,用截留分子量6000DaltOn的超濾膜超濾,冷凍干燥或噴霧 干燥;(4) β-葡聚糖鐵質(zhì)量測(cè)定鄰菲啰啉分光光度法測(cè)定葡聚糖鐵中的鐵含量;硫 酸-苯酚分光光度法測(cè)定葡聚糖含量用;亞鐵氰化鉀分光光度法測(cè)定游離Fe3+含量。結(jié)果顯 示,10L裂褶菌發(fā)酵液,經(jīng)上述各步驟處理,得β -葡聚糖鐵97. 34g,其中鐵含量為33. 8%,葡聚糖含量為40. 21% ;所得β -葡聚糖鐵中不含游離Fe3+。實(shí)施例7核盤菌β -葡聚糖鐵復(fù)合物的制備。 (1)堿溶性β-葡聚糖制備核盤菌發(fā)酵液10L,固形物含量為2. 67% (w/v),添 加固體Na2CO3,攪拌,使發(fā)酵液中堿濃度為0. 5mol/L,緩慢加熱至40°C,攪拌處理lh,6000r/ min離心20min,收集上清液即為堿溶性β-葡聚糖溶液;所得堿溶性β -葡聚糖提取液,不 經(jīng)過超濾、濃縮、醇沉、干燥等過程,直接用于下一步驟葡聚糖鐵的合成;(2) β -葡聚糖鐵合成將步驟⑴所得堿溶性β -葡聚糖溶液加熱至75°C,在持 續(xù)攪拌下,先連續(xù)滴加或流加乙二胺四乙酸(EDTA),pH降低至9. 5時(shí),同時(shí)流加乙二胺四 乙酸(EDTA)和硝酸鐵,自同時(shí)流加絡(luò)合劑和三價(jià)鐵化合物至整個(gè)合成反應(yīng)結(jié)束的過程中, EDTA和硝酸鐵的摩爾比為2 1,控制乙二胺四乙酸和硝酸鐵的流加速度,使初始pH值控 制在9. 5,同時(shí)又使出現(xiàn)的沉淀在攪拌狀態(tài)下能迅速溶解;調(diào)節(jié)檸檬酸三鈉和硫酸鐵的流 加速度,逐漸增加檸檬酸三鈉的流速,使PH值每IOmin降低0.2,直到pH值降低至接近7.0, 調(diào)節(jié)乙二胺四乙酸(EDTA)和硝酸鐵的流加速度,使pH值穩(wěn)定控制在7.0左右,持續(xù)進(jìn)行 反應(yīng),直到出現(xiàn)的沉淀不再溶解,停止加入乙二胺四乙酸(EDTA)和硝酸鐵,繼續(xù)攪拌、保溫 lh;(3) β -葡聚糖鐵分離純化β -葡聚糖鐵合成反應(yīng)結(jié)束后,降溫,管式離心機(jī) 8000r/min離心,去除不溶物,用截留相對(duì)分子質(zhì)量lOOOOODalton的超濾膜超濾,冷凍干燥 或噴霧干燥;(4) β-葡聚糖鐵質(zhì)量測(cè)定鄰菲啰啉分光光度法測(cè)定葡聚糖鐵中的鐵含量;硫 酸-苯酚分光光度法測(cè)定葡聚糖含量用;亞鐵氰化鉀分光光度法測(cè)定游離Fe3+含量。結(jié)果顯 示,10L核盤菌發(fā)酵液,經(jīng)上述各步驟處理,得β-葡聚糖鐵118. 0g,其中鐵含量為39. 52%, 葡聚糖含量為43. 73% ;所得β -葡聚糖鐵中不含游離Fe3+。
權(quán)利要求
一種β 葡聚糖鐵復(fù)合物,其特征在于其重均相對(duì)分子質(zhì)量Mr為5 20萬Dalton,相對(duì)分子質(zhì)量分布寬度D為1.0 3.0,鐵含量為10 50%(w/w);所述β 葡聚糖為真菌來源的β 葡聚糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葡聚糖鐵復(fù)合物,其特征在于所述真菌來源,是由去除 了菌絲體的真菌菌絲體發(fā)酵液或包含菌絲體的真菌菌絲體發(fā)酵液或去除了發(fā)酵液的真菌 菌絲體為來源的;或真菌子實(shí)體為來源的;所述的真菌為小菌核菌屬真菌或核盤菌或雜色 云芝或裂褶菌或香菇。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的β-葡聚糖鐵復(fù)合物,其特征在于所述的β -葡聚糖包括 中性β-葡聚糖或酸性β-葡聚糖或中性蛋白聚糖或酸性蛋白聚糖或其混合物;其中,中性 蛋白聚糖和酸性蛋白聚糖中的糖均為β-葡聚糖。
4.制備如權(quán)利要求1所述的β-葡聚糖鐵復(fù)合物的方法,其步驟如下(1)β-葡聚糖制備向完成發(fā)酵的菌絲體發(fā)酵液直接加入堿并加熱至10-60°C,攪拌 處理l_3h提取β-葡聚糖;或?qū)㈩A(yù)處理過的菌絲體或子實(shí)體加入堿并加熱提取獲得葡 聚糖;所述的預(yù)處理為將菌絲體或子實(shí)體經(jīng)脫脂、水提去除脂溶物和雜多糖;(2)β -葡聚糖鐵的合成將步驟(1)所得β -葡聚糖溶液加熱至50-100°C,先連續(xù)滴 加或流加絡(luò)合劑,PH降低至9. 5時(shí),再同時(shí)滴加或流加絡(luò)合劑和三價(jià)鐵化合物;通過控制絡(luò) 合劑流加速度和加入量,控制PH在9. 5-7. 0的范圍內(nèi),持續(xù)進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng);(3)β-葡聚糖鐵的純化超濾濃縮脫鹽,冷凍干燥、噴霧干燥或醇沉后真空干燥。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的葡聚糖鐵復(fù)合物的制備方法,其特征在于步驟(1) β -葡聚糖制備所用的向完成發(fā)酵的菌絲體發(fā)酵液直接加入的堿為固體NaOH或KOH或 Na2CO3,添加堿固體后,整個(gè)溶液中的堿濃度為0. 01-0. 25mol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的葡聚糖鐵復(fù)合物的制備方法,其特征在于步驟(2)中 所述的絡(luò)合劑選用酸性絡(luò)合劑,選自檸檬酸、檸檬酸三鈉、檸檬酸三鉀、酒石酸鉀鈉、焦磷酸 鈉、蘋果酸、乳酸、草酸、乙二胺四乙酸、環(huán)己二胺四乙酸、二乙三胺五乙酸或氨三乙酸中的 一種或數(shù)種。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的葡聚糖鐵復(fù)合物的制備方法,其特征在于通過調(diào)節(jié)酸 性絡(luò)合劑的加入速度和用量,控制反應(yīng)過程中PH值從ρΗ9. 5逐漸向pH7. 0連續(xù)變化,并控 制在ρΗ7. 0-9. 5之間。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的葡聚糖鐵復(fù)合物的制備方法,其特征在于所述的步驟 (2)中三價(jià)鐵化合物選自氯化鐵或硫酸鐵或硝酸鐵或磷酸鐵或醋酸鐵。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的β-葡聚糖鐵復(fù)合物的制備方法,其特征在于步驟⑴所 得的葡聚糖提取液直接用于步驟(2)中。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的葡聚糖鐵復(fù)合物的制備方法,其特征在于步驟(2)中 同時(shí)滴加或流加絡(luò)合劑和三價(jià)鐵化合物時(shí)起至整個(gè)合成反應(yīng)完成,三價(jià)鐵化合物與絡(luò)合劑 總用量的摩爾比為2 η,其中η= 1-5之間的整數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域和食品醫(yī)藥領(lǐng)域,具體提供了一種利用真菌β-葡聚糖為配體化合物,以三價(jià)鐵為配位中心離子制備的β-葡聚糖鐵及其制備方法,所制備的β-葡聚糖鐵復(fù)合物含鐵量高,水溶性好,不含游離鐵離子,體外環(huán)境中穩(wěn)定,體內(nèi)通過胃酸作用,解離出Fe3+被人體吸收,在體內(nèi)被還原成Fe2+利用,同時(shí)解離出的β-葡聚糖進(jìn)而發(fā)揮其提高機(jī)體免疫力和生血活血的協(xié)同補(bǔ)血功效,因此β-葡聚糖鐵絡(luò)合物同時(shí)具有補(bǔ)鐵補(bǔ)血和免疫調(diào)節(jié)的雙重功效。
文檔編號(hào)C08B37/02GK101967205SQ20101050385
公開日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2010年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月12日
發(fā)明者徐澤平, 王寶琴 申請(qǐng)人:濱州學(xué)院;王寶琴
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