專利名稱：新的糖胺聚糖和使用同樣物質(zhì)作為活性成分的藥用組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有硫酸酯基團(tuán)的糖胺聚糖，其中基本上除去了結(jié)合到組成該糖胺聚糖的葡糖胺殘基6-位上的所有的硫酸酯基團(tuán)并且其它硫酸酯基團(tuán)的除去減至最低，涉及包含作為活性成分的糖胺聚糖的藥用制劑，并且涉及產(chǎn)生糖胺聚糖的方法。
背景技術(shù)：
肝素為具有由糖醛酸(艾杜糖醛酸(IdoA)或葡糖醛酸(GlcA))殘基和葡糖胺(GlcN)殘基組成的二糖單位的重復(fù)結(jié)構(gòu)作為主鏈的糖胺聚糖之一。肝素為其中糖醛酸殘基的2-位羥基基團(tuán)和葡糖胺殘基的6-位羥基基團(tuán)和2-位氨基基團(tuán)的每一個(gè)經(jīng)歷了一定程度硫酸化作用的糖胺聚糖。因?yàn)楦嗡鼐哂锌鼓涪?在下文也稱作“ATⅢ”)結(jié)合位點(diǎn)(FEBS Lett.(1980)117，203-206)并與ATⅢ結(jié)合來(lái)抑制凝血酶作用，由此產(chǎn)生抗凝血作用，肝素長(zhǎng)期以來(lái)廣泛用作藥物例如用于改善透析治療結(jié)果等的抗凝血?jiǎng)Ｗ罱?，已發(fā)現(xiàn)肝素與多種生理活性因子相互作用。例如，肝素與脂蛋白脂肪酶相互作用(J.Biol.Chem.(1981)256，12893-12898)，并且對(duì)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子具有親和性(J.Cell.Biol.(1990)111，1651-1659)。
在這樣的情況下，注意力已經(jīng)集中到在肝素中參與在肝素和特異的細(xì)胞生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子之間的結(jié)合的結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)上。此外，由于ATⅢ結(jié)合位點(diǎn)的存在并由此增加生理活性因子的相互作用，正在進(jìn)行涉及由肝素的脫硫酸化作用為代表的、目的為降低抗凝作用的化學(xué)修飾的重要研究(J.Carbohydr.Chem.(1993)12，507-521；Carbohydr．Res.(1989)193，165-172；Carbohydr．Res.(1976)46，87-95；WO95/30424等)。
關(guān)于以上提到的肝素的脫硫酸化作用，近年來(lái)焦點(diǎn)在除去在肝素中結(jié)合到葡糖胺殘基的6-位羥基基團(tuán)上的硫酸酯基團(tuán)(6-脫硫酸化作用)。作為脫硫酸化方法，能夠提及的是使用溶劑分解的方法(WO95/30424)和使用硅烷基化試劑的方法(WO96/01278)。
用前一個(gè)方法，伴隨除去在肝素分子中結(jié)合到葡糖胺殘基6-位羥基基團(tuán)上的硫酸酯基團(tuán)(6-O-硫酸酯基團(tuán))，結(jié)合在糖醛酸殘基2-位羥基基團(tuán)上的硫酸酯基團(tuán)(2-O-硫酸酯基團(tuán))和結(jié)合在葡糖胺殘基2-位氨基基團(tuán)上的硫酸酯基團(tuán)(N-硫酸酯基團(tuán))也被除去。因此，在使用前者方法以基本上除去所有6-O-硫酸酯基團(tuán)的過(guò)程中，幾乎所有的葡糖胺殘基的N-硫酸酯基團(tuán)和糖醛酸殘基的2-O-硫酸酯基團(tuán)也會(huì)失去。當(dāng)如此修飾的肝素的葡糖胺殘基2-位的氨基基團(tuán)能夠再次硫酸化時(shí)，糖醛酸殘基的2-位再次硫酸化作用而不使葡糖胺殘基的6-位硫酸化是困難的。
后一種方法優(yōu)于前一種方法之處在于它使葡糖胺殘基的6-O-硫酸酯基團(tuán)更特異地除去。然而，用后一種方法如此得到的修飾的肝素，如通過(guò)酶二糖分析方法測(cè)定的有效二糖收率是低的，這意味著用這個(gè)方法仍然存在著問(wèn)題，這在于這個(gè)方法中該結(jié)構(gòu)鑒定可不足以應(yīng)用于藥用用途。此外，盡管修飾的肝素的抗凝血作用大大降低，它是存在的，而不可能得到其中該抗凝血活性已經(jīng)完全消除的修飾的肝素。
由于肝素或其片段對(duì)多種生理活性物質(zhì)具有親和性并且該親和性與這類物質(zhì)的功能密切相關(guān)，已進(jìn)行深入研究用來(lái)尋找和開發(fā)利用肝素或修飾的肝素的藥物。然而，盡管做了這樣的努力，它們?cè)谒幬飸?yīng)用時(shí)仍然僅有效地用作血液抗凝血藥物。
即集中在使用肝素應(yīng)用在除抗凝血藥物外的用途中，重要地是基本上消除其抗凝血作用和出血作用，并且對(duì)于使用其作為藥用物質(zhì)而言，必須使其“作為物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定”成為可能。對(duì)于這些問(wèn)題而言，必須進(jìn)一步改進(jìn)，并且要求解決這些遺留問(wèn)題并使用肝素對(duì)生理活性物質(zhì)的親和性來(lái)提供安全和有用的藥物。
本發(fā)明的公開作為針對(duì)解決以上問(wèn)題的刻苦研究的結(jié)果，通過(guò)使用特殊的方法以影響糖胺聚糖例如具有硫酸酯基團(tuán)的肝素的脫硫酸化作用，本發(fā)明人成功地制備了新的糖胺聚糖，其中基本上消除了其抗凝血作用和出血活性，而它對(duì)生物體的生物有利作用例如其對(duì)于生理活性物質(zhì)的親和性得到維持，并且不可鑒定的結(jié)構(gòu)明顯地降低到“該物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定”能夠容易地完成的程度，這對(duì)于藥物應(yīng)用來(lái)說(shuō)是重要的。因此，已經(jīng)完成了本發(fā)明。
特別地，業(yè)已證實(shí)通過(guò)在硅烷基化試劑N-甲基-N-(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(在下文也稱作“MTSTFA”)存在下，于吡啶中，將具有硫酸酯基團(tuán)的糖胺聚糖在100℃或更高溫度下加熱處理來(lái)基本上除去葡糖胺殘基上所有的6-O-硫酸酯基團(tuán)，然后從反應(yīng)混合物中蒸發(fā)吡啶，加入水并減壓下濃縮，得到的糖胺聚糖在促進(jìn)皮膚傷口愈合方面和治療糖尿病皮膚潰瘍方面是高度有效的，并且它具有果糖-1，6-二磷酸醛縮酶抑制活性，并且其抗凝血作用和出血活性已經(jīng)消失。
另外，經(jīng)過(guò)證實(shí)通過(guò)使用利用糖胺聚糖酶的酶二糖分析方法，能夠容易地確定通過(guò)以上精確方法制備的糖胺聚糖結(jié)構(gòu)，因?yàn)樘前肪厶敲笇?duì)糖胺聚糖具有良好的消化能力。這是與以前在鑒定修飾的肝素結(jié)構(gòu)上的困難相比較的，該肝素已經(jīng)通過(guò)經(jīng)歷多種類型的化學(xué)處理來(lái)修飾。使用由此作為藥物結(jié)構(gòu)能夠進(jìn)行鑒定的糖胺聚糖使得有可能提供高度安全的和有用的藥物。
本發(fā)明人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)糖胺聚糖對(duì)1，6-二磷酸果糖醛縮酶具有高度親和性，該酶為糖酵解途徑的關(guān)鍵酶，并且能夠用作該酶的強(qiáng)力抑制劑。因此，提供新的1，6-二磷酸果糖醛縮酶抑制劑已經(jīng)成為可能。
即本發(fā)明提供了如下內(nèi)容。
1．具有包含了糖醛酸殘基和葡糖胺殘基的二糖重復(fù)結(jié)構(gòu)的主鏈和具有硫酸酯基團(tuán)的糖胺聚糖(其中如同通過(guò)化學(xué)二糖分析方法測(cè)定的那樣，基本上未檢測(cè)到結(jié)合到主鏈的葡糖胺殘基6-位羥基基團(tuán)上的硫酸酯基團(tuán)，其中該糖胺聚糖用亞硝酸分解)與對(duì)硝基苯肼反應(yīng)并通過(guò)高效液相色譜法分析，并且在2-位具有硫酸酯基團(tuán)的糖醛酸殘基的％(mol)相對(duì)于總糖醛酸殘基不低于45％，該％(mol)從通過(guò)酶二糖分析方法得到的二糖組成來(lái)計(jì)算得到，在該方法中糖胺聚糖用糖胺聚糖酶消化并通過(guò)高效液相色譜法分析。
2．具有包含了糖醛酸殘基和葡糖胺殘基的二糖重復(fù)結(jié)構(gòu)的主鏈和具有硫酸酯基團(tuán)的糖胺聚糖(其中通過(guò)酶二糖分析得到糖胺聚糖的二糖組成，其中糖胺聚糖用糖胺聚糖酶消化并通過(guò)高效液相色譜法分析)，總的2-乙酰氨基-2-脫氧-4-O-(4-脫氧-α-L-蘇阿-己-4-烯吡喃糖基(enopyranosyl)糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖、2-脫氧-2-磺氨基-4-O-(4-脫氧-α-L-蘇阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖、2-乙酰氨基-2-脫氧-4-O-(4-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖和2-脫氧-2-磺氨基-4-O-(4-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖不多于10％(mol)，并且2-脫氧-2-磺氨基-4-O-(4-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖不多于1.5％(mol)，并且有效的二糖收率不少于60％。
3．本條目2的糖胺聚糖，其中通過(guò)酶二糖分析方法得到二糖組成，總的2-乙酰氨基-2-脫氧-4-O-(4-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-D-葡萄糖、2-脫氧-2-磺氨基-4-O-(4-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-D-葡萄糖、2-乙酰氨基-2-脫氧-4-O-(4-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖和2-脫氧-2-磺氨基-4-O-(4-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖不少于45％(mol)。
4．條目1至3中任何一個(gè)條目的糖胺聚糖(其中在該糖胺聚糖的13C-NMR譜分析中，使用糖胺聚糖在氧化氘中的5％溶液并且3-(三甲基甲硅烷基)丙酸鈉作為標(biāo)準(zhǔn)物)在66.5至67.5ppm基本上未檢測(cè)到峰并且在大約100ppm至102ppm的信號(hào)強(qiáng)度高于大約98.3ppm的信號(hào)強(qiáng)度。
5．包括如同在條目1至4中任何一個(gè)條目中定義的糖胺聚糖(在下文也稱作“本發(fā)明的糖胺聚糖”)的果糖-1，6-二磷酸醛縮酶抑制劑作為活性成分。
6．藥用組合物包括作為活性成分的本發(fā)明的糖胺聚糖。
7．條目6的藥用組合物，其為治療組織損傷和潰瘍的藥物。
8．條目6的藥用組合物，其為治療皮膚疾病的藥物。
9．條目8的藥用組合物，其中該治療皮膚疾病的藥物為促進(jìn)皮膚傷口愈合的藥物或治療皮膚潰瘍的藥物。
10．產(chǎn)生本發(fā)明糖胺聚糖的方法，該方法包括以下步驟(a)在MTSTFA存在下，在不低于100℃的溫度下，在吡啶中加熱具有包括糖醛酸殘基和葡糖胺殘基的二糖重復(fù)結(jié)構(gòu)的主鏈并且具有硫酸酯基團(tuán)的比啶可溶的糖胺聚糖的鹽，在加熱足夠長(zhǎng)的時(shí)間以至于如同通過(guò)化學(xué)二糖分析方法測(cè)定的那樣，基本上不應(yīng)該檢測(cè)到結(jié)合到葡糖胺殘基6-位羥基基團(tuán)上的硫酸酯基團(tuán)，在該方法中該糖胺聚糖用亞硝酸分解，其與對(duì)硝基苯肼反應(yīng)并通過(guò)高效液相色譜法分析。
(b)從在步驟(a)中得到的該反應(yīng)混合物中蒸發(fā)吡啶，并且(c)把水加入到在步驟(b)中得到的該反應(yīng)混合物中，然后減壓下于常規(guī)溫度下放置該混合物。
本發(fā)明實(shí)施方案現(xiàn)在將做如下描述。
在本發(fā)明中，“具有包含糖醛酸殘基和葡糖胺殘基的二糖重復(fù)結(jié)構(gòu)的主鏈并且具有硫酸酯基團(tuán)的糖胺聚糖”為具有糖醛酸殘基和葡糖胺殘基重復(fù)結(jié)構(gòu)的肝素結(jié)構(gòu)的糖胺聚糖中具有硫酸酯基團(tuán)的糖胺聚糖，并且包括肝素、硫酸乙酰肝素和硫酸化透明質(zhì)酸。“葡糖胺殘基”也包括那些具有乙?；被鶊F(tuán)和硫酸化氨基基團(tuán)的物質(zhì)。1．本發(fā)明的糖胺聚糖按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了具有包括糖醛酸殘基和葡糖胺殘基的二糖重復(fù)結(jié)構(gòu)的主鏈并且具有硫酸酯基團(tuán)的糖胺聚糖，其中如同按照化學(xué)二糖分析方法測(cè)量，基本上未檢測(cè)到結(jié)合到主鏈葡糖胺殘基6-位羥基基團(tuán)上的硫酸酯基團(tuán)，在該方法中該糖胺聚糖用亞硝酸分解，與對(duì)硝基苯肼(也稱作PNP-肼)反應(yīng)并通過(guò)高效液相色譜法(在下文也縮寫為“HPLC”)分析，并且在2-位具有硫酸酯基團(tuán)的糖醛酸殘基的％(mol)相對(duì)于總糖醛酸殘基不少于45％，該％(mol)由通過(guò)酶二糖分析方法得到的二糖組成計(jì)算得到，其中糖胺聚糖用糖胺聚糖酶消化并且通過(guò)高效液相色譜法分析。更優(yōu)選地該糖胺聚糖如下描述的那樣具有不少于60％的有效二糖收率。
如同參照后面試驗(yàn)方法1描述的那樣，以上提到的化學(xué)二糖分析方法指得是包括用亞硝酸分解所測(cè)量的物料、使產(chǎn)物與對(duì)硝基苯肼反應(yīng)并且通過(guò)HPLC分析該產(chǎn)物的方法。
經(jīng)檢測(cè)在葡糖胺殘基6-位羥基基團(tuán)上基本上不結(jié)合有硫酸酯基團(tuán)的描述通常意味著前面提到的化學(xué)二糖分析方法不可能檢測(cè)到通過(guò)以上經(jīng)常規(guī)HPLC化學(xué)處理而產(chǎn)生的ISMS(IdoA(2S)α1→4AnMan(6S)-PNP，這里4AnMan(6S)-PNP表示AnMan(6S)-CH=N-NH-PNP，并且AnMan(6S)表示2，5-脫水甘露糖-6-硫酸酯)的峰。詳細(xì)地說(shuō)，其能夠通過(guò)作為一個(gè)指數(shù)來(lái)測(cè)量，該指數(shù)為本發(fā)明不具有6-硫酸酯基團(tuán)的所有葡糖胺殘基的數(shù)目相對(duì)于總葡糖胺殘基數(shù)目的百分比，其由ISM(IdoA(2S)α1→4AnMan-PNP，這里AnMan-PNP表示AnMan-CH=N-NH-PNP，并且AnMan表示2，5-脫水甘露糖)的峰面積和ISMS的峰面積來(lái)計(jì)算。例如，不少于95％的可認(rèn)為是意味著“基本上未檢測(cè)到”并且100％是最優(yōu)選的。對(duì)于降低抗凝血作用而言，優(yōu)選地是在本發(fā)明糖胺聚糖結(jié)構(gòu)中基本上不具有帶有6-O-硫酸酯基團(tuán)的葡糖胺殘基。為了方便起見，在下文中這些葡糖胺殘基6-位的脫硫酸作用的比例將稱作“6-脫硫酸化比例”。
該6-脫硫酸比例也能從如同在實(shí)施例中描述的核磁共振譜所得到的信號(hào)強(qiáng)度來(lái)計(jì)算。以這樣方式得到的結(jié)果基本上與前面提到的化學(xué)二糖分析方法得到的“6-脫硫酸化比例”相符。
在本發(fā)明糖胺聚糖的肝素結(jié)構(gòu)中，結(jié)合到組分糖殘基上的硫酸酯基團(tuán)的位置和量能夠由通過(guò)酶二糖分析方法檢測(cè)不飽和二糖的組成(二糖組成)來(lái)計(jì)算，其中該糖胺聚糖以糖胺聚糖酶來(lái)消化并經(jīng)過(guò)高效液相色譜法(使用糖胺聚糖酶的消化作用與HPLC的聯(lián)合方法的酶二糖分析方法)分析。
“在2-位具有硫酸酯基團(tuán)的糖醛酸殘基相對(duì)于總糖醛酸殘基的％(mol)”意指取作通過(guò)以下提到的通式表達(dá)的不飽和二糖100％總量[2-乙酰氨基-2-脫氧-4-O-(4-脫氧-α-L-蘇阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-D-葡萄糖(在下文中稱作“ΔDiHS-OS”)、2-脫氧-2-磺氨基-4-O-(4-脫氧-α-L-蘇阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-D-葡萄糖(在下文中稱作“ΔDiHS-NS”)、2-乙酰氨基-2-脫氧-4-O-(4-脫氧-α-L-蘇阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖(在下文中稱作“ΔDihS-6S”)、2-乙酰氨基-2-脫氧-4-O-(4-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-D-葡萄糖(在下文中稱作“ΔDiHS-US”)、2-脫氧-2-磺氨基-4-O-(4-脫氧-α-L-蘇阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖(在下文中稱作“ΔDiHS-di(6，N)S”)、2-脫氧-2-磺氨基-4-O-(4-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-D-葡萄糖(在下文中稱作“ΔDiHS-di(U，N)S”)、2-乙酰氨基-2-脫氧-4-O-(4-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖(在下文中稱作“ΔDiHS-di(U，6)S”)和2-脫氧-2-磺氨基-4-O-(4-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖(在下文中稱作“ΔDiHS-tri(U，6，N)S”)的總(摩爾數(shù))]，其為前面提到的每一個(gè)在糖醛酸殘基2-位具有硫酸酯基團(tuán)的不飽和二糖的比例(ΔDiHS-US、ΔDiHS-di(U，N)S、ΔDiHS-di(U，6)S和ΔDiHS-tri(U，6，N)S的總(摩爾數(shù)))如同按照使用以糖胺聚糖酶消化作用和HPLC的聯(lián)合的酶二糖分析方法所測(cè)定那樣的百分?jǐn)?shù)。為了維持本發(fā)明糖胺聚糖治療皮膚疾病的高度活性，該值通常不少于45％，優(yōu)選不少于50％并且更優(yōu)選不少于60％。使用酶消化作用和HPLC聯(lián)合的二糖分析方法指的是在后面試驗(yàn)方法2中描述的酶消化作用和HPLC聯(lián)合的酶二糖分析方法。 表1 通過(guò)以上縮寫表示的這些結(jié)構(gòu)也能以如下顯示的那樣來(lái)表達(dá)ΔDiHS-OSΔHexAl→4GlcNAc；ΔDiHS-NSΔHexAl-4GlcNS；ΔDiHS-6SΔHexAl→4GlcNAc(6S)；ΔDiHS-USΔHexA(2S)1→4GlcNAc；ΔDiHS-di(6，N)SΔHexAl→4GlcNS(6S)；ΔDiHS-di(U，N)SΔHexA(2S)1→4GlcNS；ΔDiHS-di(U，6)SΔHexA(2S)1→4GlcNAc(6S)；ΔDiHS-tri(U，6，N)SΔHexA(2S)1→4GlcNS(6S)。
在以上式中，ΔHexA代表不飽和己糖醛酸、GlcNAc代表N-乙酰葡糖胺，GlcNS代表N-硫酸化葡糖胺并且硫酸酯基團(tuán)的結(jié)合位置在括號(hào)中顯示。
通過(guò)酶二糖分析方法得到的數(shù)值反映了酶消化之前糖胺聚糖的硫酸酯基團(tuán)的位置和數(shù)目。對(duì)于更準(zhǔn)確的反映來(lái)說(shuō)，該酶消化必須為更一致的和盡可能高的消化能力(酶消化能力(試驗(yàn)方法4如下描述))，通常不低于60％，優(yōu)選不低于70％并且更優(yōu)選不低于80％。
另外，借助酶二糖分析方法計(jì)算的糖胺聚糖的有效二糖收率顯示了能夠通過(guò)糖胺聚糖作為分析對(duì)象的方法鑒定的二糖單位的比例。作為結(jié)構(gòu)鑒定容易性的指數(shù)的有效二糖收率通常不少于60％，優(yōu)選不少于70％并且更優(yōu)選地不少于80％。
“有效二糖收率”是表達(dá)為通過(guò)可鑒定的不飽和二糖(ΔDiHS-OS、ΔDiHS-NS、ΔDiHS-6S、ΔDiHS-US、ΔDiHS-di(6，N)S、ΔDiHS-di(U，N)S、ΔDiHS-di(U，6)S和ΔDiHS-tri(U，6，N)S)的總峰面積與在上述二糖分析方法中使用HPLC檢測(cè)到的不飽和二糖的總峰面積比值乘以酶消化能力的百分?jǐn)?shù)的值。
在本發(fā)明的糖胺聚糖的情況下，含有在6-位具有硫酸酯基團(tuán)的葡糖胺殘基的不飽和二糖(ΔDiHS-6S、ΔDiHS-di(6，N)S、ΔDiHS-di(U，6)S和ΔDiHS-tri(U，6，N)S的總和)不多于10％(mol)，優(yōu)選不多于5％(mol)，并且ΔDiHS-tri(U，6，N)S不多于1.5％(mol)，優(yōu)選不多于1％(mol)，并且更優(yōu)選如通過(guò)酶二糖分析方法來(lái)分析的那樣是不可測(cè)定的(在二糖組成中)。
當(dāng)通過(guò)酶二糖分析方法分析時(shí)，通過(guò)使用以下提及的作為參照物的標(biāo)準(zhǔn)肝素計(jì)算的本發(fā)明的糖胺聚糖的6-脫硫酸比例正常不少于90％。
已知肝素顯示與(親和于)多種細(xì)胞因子(例如，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、上皮生長(zhǎng)因子、midkine、白細(xì)胞介素8、玻連蛋白、肝素結(jié)合腦細(xì)胞促分裂因子和肝素結(jié)合軸突生長(zhǎng)暈促進(jìn)因子等)存在相互作用，并且已知結(jié)合到該肝素結(jié)構(gòu)上的硫酸酯基團(tuán)在這樣的相互作用中起主要作用。因?yàn)楸景l(fā)明的糖胺聚糖基本上沒(méi)有葡糖胺殘基的6-O-硫酸酯基團(tuán)，盡管抗凝血作用、對(duì)在該作用中起主要作用的ATⅢ的親和性和出血作用喪失了，肝素與上述細(xì)胞因子的相互作用(親和性)則維持著。因此，在本發(fā)明糖胺聚糖中，為維持親和性，在如同通過(guò)使用上述酶二糖分析方法得到的不飽和二糖的組成(二糖組成)中，具有結(jié)合在2-位氨基基團(tuán)上的硫酸酯基團(tuán)的葡糖胺殘基的不飽和二糖(ΔDiHS-NS、ΔDiHS-di(6，N)S、ΔDiHS-di(U，N)S和ΔDiHS-tri(U，6，N)S的總和)的％(mol)優(yōu)選不少于65％(mol)，更優(yōu)選不少于75％(mol)。并且如上所述，相對(duì)于總糖醛酸殘基的具有2-O-硫酸酯基團(tuán)的糖醛酸殘基的％(mol)正常地不少于45％，優(yōu)選地不少于50％，最優(yōu)選地不少于60％。
此外，為了維持對(duì)細(xì)胞因子的親和性，當(dāng)3-(三甲基甲硅烷基)丙酸鈉(在下文中縮寫為“TSP”)作為使用氧化氘溶液(在以下實(shí)施例3中描述)的13C-核磁共振(NMR)譜的結(jié)構(gòu)分析中用作參照物(0ppm)時(shí)，基本上應(yīng)該在66.5至67.5ppm觀察不到峰而在70.0至71.0ppm觀察到峰是優(yōu)選的，并且進(jìn)一步優(yōu)選的是當(dāng)把大約98.3ppm、100ppm和102ppm的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行比較時(shí)，約100ppm和102ppm兩處的信號(hào)強(qiáng)度應(yīng)高于大約98.3ppm的信號(hào)強(qiáng)度。在本發(fā)明糖胺聚糖的最優(yōu)選實(shí)施方案之一中，除了前面提到的特性以外，在96.5至97.0ppm的區(qū)域觀察不到連續(xù)的峰。
本發(fā)明糖胺聚糖優(yōu)選地對(duì)于促進(jìn)前面提到的細(xì)胞因子的活性、特別是堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)(細(xì)胞增殖促進(jìn)活性)的活性具有高度活性，并且如同通過(guò)用于測(cè)量促進(jìn)bFGF活性的活性的方法測(cè)量的那樣(其中通過(guò)使用NaClO3使培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)受細(xì)胞增殖抑制作用來(lái)測(cè)量促進(jìn)bFGF活性的活性)，其優(yōu)選具有相應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)肝素或市售肝素的促進(jìn)bFGF活性的活性不低于80％，更優(yōu)選不低于90％(參見實(shí)施例中試驗(yàn)方法9的用于促進(jìn)bFGF活性的活性的測(cè)量1)。此外，如同通過(guò)用于測(cè)量促進(jìn)bFGF活性的活性的方法測(cè)定的那樣(在該方法中不使用NaClO3培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)測(cè)量促進(jìn)bFGF活性的活性)，本發(fā)明的糖胺聚糖對(duì)于促進(jìn)bFGF活性的活性也優(yōu)選相應(yīng)于不低于70％，更優(yōu)選不低于80％，最優(yōu)選不低于90％的標(biāo)準(zhǔn)品肝素或市售肝素的促進(jìn)bFGF活性的活性(參見實(shí)施例中試驗(yàn)方法9，用于促進(jìn)bFGF活性的活性的測(cè)量2)。
因?yàn)樯婕暗娇鼓钚院统鲅钚缘母嗡刂麈溨械母吡蛩峄瘏^(qū)域(硫酸化的簇)通過(guò)前面提到的二糖分析方法來(lái)檢測(cè)為ΔDiHS-tri(U，6，N)S，在本發(fā)明糖胺聚糖中，ΔDiHS-tri(U，6，N)S不多于1.5％(mol)，優(yōu)選不多于1％(mol)，最優(yōu)選如同通過(guò)前面提到的酶二糖分析方法測(cè)定的那樣在不飽和二糖組成(二糖組成)中檢測(cè)不到ΔDiHS-tri(U，6，N)S。本發(fā)明這樣的糖胺聚糖基本上喪失了抗凝血活性和出血活性。
如同通過(guò)使用凝膠過(guò)濾法測(cè)定的那樣，本發(fā)明糖胺聚糖優(yōu)選地具有3，000-30，000，更優(yōu)選地具有5，000-20，000，最優(yōu)選地具有7．000-16，000的平均分子量，但是其并不特別限制。
如上提到的那樣，本發(fā)明糖胺聚糖基本上喪失了抗凝血活性和出血活性。即當(dāng)在反應(yīng)混合物中以最終30μg/ml的濃度加入本發(fā)明的糖胺聚糖，以APTT和TT的測(cè)量方法(試驗(yàn)方法5和6)來(lái)測(cè)量該活化的部分組織促凝血酶原激酶時(shí)間(在下文也縮寫為“APTT”)和組織促凝血酶原激酶時(shí)間(在下文也縮寫為“TT”)時(shí)，APTT不超過(guò)50秒，并且以加入最終100μg/ml的濃度，TT不超過(guò)50秒。
此外，在使用牛ATⅢ測(cè)量抗凝血酶活性中(例如，在以下提到的試驗(yàn)方法(試驗(yàn)方法7)中描述在[抗凝血酶活性測(cè)量方法]中的方法)，提供50％抑制作用的濃度(IC50)優(yōu)選地不少于50μg/ml，更優(yōu)選地不少于100μg/ml。
由于本發(fā)明糖胺聚糖基本上喪失了如上提到的抗凝血活性和出血活性，并且具有優(yōu)良的如在以下實(shí)施例中證實(shí)的促進(jìn)傷口愈合活性和治療皮膚潰瘍活性，其可用作藥物的活性成分。
當(dāng)本發(fā)明糖胺聚糖也能以游離形式使用時(shí)，其優(yōu)選地作為藥學(xué)上可接受的鹽來(lái)得到。這樣的鹽的實(shí)例包括例如那些選自堿金屬鹽如鈉鹽和鉀鹽、堿土金屬鹽如鎂鹽和鈣鹽、銨鹽、胺鹽如三丁基胺鹽等藥學(xué)上可接受的鹽，但是堿金屬鹽尤其是鈉鹽為優(yōu)選的。2．本發(fā)明的抑制劑本發(fā)明抑制劑為1，6-二磷酸果糖醛縮酶抑制劑，其特征在于包含作為活性成分的本發(fā)明糖胺聚糖。
以上所述的能夠用作本發(fā)明抑制劑的活性成分的本發(fā)明糖胺聚糖對(duì)于稱作控制糖酵解酶的反應(yīng)速率的酶的1，6-二磷酸果糖醛縮酶(在下文縮寫為“FPA”)顯示高度親和性并且具有抑制該酶反應(yīng)的活性。因此，本發(fā)明糖胺聚糖能夠抑制整個(gè)糖酵解途徑，并且因而其能夠用作糖酵解抑制劑尤其是FPA抑制劑的活性成分。
如同在以下提到的實(shí)施例中證實(shí)的那樣，發(fā)現(xiàn)任何(1)本發(fā)明的糖胺聚糖、(2)相應(yīng)于僅通過(guò)酯鍵結(jié)合于肝素糖醛酸殘基2-位羥基基團(tuán)上的硫酸酯基團(tuán)從肝素上被除去的肝素的衍生物(2ODSH)和(3)相應(yīng)于僅通過(guò)酰胺鍵結(jié)合于肝素的葡糖胺殘基2-位氨基基團(tuán)上的硫酸酯基團(tuán)被從肝素上除去的肝素的衍生物(NDSH)顯示對(duì)FPA的親和性并且抑制FPA的活性。
盡管這些結(jié)果表明了肝素對(duì)抑制FPA顯示了最高活性，也發(fā)現(xiàn)在(1)、(2)和(3)的物質(zhì)中本發(fā)明糖胺聚糖顯示最高的FPA抑制活性，(2)的衍生物顯示第二高的抑制活性并且(3)的衍生物顯示最弱的抑制活性。因此，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在該肝素的結(jié)構(gòu)中葡糖胺殘基2-位氨基基團(tuán)具有硫酸酯基團(tuán)是最重要的，在該肝素的結(jié)構(gòu)中糖醛酸殘基2-位羥基基團(tuán)結(jié)合有硫酸酯基團(tuán)對(duì)FPA活性是第二重要的，最少涉及的硫酸酯基團(tuán)是通過(guò)酯鍵結(jié)合于葡糖胺殘基6-位羥基基團(tuán)上的硫酸酯基團(tuán)。在這些發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明，并且本發(fā)明抑制劑為含有作為活性成分的本發(fā)明糖胺聚糖的FPA抑制劑，該物質(zhì)具有與肝素活性比較的、高的FPA抑制活性并且降低了肝素所顯示的副作用如出血活性。
用作FPA抑制劑的活性成分的本發(fā)明糖胺聚糖優(yōu)選地含有相對(duì)于組成糖胺聚糖主鏈的葡糖胺殘基的總量不少于40％(mol)的2-位氨基基團(tuán)硫酸化的葡糖胺殘基。更詳細(xì)地講，在前面說(shuō)到的酶二糖分析方法(二糖組成)中，含有具有2-位硫酸酯基團(tuán)的葡糖胺殘基的不飽和二糖(ΔDiHS-NS、ΔDiHS-di(6，N)S、ΔDiHS-di(U，N)S、ΔDiHS-tri(U，6，N)S)的％(mol)優(yōu)選不少于40％(mol)，更優(yōu)選不少于50％(mol)。另外，用作FPA抑制劑的活性成分的本發(fā)明的糖胺聚糖優(yōu)選地含有相對(duì)于組成糖胺聚糖主鏈的糖醛酸殘基的總量不少于45％(mol)的2-位羥基基團(tuán)硫酸化的糖醛酸殘基。更詳細(xì)地講，在前面說(shuō)到的酶二糖分析方法(二糖組成)中，具有2-位硫酸酯基團(tuán)的糖醛酸殘基(ΔDiHS-US、ΔDiHS-di(U，6)S、ΔDiHS-di(U，N)S、ΔDiHS-tri(U，6，N)S)的％(mol)一般不少于45％(mol)，優(yōu)選不少于50％(mol)。
如同在下列描述的實(shí)施例15中提到的條件下測(cè)定的那樣，用作FPA抑制劑的活性成分的本發(fā)明糖胺聚糖對(duì)牛腦1，6-二磷酸果糖醛縮酶的同工酶A4和C4優(yōu)選地分別具有少于0.4μg/ml和少于2.5μg/ml的Ki值。
本發(fā)明抑制劑能夠用作治療和預(yù)防伴隨糖酵解途徑代謝增進(jìn)的疾病或失調(diào)的藥物。這樣的伴隨糖酵解途徑代謝增進(jìn)的疾病或失調(diào)的實(shí)例包括例如瘧原蟲的感染等，并且含有本發(fā)明抑制劑的藥物可認(rèn)為對(duì)這樣的疾病或失調(diào)呈現(xiàn)治療或預(yù)防作用。3．本發(fā)明的藥用組合物本發(fā)明的藥用組合物的特征在于含有作為活性成分的本發(fā)明的糖胺聚糖。
因?yàn)樯鲜霰景l(fā)明的糖胺聚糖基本上沒(méi)有被當(dāng)成副作用問(wèn)題的抗凝血活性和出血活性，其能夠作為藥物給予生物體。
在本發(fā)明糖胺聚糖具有的生理活性中，特別顯著地是促進(jìn)組織損傷或潰瘍愈合的活性，并且本發(fā)明的糖胺聚糖能夠用作治療(包括預(yù)防藥物)創(chuàng)傷和組織潰瘍的藥物。以上所述的組織包括上皮組織例如皮膚、角膜和包括鼻腔粘膜和口腔粘膜的粘膜、締結(jié)組織例如軟骨和骨頭和神經(jīng)組織以及消化道和血管組織等。該創(chuàng)傷包括發(fā)生在上述組織中的疾病(例如通過(guò)外部力量引起的損傷、燒傷等)。在它們當(dāng)中，本發(fā)明藥用組合物的優(yōu)選的實(shí)施方案為特別地促進(jìn)傷口愈合或在皮膚上產(chǎn)生的潰瘍的愈合的藥物(治療皮膚疾病的藥物)，并且本發(fā)明藥用組合物最優(yōu)選的實(shí)施方案為促進(jìn)皮膚傷口愈合的藥物和治療皮膚潰瘍的藥物。除了一般的潰瘍以外，上述皮膚潰瘍包括例如難治的潰瘍例如下肢潰瘍和褥瘡性潰瘍(也包括糖尿病性皮膚潰瘍)。
因?yàn)楸景l(fā)明糖胺聚糖對(duì)于bFGF具有高度的親和性并且如同在以下描述的實(shí)施例中證實(shí)的那樣對(duì)于促進(jìn)bFGF活性具有高度活性，除了以上提到的實(shí)施方案以外，本發(fā)明的藥用組合物也能用在打算應(yīng)用于被認(rèn)為是涉及bFGF的紊亂和疾病的愈合的實(shí)施方案中，并且與含有已知的修飾肝素的藥物相比較，其呈現(xiàn)更優(yōu)良的作用。這樣的紊亂和疾病的實(shí)例包括例如牙周疾病、心瓣再狹窄、癌癥、涉及新血管形成的疾病(增生的視網(wǎng)膜炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、牛皮癬等)、局部再灌注紊亂、炎癥、多種循環(huán)器官疾病等。
此外，如同對(duì)于本發(fā)明抑制劑解釋的那樣，因?yàn)楸景l(fā)明糖胺聚糖具有FPA抑制活性，其能夠用作治療和預(yù)防伴隨糖酵解途徑代謝增進(jìn)的疾病的藥物。
因此，通過(guò)給予需要治療皮膚疾病或者治療或預(yù)防伴隨糖酵解途徑代謝增進(jìn)的疾病的受治療者有效量的本發(fā)明糖胺聚糖能夠治療皮膚疾病和治療或預(yù)防伴隨糖酵解途徑代謝增進(jìn)的疾病。
當(dāng)本發(fā)明的藥用組合物給予生物體時(shí)，依所考慮疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重性而定能夠適宜地選擇所使用的劑型和給藥途徑。例如，本發(fā)明糖胺聚糖能夠作為其本身或以含有其它藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑、稀釋劑等藥用組合物的形式(例如外用制劑如溶液劑、混懸劑、軟膏劑、硬膏劑、洗劑、糊劑、搽劑和貼片以及注射劑、栓劑、片劑、膠囊劑等)經(jīng)過(guò)非腸道或口服安全地給予溫血?jiǎng)游?例如人、小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、兔、狗、貓、馬等)。
當(dāng)本發(fā)明糖胺聚糖用作治療皮膚疾病的藥物時(shí)，非腸道給藥為特別優(yōu)選的，并且適宜于這樣給藥的劑型包括上述外部制劑。能夠通過(guò)(但不局限于)滴入、敷用、貼膏藥等給藥。
本發(fā)明糖胺聚糖在組合物中的配方量和給藥量應(yīng)依制劑的給藥方案、劑型、患者的特殊情況、患者的體重等而定來(lái)單獨(dú)決定，并且它們不被特別限制。然而，本發(fā)明糖胺聚糖的給藥量通常為例如一天大約100μg/kg至大約100mg/kg。至于該制劑的給藥次數(shù)，可為一天一次或者一天2-4次或更多。
待加入到本發(fā)明藥用組合物中的本發(fā)明糖胺聚糖的量依該組合物的劑型而變化。例如其可為每單位組合物大約10μg至50mg，但是其應(yīng)適宜地依劑型、患者的特殊情況等來(lái)控制。
已知通過(guò)小鼠(雄性和雌性)的急性毒性試驗(yàn)測(cè)量的正常肝素的50％致死劑量(LD50)對(duì)于口服給藥不少于5，000mg/kg，對(duì)于皮下或腹膜內(nèi)給藥不少于2，500mg/kg，或者對(duì)于靜脈注射給藥不少于1，000mg/kg，并且目前其一般用作藥物(抗凝血藥)。因此，其安全性已經(jīng)建立。
另一方面，當(dāng)如同在以下實(shí)施例中指出的那樣給予正常大鼠和患有遺傳性糖尿病的小鼠時(shí)，用于本發(fā)明藥用組合物的本發(fā)明糖胺聚糖顯示無(wú)死亡。此外，本發(fā)明糖胺聚糖為在肝素基礎(chǔ)上生成的物質(zhì)，并且與肝素相比較顯示極低的抗凝血活性和出血活性或基本上已經(jīng)喪失這些活性。因此，能夠說(shuō)含有本發(fā)明糖胺聚糖的本發(fā)明藥用組合物對(duì)于溫血?jiǎng)游锸歉叨劝踩摹?．本發(fā)明的生產(chǎn)方法本發(fā)明的生產(chǎn)方法為用于生產(chǎn)上述本發(fā)明糖胺聚糖的方法，并且包括如下步驟(a)在MTSTFA存在下，在不低于100℃的溫度下，于吡啶中將具有包括糖醛酸殘基和葡糖胺殘基的二糖重復(fù)結(jié)構(gòu)的主鏈并且具有硫酸酯基團(tuán)的糖胺聚糖的吡啶可溶的鹽加熱足夠長(zhǎng)的時(shí)間以至于如同通過(guò)酶二糖分析方法測(cè)定的那樣應(yīng)該基本上檢測(cè)不到結(jié)合于葡糖胺殘基6-位羥基基團(tuán)上的硫酸酯基團(tuán)，(b)從在步驟(a)中得到的該反應(yīng)混合物中蒸發(fā)吡啶，并且(c)把水加入到在步驟(b)中得到的該反應(yīng)混合物中，然后在減壓下、于常規(guī)溫度下放置該混合物。
本發(fā)明生產(chǎn)方法的實(shí)例解釋如下。(a)在MTSTFA存在下，于不少于100℃的溫度下，加熱在吡啶中的肝素的吡啶可溶的鹽的步驟在本發(fā)明生產(chǎn)方法中使用的“具有包括糖醛酸殘基和葡糖胺殘基的二糖重復(fù)結(jié)構(gòu)的主鏈并且具有硫酸酯基團(tuán)的糖胺聚糖的吡啶可溶的鹽”優(yōu)選為肝素的吡啶鎓鹽，而不特別限制只要它為肝素的吡啶可溶的鹽。這樣的肝素的吡啶鎓鹽能夠通過(guò)例如使肝素鈉鹽經(jīng)陽(yáng)離子交換柱(如以Amberlite IR-120B(H+形式)樹脂填充的柱(由ORGANO CORP生產(chǎn)))得到，其經(jīng)蒸餾水平衡以轉(zhuǎn)化為游離形式，并且將過(guò)量的吡啶加入到生成的酸部份中以調(diào)節(jié)其pH值到5至7，優(yōu)選為5.5至6.5并且使該部份冷凍干燥。也可使用市售肝素的吡啶鎓鹽。
在MTSTFA存在下，于吡啶中，使上述肝素的吡啶可溶的鹽反應(yīng)。用于該反應(yīng)的MTSTFA正常地以肝素的吡啶可溶的鹽的6至12倍的體積(w/w)，優(yōu)選地為8至11倍的體積(w/w)的量加入。用于該反應(yīng)的吡啶的量?jī)?yōu)選為以肝素的吡啶可溶的鹽的5至150倍的體積(v/w)，更優(yōu)選為10至120倍的體積(v/w)，最優(yōu)選為15至110倍體積(v/w)，但是并不局限于這些量。
對(duì)于上述反應(yīng)的溫度優(yōu)選為100-115℃，最優(yōu)選地為108-112℃。當(dāng)維持上述優(yōu)選溫度范圍內(nèi)的溫度時(shí)，足夠長(zhǎng)的以至于通過(guò)以化學(xué)二糖分析方法測(cè)定到在葡糖胺殘基6-位羥基基團(tuán)上基本上無(wú)結(jié)合的硫酸酯基團(tuán)的時(shí)間優(yōu)選為90至150分鐘，最優(yōu)選為100至130分鐘。此外，例如通過(guò)維持上述溫度10-20分鐘、25-35分鐘或50-70分鐘，其也可能分別制備具有大約50％、大約70％或大約90％的6-脫硫酸比例的糖胺聚糖。即在本發(fā)明生產(chǎn)方法中，可能通過(guò)如上描述的反應(yīng)時(shí)間來(lái)精確控制6-脫硫酸化比例。
在完成上述反應(yīng)之后，該反應(yīng)優(yōu)選地通過(guò)冷卻該反應(yīng)混合物來(lái)停止。例如這樣的冷卻通過(guò)室溫下靜置含有該反應(yīng)混合物的容器或者以流動(dòng)的水或冰來(lái)冷卻。當(dāng)并不特別限制用于冷卻的方法時(shí)，其優(yōu)選地通過(guò)冰冷卻來(lái)達(dá)到目的。(b)蒸發(fā)吡啶的步驟從該冷卻的反應(yīng)混合物中蒸發(fā)吡啶。當(dāng)通過(guò)任何已知的用于蒸發(fā)有機(jī)溶劑的方法蒸發(fā)吡啶時(shí)，其優(yōu)選地通過(guò)減壓下使用于25至37℃下的蒸發(fā)器來(lái)進(jìn)行，因?yàn)槠湟子诓僮鳌Ｍㄟ^(guò)蒸發(fā)使該反應(yīng)混合物濃縮。至于該反應(yīng)混合物的濃縮程度，其優(yōu)選為該反應(yīng)混合物濃度的7至25倍濃度，最優(yōu)選為8至20倍濃度。術(shù)語(yǔ)“減壓”通常意指10-2至10-4托的壓力。(c)加入水并且在常溫下于減壓下放置的步驟向通過(guò)蒸發(fā)吡啶濃縮后的該反應(yīng)混合物中加入水以分解結(jié)合到羥基基團(tuán)上的MTSTFA和游離的MTSTFA。所加入的水量?jī)?yōu)選為相對(duì)于濃縮后的反應(yīng)混合物的1.5至3倍量，最優(yōu)選為1.8至2.5倍量。當(dāng)如上描述的那樣將水加入到該濃縮的反應(yīng)混合物中時(shí)，在反應(yīng)混合物中產(chǎn)生白色混濁。為了消除這樣的白色混濁，加入水的濃縮反應(yīng)混合物在常溫下、減壓下放置。通過(guò)使用蒸發(fā)器可實(shí)現(xiàn)常溫下的減壓，并且該減壓優(yōu)選地維持在25至37℃下直到白色混濁消失。該減壓正常維持5至10分鐘。像上述提到的減壓一樣，該減壓優(yōu)選為10-2至10-4托的壓力，并且其優(yōu)選為該濃縮的反應(yīng)混合物由于減壓而沸騰的壓力。(d)其它步驟在前面提到的步驟(c)的處理之后，優(yōu)選地從該反應(yīng)混合物中除去MTSTFA的分解產(chǎn)物和有機(jī)溶劑。為此目的，能夠使用已知方法，其包括使用透析、乙醇沉淀、陽(yáng)離子交換柱等的方法。
當(dāng)使用透析時(shí)，僅流動(dòng)的水或者流動(dòng)水和蒸餾水的組合能夠用于透析的外部液體。當(dāng)向流動(dòng)的水中透析時(shí)，該透析正常地進(jìn)行至少24小時(shí)，優(yōu)選至少40小時(shí)，最優(yōu)選48小時(shí)。當(dāng)通過(guò)使用流動(dòng)水和蒸餾水的組合進(jìn)行透析時(shí)，該反應(yīng)混合物能夠向流動(dòng)的水中透析，然后向蒸餾水中透析。在實(shí)施如上描述的向流動(dòng)的水中透析之后，向蒸餾水中的透析正常地進(jìn)行至少1小時(shí)，優(yōu)選1.5至2.5小時(shí)。
從其中除去MTSTFA的分解產(chǎn)物和有機(jī)溶劑的反應(yīng)混合物中，通過(guò)使糖胺聚糖沉淀的一般方法，能夠以其鹽的形式得到本發(fā)明的糖胺聚糖。
作為得到以鹽形式的本發(fā)明糖胺聚糖的方法，能夠提到例如包括通過(guò)使用用蒸餾水平衡的陽(yáng)離子交換柱(例如，Amberlite IR-120B(H+形式)樹脂填充柱(由ORGANO CORP.生產(chǎn)))將從所述透析得到的內(nèi)部溶液分級(jí)分離以收集酸性部份，通過(guò)加入堿性水溶液(例如，堿金屬氫氧化物或堿土金屬氫氧化物的水溶液如優(yōu)選地以濃度為0.1-2N的氫氧化鈉水溶液、氫氧化鉀水溶液、氫氧化鎂水溶液和氫氧化鈣水溶液)使該酸性部份的pH調(diào)節(jié)到8至10，優(yōu)選8.5至9.5，將該部份向流動(dòng)水中透析一般至少15小時(shí)，優(yōu)選大約18小時(shí)，然后向蒸餾水透析一般1.5至2.5小時(shí)，并且使從透析中得到的內(nèi)部溶液冷凍干燥的方法。通過(guò)這個(gè)方法，能夠得到本發(fā)明糖胺聚糖的冷凍干燥產(chǎn)物。
如同需要通過(guò)適當(dāng)?shù)厥褂冒ㄊ蛊咸前窔埢?-位氨基基團(tuán)或構(gòu)成主鏈的糖醛酸殘基2-位羥基基團(tuán)硫酸化的方法和包括使構(gòu)成組合主鏈的糖醛酸殘基2-位硫酸酯基團(tuán)釋放的方法，具有在葡糖胺殘基2-位和糖醛酸殘基2-位不同程度硫酸化作用的本發(fā)明糖胺聚糖的改進(jìn)的方案能夠通過(guò)改變使本發(fā)明糖胺聚糖的這樣的硫酸化程度來(lái)制備。
作為使該葡糖胺殘基2-位氨基基團(tuán)硫酸化的方法，例如，能夠提到的是帶有改進(jìn)的Nagasawa等的方法(Carbohydr.Res.(1989)193，165-172)。即把本發(fā)明糖胺聚糖或其鹽溶解在pH大約為9至10的堿性溶液(例如，碳酸鈉溶液、氫氧化鈉溶液、氫氧化鉀溶液等)中，并且在50至55℃下，于6至24小時(shí)內(nèi)另外加入固體磺酸三甲基銨或磺酸三乙基銨。
另外，作為使該糖醛酸殘基2-位羥基基團(tuán)硫酸化的方法，例如，也能夠提到Nagasawa等(Carbohydr．Res.(1989)193，165-172)的方法，該方法與以上提到的方法相同并帶有改進(jìn)。即通過(guò)以常規(guī)方式的鹽交換將本發(fā)明糖胺聚糖制備成為三丁基銨鹽，并且將所得到的本發(fā)明糖胺聚糖的三丁基銨鹽充分溶解于N，N-二甲基甲酰胺，并且在-10至0℃下，使其與5至20摩爾當(dāng)量/(摩爾的游離羥基)的硫酸化吡啶反應(yīng)1小時(shí)。然而，在這個(gè)方法中，與該糖醛酸殘基2-位羥基基團(tuán)的硫酸化一起，葡糖胺殘基6-位硫酸酯基團(tuán)也被硫酸化。因此，當(dāng)使用該方法時(shí)，可優(yōu)選地使該產(chǎn)物再次經(jīng)歷生產(chǎn)本發(fā)明糖胺聚糖的方法以釋放該葡糖胺殘基6-位的硫酸酯基團(tuán)。
作為使該糖醛酸殘基2-位硫酸酯基團(tuán)釋放的方法，能夠提到例如Jaseja等的方法(Can.J.Chem.(1989)67，1449-1456)的部分改進(jìn)的方案。即將本發(fā)明糖胺聚糖的鈉鹽溶于NaOH溶液并立即冷凍干燥。把所得到的冷凍干燥粉末溶于蒸餾水中，并且通過(guò)加入乙酸調(diào)節(jié)到pH6至8，優(yōu)選pH6.5至7.5。然后，該溶液經(jīng)歷透析和冷凍干燥。
本發(fā)明糖胺聚糖的制劑優(yōu)選地含有較少污染的內(nèi)毒素。特別地，包含在1mg本發(fā)明糖胺聚糖制劑中的此污染的內(nèi)毒素的量(內(nèi)毒素活性)優(yōu)選為(但是不局限于)不多于0.2USP內(nèi)毒素單位(EU)，更優(yōu)選不多于0.1EU，最優(yōu)選少于0.05EU。
另外，當(dāng)本發(fā)明糖胺聚糖的制劑用作藥物原料時(shí)，為了確保安全性，本發(fā)明糖胺聚糖的制劑優(yōu)選地具有吡啶的含量不多于200ppm，更優(yōu)選地不多于150ppm，最優(yōu)選地不多于100ppm。按照日本藥局方，在藥用制劑中的吡啶含量被調(diào)節(jié)至不多于200ppm。
附圖的簡(jiǎn)介

圖1顯示了本發(fā)明糖胺聚糖(發(fā)明2)制備期間的13C-NMR譜的變化時(shí)間過(guò)程。圖1(1)顯示了標(biāo)準(zhǔn)肝素(標(biāo)準(zhǔn)H)的13C-NMR譜。圖1(2)、(3)、(4)和(5)顯示了在110℃下通過(guò)分別將保留時(shí)間改變?yōu)?5、30、60和120分鐘所得到的糖胺聚糖的13C-NMR譜(對(duì)照3、對(duì)照4、對(duì)照5和發(fā)明2)。在該圖中，6S為具有6-O-硫酸酯基團(tuán)的葡糖胺殘基6-位碳原子的信號(hào)并且6為不具有6-O-硫酸酯基團(tuán)的葡糖胺殘基6-位碳原子的信號(hào)。
圖2顯示了本發(fā)明糖胺聚糖的13C-NMR譜(發(fā)明1)。
圖3顯示了本發(fā)明糖胺聚糖的13C-NMR譜(發(fā)明3)。
圖4顯示了本發(fā)明糖胺聚糖的13C-NMR譜(發(fā)明4)。
圖5顯示了對(duì)照組糖胺聚糖的13C-NMR譜(對(duì)照1)。
圖6顯示了對(duì)照組糖胺聚糖的13C-NMR譜(對(duì)照2)。
圖7顯示了本發(fā)明糖胺聚糖的促進(jìn)健康皮膚傷口愈合的活性(發(fā)明2)。
圖8顯示了本發(fā)明糖胺聚糖促進(jìn)糖尿病性皮膚潰瘍愈合的活性(發(fā)明2)。
用于實(shí)施本發(fā)明的最佳方式從此以后，本發(fā)明將參照以下實(shí)施例更詳細(xì)地進(jìn)行解釋。
首先將解釋試驗(yàn)方法。試驗(yàn)方法1[通過(guò)使用化學(xué)二糖分析方法并且計(jì)算6-脫硫酸化比例來(lái)檢測(cè)結(jié)合在葡糖胺殘基6-位羥基基團(tuán)上的硫酸酯基團(tuán)]根據(jù)Kariya等(Kariya等，J.Biochem.(1998)123，240-246)的方法，測(cè)定了受試物質(zhì)的6-脫硫酸比例。即把100μl亞硝酸溶液(pH1.5)加入到1mg的樣品中并且于室溫下維持10分鐘。用1N碳酸鈉將該混合物調(diào)節(jié)至pH7.5，并且在其上通過(guò)惰性氣流進(jìn)行干燥。向該干燥產(chǎn)物中加入200μl蒸餾水和200μl含有1％PNP-肼的乙腈，并且在37℃下使該混合物維持30分鐘以使得糖胺聚糖與PNP的偶合反應(yīng)發(fā)生。然后，通過(guò)使用SepPak C-18筒形柱(Waters)部分純化。通過(guò)IPRP-HPLC(離子對(duì)反相HPLC)分析該部分純化的產(chǎn)物以證實(shí)ISMS(IdoA(2S)-AnMan(6S)-PNP)的峰存在或不存在。另外，計(jì)算ISM(IdoA(2S)-AnMan-PNP)和ISMS(IdoA(2S)-AnMan(6S)-PNP)的峰面積并且所得到的值根據(jù)下式用于計(jì)算6-脫硫酸化比例6-脫硫酸化比例=(B0×A1-A0×B1)/(B0(A1+B1))×100(％)其中，A0為當(dāng)以下提到的標(biāo)準(zhǔn)肝素用作樣品時(shí)的ISM的峰面積，B0為當(dāng)以下提到的標(biāo)準(zhǔn)肝素用作樣品時(shí)的ISMS的峰面積，A1為當(dāng)受試物質(zhì)(用作對(duì)待測(cè)物質(zhì)例如標(biāo)準(zhǔn)肝素、本發(fā)明糖胺聚糖等的通用名稱)用作樣品時(shí)的ISM的峰面積，并且B1為當(dāng)受試物質(zhì)用作樣品時(shí)的ISMS的峰面積。試驗(yàn)方法2[使用糖胺聚糖酶消化作用與高效液相色譜法聯(lián)合的酶二糖分析方法](1)用糖胺聚糖酶的消化作用將1.0mg受試物質(zhì)溶于220μl含有2mM乙酸鈣的20mM乙酸鈉(pH7.0)中。把糖胺聚糖酶(每一個(gè)肝素酶20mU，肝素酶Ⅰ和Ⅱ)加入其中，并且使之在37℃下反應(yīng)2小時(shí)。(2)HPLC分析在下列條件下通過(guò)使用HPLC(Shimadzu公司，型號(hào)LC6AD)分析在以上(1)(20μl)中酶消化作用后的溶液。使用與已知方法(Kariya等，Comp.Biochem.Physiol．(1992)103B，473-479)相一致的離子交換柱(Dionex，CarboPac PA-1柱，φ4.0×250mm)，在每分鐘1ml的流速下通過(guò)使用氯化鋰梯度(50mM→2.5M)進(jìn)行洗脫，并在232nm下測(cè)量吸收度。(3)計(jì)算二糖組成，在所有糖醛酸殘基中的2-O-硫酸化糖醛酸殘基的％(mol)和有效二糖收率從通過(guò)HPLC在以上(2)中檢測(cè)的峰面積，通過(guò)測(cè)定每一個(gè)可鑒定的不飽和二糖(ΔDiHS-OS、ΔDiHS-NS、ΔDiHS-6S、ΔDiHS-US、ΔDiHS-di(6，N)S、ΔDiHS-di(U，N)S、ΔDiHS-di(U，6)S和ΔDiHS-tri(U，6，N)S)的量來(lái)得到該二糖組成，并且計(jì)算每一個(gè)不飽和二糖的比例(％(mol))。在所有糖醛酸殘基中的2-O-硫酸化糖醛酸殘基的％(mol)作為在該糖醛酸殘基2-位具有硫酸酯基團(tuán)的不飽和二糖的比例來(lái)計(jì)算(ΔDiHS-US、ΔDiHS-di(U，N)S、ΔDiHS-di(U，6)S和ΔDiHS-tri(U，6，N)S的峰的總面積)，把通過(guò)HPLC鑒定的不飽和二糖的總量[ΔDiHS-OS、ΔDiHS-NS、ΔDiHS-6S、ΔDiHS-US、ΔDiHS-di(6，N)S、ΔDiHS-di(U，N)S、ΔDiHS-di(U，6)S和ΔDiHS-tri(U，6，N)S的峰的總面積]取作100％。
該有效二糖收率作為通過(guò)可鑒定的不飽和二糖(ΔDiHS-OS、ΔDiHS-NS、ΔDiHS-6S、ΔDiHS-US、ΔDiHS-di(6，N)S、ΔDiHS-di(U，N)S、ΔDiHS-di(U，6)S和ΔDiHS-tri(U，6，N)S)的總峰面積在以上二糖分析方法中通過(guò)HPLC分析檢測(cè)的所有峰的總面積中的比例乘以根據(jù)以下試驗(yàn)方法4測(cè)量的酶消化作用的百分?jǐn)?shù)來(lái)表示。試驗(yàn)方法3[分子量的測(cè)定]通過(guò)HPLC凝膠過(guò)濾分析了10μl含有3％(w/w)受試物質(zhì)的溶液。所用的柱為TSK凝膠-(G4000+G3000+G2500)PWXL(Tosoh公司，φ7.8×300mm)。通過(guò)使用0.2M氯化鈉作為洗脫劑在0.6ml/分鐘流速下洗脫該受試物質(zhì)。將差示折光計(jì)(Shimadzu公司，AID-2A型)用于檢測(cè)該受試物質(zhì)。通過(guò)使用預(yù)先測(cè)定分子量的肝素(重均分子量)作為對(duì)照來(lái)計(jì)算該分子量(Kaneda等，Biochem.Biophys.Res.Comm.(1996)220，108-112)。試驗(yàn)方法4[用于酶消化作用的測(cè)量方法](1)糖胺聚糖酶的消化作用將1.0mg受試物質(zhì)溶于220μl含有2mM乙酸鈣的20mM乙酸鈉(pH7.0)中。把糖胺聚糖酶(每一個(gè)肝素酶20mU，肝素酶Ⅰ和Ⅱ)加入其中，并且使之在37℃下反應(yīng)2小時(shí)。(2)通過(guò)凝膠過(guò)濾分析使用HPLC凝膠過(guò)濾分析了根據(jù)以上(1)酶消化作用后得到的20μl溶液。所使用的柱為TSK凝膠-(G4000+G3000+G2500)PWXL(Tosoh公司，φ7.8×300mm)。通過(guò)使用0.2M氯化鈉作為洗脫劑在每分鐘0.6ml的流速下洗脫該受試物質(zhì)。使用差示折光計(jì)(Shimadzu公司，AID-2A型)來(lái)檢測(cè)該受試物質(zhì)。該酶消化性作為相對(duì)于保留時(shí)間在40分鐘(不飽和四糖)、41.5分鐘(三硫酸化不飽和二糖)、42分鐘(二硫酸化不飽和二糖)、43分鐘(單硫酸化不飽和二糖)和45分鐘(無(wú)硫酸酯基團(tuán)的不飽和二糖)的總峰面積在保留時(shí)間41.5分鐘(三硫酸化不飽和二糖)、42分鐘(二硫酸化不飽和二糖)、43分鐘(單硫酸化不飽和二糖)和45分鐘(無(wú)硫酸酯基團(tuán)的不飽和二糖)的總峰面積的百分?jǐn)?shù)來(lái)計(jì)算。試驗(yàn)方法5[用于活化部分組織促凝血酶原激酶時(shí)間(APTT)的測(cè)量方法]用含有3.2％(重量)的構(gòu)櫞酸鈉水溶液的注射器從大鼠下主動(dòng)脈采集構(gòu)櫞酸鈉水溶液9倍體積的血。在4℃下，以1，000×g將該混合物離心10分鐘以得到血漿。將100μl血漿和100μl含有預(yù)先測(cè)定濃度的受試物質(zhì)的生理鹽水分散在測(cè)量杯中并在37℃下溫育1分鐘。然后，將100μl的預(yù)先已在37℃下維持5分鐘的肌動(dòng)蛋白(Yoshitomi制藥工業(yè)有限公司的商品名)加入其中并在37℃下進(jìn)一步溫育2分鐘。隨后，通過(guò)加入已在37℃下預(yù)先維持的100μl的0.02M氯化鈣溶液開始凝血作用。通過(guò)使用自動(dòng)血液凝血測(cè)量?jī)x(Baxter，型號(hào)AMELUNG KC10A)來(lái)測(cè)量凝血時(shí)間。試驗(yàn)方法6[用于凝血酶時(shí)間(TT)的測(cè)量方法]將100μl的根據(jù)對(duì)于上述APTT測(cè)量方法所解釋的方法制備的血漿和100μl含有預(yù)先測(cè)定濃度的受試物質(zhì)的生理鹽水分散在測(cè)量杯中并在37℃下溫育1分鐘。然后，通過(guò)加入已在37℃下預(yù)先維持5分鐘的100μl凝血酶(10U/ml，Yoshitomi制藥工業(yè)有限公司)開始凝血作用。通過(guò)使用自動(dòng)血液凝血測(cè)量?jī)x(Baxter，型號(hào)AMELUNG KC10A)來(lái)測(cè)量凝血時(shí)間。試驗(yàn)方法7[用于抗凝血酶活性的測(cè)量方法]
在冷卻狀態(tài)下，把350μl含有150mM氯化鈉、10mM氯化鈣和0.1％牛血清清蛋白、100μl牛ATⅢ溶液的20mM Tris緩沖液(在同一緩沖液中為1U/ml)和100μl的兩倍連續(xù)稀釋的受試物質(zhì)(樣品)的水溶液三份溶液混合并且在37℃下溫育2分鐘。向該溶液中加入50μl牛凝血酶溶液(在蒸餾水中為50mU/ml)并且在37℃下溫育5分鐘。然后，向該混合物加入100μl的底物溶液(Boc-Val-Pro-Arg-MCA(peptide Laboratory，Boc意指叔丁氧基羰基，并且MCA意指7-氨基-4-甲基香豆素，70μM水溶液)，將該混合物攪拌并且在37℃下溫育3分鐘。隨后，通過(guò)加入300μl的30％乙酸終止該反應(yīng)。在激發(fā)波長(zhǎng)350nm和熒光波長(zhǎng)444nm下測(cè)量該反應(yīng)混合物的熒光強(qiáng)度。使用蒸餾水的空白組1替代以上反應(yīng)混合物組成中的樣品并且空白組2由僅包含底物的反應(yīng)混合物組成，并且該緩沖液以相同的方式處理，由此測(cè)量其熒光強(qiáng)度。
根據(jù)以下公式計(jì)算凝血酶活性抑制率，并且將在受試物質(zhì)濃度下的抑制率繪制在半對(duì)數(shù)圖中以得到呈現(xiàn)50％抑制作用的濃度(IC50)。
凝血酶活性抑制率=(1-(ΔFs/ΔFb))×100(％)其中，ΔFs代表(樣品熒光強(qiáng)度-空白組1熒光強(qiáng)度)和ΔFb代表(空白組2熒光強(qiáng)度-空白組1熒光強(qiáng)度)。試驗(yàn)方法8[用于出血活性的測(cè)量方法]用乙醚麻醉大鼠，然后在每個(gè)給藥部位用0.4ml含有0.2mg、0.4mg或0.8mg的每一種受試物質(zhì)的生理鹽水在其背上進(jìn)行皮下給藥。至于陰性對(duì)照組，每個(gè)給藥部位用0.4ml生理鹽水皮下給藥。放血24小時(shí)后處死大鼠。除去圍繞每個(gè)給藥部位的皮膚并且通過(guò)使用游標(biāo)卡尺來(lái)測(cè)量該皮下瘀斑的長(zhǎng)短直徑以計(jì)算面積。通過(guò)Dunnett氏多元比較試驗(yàn)來(lái)測(cè)量與陰性對(duì)照組的差異。試驗(yàn)方法9[用于促進(jìn)bFGF活性作用的測(cè)量方法1(加入NaClO3)]將在含有10％牛血清的DMEM(Asahi Techno Glass)中傳代培養(yǎng)的A31細(xì)胞(BALB/C小鼠3T3細(xì)胞)以5×104細(xì)胞/ml密度懸浮于含有20mM的NaClO3和2ng/ml人重組堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hrbFGF，Promega)的DMEM-ITS培養(yǎng)基(由GIBCO BRL制備的ITS、10mg/l胰島素、5.5mg/l運(yùn)鐵蛋白和6.7μg/l亞硒酸)中。以1μg/ml的最終濃度把每一種受試物質(zhì)加入到該細(xì)胞懸浮液中。在96孔微量滴定板上的每一個(gè)孔中接種100μl的細(xì)胞懸浮液并且進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)3天后，每一個(gè)孔中加入20μl的Celltiter96AQ非放射性細(xì)胞增殖測(cè)試溶液(Promega)，并且在37℃下培養(yǎng)2小時(shí)。通過(guò)使用吸光計(jì)測(cè)量在492nm波長(zhǎng)下的吸收以量化每一個(gè)孔中細(xì)胞增殖。通過(guò)將加入標(biāo)準(zhǔn)肝素時(shí)，細(xì)胞增殖率取作100，而陰性對(duì)照組的細(xì)胞增殖率(沒(méi)有加入受試物質(zhì)，僅加入作為溶劑的磷酸鹽緩沖的生理鹽水(PBS))取作0，來(lái)計(jì)算加入每一種受試物質(zhì)時(shí)的細(xì)胞增殖率。[用于促進(jìn)bFGF活性作用的測(cè)量2(沒(méi)有加入NaClO3)]將在含有10％牛血清的DMEM(Asahi Techno Glass)中傳代培養(yǎng)的A31細(xì)胞(BALB/C小鼠3T3細(xì)胞)以5×104細(xì)胞/ml密度懸浮于含有2ng/ml的hrbFGF(Promega)的DMEM-ITS培養(yǎng)基(由GIBCO BRL制備的ITS、10mg/l胰島素、5.5mg/l運(yùn)鐵蛋白和6.7μg/l亞硒酸)中。以20μg/ml的最終濃度把每一種受試物質(zhì)加入到該細(xì)胞懸浮液中。在96孔微量滴定板上的每一個(gè)孔中接種100μl的細(xì)胞懸浮液并且進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)3天后，每一個(gè)孔中加入20μl的Celltiter 96AQ非放射性細(xì)胞增殖測(cè)試溶液(Promega)，并且在37℃下培養(yǎng)2小時(shí)。通過(guò)使用吸光計(jì)在492nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸收度來(lái)量化每一個(gè)孔中細(xì)胞增殖。通過(guò)將標(biāo)準(zhǔn)肝素加入時(shí)的細(xì)胞增殖率取作100，而陰性對(duì)照組(沒(méi)有加入受試物質(zhì)，僅加入作為溶劑的磷酸鹽緩沖的生理鹽水(PBS))的細(xì)胞增殖率取作0，來(lái)計(jì)算每一種受試物質(zhì)加入時(shí)的細(xì)胞增殖率。[用于促進(jìn)bFGF活性作用的測(cè)量3(沒(méi)有加入NaClO3/原代培養(yǎng)細(xì)胞)]在乙醚麻醉下，把C57BL/6小鼠(9周齡，雌性，Charles River)背部毛刮凈并在皮下植入預(yù)滅菌棉球(2個(gè)位置/小鼠)。10天后將這些棉球與肉芽組織一同移去。用青霉素/鏈霉素溶液(青霉素200U／ml，鏈霉素200μg/ml)洗滌棉球兩次并用PBS洗滌一次。然后，除去覆蓋在這些棉球上的膜。把棉球轉(zhuǎn)移到包括含有0.1％膠原酶和0.25％胰蛋白酶的溶液的試管中，并且在37℃下于恒溫器中振搖1小時(shí)。該處理過(guò)的溶液通過(guò)細(xì)胞滲濾器(φ=70μm)篩分。在其中加入含有10％牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(Iwaki)，輕微攪拌該混合物并以2，000×g離心3分鐘。用相同的培養(yǎng)基將得到的細(xì)胞洗滌三次，并且以密度為1×105細(xì)胞/ml再懸浮于相同的培養(yǎng)基中并接種到10cm培養(yǎng)皿上。次日，除去未附著的細(xì)胞并在CO2孵育器中于37℃下培養(yǎng)這些細(xì)胞直到得到分會(huì)合狀態(tài)。
通過(guò)使用0.25％胰蛋白酶和0.05％EDTA溶液從培養(yǎng)皿中分離分會(huì)合的細(xì)胞。通過(guò)離心洗滌該細(xì)胞并以密度為5×104細(xì)胞/ml懸浮于含有0.1％透析的牛血清的Basal MF/S-MEM培養(yǎng)基(Gibco)中。在96孔微量滴定板上的每一個(gè)孔中分散100μl的細(xì)胞懸浮液。另外，把50μl溶有4μg/ml的hrbFGF(Promega)的Basal ME/S-MEM培養(yǎng)基和50μl溶有發(fā)明2的Basal ME/S-MEM培養(yǎng)基分散到每一個(gè)孔中，并且在CO2孵育器中于37℃下將細(xì)胞培養(yǎng)3夭。在完成培養(yǎng)之后，向每一個(gè)孔中加入15μl細(xì)胞計(jì)數(shù)溶液(Dojin)并且把該培養(yǎng)物繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。然后，在450nm下測(cè)量該培養(yǎng)基的吸收度。使用僅有Basal ME/S-MEM培養(yǎng)基作為溶劑但是未加入發(fā)明2的樣品作為陰性對(duì)照組。加入溶有標(biāo)準(zhǔn)H以替代發(fā)明2的BasalME/S-MEM培養(yǎng)基的樣品用作陽(yáng)性對(duì)照。
參照實(shí)施例1[實(shí)施例中用作對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)肝素]作為標(biāo)準(zhǔn)肝素，使用源于豬小腸的肝素(來(lái)自SPL的市售產(chǎn)品)。該肝素具有以下理化性質(zhì)。(1)根據(jù)以上試驗(yàn)方法2，通過(guò)二糖分析方法得到以下二糖組成(％(mol))(其有效二糖收率85.5％)。
表2 (2)抗凝血活性為160IU/mg。(3)通過(guò)以上試驗(yàn)方法3測(cè)得平均分子量在13，000至15，000Da范圍內(nèi)。(4)通過(guò)以上試驗(yàn)方法4測(cè)得酶消化活性為89.8％。(5)當(dāng)使用含有3μg/ml標(biāo)準(zhǔn)H的溶液時(shí)，通過(guò)以上試驗(yàn)方法5的APTT測(cè)量方法測(cè)得APTT不少于200秒。(6)當(dāng)使用含有1μg/ml標(biāo)準(zhǔn)H的溶液時(shí)，通過(guò)以上試驗(yàn)方法6的TT測(cè)量方法測(cè)得TT不少于600秒。
以后，該標(biāo)準(zhǔn)肝素僅稱作“標(biāo)準(zhǔn)H”。
參照實(shí)施例2制備對(duì)照糖胺聚糖1(已知物質(zhì)1)按照在WO96/01278的實(shí)施例中描述的方法，制備對(duì)照糖胺聚糖1(在下文中簡(jiǎn)單稱作“對(duì)照1”)。即把以常規(guī)方式由標(biāo)準(zhǔn)H作為吡啶鎓鹽制備的200mg肝素吡啶鎓鹽(在下文中稱作“HepP”)加入到并溶解在20ml無(wú)水吡啶中。向該溶液加入4ml(大約4g，20倍重量的HepP)的MTSTFA并且在95℃下將該混合物攪拌2小時(shí)。然后，向該混合物中加入20ml水并且使用Millipore超濾膜(Millipore)透析該混合物。在100℃下加熱該透析溶液直到白色混濁消失。隨后，通過(guò)加入NaOH(1N)將該溶液調(diào)節(jié)至pH9，向流動(dòng)水的透析進(jìn)行18小時(shí)并且對(duì)蒸餾水透析進(jìn)行2小時(shí)。冷凍干燥該透析溶液以得到130mg的粉末狀對(duì)照1(鈉鹽)。
參照實(shí)施例3制備對(duì)照糖胺聚糖2(已知物質(zhì)2，溶劑分解+N-再硫酸化作用)按照在WO95/30424的實(shí)施例1中的描述，制備對(duì)照糖胺聚糖2(在下文中簡(jiǎn)單稱作“對(duì)照2”)。即加入50mg的HepP并溶解在10ml水中。用90ml二甲基亞砜稀釋該溶液，并在熱水浴上于100℃下將該混合物攪拌72小時(shí)。向其加入5％碳酸氫鈉50ml并將該混合物冷卻。然后，每次12小時(shí)向1L 0.1M乙酸鈉溶液透析兩次并且向蒸餾水徹底透析。
向該透析溶液中加入濃度為0.1M的碳酸鈉水溶液和另外5摩爾當(dāng)量的吡啶/SO3并且于60℃下將該混合物攪拌24小時(shí)。在24小時(shí)期間，每8小時(shí)加入5摩爾當(dāng)量的吡啶/SO3兩次。然后，向流動(dòng)水透析該溶液18小時(shí)并向蒸餾水透析2小時(shí)。過(guò)濾該透析溶液并冷凍干燥以得到47.5mg的粉末狀對(duì)照2(鈉鹽)。
實(shí)施例1[制備本發(fā)明糖胺聚糖等]在以下表3中描述的每一個(gè)反應(yīng)條件下將HepP和MTSTFA加入到吡啶中，并且攪拌該混合物，加熱和溫育一定的時(shí)間。在冰上冷卻含有該反應(yīng)混合物的容器。然后，減壓下通過(guò)使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮該混合物10倍，并且然后向其中加入2倍體積的蒸餾水。另外，減壓下通過(guò)使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器放置該混合物直到白色混濁消失，并向流動(dòng)水透析48小時(shí)和對(duì)蒸餾水透析2小時(shí)。該透析溶液通過(guò)以Amberlite IR-120B(H+形式)樹脂(ORGANO CORP.)填充的柱(用蒸餾水平衡)，并且僅有酸性部份集中在收集的部份中。通過(guò)加入NaOH(1N)將該酸性部份調(diào)至pH9，向流動(dòng)水透析18小時(shí)并且向蒸餾水透析2小時(shí)。冷凍干燥該透析溶液以得到每一個(gè)作為粉末的靶制劑(鈉鹽)。
得到的制劑(本發(fā)明1至4的糖胺聚糖(發(fā)明1至4)和對(duì)照的糖胺聚糖3至6(對(duì)照3至6))和用于每一個(gè)制劑的條件顯示在表3中。
表3 *蒸汽夾套用于加熱不同的反應(yīng)規(guī)模用于發(fā)明1至4。與發(fā)明2相同的反應(yīng)規(guī)模用于對(duì)照3至5，但是改變反應(yīng)時(shí)間以得到對(duì)照組。以對(duì)于發(fā)明2的相同量的HepP用于對(duì)照6，但是以20倍的量使用作為硅烷基化試劑的MTSTFA并且降低該反應(yīng)溫度以得到該對(duì)照組。
按照試驗(yàn)方法3測(cè)量平均分子量。結(jié)果揭示對(duì)于所有的物質(zhì)而言大約為12，500Da并且發(fā)現(xiàn)該分子量基本上一直未降低。
實(shí)施例2(1)酶消化性按照在試驗(yàn)方法4中描述的方法測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)H、發(fā)明1至4和對(duì)照1、2和6的酶消化性。也按照在試驗(yàn)方法1(表4)中描述的方法計(jì)算除了標(biāo)準(zhǔn)H以外的物質(zhì)的6-脫硫酸化比例。顯示在表4中的對(duì)照1的6-脫硫酸化比例引用自WO96/01278中所給出的值。
表4 *在WO96/01278中給出的6-脫硫酸化比例。
這揭示了在本發(fā)明糖胺聚糖(發(fā)明1至4)和對(duì)照2中得到高的酶消化性和高的6-脫硫酸化比例。(2)二糖組成按照在試驗(yàn)方法2(表5)中描述的酶二糖分析方法測(cè)量了對(duì)標(biāo)準(zhǔn)H、發(fā)明1至4和對(duì)照1、2和6的二糖組成。
表5 注0表明該值低于檢測(cè)限。單位％(mol)。
結(jié)果，通過(guò)使用溶劑解的脫硫酸化方法制備的對(duì)照2呈現(xiàn)了明顯不同于其它物質(zhì)的二糖組成。也發(fā)現(xiàn)本發(fā)明糖胺聚糖與標(biāo)準(zhǔn)H、對(duì)照1和對(duì)照6相比較具有較少的6-位硫酸酯基團(tuán)。另外，本發(fā)明的糖胺聚糖特征在于未檢測(cè)到三硫酸化的不飽和二糖(ΔDiHS-(U，6，N)triS)。
實(shí)施例3內(nèi)毒素濃度的測(cè)量使用Toxicolor-LS-50M儀(Seikagaku公司)通過(guò)比色定量測(cè)定本發(fā)明糖胺聚糖制劑中所污染的內(nèi)毒素。Toxicolor-Et-2(Seikagaku公司)用作標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素。
即按照用于描述在實(shí)施例1中的制備發(fā)明2的方法，通過(guò)使用無(wú)內(nèi)毒素儀器、吡啶和蒸餾水來(lái)制備發(fā)明5。然后，將50μl的(1)的水溶液(其中發(fā)明5稀釋成濃度為2mg/ml)和(2)含有0.212EU/mL內(nèi)毒素的(1)的水溶液各分散在無(wú)內(nèi)毒素的微量滴定板的孔中。相似地，將(3)含有0.424EU/mL的Et-2作為標(biāo)準(zhǔn)溶液的水溶液50μl和(4)50μl蒸餾水(無(wú)內(nèi)毒素)作為空白的每一個(gè)分散在無(wú)內(nèi)毒素的微量滴定板的孔中。將含在Toxicolor-LS-50M儀中的50μl主要反應(yīng)物加入分散有(1)至(4)的每一個(gè)孔中，并且迅速將該板置于孔讀數(shù)器SK601(購(gòu)買自Seikagaku公司)上。在37℃下30分鐘反應(yīng)期間內(nèi)測(cè)量在405nm的測(cè)量波長(zhǎng)下和492nm的對(duì)照波長(zhǎng)下的吸收度的時(shí)間過(guò)程(mAbs/min)以得到絕對(duì)校準(zhǔn)曲線，該曲線用于計(jì)算內(nèi)毒素的濃度。
因?yàn)榘l(fā)明5本身具有針對(duì)LAL試劑的抑制活性或活性過(guò)強(qiáng)是可能的，按照以下等式由相應(yīng)于加入的內(nèi)毒素單位量的測(cè)量值得到加入收率，并且通過(guò)與其相乘來(lái)校正實(shí)際測(cè)量值。
{(加入的測(cè)量值)-(未加入的測(cè)量值)}/(加入內(nèi)毒素的濃度)由此得到的在發(fā)明5的10mg/ml水溶液中的內(nèi)毒素活性為0427EU/ml。即發(fā)明5的污染的內(nèi)毒素量為0.0427EU/mg。因此，這揭示了作為藥用制劑具有污染了足夠低的內(nèi)毒素量的本發(fā)明糖胺聚糖制劑僅能通過(guò)本發(fā)明制備方法來(lái)制備。
實(shí)施例4吡啶含量的測(cè)定測(cè)量了殘留在本發(fā)明糖胺聚糖中吡啶的含量。即將發(fā)明3(20mg)加入到5N的NaOH(1ml)中，并且把該溶液超聲處理5分鐘。向該溶液中加入1ml二甲基醚并且劇烈攪拌該混合物2分鐘。然后，以3，000×g將該溶液離心10分鐘以分離成上層(1)(有機(jī)層)和下層(1)(水溶液層)。向該下層(1)中加入1ml二甲基醚并再次劇烈攪拌該混合物。然后在如上相同的條件下離心該溶液以分離成上層(2)(有機(jī)層)和下層(2)(水溶液層)。棄去下層(2)。合并上層(1)和上層(2)以得到2ml提取液(1)。
向如上描述的得到的提取液(1)中加入400μl的2N HCl并且劇烈攪拌該混合物2分鐘。以3，000×g將該混合物離心10分鐘以分離成上層(3)(有機(jī)層)和下層(3)(水溶液層)。棄去上層。向下層(3)中加入5 N的NaOH(800μl)和另外300μl的二氯甲烷，然后劇烈攪拌該混合物2分鐘。以3，000×g將該溶液離心10分鐘以分離成上層(4)(水溶液層)和下層(4)(有機(jī)層)。棄去上層(4)。通過(guò)氣相層析法來(lái)分析1μl的下層(4)。
將GC-18APFSC(Shimadzu公司)用于該氣相層析法并且使用DB-5ms(φ0.25mm(I.D.0.5μm)×30mJ&W)作為柱。氦用作流動(dòng)相。在80℃下將流速設(shè)置成22cm/sec并且使該柱在80℃下維持1分鐘。然后，該柱加熱爐溫度以每分鐘10℃的速度增至120℃用于洗脫。通過(guò)使用FID(火焰離子化檢測(cè)器)在300℃下進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)分析在濃度分別為20、40、60、80和100ppm下的1μl含有吡啶的甲醇來(lái)建立校準(zhǔn)曲線。將發(fā)明3的水分含量設(shè)置為10％以便計(jì)算。對(duì)于發(fā)明3而言，吡啶含量的提取和量化進(jìn)行兩次。結(jié)果，該吡啶含量?jī)蓚€(gè)測(cè)量值為73.1ppm和70.3ppm。兩個(gè)數(shù)值可考慮低于200ppm，其為對(duì)藥物制劑的吡啶含量的調(diào)控值。
實(shí)施例5[通過(guò)13C-核磁共振譜的結(jié)構(gòu)分析]通過(guò)13C-核磁共振譜(13C-NMR)分析標(biāo)準(zhǔn)H、發(fā)明1至4和對(duì)照3至5(標(biāo)準(zhǔn)H圖1(1)，發(fā)明1圖2，發(fā)明2圖1(5)，發(fā)明3圖3，發(fā)明4圖4，對(duì)照3圖1(2)，對(duì)照4圖1(3)，對(duì)照5圖1(4))。型號(hào)為QE300(GE)的NMR光譜儀用于該13C-NMR譜。以氧化氘制備每一個(gè)受試物質(zhì)的5％(w/v)溶液。在80℃的測(cè)量溫度下，采用60°的脈中寬度和90，000次的積分?jǐn)?shù)，當(dāng)TSP(Wako純化學(xué)工業(yè)有限公司)用作標(biāo)準(zhǔn)(0ppm)(作為內(nèi)標(biāo)物)時(shí)，通過(guò)使用顯示51.66ppm化學(xué)位移的甲醇進(jìn)行測(cè)量。標(biāo)準(zhǔn)H、發(fā)明1至4的信號(hào)的化學(xué)位移如下(表6)。
表6 單位ppm
13C-NMR的結(jié)果顯示在69.1ppm(具有硫酸酯基團(tuán)的6-位碳原子的信號(hào))和62.6至63.0ppm(不具有硫酸酯基團(tuán)的6-位碳原子的信號(hào))檢測(cè)到該葡糖胺殘基的C-6的信號(hào)。通過(guò)使用以上信號(hào)強(qiáng)度和信號(hào)強(qiáng)度比例，6-位未硫酸化的葡糖胺殘基(6-位無(wú)硫酸化GlcN比例)的比例和基于每一個(gè)樣品(發(fā)明1至4和對(duì)照3至5)的標(biāo)準(zhǔn)H的葡糖胺殘基6-位脫硫酸化比例(de-6S比例)的計(jì)算結(jié)果顯示如下。
表7 注0*表示該值為低于測(cè)量限。
如從這些結(jié)果顯而易見的是，當(dāng)在以上脫硫酸作用的條件下于110℃溫育時(shí)通過(guò)大約2小時(shí)的反應(yīng)得到幾乎100％的6-位脫硫酸作用。
通過(guò)使用如上所述13C-NMR光譜來(lái)分析對(duì)照1和對(duì)照2。對(duì)于對(duì)照1而言，在靠近發(fā)明1至4的那些的位置檢測(cè)到每一個(gè)碳原子的峰位置，但是在67ppm和96.5至97.0ppm(連續(xù))檢測(cè)到發(fā)明1至4和標(biāo)準(zhǔn)H的任何一個(gè)中未觀察到特征峰(圖5)。因?yàn)樵趯?duì)照3、對(duì)照4和對(duì)照5中(在制備發(fā)明2中通過(guò)改變反應(yīng)時(shí)間得到的物質(zhì))未觀察到這些特征峰，這揭示了對(duì)照1具有不同于本發(fā)明糖胺聚糖的結(jié)構(gòu)或通過(guò)改變6-位脫硫酸化反應(yīng)時(shí)間得到的物質(zhì)。
至于對(duì)照2，發(fā)現(xiàn)在70.0至71.0ppm范圍內(nèi)未觀察到其對(duì)標(biāo)準(zhǔn)H和發(fā)明1至4所觀察到的糖醛酸3-位碳原子的峰(圖6)。另外，當(dāng)對(duì)該肝素結(jié)構(gòu)所觀察到的大約98.3ppm、100ppm和102ppm的峰進(jìn)行比較時(shí)，大約98.3ppm的峰是最高的，其成為圖表的特征。這些結(jié)果也證實(shí)對(duì)照2也具有不同于本發(fā)明糖胺聚糖的結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例6[抗凝血活性的測(cè)量](1)活化的部分組織促凝血酶原激酶時(shí)間(APTT)的測(cè)定按照在試驗(yàn)方法5中描述的方法測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)H、發(fā)明2、對(duì)照4和對(duì)照5的APTT(表8)。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在標(biāo)準(zhǔn)H、對(duì)照4和對(duì)照5中APTT被延長(zhǎng)，而發(fā)明2顯示對(duì)延長(zhǎng)APTT幾乎無(wú)作用。因?yàn)閷?duì)照1和對(duì)照6的6-位脫硫酸比例介于對(duì)照4和對(duì)照5的脫硫酸比例之間，預(yù)期它們的抗凝血活性將介于對(duì)照4和對(duì)照5之間。
表8 注-表示“未測(cè)定”。單位秒(2)凝血酶時(shí)間(TT)的測(cè)定按照在試驗(yàn)方法6中描述的方法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)H、發(fā)明2、對(duì)照4和對(duì)照5的TT(表9)。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在標(biāo)準(zhǔn)H、對(duì)照4和對(duì)照5中TT被延長(zhǎng)，而發(fā)明2顯示對(duì)延長(zhǎng)TT無(wú)作用。因?yàn)閷?duì)照1和對(duì)照6的6-位脫硫酸比例介于對(duì)照4和對(duì)照5的脫硫酸比例之間，預(yù)期它們的抗凝血活性將介于對(duì)照4和對(duì)照5之間。
表9

注-表示“未測(cè)定”。單位秒(3)抗凝血酶活性的測(cè)定按照在試驗(yàn)方法7中描述的方法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)H、發(fā)明2和對(duì)照1的抗凝血酶活性(表10)。這些結(jié)果揭示與標(biāo)準(zhǔn)H和對(duì)照1相比發(fā)明2的抗凝血酶活性基本上被降低。
表10

實(shí)施例7[本發(fā)明糖胺聚糖的出血活性]按照在試驗(yàn)方法8中描述的方法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)H和發(fā)明2的出血活性(表11)。這些結(jié)果揭示發(fā)明2完全喪失出血活性。
表11

注-表示“未測(cè)定”。
實(shí)施例8[本發(fā)明糖胺聚糖對(duì)健康皮膚傷口的促進(jìn)傷口愈合活性]通過(guò)使用健康大鼠檢查本發(fā)明糖胺聚糖對(duì)健康皮膚傷口的促進(jìn)傷口愈合活性。即把健康大鼠進(jìn)行背部刮毛，并且通過(guò)使用φ8mm眼科環(huán)鋸將該皮膚解剖至皮下區(qū)域。經(jīng)使用眼科剪刀和鑷子移去皮膚以在大鼠背上建立兩個(gè)有缺陷的傷口。然后，制備每一個(gè)含有0.5％(重量)的標(biāo)準(zhǔn)H、發(fā)明2或?qū)φ?的油膏劑，并且每天涂敷0.1g每一種膏劑以比較基于愈合面積的傷口愈合程度。乙醚麻醉下使大鼠保持靜止，然后以恒定不變的焦距拍攝這些缺陷部分的照片。通過(guò)使用成像分析系統(tǒng)在這些正片上測(cè)定皮膚缺陷部分以進(jìn)行測(cè)量。通過(guò)從在建立該缺陷部分之后的面積迅速減去每一次測(cè)量的面積來(lái)得到每一個(gè)愈合面積。通過(guò)Tukey氏多重比較試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果，從通過(guò)涂敷使用發(fā)明2制備的膏劑至上述組動(dòng)物中觀察到明顯的促進(jìn)皮膚傷口愈合活性(圖7)。
實(shí)施例9[本發(fā)明糖胺聚糖的促進(jìn)糖尿病性皮膚潰瘍的愈合活性]通過(guò)使用患有遺傳性糖尿病的小鼠(db/db小鼠(雌性)日本Clare)檢查本發(fā)明糖胺聚糖的促進(jìn)糖性尿病皮膚潰瘍的愈合活性。即將患有遺傳性糖尿病的小鼠進(jìn)行背部刮毛，并且通過(guò)使用φ8mm眼科環(huán)鋸將該皮膚解剖至皮下區(qū)域。經(jīng)使用眼科剪刀和鑷子移去皮膚以在其背部建立兩個(gè)有缺陷的傷口。然后，每天滴入50μl的溶有1％(w/w)的標(biāo)準(zhǔn)H、發(fā)明2或?qū)φ?的生理鹽水以比較傷口愈合程度。乙醚麻醉下使大鼠保持靜止，然后以恒定不變的焦距拍攝這些缺陷部分的照片。通過(guò)使用成像分析系統(tǒng)在這些正片上測(cè)量皮膚缺陷部分以進(jìn)行測(cè)量。通過(guò)從在建立該缺陷部分之后的面積迅速減去每一次測(cè)量的面積來(lái)得到每一個(gè)愈合面積。通過(guò)Tukey氏多重比較試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果，其揭示了發(fā)明2從給藥開始到第11天后統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的促進(jìn)愈合，盡管前7夭在任何受試物質(zhì)中未發(fā)現(xiàn)到顯著的差異。
實(shí)施例10[本發(fā)明糖胺聚糖對(duì)bFGF親和性的測(cè)量]測(cè)量了本發(fā)明糖胺聚糖對(duì)細(xì)胞增殖因子的親和性。即將0.2mg的發(fā)明2溶于100μl的50mM碳酸氫鈉緩沖液(pH8.5)中。向其中加入含有74μg的NHS-LC-生物素(琥珀酰亞胺基-6-(生物素酰胺)-己酸酯，Pierce)的水溶液，并且使該混合物在室溫下反應(yīng)30分鐘。隨后，向該溶液中加入2.5倍體積乙醇，并經(jīng)離心收集沉淀的和生物素?；陌l(fā)明2。將生物素?；陌l(fā)明2固定在抗生物素?；膫鞲衅髑镀?BIAcore AB，SA)上。使溶于液相的bFGF與傳感器嵌片表面發(fā)生接觸，然后通過(guò)兩種方法分析發(fā)明2和bFGF之間的相互作用，這兩種方法為親和性和動(dòng)力學(xué)分析與穩(wěn)態(tài)分析方法，兩者都使用表面胞質(zhì)基因效應(yīng)。
結(jié)果，通過(guò)前一種分析方法得到的締合速度常數(shù)(Ka)對(duì)于用作對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)H和發(fā)明2分別為1.3(M-1S-110-6)和1.0(M-1S-110-6)。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)H和發(fā)明2的解離速度常數(shù)(Kd)分別為4.8(S-1103)和5.3(S-1103)。由這些結(jié)果計(jì)算的解離常數(shù)(KD)對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)H和發(fā)明2分別為4.1nM和4.3nM。
通過(guò)后一種分析方法得到的解離常數(shù)(KD)對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)H和發(fā)明2分別為23nM和24nM。
從這些結(jié)果中顯而易見地是發(fā)明2對(duì)bFGF的親和性基本上與標(biāo)準(zhǔn)H的親和性相同。
實(shí)施例11[本發(fā)明糖胺聚糖的促進(jìn)bFGF活性的作用的測(cè)量(加入NaClO3)]按照在試驗(yàn)方法9中描述的[對(duì)促進(jìn)bFGF活性的作用的測(cè)量1]測(cè)量了發(fā)明2的促進(jìn)bFGF活性的作用。相似地，按照相同方法也測(cè)量了對(duì)照1和對(duì)照2的促進(jìn)bFGF活性的作用。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)發(fā)明2具有與標(biāo)準(zhǔn)H相同程度的促進(jìn)bFGF活性的作用(表12)。也發(fā)現(xiàn)對(duì)照1與標(biāo)準(zhǔn)H相比較具有大約26％的促進(jìn)bFGF活性的作用，即不多于發(fā)明2的作用的1/4。提示通過(guò)13C-NMR揭示的結(jié)構(gòu)差異引起促進(jìn)bFGF活性的作用的差異。
表12

實(shí)施例12[本發(fā)明糖胺聚糖的促進(jìn)bFGF活性的作用的測(cè)量2(未加入NaClO3)]按照在試驗(yàn)方法9中描述的[對(duì)促進(jìn)bFGF活性的作用的測(cè)量2]測(cè)量了本發(fā)明(發(fā)明2)糖胺聚糖的促進(jìn)bFGF活性的作用。對(duì)照2用作比較對(duì)照組。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)發(fā)明2具有與標(biāo)準(zhǔn)H相同程度的促進(jìn)bFGF的活性作用(表13)。這也揭示了對(duì)照2的促進(jìn)bFGF活性的作用不多于發(fā)明2的一半。
表13

實(shí)施例13[本發(fā)明糖胺聚糖的促進(jìn)bFGF活性的作用的測(cè)量3(未加入NaClO3/原代培養(yǎng)細(xì)胞)]按照在試驗(yàn)方法9中描述的[對(duì)促進(jìn)bFGF活性的作用的測(cè)量3]測(cè)量了本發(fā)明(發(fā)明2)糖胺聚糖在原代培養(yǎng)細(xì)胞上對(duì)bFGF活性的促進(jìn)作用。標(biāo)準(zhǔn)H用作比較對(duì)照組。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)發(fā)明2在原代培養(yǎng)細(xì)胞上與具有75％的標(biāo)準(zhǔn)H的促進(jìn)bFGF活性的作用(表14)。
表14

實(shí)施例14[本發(fā)明糖胺聚糖對(duì)果糖-1，6-二磷酸醛縮酶親和性的測(cè)量]通過(guò)親和色譜法測(cè)量了其為呼吸作用中糖酵解途徑的關(guān)鍵酶的果糖-1，6-二磷酸醛縮酶(在下文稱作“FPA”)與本發(fā)明糖胺聚糖之間的親和性，其中使用了按照Sasaki等(J.Chromatogr.(1987)400，123-132)的方法制備的親和凝膠載體填充的FPLC的柱。該親和凝膠載體制備如下。將200mg的發(fā)明2溶于5ml的2M磷酸鹽緩沖液(pH7.2)中，并把5g氨基瓊脂糖凝膠粉末懸浮在該溶液中。將15mg的NaB(CN)H3加入到該混合物中，室溫下充分?jǐn)嚢柙摶旌衔锊⑹怪磻?yīng)24小時(shí)。在反應(yīng)完成后，過(guò)濾含有該偶合產(chǎn)物的凝膠并以水洗滌3次以完全脫鹽。把該脫鹽凝膠懸浮在5ml的0.2M的CH3COONa溶液中，并向其內(nèi)加入2.5ml乙酸酐，使之在0℃下反應(yīng)30分鐘并然后在室溫下反應(yīng)30分鐘。在該反應(yīng)完成后，洗滌該生成的凝膠以完全脫鹽。
把A4醛縮酶、C4醛縮酶和其雜化型醛縮酶的混合物上樣到用凝膠載體裝填的柱上，在所述凝膠載體上用含有1mM EDTA和0.5mM2-巰基乙醇的10mM的Tris-HCl(pH7.5)固定和平衡。通過(guò)使用線性濃度梯度的NaCl(0至1.0M)洗脫該吸附的部份，該NaCl由兩種溶液所形成15ml含有1mM EDTA和0.5mM 2-巰基乙醇的10mMTris-HCl(pH7.5)和15ml含有1.0M NaCl、1mM EDTA和0.5mM 2-巰基乙醇的10mM Tris-HCl(pH7.5)。通過(guò)在220nm下測(cè)定吸收度來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，并且測(cè)量相應(yīng)于最高洗脫峰的NaCl濃度。
相似地，以通過(guò)使用以下物質(zhì)代替發(fā)明2制備的載體來(lái)進(jìn)行親和色譜，這些物質(zhì)包括(1)標(biāo)準(zhǔn)H、(2)肝素衍生物(在下文也稱作“2ODSH”)，該衍生物通過(guò)Jaseja等的方法(Can.J.Chem.(1989)67，1449-1456)并帶有部分改進(jìn)處理標(biāo)準(zhǔn)H以除去通過(guò)酯鍵結(jié)合在構(gòu)成標(biāo)準(zhǔn)H的主鏈的糖醛酸殘基2-位羥基基團(tuán)上的硫酸酯基團(tuán)來(lái)得到和(3)肝素衍生物(在下文也稱作“NDSH”)，該衍生物根據(jù)Inoue和Nagasawa的方法(Carbohydr.Res.(1976)46，87-95)處理標(biāo)準(zhǔn)H以除去通過(guò)酯鍵結(jié)合在構(gòu)成標(biāo)準(zhǔn)H的主鏈的葡糖醛酸殘基2-位氨基基團(tuán)上的硫酸酯基團(tuán)并且使該產(chǎn)物N-乙?；瘉?lái)得到。測(cè)量所得到的最高洗脫峰的NaCl濃度以便比較親和程度。
結(jié)果，發(fā)現(xiàn)從標(biāo)準(zhǔn)H固定的凝膠載體中以大約0.37M洗脫該FPA活性部份，同時(shí)從固定發(fā)明2、2ODSH或NDSH的凝膠載體中以0.31至0.33M洗脫該活性部份。即人們發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)具有幾乎與標(biāo)準(zhǔn)H相同水平的FPA親和性。
實(shí)施例15[本發(fā)明糖胺聚糖的果糖-1，6-二磷酸醛縮酶抑制活性的測(cè)量]測(cè)量了本發(fā)明糖胺聚糖的FPA抑制活性。當(dāng)以上的酶作用在作為底物的1，6-二磷酸果糖(在下文稱作“F-1，6-P2”)上時(shí)，該酶將底物分解為磷酸二羥丙酮(在下文稱作“DHAP”)和3-磷酸甘油醛(GAL-3-P)。當(dāng)其作用在作為底物的1-磷酸果糖(在下文稱作“F-1-P”)上時(shí)，它將底物分解成為DHAP和甘油醛(GAL)。因此，使用F-1，6-P2和F-1-P作為底物，當(dāng)在丙糖磷酸異構(gòu)酶存在下該3-磷酸甘油脫氫酶系統(tǒng)偶合時(shí)，通過(guò)在340nm下測(cè)量吸收度的變化來(lái)測(cè)量NADH(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)量的變化，并且因此將所生成的DHAP還原為3-磷酸甘油。
按照Blostein和Rutter的方法(J.Biol.Chem.(1963)238，3280-3285)進(jìn)行測(cè)量。即把最終濃度為0.4至4μg/ml([Ⅰ])的發(fā)明2加入到20ml的0.1M甘氨酰甘氨酸緩沖液(pH7.5)中，該緩沖液含有50mMF-1，6-P2的鈉鹽、0.1MF-1-P單環(huán)己基銨鹽、4mg的NADH和500μg的3-磷酸甘油脫氫酶/丙糖磷酸異構(gòu)酶復(fù)合物溶液。通過(guò)加入5至50μl的FPA(在衍生于牛腦的五種FPA同工型中的A4醛縮酶(A4同工型)和C4醛縮酶(C4同工型)，0.005至0.02單位)到該反應(yīng)混合物中來(lái)起動(dòng)該反應(yīng)。從在25℃的溫度條件下于340nm下每單位時(shí)間吸收度的減少來(lái)計(jì)算該反應(yīng)速率(v)。從這些結(jié)果，以1/v相對(duì)于[Ⅰ]作圖(Dixon曲線)并由[Ⅰ]的截距值來(lái)計(jì)算每一種情況的Ki值。
至于FPA的單位(活性單位)，1單位定義為在以上反應(yīng)系統(tǒng)中于25℃下每分鐘裂解1μmol底物的酶的量。該特異活性定義為每mg蛋白中單位的數(shù)目。
作為以上抑制活性測(cè)量的陰性對(duì)照組，通過(guò)使用硫酸軟骨素A(Seikagaku公司)和硫酸軟骨素C(Seikagaku公司)替代在以上實(shí)施例14中描述的發(fā)明2、2ODSH和NDSH來(lái)測(cè)量該抑制活性。
結(jié)果，發(fā)明2呈現(xiàn)FPA抑制活性(表15)。此外，發(fā)現(xiàn)發(fā)明2的抑制模式為競(jìng)爭(zhēng)性抑制。
從這些結(jié)果上看，提示發(fā)明2能夠用作有效的FPA活性抑制劑，并且因?yàn)槔缙湟种铺墙徒馔緩降拇x增進(jìn)的作用，所以其可用作藥物例如預(yù)防瘧原蟲感染的藥物。
表15

注-表示“未測(cè)量”。
實(shí)施例16[藥用組合物的實(shí)施例](1)注射劑(溶液劑)將發(fā)明2(鈉鹽)的冷凍干燥產(chǎn)品(30mg/ml)以最終濃度為5mg/ml溶于5％甘露醇水溶液中。將該溶液經(jīng)歷滅菌過(guò)濾，并且以每安瓿2ml的量充入安瓿中以生產(chǎn)注射劑(溶液劑)。(2)軟膏劑將100mg發(fā)明2(鈉鹽)的冷凍干燥產(chǎn)品、4g礦物油、8g凡士林、60mg羥苯甲酸甲酯/羥苯甲酸丙酯混合物、1g非離子表面活性劑和30g純化水均勻混合并充入容器中以生成軟膏劑。
工業(yè)應(yīng)用本發(fā)明提供了與常規(guī)修飾的肝素相比較具有相當(dāng)容易被鑒定的結(jié)構(gòu)、對(duì)生物體具有優(yōu)良活性的并且無(wú)抗凝血活性和出血活性的新的糖胺聚糖。其也提供了用于對(duì)生物體具有活性的該糖胺聚糖的藥物。
權(quán)利要求
1．具有包含糖醛酸殘基和葡糖胺殘基的二糖重復(fù)結(jié)構(gòu)的主鏈和具有硫酸酯基團(tuán)的糖胺聚糖(其中如同通過(guò)化學(xué)二糖分析方法測(cè)定的那樣，基本上未檢測(cè)到結(jié)合到主鏈上葡糖胺殘基6-位羥基基團(tuán)上的硫酸酯基團(tuán)，其中該糖胺聚糖用亞硝酸分解)與對(duì)硝基苯肼反應(yīng)并通過(guò)高效液相色譜法分析，并且在2-位具有硫酸酯基團(tuán)的糖醛酸殘基的％(mol)相對(duì)于總糖醛酸殘基不低于45％，該％(mol)從通過(guò)酶二糖分析方法得到的二糖組成來(lái)計(jì)算得到，在該方法中糖胺聚糖用糖胺聚糖酶消化并通過(guò)高效液相色譜法分析。
2．具有包含糖醛酸殘基和葡糖胺殘基的二糖重復(fù)結(jié)構(gòu)的主鏈并且具有硫酸酯基團(tuán)的糖胺聚糖，其中，在通過(guò)酶二糖分析方法得到的糖胺聚糖的二糖組成中，其中該糖胺聚糖用糖胺聚糖酶消化并且通過(guò)高效液相色譜法分析，2-乙酰氨基-2-脫氧-4-O-(4-脫氧-α-L-蘇阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖、2-脫氧-2-磺氨基-4-O-(4-脫氧-α-L-蘇阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖、2-乙酰氨基-2-脫氧-4-O-(4-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖和2-脫氧-2-磺氨基-4-O-(4-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖的總數(shù)不多于10％(mol)，并且2-脫氧-2-磺氨基-4-O-(4-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖不多于1.5％(mol)，并且有效二糖收率不少于60％。
3．權(quán)利要求2的糖胺聚糖，其中，在通過(guò)酶二糖分析方法得到的該二糖組成中，2-乙酰氨基-2-脫氧-4-O-(4-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-D-葡萄糖、2-脫氧-2-磺氨基-4-O-(4-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-D-葡萄糖、2-乙酰氨基-2-脫氧-4-O-(4-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖和2-脫氧-2-磺氨基-4-O-(4-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖的總數(shù)不少于45％(mol)。
4．權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)的糖胺聚糖，其中在該糖胺聚糖的13C-NMR譜分析中，使用5％糖胺聚糖在氧化氘中的溶液并且使用3-(三甲基甲硅烷基)丙酸鈉作為標(biāo)準(zhǔn)物，在66.5至67.5ppm基本上檢測(cè)不到峰并且在大約100ppm至102ppm的信號(hào)強(qiáng)度高于大約98.3ppm的信號(hào)強(qiáng)度。
5．1，6-二磷酸果糖醛縮酶抑制劑，它包括如在權(quán)利要求1至4中任何一項(xiàng)定義的作為活性成分的糖胺聚糖。
6．藥用組合物包括如在權(quán)利要求1至4中任何一項(xiàng)定義的作為活性成分的糖胺聚糖。
7．權(quán)利要求6的藥用組合物，它為治療組織創(chuàng)傷和潰瘍的藥物。
8．權(quán)利要求6的藥用組合物，它為治療皮膚疾病的藥物。
9．權(quán)利要求8的藥用組合物，其中該治療皮膚疾病的藥物為促進(jìn)皮膚傷口愈合的藥物或者為治療皮膚潰瘍的藥物。
10．生產(chǎn)如在權(quán)利要求1至4中任何一項(xiàng)定義的糖胺聚糖的方法，該方法包括以下步驟(a)在N-甲基-N-三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺存在下，在不低于100℃的溫度下，將具有包含糖醛酸殘基和葡糖胺殘基的二糖重復(fù)結(jié)構(gòu)的主鏈并且具有硫酸酯基團(tuán)的糖胺聚糖的吡啶可溶的鹽在吡啶中加熱足夠長(zhǎng)的時(shí)間以至于如同通過(guò)化學(xué)二糖分析方法測(cè)定的那樣應(yīng)該基本上檢測(cè)不到葡糖胺殘基6-位羥基基團(tuán)上結(jié)合的硫酸酯基團(tuán)，在該分析方法中該糖胺聚糖用亞硝酸分解，與對(duì)硝基苯肼反應(yīng)并通過(guò)高效液相色譜法分析，(b)從在步驟(a)中得到的該反應(yīng)混合物中蒸發(fā)吡啶，并且(c)將水加入到在步驟(b)中得到的該反應(yīng)混合物中，然后減壓下于常規(guī)溫度下放置該混合物。
全文摘要
提供了具有包含了糖醛酸殘基和葡糖胺殘基二糖重復(fù)結(jié)構(gòu)的主鏈并且具有硫酸酯基團(tuán)的糖胺聚糖,其中如同通過(guò)化學(xué)二糖分析方法測(cè)定的那樣;基本上檢測(cè)不到在主鏈上葡糖胺殘基6－位羥基基團(tuán)上結(jié)合的硫酸酯基團(tuán),在該方法中該糖胺聚糖用亞硝酸分解,與對(duì)硝基苯肼反應(yīng)并通過(guò)高效液相色譜法分析,并且2－位具有硫酸酯基團(tuán)的糖醛酸殘基的%(摩爾)相對(duì)于總糖醛酸殘基不少于45%,該值從通過(guò)酶二糖分析方法得到的二糖組成來(lái)計(jì)算,其中該糖胺聚糖用糖胺聚糖酶消化并通過(guò)高效液相色譜法分析。該糖胺聚糖能夠用作藥物的活性成分。
文檔編號(hào)C08B37/00GK1286699SQ99801643
公開日2001年3月7日 申請(qǐng)日期1999年8月2日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月31日
發(fā)明者苅谷豐, 高野良, 龜井加惠子, 原三郎, 女屋純一, 堀祐輔 申請(qǐng)人:生化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社