專利名稱：腫瘤靶向光敏免疫偶聯(lián)物的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥、生物技術(shù)、化學(xué)、免疫生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來，國內(nèi)外文獻(xiàn)越來越多地報道了一種新的腫瘤治療方法——光動力療法 (PDT)。腫瘤光動力療法是現(xiàn)代腫瘤微創(chuàng)或無創(chuàng)治療領(lǐng)域的最新進(jìn)展，于1996年被美國FDA 批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床，并在美國、日本、英國、法國、德國、加拿大等國用于多種腫瘤治療取得成功。2003年5月中國SFDA批準(zhǔn)了這一治療系統(tǒng)進(jìn)入臨床應(yīng)用。光動力療法是一種正在發(fā)展中的治療惡性腫瘤的新型治療手段，臨床上已用于多種腫瘤的治療。為了增加光動力療效，我們選用能與腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合的單克隆抗體為載藥工具，將光敏劑與抗體共價偶聯(lián)，形成穩(wěn)定的光敏免疫偶聯(lián)物，由抗體進(jìn)行導(dǎo)向，使光敏劑與特定腫瘤細(xì)胞進(jìn)行特異性結(jié)合，達(dá)到靶向給藥的目的，提高治療的依從性。光動力治療是一種很有前景的腫瘤治療方法，在臨床上已經(jīng)被運(yùn)用于頭頸部腫瘤、食管癌、乳腺癌、基底細(xì)胞癌等多種腫瘤的治療，但是目前的光動力治療的藥物仍存在一些不足，如光敏劑對腫瘤的選擇性差；存在光毒性反應(yīng)，治療后病人避光時間長。為了克服這些不足，人們開始進(jìn)行了光免疫治療的研究，達(dá)到靶向給藥的目的。光免疫治療是指將光敏劑與單克隆抗體通過化學(xué)方法聯(lián)接，制備出光敏免疫偶聯(lián)物，旨在選擇性的將光敏劑運(yùn)輸?shù)侥[瘤部位，使腫瘤部位的光敏劑濃度增高，減少用量， 提高療效，同時，由于皮膚對大分子物質(zhì)滲透性差，也可以降低光毒性反應(yīng)，縮短避光時間。 1983年加拿大的Mew. D等首先報道了血卟啉與單克隆抗體的交聯(lián)物對靶細(xì)胞具有殺傷作用。在國內(nèi)，制備血卟啉一抗體偶聯(lián)物已有先例，劉建源等將血卟啉衍生物與抗CEA單抗制成免疫偶聯(lián)物，腫瘤細(xì)胞特異結(jié)合的單抗與光敏劑偶聯(lián)，使得光敏劑通過單抗的導(dǎo)向作用到達(dá)腫瘤組織的劑量增加、滯留時間延長且吸收增加，并且副作用減少。酞菁及其衍生物以其良好的光熱穩(wěn)定性、強(qiáng)的紅外吸收、和較強(qiáng)的光動力效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，成為新一代光敏劑中的佼佼者。本項(xiàng)發(fā)明主要利用一種單取代酞菁鋅與靶向腫瘤的單克隆抗體制備光敏免疫偶聯(lián)物，提高光動力治療的靶向特異性，以增加該光敏劑的選擇性，同時也減少它對正常細(xì)胞的毒性。

發(fā)明內(nèi)容
本申請?zhí)峁┝艘环N高活性的酞菁鋅-單克隆抗體腫瘤靶向光敏免疫偶聯(lián)物的制備方法及其抗腫瘤應(yīng)用的技術(shù)方法(圖I)，所制備的光敏免疫偶聯(lián)物具有成本低、穩(wěn)定性好、抗腫瘤活性高等特點(diǎn)。一、本項(xiàng)發(fā)明所用的單克隆抗體是具有如下特征的單克隆抗體I)分子量150-170KDa ；2)吸光特性280nm具有特征吸收峰；3)生物學(xué)特性單克隆抗體，能特異性識別腫瘤細(xì)胞表面生長因子受體，并與之發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)。4)本項(xiàng)發(fā)明所述的單克隆抗體包括曲妥珠單抗(Herceptin)、西妥昔單抗(cetuximab)、尼妥珠單抗(Nimotuzumab)等能特異性識別腫瘤細(xì)胞表面生長因子受體的單克隆抗體。二、酞菁鋅-單克隆抗體腫瘤靶向光敏免疫偶聯(lián)物的制備方法如下I)水溶性單羧基酞菁鋅酰肼衍生物的制備，以已公開的“一種廣譜、低毒性的酞菁類殺菌劑及其制備方法和用途”(專利申請?zhí)?00510107773)所提及的一種新型酞菁類光敏劑，即單羧基取代酞菁鋅(ZnPc-COOH)為基礎(chǔ)，將單羧基取代酞菁鋅與表面帶有五聚賴氨酸(5K)的樹脂反應(yīng)，再用水合肼肼解，脫去保護(hù)基，形成水溶性單羧基酞菁鋅酰肼衍生物(ZnPC-C0-5K-NHNH2)。本項(xiàng)發(fā)明利用水溶性單羧基酞菁鋅酰肼衍生物與單克隆抗體共價偶聯(lián)，目前在國內(nèi)外均未見有此化合物的相關(guān)報道。2)抗體氧化單克隆抗體在PH7. 2的磷酸鹽緩沖液中，加入終濃度IOmM的高碘酸鈉，25°C氧化30min后，加入終濃度IOmM的抗壞血酸，將殘留的高碘酸鈉徹底還原成碘離子，防止殘留的高碘酸鈉氧化將要偶聯(lián)的酞菁鋅，本發(fā)明利用抗壞血酸還原高碘酸鈉，這種做法目前在國內(nèi)外均未見有此化合物的相關(guān)報道。3)將氧化后的單克隆抗體與ZnPC-C0-5K-NHNH2偶聯(lián)，取氧化后的單克隆抗體與單羧基酞菁鋅酰肼衍生物按摩爾比I : 10，溶于在PH7. 2的磷酸鹽緩沖液中，混勻，4°C冰箱避光渦旋震蕩過夜后，加入還原劑，4°C冰箱，反應(yīng)4h，形成穩(wěn)定偶聯(lián)物。本發(fā)明在中性的水溶液中完成抗體與酞菁鋅的偶聯(lián)，最大程度的保存抗體的活性，這種做法目前在國內(nèi)外均未見有此化合物的相關(guān)報道。4)用Sephadex GlOO凝膠柱分離光敏免疫偶聯(lián)物，以磷酸鹽緩沖液(PBS)為洗脫液，收集第一洗脫峰，用超濾離心管濃縮備用。本發(fā)明是在中性的水溶液中完成抗體與酞菁鋅的偶聯(lián)，由于單羧基酞菁鋅酰肼衍生物是溶于水的，因此可以用PBS作為洗脫液，除去游離的單羧基酞菁鋅酰肼衍生物，不用有機(jī)溶劑，最大程度的保存抗體的活性，這種做法目前在國內(nèi)外均未見有此化合物的相關(guān)報道。三、酞菁鋅-單克隆抗體腫瘤靶向光敏免疫偶聯(lián)物的鑒定方法用非還原SDS-page電泳檢測純度。偶聯(lián)比計(jì)算偶聯(lián)物溶于PBS (含O. 1% tween80)中，UV-Vis分光光度計(jì)掃全譜， 得其Q帶最大吸收波長λ max ο分別檢測偶聯(lián)物的Amax、A280nm,依據(jù)下列公式計(jì)算偶聯(lián)度(DOL) :Aprotein = A280nm_AmaxXCF,其中，CF = ε 280nm, free dye/ ε max, free dye, Cprotein = Aprotein/ ε protein, DOL = Amax/Cprotein/ ε max, free dye,粗略估計(jì)抗體的摩爾消光系數(shù)ε 280nm = 203，OOOM-lcm-l，將偶聯(lián)物在PBS溶液(含0. 1% tween80)中的A280nm、A674nm，代入公式，可得偶聯(lián)比，偶聯(lián)比在2-7之間較好。3)用酶聯(lián)免疫分析(ELISA)技術(shù)，測定光敏免疫偶聯(lián)物與特定抗原的效價，效價越高越好。四、本發(fā)明還提供了光敏免疫偶聯(lián)物抗腫瘤的測定方法將制備好的光敏免疫偶聯(lián)物，用0.22μπι的無菌濾器過濾除菌，并稀釋成不同的濃度備用。選擇含有特定的表面生長因子腫瘤細(xì)胞，該生長因子能特異性的被光敏免疫偶聯(lián)物識別。將腫瘤細(xì)胞接種于無菌96孔板上，每孔1-2萬個細(xì)胞，待細(xì)胞完全貼壁后，加入不同濃度的光敏免疫偶聯(lián)物，37°C孵育24h后吸出，加入PBS
洗滌3次后，加入新鮮培養(yǎng)基，用波長670nm，能量密度l_100J/Cm2的激光照射后， 37°C 孵育 24h。alamarBlue (一種氧化還原指示劑，能根據(jù)細(xì)胞的代謝活性產(chǎn)生吸光度變化和熒光信號)法測定細(xì)胞存活率。


圖I單克隆抗體與ZnPC-C0-5K_NHNH2偶聯(lián)示意圖；圖2ZnPC-C0-5K_NHNH2 制備路線圖；圖3聚丙烯酰胺凝膠未經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，其中蛋白無色，含有酞菁鋅分子的電泳條帶均為綠色，l、ZnPC-C0-5K-NHNH2 ;2、未偶聯(lián)的尼妥珠單抗；3、未經(jīng)純化的酞菁鋅-尼妥珠單抗光敏免疫偶聯(lián)物；4、經(jīng)純化的酞菁鋅-尼妥珠單抗光敏免疫偶聯(lián)物；圖4聚丙烯酰胺凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，其中蛋白和含有酞菁鋅分子的電泳條帶均為藍(lán)色，l、ZnPC-C0-5K-NHNH2 ;2、未經(jīng)偶聯(lián)的尼妥珠單抗；3、未經(jīng)純化的酞菁鋅-尼妥珠單抗光敏免疫偶聯(lián)物；4、經(jīng)純化的酞菁鋅-尼妥珠單抗光敏免疫偶聯(lián)物。圖5光免疫偶聯(lián)物暗毒性；圖6光免疫偶聯(lián)物光毒性。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I水溶性單羧基酞菁鋅酰肼衍生物的制備(圖2)a、稱取20mg單羧基酞菁鋅(ZnPc-COOH)、24mg苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、帶有五聚賴氨酸的樹脂128mg，在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中預(yù)先溶脹30min)，共加入4ml DMF (酞菁反應(yīng)濃度約5mg/ml)，再滴入5uL的N，N- 二異丙基乙胺 (DIEA)，室溫、攪拌、避光反應(yīng)過夜，共計(jì)16小時。反應(yīng)完成后抽濾，用DMF洗至無色，再用甲醇洗滌2-3次，抽濾后干燥。b、取上述樣品加入5ml DMF, 200ul 85%的水合肼，室溫、攪拌、避光反應(yīng)過夜完成后抽濾，加入少量DMF洗滌樹脂，再將濾液加入10倍體積的冰冷的無水乙醚析出沉淀，離心備用。
C、取上述樣品加入90%的TFA室溫、攪拌、避光反應(yīng)4小時后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去三氟乙酸，用少量甲醇溶解樣品，并加入冰冷的無水乙醚析出沉淀，離心，凍干得到 ZnPC-C0-5K-NHNH2od、取上述樣品加入5ml的甲醇溶解，用HPLC制備柱分離樣品。采用0DSC18柱，流動相——A相含O. 5%。三氟乙酸(TFA)的純水，B相含O. 5% TFA的DMF，20min內(nèi)B相從 50%-100%梯度洗脫，收集洗脫峰為我們的目標(biāo)產(chǎn)物。實(shí)施例2尼妥珠單抗的氧化取40ul 尼妥珠單抗(5mg/ml,0. 033mmol/L),即 200ug,加入 IOul SOmmoI /I,的高碘酸鈉(NaI04)，使之終濃度達(dá)10mmol/L，室溫(25°C水浴)避光反應(yīng)30min后，加入IOul lmol/L的抗壞血酸，4°C冰箱靜置30min，除去殘留的NaI04備用。實(shí)施例3氧化后的尼妥珠單抗與ZnPC-C0-5K_NHNH2偶聯(lián)ZnPC-C0-5K-NHNH2用純水配制成3. 3mmol/L的儲備液，取氧化后的尼妥珠單抗，每IOOul加入IOul的上述儲備液，加入IOul lmol/L的磷酸鹽緩沖液(PH7. 2)，混勻，4°C 冰箱避光渦旋震蕩過夜后，加入20ul lmol/L的硼氫化鈉(NaBH4) (lmol/L的Na2C03新鮮配制)溶液，4°C冰箱，靜置4h。用S印hadexGlOO凝膠柱(12X300mm)分離，以PBS為洗脫液，收集第一洗脫峰，用IOkDa的超濾離心管濃縮至IOOul備用。同時用非還原SDS-page 以10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測純度(圖3、圖4)。實(shí)施例4酞菁鋅-尼妥珠單抗光敏免疫偶聯(lián)物抗腫瘤活性將制備好的酞菁鋅-尼妥珠單抗光敏免疫偶聯(lián)物，用0. 22u的無菌濾器過濾除菌， 并稀釋成不同的濃度備用。選擇兩株細(xì)胞含有表面生長因子受體(EGFR)的腫瘤細(xì)胞MDA_MB_321和 MDA-MB-435S，該表面生長因子受體能特異性的被尼妥珠單抗識別，其中MDA-MB-321的 EGFR高表達(dá)，MDA-MB-435S的EGFR低表達(dá)，以及一株正常細(xì)胞人胚肺成纖維細(xì)胞(HELF)， 作為受試細(xì)胞株。將腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞接種于無菌96孔板上，每孔1-2萬個細(xì)胞，待細(xì)胞完全貼壁后，加入不同濃度的光敏免疫偶聯(lián)物，37°C孵育24h (37°C ,5%C02)后吸出，加入PBS洗滌 3次后，加入新鮮培養(yǎng)基，用波長670nm，能量密度14J/cm2的激光照射后，37°C孵育24h。加入10%的alamarBlue，孵育2_4h，用熒光讀板機(jī)測定530nm激發(fā)、590nm發(fā)射的熒光值，與對照孔的熒光值相比，可以得到細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率％ =實(shí)驗(yàn)孔的熒光值/對照孔的熒光值*100%實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所制備的酞菁鋅-尼妥珠單抗光敏免疫偶聯(lián)物，用波長670nm，能量密度14J/cm2的激光照射后，對MDA-MB-321、MDA-MB-435S和正常細(xì)胞(HELF)的半數(shù)抑制率分別為269nM、467nM和大于2700nM，而沒有光照的實(shí)驗(yàn)組(暗毒性)的半數(shù)抑制率均大于2700nM，具有很高的抗腫瘤細(xì)胞活性和選擇性(圖5、圖6)。
權(quán)利要求
1.酞菁鋅-單克隆抗體腫瘤靶向光敏免疫偶聯(lián)物的制備方法，其特征在于利用單取代酞菁衍生物與單克隆抗體共價偶聯(lián)。
2.如權(quán)利要求I所述的酞菁鋅-單克隆抗體腫瘤靶向光敏免疫偶聯(lián)物的制備方法， 其特征在于所述的單克隆抗體是具有如下特征的單克隆抗體1)分子量150-170KDa ；2) 吸光特性280nm具有特征吸收峰；3)生物學(xué)特性單克隆抗體，能特異性識別腫瘤細(xì)胞表面生長因子受體，并與之發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)。
3.如權(quán)利要求I所述的酞菁鋅-單克隆抗體腫瘤靶向光敏免疫偶聯(lián)物的制備方法，其特征在于所述的單克隆抗體包括曲妥珠單抗、西妥昔單抗或尼妥珠單抗。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種高活性的酞菁鋅-單克隆抗體腫瘤靶向光敏免疫偶聯(lián)物的制備方法及其抗腫瘤應(yīng)用的技術(shù)方法。利用結(jié)構(gòu)單一的單羧基酞菁鋅與五聚賴氨酸酰肼反應(yīng)，形成水溶性的高反應(yīng)活性的單羧基酞菁鋅酰肼衍生物，同時選擇具有抗腫瘤活性的單克隆抗體，在中性條件下，用高碘酸鈉溫和的氧化與抗體活性無關(guān)的糖基為醛基，4℃，過量的單羧基酞菁鋅酰肼衍生物極易與之反應(yīng)，并進(jìn)一步還原成穩(wěn)定的光敏免疫偶聯(lián)物，得到高純度的光敏免疫偶聯(lián)物。本法制備的特點(diǎn)是低溫、中性條件、不用任何有機(jī)溶劑。并通過體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)該偶聯(lián)物具有很好的選擇性和抗腫瘤活性，具有應(yīng)用價值。
文檔編號A61K41/00GK102585003SQ20121002595
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月6日
發(fā)明者周山勇, 胡萍, 陳卓, 陳錦燦, 黃明東 申請人:中國科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所