專利名稱：一種分離人臍帶血干細(xì)胞的試劑盒及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離人臍帶血干細(xì)胞的試劑盒及其使用方法。本發(fā)明還涉及一種人臍帶血干細(xì)胞治療液，其包含利用本發(fā)明試劑盒制備的人臍帶血干細(xì)胞。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞是具有自我復(fù)制和多向分化潛能的原始細(xì)胞，是機(jī)體的起源細(xì)胞，是形成人體各種組織器官的原始細(xì)胞。在一定條件下，它可以分化成多種功能細(xì)胞或組織器官，醫(yī)學(xué)界稱其為“萬用細(xì)胞”。干細(xì)胞對早期人體的發(fā)育特別重要，在兒童和成年人中也可發(fā)現(xiàn)專能干細(xì)胞。舉我們所最熟知的干細(xì)胞之一，造血干細(xì)胞為例，造血干細(xì)胞存在于每個(gè)兒童和成年人的骨髓之中，也存在于循環(huán)血液中，但數(shù)量非常少。在我們的整個(gè)生命過程中，造血干細(xì)胞在不斷地向人體補(bǔ)充血細(xì)胞——紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板的過程中起著很關(guān)鍵的作用。如果沒有造血干細(xì)胞，我們就無法存活。干細(xì)胞是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞。它包括胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。干細(xì)胞的發(fā)育受多種內(nèi)在機(jī)制和微環(huán)境因素的影響。目前人類胚胎干細(xì)胞已成功地在體外培養(yǎng)。最新研究發(fā)現(xiàn)，成體干細(xì)胞可以橫向分化為其它類型的細(xì)胞和組織，為干細(xì)胞的廣泛應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。在胚胎的發(fā)生發(fā)育中，單個(gè)受精卵可以分裂發(fā)育為多細(xì)胞組織或器官。在成年動(dòng)物中，正常的生理代謝或病理損傷也會(huì)引起組織或器官的修復(fù)再生。胚胎的分化形成和成年組織的再生是干細(xì)胞進(jìn)一步分化的結(jié)果。胚胎干細(xì)胞是全能的，具有分化為幾乎全部組織和器官的能力。而成年組織或器官內(nèi)的干細(xì)胞一般認(rèn)為具有組織特異性，只能分化特定的細(xì)胞或組織。然而，這個(gè)觀點(diǎn)目前受到了挑戰(zhàn)。最新的研究表明，組織特異性干細(xì)胞同樣具有分化成其它細(xì)胞或組織的潛能，這為干細(xì)胞的應(yīng)用開創(chuàng)了更廣泛的空間。按分化潛能的大小，干細(xì)胞基本上可分為三種類型一類是全能性干細(xì)胞，它具有形成完整個(gè)體的分化潛能。如胚胎干細(xì)胞，它是從早期胚胎內(nèi)的細(xì)胞團(tuán)分離出來的一種高度未分化的細(xì)胞系，具有與早期胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)特征和很強(qiáng)的分化能力，它可以無限增殖并分化成為全身200 多種細(xì)胞類型，進(jìn)一步形成機(jī)體的所有組織、器官。另一類是多能性干細(xì)胞，這種干細(xì)胞具有分化出多種細(xì)胞組織的潛能，但卻失去了發(fā)育成完整個(gè)體的能力，發(fā)育潛能受到一定的限制，骨髓多能造血干細(xì)胞是典型的例子，它可分化出至少十一中血細(xì)胞，但不分化出造血系統(tǒng)以外的其他細(xì)胞。還有一類干細(xì)胞為單能干細(xì)胞(也稱專能、偏能干細(xì)胞)，這類干細(xì)胞只能向一種類型或密切相關(guān)的兩種類型的細(xì)胞分化，如上皮組織基底層的干細(xì)胞、肌肉中的成肌細(xì)胞?？傊?，凡需要不斷產(chǎn)生新的分化細(xì)胞以及分化細(xì)胞本身不能再分裂的細(xì)胞或組織，都要通過干細(xì)胞所產(chǎn)生的具有分化能力的細(xì)胞來維持肌體細(xì)胞的數(shù)量，可以這樣說，生命是通過干細(xì)胞的分裂來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的更新及保證持續(xù)生長。干細(xì)胞可以從常用的四種來源取得胚胎(主要用于基礎(chǔ)研究)，胎盤及其附屬物，骨髓，成體組織(包含外周血)。目前用于臨床干細(xì)胞來源主要有三種自體外周血、自體骨髓、胎盤及其附屬物。干細(xì)胞移植常用的有四種途徑介入途徑、局部種植、靜脈途徑、腰穿途徑。干細(xì)胞的移植所有程序都從在醫(yī)院進(jìn)行身體檢查開始。然后，在國際GMP標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室里制備出所需的干細(xì)胞，送入醫(yī)院，臨床醫(yī)生將依據(jù)患者的臨床評估，將干細(xì)胞通過注射、介入等方法植入人體，一旦細(xì)胞到達(dá)目的地，這些細(xì)胞具有修復(fù)組織細(xì)胞和恢復(fù)組織功能的能力。在治療后幾個(gè)星期內(nèi)，患者還不會(huì)看到或感覺到任何改變，當(dāng)然也有部分患者可能很快就見到效果。在一個(gè)月內(nèi)，有時(shí)需要二個(gè)月的時(shí)間，患者應(yīng)該可以感覺到癥狀減輕，活動(dòng)能力增力口。其結(jié)果正如患者所希望的，改善了生活質(zhì)量。依據(jù)每個(gè)病人的病情移植治療時(shí)間約需三至四周。目前干細(xì)胞技術(shù)治療的主要疾病(1)視神經(jīng)發(fā)育不全( 腦梗塞、腦出血、腦外傷、脊髓損傷后的截癱C3)肌萎縮側(cè)索硬化癥、脊髓性肌萎縮、多發(fā)性硬化(4)老年癡呆癥、 腦發(fā)育不全、腦萎縮、共濟(jì)失調(diào)( 長期昏迷、植物生存狀態(tài)(6)腦癱、小兒缺血缺氧性腦病、智力低下(7)脊髓炎后遺癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病(8)糖尿病并發(fā)癥(9)股骨頭壞死等等。從干細(xì)胞發(fā)育為成熟的組織細(xì)胞，根據(jù)疾病的不同及疾病目前所處的階段的不同，其所需要的時(shí)間也是不同的。其在體內(nèi)遷移、分化的過程非常復(fù)雜，具體到每個(gè)個(gè)體，我們還無法完全預(yù)知其確切時(shí)間。這是一個(gè)從量變到質(zhì)變的過程，一般在移植術(shù)后的2-3個(gè)月之后才逐漸顯示出現(xiàn)及越來越大的療效表現(xiàn)，那么這個(gè)過程要在出院后3個(gè)月及以上。因?yàn)楦杉?xì)胞是一種未分化未成熟的細(xì)胞，其細(xì)胞表面的抗原表達(dá)很微弱，患者自身的免疫系統(tǒng)對這種未分化細(xì)胞的識(shí)別能力很低，無法判斷它們的屬性，從而避免了器官移植引起的免疫排斥反應(yīng)及過敏反應(yīng)等，使同種異體移植神經(jīng)干細(xì)胞變得非常安全。目前， 干細(xì)胞研究完成了干細(xì)胞的臨床前全套安全性實(shí)驗(yàn)，包括急性毒性試驗(yàn)，長期毒性試驗(yàn)，致瘤性試驗(yàn)，致畸性試驗(yàn)，局部刺激試驗(yàn)，發(fā)熱試驗(yàn)和免疫毒性試驗(yàn)，結(jié)果表明，干細(xì)胞臨床應(yīng)用是安全，無毒的。在臨床研究中，經(jīng)過大量的臨床病例研究表明，干細(xì)胞治療除了極少數(shù)病人有輕微的發(fā)熱、頭痛外，無嚴(yán)重不良反應(yīng)發(fā)生，表明其臨床應(yīng)用是安全的。干細(xì)胞移植治療后沒有后遺癥，干細(xì)胞移植后會(huì)在患者體內(nèi)長期存活，但其療效則根據(jù)原發(fā)病的不同也不盡相同。對于原致病因素已經(jīng)結(jié)出的患者來說，可能會(huì)長期有效， 但對于致病因素持續(xù)存在的患者而言，則由于致病因素的持續(xù)破壞，其療效難以長期維持， 但可以延緩疾病發(fā)展的速度。干細(xì)胞治療疾病的優(yōu)勢應(yīng)用干細(xì)胞技術(shù)能治療神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等多種系統(tǒng)的各種疾病，且較很多傳統(tǒng)治療方法具有無可比擬的優(yōu)點(diǎn)。1)安全低毒性或無毒性。2) 在尚未完全了解疾病發(fā)病的確切機(jī)理前也可以應(yīng)用。3)治療材料來源充足。4)治療范圍廣闊?；檬亲詈玫拿庖咧委熀突蛑委熭d體。6)傳統(tǒng)療法認(rèn)為是“不治之癥”的疾病，又有了新的療法和新的希望。我國科學(xué)家韓忠朝率領(lǐng)科技團(tuán)隊(duì)獨(dú)辟蹊徑找到干細(xì)胞非常理想的來源，于2006 年首次從新生嬰兒廢棄的臍帶組織中得到了一種多能干細(xì)胞，稱為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 (UC-MSC)。UC-MSC不但具有胚胎干細(xì)胞類似的增殖能力和多向分化潛能，來源豐富、取材方便、低病毒感染率、無倫理障礙，而且沒有胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生畸胎瘤問題，并且抗原性很低不產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，異體使用無需HLA配型。隨著國內(nèi)臍血干細(xì)胞庫的建立和發(fā)展，臍血干細(xì)胞在臨床中的應(yīng)用范圍將逐漸擴(kuò)大。臍帶血、骨髓、外周血來源的細(xì)胞比較如下⑴骨髓中的干細(xì)胞比外周血的干細(xì)胞原始。( 臍帶血比骨髓更為原始。( 臍帶血的干細(xì)胞自我繁殖能力最強(qiáng)、繁殖速度最快，骨髓次之。(4)臍帶血中干細(xì)胞的比率最大，骨髓次之。( 外周血中的干細(xì)胞更接近終端細(xì)胞或叫祖細(xì)胞或前體細(xì)胞。公開號為CN1436843A的發(fā)明專利公開了一種臍血造血干細(xì)胞的制作方法，按如下步序進(jìn)行(1)采集臍血，將出生的胎兒的臍血采到臍血采集袋內(nèi)；( 加入紅細(xì)胞沉淀劑；(3)離心分離1，將臍血采集袋中臍血中的紅細(xì)胞分離；(4)移出紅細(xì)胞，將紅細(xì)胞輸送到紅細(xì)胞收集袋內(nèi)；(5)離心分離2，將白細(xì)胞包括造血干細(xì)胞與血漿再一次分離；(6)移出血漿，將被分離的血漿輸入到血漿收集袋內(nèi)，臍血收集袋內(nèi)剩余的臍血為含富集白細(xì)胞的臍血；(7)加入冷凍劑，將臍血收集袋中的富集白細(xì)胞臍血中加入冷凍劑；(8)包裝；(9)降溫；(10)入庫保存。但使用該方法制備的造血干細(xì)胞含有大量白細(xì)胞。公開號為CN101693884A的發(fā)明專利公開了一種從胎盤、臍帶或脂肪組織中分離提取干細(xì)胞的方法，其工藝步驟為首先將胎盤、臍帶或脂肪組織與細(xì)胞保養(yǎng)液按2. 5 4 1的重量比混合放入組織粉碎桶中，以3000-6000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速粉碎2-4分鐘，然后加入膠原酶充分混勻，放置到37°C 士0. 5°C的水浴箱中孵育20-30分鐘，用200目過濾器過濾，按組織懸液量的25% -40%比例加入沉淀劑，混勻后靜置10 30分鐘，吸取上清液， 用IlOOXg的離心力離心3 5分鐘，除去上清液，將濃縮的細(xì)胞加入到泛影酸鈉-聚蔗糖 400#的液體上，用離心力650 Xg離心10-30分鐘，收取中間10_15ml的細(xì)胞層，用細(xì)胞保養(yǎng)液清洗3-4次，將收集的細(xì)胞計(jì)數(shù)，檢測細(xì)胞存活率> 95%時(shí)，即可以供臨床使用。該方法分離提取干細(xì)胞的生產(chǎn)成本較高。公開號為CN1016^165A的發(fā)明專利公開了一種原始間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法， 其特征在于，它是采用以下工藝方法制備的取人新鮮臍帶，以等滲的平衡鹽溶液或無血清培養(yǎng)基溶液洗去臍帶殘留血液，去除臍動(dòng)脈、臍靜脈及臍帶外膜，提取華通膠并剪切成塊， 再以等滲的平衡鹽溶液或無血清培養(yǎng)基溶液沖洗后，浸泡于0. 05 0. 3%膠原酶溶液中， 置35 37. 5°C溫箱中10 30小時(shí)，組織塊消化，液體呈粘稠狀，然后加入相當(dāng)于原液1 10倍量的含胎牛血清培養(yǎng)基終止消化，分裝于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，置CO2培養(yǎng)箱，待細(xì)胞貼壁后更換含胎牛血清的培養(yǎng)基溶液，以后每隔2 4天換液一次，細(xì)胞貼壁融合后傳代培養(yǎng)； 傳代培養(yǎng)2 4代，即時(shí)使用或冷凍保存?zhèn)溆?。該發(fā)明制備干細(xì)胞需要時(shí)間長。公開號為CN1597935A的發(fā)明專利公開了一種活細(xì)胞胎盤素臍帶干細(xì)胞的提取方法，其要點(diǎn)是選擇健康產(chǎn)婦的嬰兒臍帶，而且必須是男嬰臍帶，在靠近肚臍的一段其長度為6-8cm ；將該臍帶放在濃度為0. 1-0. 5%的抗凝劑檸檬酸鈉液體內(nèi)浸泡；并放在冷藏箱內(nèi)冷藏保存，在冷藏箱內(nèi)溫度為5°C至-20°C條件下，可冷藏保存2-10天，然后將該臍帶取出， 植入體內(nèi)可用來治療哮喘、過敏性鼻炎、婦女更年期綜合癥、男性性功能減退，且能提高免疫系統(tǒng)、增強(qiáng)抵抗力，還可治療肝炎、肝硬化、甲、乙、丙型肝炎、慢性腎炎、胃腸綜合癥、精神性胃潰瘍、神經(jīng)衰弱、美容、美聲，還具有抗衰老、返老還童的功效。該發(fā)明提取干細(xì)胞必須來自男嬰臍帶，有局限性。公開號為CN1407088A的發(fā)明專利公開了一種從胎盤組織中提取造血干細(xì)胞用于建立造血干細(xì)胞庫的新方法，其特征是所述的方法包括從胎盤組織里提取組織細(xì)胞的方法并有如下步驟(1)怎樣系統(tǒng)有序的電腦聯(lián)網(wǎng)儲(chǔ)存有關(guān)胎盤及臍帶血的資料，0怎樣無菌的處理胎盤，避免一切可能的細(xì)菌和霉菌的污染，(3)怎樣清除母親血液對胎盤和臍帶血細(xì)胞的混入，(4)怎樣采用機(jī)械的方法分離胎盤組織細(xì)胞，(5)怎樣采用酶消化的方法分離胎盤組織細(xì)胞，(6)怎樣采用CD34單克隆抗體-磁珠法純化胎盤組織干細(xì)胞，(7)怎樣冰凍長期保存胎盤組織細(xì)胞。該發(fā)明方法提取的干細(xì)胞，自我繁殖能力較弱，繁殖速度較慢，提取出干細(xì)胞的比率不夠大。人臍帶血干細(xì)胞在臨床上雖然有廣泛的應(yīng)用前景，但現(xiàn)有的分離方法存在種種不足，例如分離步驟復(fù)雜，耗時(shí)冗長，分離成本高，制備的臍帶血干細(xì)胞純度低，活性差等，限制了臍帶血干細(xì)胞的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對上述現(xiàn)有問題提供一種簡單高效分離人臍帶血干細(xì)胞的試劑盒及其使用方法。本發(fā)明人設(shè)計(jì)了許多實(shí)驗(yàn)方案，嘗試了大量試劑組合，出人意料的發(fā)現(xiàn)在從臍帶血分離干細(xì)胞的過程中，在分離液中加入葛根素和4-羥基肉桂酸苯乙酯能有效提高干細(xì)胞的分離效率和純度。本發(fā)明的方法工藝簡單，條件溫和，產(chǎn)品中的活性成分含量高，活性高，安全性好， 產(chǎn)品生產(chǎn)成本低，使醫(yī)生在臨床上方便、安全、規(guī)范地獲取人臍帶血干細(xì)胞來治療相關(guān)疾病，便利推廣干細(xì)胞治療技術(shù)。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供一種分離人臍帶血干細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒由A液、B液和C液組成，A 液0. 2-0. 5mmol/L 葛根素，0. 3-1. Oymol/L 4-羥基肉桂酸苯乙酯，5_20mmol/L PBS, ρΗ7· 4 ；B液質(zhì)量/體積百分比濃度為8-15%的羥乙基淀粉溶液或質(zhì)量/體積百分比濃度為0. 5-1. 0%的甲基纖維素溶液；C液密度為1. 077g/mL的葡聚糖-泛影葡胺溶液或密度為1. 076g/mL的Percol 1。優(yōu)選的，上述試劑盒的特征在于A 液0· 3-0. 5mmol/L 葛根素，0. 5-0. 8ymol/L 4-羥基肉桂酸苯乙酯，10_15mmol/ L PBS, ρΗ7· 4 ；B液質(zhì)量/體積百分比濃度為10-15%的羥乙基淀粉溶液或質(zhì)量/體積百分比濃度為0. 5-0. 8%的甲基纖維素溶液；C液密度為1. 077g/mL的葡聚糖-泛影葡胺溶液或密度為1. 076g/mL的Percol 1。更優(yōu)選的，上述試劑盒的特征在于A 液0. 3mmol/L 葛根素，0. 5ymol/L 4-羥基肉桂酸苯乙酉旨，10mmol/L PBS，pH7.4B液質(zhì)量/體積百分比濃度為10%的羥乙基淀粉溶液C液密度為1. 077g/mL的葡聚糖-泛影葡胺溶液。另一方面，本發(fā)明提供上述分離人臍帶血干細(xì)胞的試劑盒的使用方法，包括如下步驟1)取含有10_50U/mL肝素的臍帶血與A液按2 1的體積比混勻；2)將步驟1)的溶液與B液按1 1的體積混合，充分混勻，室溫靜置60-120分鐘；3)用移液管移取上層細(xì)胞液至50mL離心管中；4)將離心管置于離心機(jī)中，1000-2000rpm離心15-30分鐘，離心后棄去上清液，用
生理鹽水清洗離心管，并用20-30mL生理鹽水重懸細(xì)胞沉淀；5)將20-30mL C液緩慢加入新的50mL離心管中，再將步驟4)得到的細(xì)胞液沿管壁緩慢加入C液上面，2000-3000rpm離心20-30分鐘；6)離心后管內(nèi)可見分為四層最上層是血漿，第二層為白膜層，主要含臍帶血干細(xì)胞，第三層為分離液層，第四層為粒細(xì)胞和紅細(xì)胞，用吸管輕輕插入，穿過血漿層至白膜層，沿管壁周緣吸出白膜層細(xì)胞，轉(zhuǎn)入另一 50mL離心管中；7)向步驟6)獲得的細(xì)胞液中加入5倍體積的生理鹽水，混勻，1000-2000rpm離心 15-30分鐘，棄去上清液，將沉淀的細(xì)胞團(tuán)用生理鹽水清洗2次，得到人臍帶血干細(xì)胞。此外，本發(fā)明還提供一種人臍帶血干細(xì)胞治療液，其包含利用上述方法制備的人臍帶血干細(xì)胞。本發(fā)明的人臍帶血干細(xì)胞治療液可用于治療多種疾病，包括但不限于，視神經(jīng)發(fā)育不全，腦梗塞、腦出血、腦外傷、脊髓損傷后的截癱，肌萎縮側(cè)索硬化癥、脊髓性肌萎縮、多發(fā)性硬化，腦發(fā)育不全、腦萎縮、共濟(jì)失調(diào)，腦癱、小兒缺血缺氧性腦病，脊髓炎后遺癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及糖尿病并發(fā)癥，股骨頭壞死等等傳統(tǒng)療法一般認(rèn)為的“不治之癥”，有效率及治愈率高。本發(fā)明制備人臍帶血干細(xì)胞的試劑盒和方法具有如下優(yōu)點(diǎn)1.工藝簡單，條件溫和，制備的人臍帶血干細(xì)胞雜質(zhì)少，活性高，安全性好，產(chǎn)品生產(chǎn)成本低。2.使得醫(yī)生在臨床上方便、安全、規(guī)范地獲取人臍帶血干細(xì)胞，解決臨床上獲取干細(xì)胞的瓶頸，推廣干細(xì)胞治療技術(shù)。
實(shí)施例實(shí)施例1分離人臍帶血干細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒由A液、B液和C液組成，A 液0. 2mmol/L 葛根素，0. 3ymol/L4-羥基肉桂酸苯乙酯，5mmol/L PBS, pH7. 4B液質(zhì)量/體積百分比濃度為8%的羥乙基淀粉溶液C液密度為1. 077g/mL的葡聚糖-泛影葡胺溶液。實(shí)施例2分離人臍帶血干細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒由A液、B液和C液組成，A 液0. 5mmol/L 葛根素，l.Oymol/L 4-羥基肉桂酸苯乙酉旨，20mmol/L PBS，pH7.4B液質(zhì)量/體積百分比濃度為0. 5%的甲基纖維素溶液C 液密度為 1. 076g/mL 的 Percoll。實(shí)施例3分離人臍帶血干細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒由A液、B液和C液組成，A 液0. 3mmol/L 葛根素，0. 5ymol/L 4-羥基肉桂酸苯乙酉旨，10mmol/L PBS，pH7.4B液質(zhì)量/體積百分比濃度為10%的羥乙基淀粉溶液C液密度為1. 077g/mL的葡聚糖-泛影葡胺溶液。
實(shí)施例4分離人臍帶血干細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒由A液、B液和C液組成，A液 0. 3mmol/L 葛根素，0. 5 μ mol/L4-羥基肉桂酸苯乙酯，IOmmol/LPBS, pH7. 4B液質(zhì)量/體積百分比濃度為0. 5%的甲基纖維素溶液C 液密度為 1. 076g/mL 的 Percoll。實(shí)施例5人臍帶血的采集，包括如下步驟1)打開采血袋包裝，關(guān)閉采血袋與穿刺針之間的管路上近針頭處的卡子，血袋置
于一旁備用?；锰好涑龊髢砂阎寡Q分別在距臍蒂側(cè)約5cm和8cm處夾閉臍帶，在兩把止血鉗之間斷臍帶，胎兒脫離母體。3)在臍帶母體側(cè)斷端確定臍靜脈穿刺采血部位，將采血袋穿刺針頭上的針帽沿順時(shí)針方向擰開后，沿臍靜脈斷端針頭斜面向下穿刺入臍靜脈，可用一把止血鉗將針頭固定在臍帶上。4)打開采血袋與針頭間輸液管上的卡子，臍帶血將注入采血袋，同時(shí)持續(xù)輕搖采血袋使抗凝劑與臍帶血充分混合，保持采血袋處于低位。為增加采血量可自胎盤側(cè)向斷端擠壓臍帶。采血量一般應(yīng)高于60ml，IOOml以上為佳。5)采血至臍帶血不能流出時(shí)，在拔針前用近針頭處和近采血袋處的兩只卡子將采血袋與穿刺針之間的管路再次關(guān)閉，拔針。6)在近針頭處卡子與針頭之間剪斷管路去掉針頭，并用熱合機(jī)封口。7)將采集的臍帶血置于4-10°C冰箱中暫存，無冰箱室內(nèi)暫存不能高于M°C。實(shí)施例6利用實(shí)施例3的試劑盒的分離人臍帶血干細(xì)胞的方法，包括如下步驟1)取含有50U/mL肝素的臍帶血與A液按2 1的體積比混勻；2)將步驟1)的溶液與B液按1 1的體積混合，充分混勻，室溫靜置90分鐘；3)用移液管移取上層細(xì)胞液至50mL離心管中； 4)將離心管置于離心機(jī)中，2000rpm離心30分鐘，離心后棄去上清液，用生理鹽水清洗離心管，并用30mL生理鹽水重懸細(xì)胞沉淀；5)將20mL C液緩慢加入新的50mL離心管中，再將步驟4)得到的細(xì)胞液沿管壁緩慢加入C液上面，2000rpm離心30分鐘；6)離心后管內(nèi)可見分為四層最上層是血漿，第二層為白膜層，主要含臍帶血干細(xì)胞，第三層為分離液層，第四層為粒細(xì)胞和紅細(xì)胞，用吸管輕輕插入，穿過血漿層至白膜層，沿管壁周緣吸出白膜層細(xì)胞，轉(zhuǎn)入另一 50mL離心管中；7)向步驟6)獲得的細(xì)胞液中加入5倍體積的生理鹽水，混勻，2000rpm離心15分鐘，棄去上清液，將沉淀的細(xì)胞團(tuán)用生理鹽水清洗2次，得到人臍帶血干細(xì)胞。實(shí)施例7將15份臍帶血分成3組，每組5份標(biāo)本。I組為本發(fā)明的分離臍帶血干細(xì)胞的試劑盒組(采用本發(fā)明試劑盒的A液、B液和C液)，按照實(shí)施例6的方法進(jìn)行。II組為對照組(采用的試劑基本與本發(fā)明試劑盒的A液、B液和C液相同，但是A液中不含葛根素和4-羥基肉桂酸苯乙酯)，操作方法同A組。III組為市售干細(xì)胞分離試劑盒組，采用購自北京盛宏業(yè)醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司的“骨髓、臍帶血細(xì)胞處理試劑盒”，按照試劑盒所附說明書提供的方法進(jìn)行分離。表1.不同方法分離臍帶血干細(xì)胞的比較
權(quán)利要求
1.一種分離人臍帶血干細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒由A液、B液和C液組成，A 液0. 2-0. 5mmol/L 葛根素，0. 3-1. Oymol/L 4-羥基肉桂酸苯乙酯，5_20mmol/LPBS， ρΗ7· 4 ；B液質(zhì)量/體積百分比濃度為8-15%的羥乙基淀粉溶液或質(zhì)量/體積百分比濃度為 0. 5-1.0%的甲基纖維素溶液；C液密度為1. 077g/mL的葡聚糖-泛影葡胺溶液或密度為1. 076g/mL的Percoll。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離人臍帶血干細(xì)胞的試劑盒，其特征在于A 液0. 3-0. 5mmol/L 葛根素，0. 5-0. 8 μ mol/L 4-羥基肉桂酸苯乙酯，10_15mmol/ LPBS，ρΗ7· 4 ；B液質(zhì)量/體積百分比濃度為10-15%的羥乙基淀粉溶液或質(zhì)量/體積百分比濃度為 0. 5-0. 8%的甲基纖維素溶液；C液密度為1. 077g/mL的葡聚糖-泛影葡胺溶液或密度為1. 076g/mL的Percoll。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離人臍帶血干細(xì)胞的試劑盒，其特征在于A 液0. 3mmol/L 葛根素，0. 5ymol/L 4-羥基肉桂酸苯乙酉旨，10mmol/L PBS, pH7. 4B液質(zhì)量/體積百分比濃度為10%的羥乙基淀粉溶液C液密度為1. 077g/mL的葡聚糖-泛影葡胺溶液。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的分離人臍帶血干細(xì)胞的試劑盒的使用方法，包括如下步驟1)取含有10-50U/mL肝素的臍帶血與A液按2 1的體積比混勻；2)將步驟1)的溶液與B液按1 1的體積混合，充分混勻，室溫靜置60-120分鐘；3)用移液管移取上層細(xì)胞液至50mL離心管中；4)將離心管置于離心機(jī)中，1000-2000rpm離心15-30分鐘，離心后棄去上清液，用生理鹽水清洗離心管，并用20-30mL生理鹽水重懸細(xì)胞沉淀；5)將20-30mLC液緩慢加入新的50mL離心管中，再將步驟4)得到的細(xì)胞液沿管壁緩慢加入C液上面，2000-3000rpm離心20-30分鐘；6)離心后管內(nèi)可見分為四層最上層是血漿，第二層為白膜層，主要含臍帶血干細(xì)胞， 第三層為分離液層，第四層為粒細(xì)胞和紅細(xì)胞，用吸管輕輕插入，穿過血漿層至白膜層，沿管壁周緣吸出白膜層細(xì)胞，轉(zhuǎn)入另一 50mL離心管中；7)向步驟6)獲得的細(xì)胞液中加入5倍體積的生理鹽水，混勻，1000-2000rpm離心 15-30分鐘，棄去上清液，將沉淀的細(xì)胞團(tuán)用生理鹽水清洗2次，得到人臍帶血干細(xì)胞。
5.一種人臍帶血干細(xì)胞治療液，其包含利用權(quán)利要求4的方法制備的人臍帶血干細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分離人臍帶血干細(xì)胞的試劑盒及其使用方法，所述試劑盒由A液、B液和C液組成，其中A液中添加適量葛根素和4-羥基肉桂酸苯乙酯。本發(fā)明還涉及一種人臍帶血干細(xì)胞治療液，其包含利用本發(fā)明試劑盒制備的人臍帶血干細(xì)胞。本發(fā)明的試劑盒能夠從臍帶血快捷高效的分離干細(xì)胞，有利于推廣干細(xì)胞治療技術(shù)。
文檔編號A61P21/00GK102492654SQ20111044582
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月28日
發(fā)明者葛龍海 申請人:葛龍海