臍帶血單個(gè)核細(xì)胞來(lái)源的dc-cik細(xì)胞制取方法及制劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種免疫細(xì)胞制取和共培養(yǎng)方法，尤其涉及一種DC細(xì)胞和CIK細(xì)胞制 取和共培養(yǎng)方法，DC細(xì)胞和CIK細(xì)胞均誘導(dǎo)和分化自臍帶血分離的單個(gè)核細(xì)胞，以及在治 療腫瘤的免疫細(xì)胞制劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 激活T細(xì)胞有賴(lài)于2個(gè)活化信號(hào)（肽-MHC-TCR復(fù)合體、共刺激分子⑶80/86與 ⑶4+T淋巴細(xì)胞表達(dá)的⑶28分子結(jié)合）的共同作用，刺激特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic Tcell，Tc)和輔助淋巴細(xì)胞（Thelpercell，Th)增殖，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生腫瘤免疫或是增強(qiáng)免 疫應(yīng)答能力。樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendriticcell，DC)是迄今發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的專(zhuān)職抗原提呈細(xì) 胞（antigenpresentingcell，APC)，成熟的DC可以通過(guò)II型組織相容性抗原（MHC-II) 等途徑提呈腫瘤抗原，有效抵制腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制。
[0003] 細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine-inducedkillers，CIK)是一類(lèi)抗腫瘤抗病 毒效應(yīng)細(xì)胞，能在體外被誘導(dǎo)并大量增殖。DC和同源CIK細(xì)胞共培養(yǎng)后即可獲得DC-CIK細(xì) 胞。DC是機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞，其攝取、加工、處理抗原，高表達(dá)MHC-I、MHC-II 類(lèi)分子、共刺激分子及粘附分子，促進(jìn)T細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)分子的相互作用以及信號(hào)通路的激 活，活化的APC和T細(xì)胞可分泌IL-1，IL-2,IFN-y等，促進(jìn)T細(xì)胞效應(yīng)功能的發(fā)揮。因此， 如將具有強(qiáng)大腫瘤抗原遞呈能力的DC與具有高效抗瘤活性的CIK細(xì)胞聯(lián)合起來(lái)治療惡性 腫瘤，無(wú)疑會(huì)起到協(xié)同抗腫瘤作用。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)中的DC制備方法多采用含有GM-CSF和IL-4的培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)5天，第 6天加入TNF-a再繼續(xù)培養(yǎng)2~3天。這種方法制備的DC細(xì)胞存在周期長(zhǎng)、得率低和抗原 遞呈能力差等缺點(diǎn)。CIK制備方法多采用病人的外周血單個(gè)核細(xì)胞，用此種細(xì)胞制備出的 CIK細(xì)胞多會(huì)存在繁殖能力差、細(xì)胞活性低、CD3+和CD56 +細(xì)胞所占比例較低等問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種DC細(xì)胞制取方法，將分離自臍帶血的單個(gè)核細(xì) 胞分別進(jìn)行分化成DC細(xì)胞，縮短DC細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種DC-CIK共培養(yǎng)制取方法，將分離自臍帶血的 單個(gè)核細(xì)胞分別進(jìn)行分化成DC細(xì)胞和CIK細(xì)胞后，再進(jìn)行共培養(yǎng)。
[0007] 本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供一種DC-CIK共培養(yǎng)制取方法，采用多種因子對(duì)分 離自臍帶血的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行分化制取DC細(xì)胞，縮短制取成熟DC細(xì)胞的時(shí)間，利于DC-CIK 共培養(yǎng)的制取。
[0008] 本發(fā)明提供的一種DC細(xì)胞制取方法，將分離自臍帶血的單個(gè)核細(xì)胞分別進(jìn)行分 化成成熟的DC細(xì)胞（mDC)。mDC具有的HLA-DR、⑶80、⑶83和⑶86表型占90%以上。
[0009] 成熟的DC細(xì)胞先采用巨細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)、白介素4 (IL-4)和FMS樣酪 氨酸激酶3配體（Flt3L)等因子分化獲得未成熟的DC細(xì)胞（iDC)，然后再使用腫瘤壞死因 子a(TNF-a)、白介素1MIL-10)、白介素6(IL-6)和前列腺素E2(PGE2)作用于iDC獲 得成熟的DC細(xì)胞。
[0010] 本發(fā)明提供的另一種DC細(xì)胞制取方法，先采用GM-CSF、IL-4和Flt3L分化分離自 臍帶血的單個(gè)核細(xì)胞24小時(shí)~48小時(shí)獲得iDC，然后使用TNF-a、IL-1 0、IL-6和PGE224 小時(shí)~48小時(shí)使iDC成為mDC。
[0011] 本發(fā)明提供的DC細(xì)胞制取方法，GM-CSF用量為20ng/ml~30ng/ml，如：但不僅 限于 20ng/ml、2lng/ml、22ng/ml、23ng/ml、24ng/ml、25ng/ml、26ng/ml、27ng/ml、28ng/ml、 29ng/ml和 30ng/ml。
[0012] 本發(fā)明提供的DC細(xì)胞制取方法，IL-4用量為lOng/ml~20ng/ml，如：但不僅限于 10ng/ml、llng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml、15ng/ml、16ng/ml、17ng/ml、18ng/ml、19ng/ ml和 20ng/ml。
[0013] 本發(fā)明提供的DC細(xì)胞制取方法，F(xiàn)lt3L用量為45ng/ml~55ng/ml，如：但不僅 限于 45ng/ml、46ng/ml、47ng/ml、48ng/ml、49ng/ml、50ng/ml、5lng/ml、52ng/ml、53ng/ml、 54ng/ml和 55ng/ml〇
[0014] 本發(fā)明提供的DC細(xì)胞制取方法，TNF-a用量為95ng/ml~105ng/ml，如：但不僅 限于 95ng/ml、96ng/ml、97ng/ml、98ng/ml、99ng/ml、100ng/ml、101ng/ml、102ng/ml、103ng/ ml、104ng/ml和 105ng/ml〇
[0015] 本發(fā)明提供的DC細(xì)胞制取方法，IL-1 0用量為5ng/ml~15ng/ml，如：但不僅限 于 5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、llng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml 和 15ng/ml〇
[0016] 本發(fā)明提供的DC細(xì)胞制取方法，IL-6用量為5ng/ml~15ng/ml，如：但不僅限于 5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、llng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml和 15ng/ml〇
[0017] 本發(fā)明提供的DC細(xì)胞制取方法，PGE2用量為0.3yg/ml~3yg/ml，如：但不僅限 于 0? 3yg/ml、0. 4yg/ml、0. 5yg/ml、0. 6yg/ml、0. 7yg/ml、0. 8yg/ml、0. 9yg/ml、1yg/ ml、2yg/ml和 3yg/ml〇
[0018] 本發(fā)明提供的另一種成熟的DC細(xì)胞可按如下方法獲得，其包括：
[0019] 將4父106個(gè)/!111~5\106個(gè)/1111取自臍帶血的單個(gè)核細(xì)胞置于37°(：，5%〇) 2培 養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)后吸出懸浮細(xì)胞，清洗，于培養(yǎng)基中加入因子GM-CSF至25ng/ml，加入 IL-4至16ng/ml和加入Flt3L至50ng/ml分化24小時(shí)~48小時(shí)，期間保持GM-CSF、IL-4 和Flt3L終濃度穩(wěn)定，獲得iDC細(xì)胞；
[0020] 再使用 100ng/mlTNF-a、l〇ng/mlIL-1 0、10ng/mlIL-6 和 1yg/mlPGE2 作用 于iDC細(xì)胞24小時(shí)~48小時(shí)獲得mDC細(xì)胞。
[0021] 采用本發(fā)明提供的DC細(xì)胞制取方法制取的DC細(xì)胞可與CIK細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，制 得DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞制劑，作為藥物用于腫瘤的免疫治療。
[0022] 本發(fā)明提供的一種DC-CIK細(xì)胞制取方法，將分離自臍帶血的單個(gè)核細(xì)胞分別進(jìn) 行分化成DC細(xì)胞和CIK細(xì)胞后，再進(jìn)行共培養(yǎng)，獲得的DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞具有CD3+和 ⑶56+免疫表型。
[0023] 本發(fā)明提供的單個(gè)核細(xì)胞是采用Ficoll密度梯度離心法分離，經(jīng)紅細(xì)胞裂解液 裂解后，用生理鹽水清洗，低速離心后獲得。
[0024] 本發(fā)明提供的DC-CIK細(xì)胞制取方法，DC細(xì)胞和CIK細(xì)胞按1 : 10~100進(jìn)行共 培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為7天~10天，IL-2濃度（95ng/ml~105ng/ml)保持穩(wěn)定。
[0025] 本發(fā)明提供的一種CIK細(xì)胞可按如下方法獲得，其包括：
[0026] 將4父106個(gè)/!111~5\106個(gè)/1111取自臍帶血的單個(gè)核細(xì)胞置于37°(：，5%〇) 2培 養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)后獲得懸浮細(xì)胞，培養(yǎng)基稀釋至細(xì)胞濃度1X106個(gè)/ml~3X10 6個(gè)/ml， 加細(xì)胞因子IFN-y至20~30ng/ml，置于37°C，5 % 0)2培養(yǎng)箱中，于次日加入Anti-⑶3mAb 至 95 ~105ng/ml，加入IL-2 至 95 ~105ng/ml，加入IL-1a至 3ng/ml~8ng/ml，并于 37°C，5%C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4天~6天，期間IL-2濃度保持穩(wěn)定。
[0027] 本發(fā)明所使用的培養(yǎng)基為以無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，根據(jù)細(xì)胞 (如：DC細(xì)胞和CIK細(xì)胞）的培養(yǎng)要求還加入0.5v/v~lv/v%臍帶血血衆(zhòng)。無(wú)血清淋 巴細(xì)胞培養(yǎng)液可通過(guò)商品化的培養(yǎng)液，如：但不僅限于X-VIV0?10(美國(guó)Lonza公司）和 X-VIV0?15(美國(guó)Lonza公司）等。
[0028] 本發(fā)明技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的有益效果