專利名稱：免疫調(diào)節(jié)劑組合物及其藥物組合物和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組合物，具體涉及免疫調(diào)節(jié)劑組合物及其藥物組合物。該免疫調(diào)節(jié)劑組合物是由多種細菌多糖提取物組成，其中至少包含來源于分支桿菌屬細菌多糖提取物和肺炎球菌多糖提取物。
背景技術(shù)：
人體免疫機能的下降是導致細菌、病毒等病原生物感染的重要原因之一。非特異性免疫反應(yīng)(也稱固有免疫應(yīng)答)是人和脊椎動物對抗病原生物的第一道防線，機體通過固有的非特異免疫系統(tǒng)的模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)對病原生物的模式識別分子(pathogen associated molecule patterns,PAMPs)進行識別而啟動非特異性免疫反應(yīng)，繼而引發(fā)特異性免疫反應(yīng)(也稱獲得性免疫反應(yīng))從而達到清除病原生物，保護機體的作用。
非特異性免疫是機體在種系發(fā)育和進化過程中形成的天然免疫防御功能，即出生后就已具備的非特異性防御功能。非特異性免疫反應(yīng)在機體的整個免疫反應(yīng)中占據(jù)關(guān)鍵地位:它是機體對抗外來病原微生物入侵的第一道防線和監(jiān)視哨，在機體早期發(fā)現(xiàn)和殺死入侵病原微生物過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用；它是機體一切免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)，是特異性免疫反應(yīng)的前提和基礎(chǔ)；因此，調(diào)節(jié)非特異性免疫反應(yīng)是機體增強防病和抗病能力的一個最重要方面(Kawai,T.et al.The role of pattern-recognition receptors in innate immunity:update on Toll-like receptors.Nature Immunol.11,373-384(2010)8212)。
當病 原細菌入侵宿主體內(nèi)時，宿主通過表達于中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞(DC)上的PRRs特異性識別來源于病原細菌的多糖類PAMPs，啟動宿主的非特異免疫和炎癥反應(yīng)，繼而引發(fā)宿主的特異性免疫反應(yīng)。研究表明:哺乳動物具有復雜的模式識別受體系統(tǒng)，它們主要包括 Toll 樣受體(Toll-like receptor, TLR)、NLRs (N0D-1 ike receptors) >RLR(RIG-1 ike receptor)和 MDA5(Melanoma differentiation associated gene5)及C型凝集素家族(C-type lectin family),這些模式識別受體系統(tǒng)相互協(xié)調(diào),啟動宿主的天然免疫反應(yīng)，進而激發(fā)獲得性免疫反應(yīng)，完成對入侵病原生物的控制和消滅(HajishengallisG,et al.Microbial manipulation of receptor crosstalk in innate immunity.NatureReviews Immunology.2011(11) 187-200)。
細菌多糖是一類非常重要的病原體模式識別分子(PAMPs)，它可引起機體產(chǎn)生非特異免疫反應(yīng)。在大多數(shù)細菌，尤其是致病菌，在其生長過程中表達大量的多糖，這些多糖以莢膜、糖蛋白或糖脂的形式存在于微生物細胞的表面。在細菌細胞中，幾乎所有的多糖都是由甘露糖、果糖、N-乙酰葡萄糖胺等十幾種單糖組成的，但是單糖之間有多種不同的連接方式，可形成不同構(gòu)型的直鏈和支鏈結(jié)構(gòu)，通過單糖分子間氫鍵及基團的相互作用進一步又形成不同形狀的高級結(jié)構(gòu)。在病原細菌與宿主(人或動物)共生的進化過程中，很多多糖結(jié)構(gòu)高度特異的表達分布于病原菌中，它們成為病原細菌被宿主天然免疫識別系統(tǒng)識別的主要分子標志，既病原體模式識別分子(PAMPs)，包括革蘭陰性菌的LPS、革蘭陽性菌的脂磷壁酸(LTA)、細菌和真菌的胞壁的肽聚糖以及細菌胞壁的糖蛋白和糖脂中的末端甘露糖、巖藻糖、葡聚糖等多糖、核酸和脂類。細菌多糖類PAMP高度保守，為病原微生物所特有，在病原微生物激發(fā)非特異性免疫應(yīng)答過程中起著關(guān)鍵作用。同時，細菌多糖能夠被MHC II分子呈遞并被α β-TCR直接或者間接識別，從而激活獲得性細胞免疫應(yīng)答；多糖類物質(zhì)亦能夠有效地激活B淋巴細胞，誘導特異性抗體的產(chǎn)生。
當機體(人或動物)的非特異性免疫反應(yīng)被細菌多糖激活，機體一方面啟動中性粒細胞、巨噬細胞、DC等免疫活性細胞內(nèi)的信號激活通路，刺激免疫活性細胞增殖、分化并分泌TNF- a、IL-12等細胞因子。IL-12等細胞因子促進ThO細胞向Thl細胞亞群轉(zhuǎn)化和IFN-Y分泌，從而產(chǎn)生Thl占優(yōu)勢的非特異性免疫反應(yīng)，增強機體抗感染、過敏能力 ’另一方面參與非特異性和特異性免疫的NK細胞、效應(yīng)T細胞等免疫細胞被活化，增強了機體免疫系統(tǒng)抗抗感染和抗腫瘤的能力(Simpson J L, et al.1nnatey immunity in asthma.Paediatr Respir Rev.2008(9)263-270 ；E.Vivier,et al.“Functions of natural killercells, ”Nature Immunology.2008(9)503-510 ;)。
綜上所述，非特異性免疫應(yīng)答是一切免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)，是人和動物抵抗外來病原生物入侵的第一道防線，是機體增強抗微生物感染、抗腫瘤、抗過敏能力的最重要方面，因此，研制可用于調(diào)節(jié)人或哺乳動物免疫反應(yīng)，特別是非特異性免疫應(yīng)答能力的細菌多糖免疫調(diào)節(jié)劑將具有重要的社會意義和經(jīng)濟價值。
早在19世紀，人們已認識到引起人和動物結(jié)核病的是各型結(jié)核桿菌。后來又發(fā)現(xiàn)。另有一些非結(jié)核桿菌，也能引起人類結(jié)核病，但毒性較結(jié)核菌為弱，后來將這類菌稱為非典型菌，并與腐物寄生桿菌和麻瘋桿菌共為分枝桿菌屬?？ń榫鸀榕Ｐ蜏p毒結(jié)核菌，無致病性，有免疫原性，用卡介菌接種代替結(jié)核菌初次感染而獲得對結(jié)核病的免疫力，是目前世界上應(yīng)用最廣泛的菌苗之一。1908年,法國巴斯德研究所的Calnette和Guerin成功培育出一株弱毒牛型結(jié)核桿菌，并命名為卡介菌(BCG)。1921年，Weill-Halle成功地將該菌應(yīng)用于人體，防治結(jié)核病。另一方面，當時，人們還認識到，自身免疫力的提高，可抵抗其它疾病，20世紀20 40年代，曾有人用草分枝桿菌液治療結(jié)核病以外的其他一些病原性疾病，如呼吸系統(tǒng)疾病，甚至性病?，F(xiàn)在才認識到，這是非特異性免疫調(diào)節(jié)作用。
在中國，上世紀60年代，湖南醫(yī)學院譚禮智和王慧人，首先用滅活卡介苗于上臂劃痕，對結(jié)核病有一定療效。但意外見到，這些劃痕的肺結(jié)核患者，原有的慢性氣管炎，感冒、哮喘、風濕性疾病或 神經(jīng)性慢性皮炎也有療效。從而，使國內(nèi)外很多研究者注意到，人體接種分枝桿菌屬細菌，可產(chǎn)生良好的非特異性免疫，并可提高機體抗病能力，表現(xiàn)出對某些慢性常見病具有一定的治療效果(死卡介苗防治慢性氣管炎、感冒和流感的臨床研究。中華內(nèi)科雜志1976，I =286-290)?，F(xiàn)代免疫學研究表明:在分支桿菌中，多糖(主要包括肽聚糖、阿拉伯半乳糖聚糖和分支菌酸)和脂類常結(jié)合在一起，構(gòu)成細胞壁的主要成分。分支桿菌細胞壁和其他細胞器上存在多糖或糖結(jié)構(gòu)的PAMPs可結(jié)合人和動物的免疫識別系統(tǒng)PRRs上，其中至少包括4種Toll受體(TLR1、TLR2、TLR4、TLR6、TLR9)、NLRs和C型凝集素等。當它們相互特異識別并結(jié)合后，啟動中性粒細胞、巨噬細胞、DC等免疫活性細胞內(nèi)的信號激活通路，刺激免疫活性細胞增殖、分化并分泌TNF- a、IL-12等細胞因子。IL-12等細胞因子促進ThO細胞向Thl細胞亞群轉(zhuǎn)化和IFN- Y分泌，從而產(chǎn)生Thl占優(yōu)勢的非特異性免疫反應(yīng)并增強NK等免疫活性細胞的功能，從而提高宿主的免疫機能(J Exp Med2003 ；197:403-411)。
近十幾年來，國內(nèi)外陸續(xù)批準多個分枝桿菌制劑上市，如治療用卡介苗、卡介苗多糖核酸注射液、凍干卡介苗細胞壁，草分支桿菌注射液及母牛分枝桿菌凍干制劑，這些制劑均有免疫調(diào)節(jié)功能。治療用卡介苗及卡介菌細胞壁主要用于治療淺表性膀胱癌；卡介苗多糖核酸注射劑主要用于預(yù)防和治療慢性氣管炎、感冒和哮喘；草分枝桿菌及母牛分枝桿菌制劑以及卡介苗多糖核酸液主要用作結(jié)核病的輔助治療。上世紀80年代批準已上市的卡介菌多糖核酸注射劑(BCG-PSN)是經(jīng)熱酚法提取卡介菌多糖核酸，配以滅菌生理鹽水制成的免疫調(diào)節(jié)劑，在該制劑中為多糖、核酸及蛋白混合物，其中多糖為70 % 80 %左右，核酸為10% 20%。BCG-PSN具有免疫調(diào)節(jié)及抗炎作用，在提高機體的免疫功能、抗過敏、抗感染方面具有一定的療效和較高的安全性，臨床上已用于抗感染、抗病毒、抗腫瘤和抗過敏性疾病的治療上。但也發(fā)現(xiàn)其免疫調(diào)節(jié)的作用不持久，治療作用不顯著。(黃建等，中國分支桿菌類免疫調(diào)節(jié)劑的評述與展望，微生物免疫學進展，2002 ；30:56-60 ;寧云山等，中國生物制品學雜志，2008 ；1:74-80,)。
肺炎球菌(也稱肺炎鏈球菌)可引發(fā)多種侵襲性疾病(如菌血癥、腦膜炎等)與非侵襲性疾病(如細菌性鼻竇炎、中耳炎、社區(qū)肺炎等)的致病病因。全球各年齡段人群的感染及相關(guān)性疾病中，肺炎球菌性疾病位居首位，尤其是幼兒、年邁者、免疫障礙患者以及患有各種慢性基 礎(chǔ)疾病患者中的發(fā)生率更高。WHO估計每年約有160萬人死于肺炎球菌感染性疾病，其中包括70萬 100萬5歲以下兒童；此外，人類免疫缺陷病毒感染以及與免疫缺陷相關(guān)的其他疾病大大增加了感染肺炎球菌疾病的可能性(Pneumococcalconjugate vaccine for childhood immunization-WHO position paper.Wkly EpidemiolRec.2007 (82):93-104)，且隨著日益廣泛地使用抗生素，致使肺炎球菌耐藥菌株達96 %以上，且呈多重耐藥性狀況。
在肺炎球菌中，多糖是主要病原體相關(guān)模式分子和主要保護性抗原，通過識別TLR等表達人類或哺乳動物免疫細胞上的病原體模式分子識別受體系統(tǒng)，啟動非特異性免疫系統(tǒng)，繼而進一步激活特異性免疫系統(tǒng)。目前，全球已有多種肺炎細菌多糖疫苗被批注用于人體，包括14價、23價多糖疫苗和PCV-7多糖蛋白結(jié)合疫苗，在預(yù)防肺炎球菌感染中取得較好的保護性效果(唐靜等，肺炎球菌疫苗的研究進展，國際呼吸雜志，2010 (30) =1392-1395)。
金黃色葡萄球菌是一種常見的革蘭氏陽性致病菌，不但寄居于皮膚和粘膜表而，也能在多種組織及血液中生長繁殖，引起多種疾病，如人和動物的局部化膿性感染、肺炎、偽膜性腸炎、心包炎以及敗血癥、膿毒敗血癥等，同時金葡菌也是醫(yī)院感染和社區(qū)感染的主要病原菌。隨著廣譜抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，醫(yī)院內(nèi)耐藥性細菌已嚴重威脅人類的健康，特別是耐甲氧西林和耐萬古霉素的金黃色葡萄球菌往往導致現(xiàn)有抗生素治療的失敗；社區(qū)獲得性金葡菌感染率和耐藥率逐年增加，引起各國政府和感染控制學家的高度重視。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種免疫調(diào)節(jié)劑組合物，該免疫調(diào)節(jié)劑組合物是由多種細菌多糖提取物組成，其至少包含分支桿菌屬細菌多糖提取物和肺炎球菌多糖提取物。
所述的免疫調(diào)節(jié)劑組合物，所述免疫調(diào)節(jié)劑組合物中分支桿菌屬細菌多糖提取物所占重量比不低于20 %，肺炎球菌多糖提取物所占重量比不低于10 %。
優(yōu)選地，所述分支桿菌屬細菌多糖提取物為卡介菌多糖提取物、草分枝桿菌多糖提取物或恥垢分枝桿菌多糖提取物。
所述的免疫調(diào)節(jié)劑組合物，還可以包可引發(fā)人或動物產(chǎn)生免疫反應(yīng)，更優(yōu)選包含可引起人或動物呼吸道、消化道或皮膚感染的細菌，更優(yōu)選包含葡萄球菌屬、鏈球菌屬、埃希菌屬、志賀菌屬、沙門菌屬、克雷伯菌屬，特別優(yōu)選包含金黃色葡萄球菌、卡他布蘭漢氏菌、肺炎克雷伯桿菌、流感嗜血桿菌、草綠色鏈球菌、化膿性鏈球菌的多糖提取物。具體可以為含金黃色葡萄球菌多糖提取物、卡他布蘭漢氏菌多糖提取物、肺炎克雷伯桿菌多糖提取物、流感嗜血桿菌多糖提取物、草綠色鏈球菌多糖提取物或化膿性鏈球菌多糖提取物。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明所述的組合物包含所有血清型肺炎球菌，更優(yōu)選包含1、2、3、4、5、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F、33F 血清型，更優(yōu)選包含 1、5、6B、14、18C、19F、23F 血清型。
優(yōu)選地，所述的免疫調(diào)節(jié)劑組合物中，所述免疫調(diào)節(jié)劑組合物中分支桿菌屬細菌多糖提取物所占重量比為20 80%，肺炎球菌多糖提取物所占重量比為10 70%，金黃色葡萄球菌多糖提取物所占質(zhì)量比為O 20%。
一優(yōu)選實施例中，所述免疫調(diào)節(jié)劑組合物中分支桿菌屬細菌多糖提取物所占重量比為50%，肺炎球菌多糖提取物所占重量比為35%，金黃色葡萄球菌多糖提取物所占質(zhì)量比為15%。
另一優(yōu)選實施例中，所述免疫調(diào)節(jié)劑組合物中分支桿菌屬細菌多糖提取物所占重量比為70%，肺炎球菌多糖提取物所占重量比為10%，金黃色葡萄球菌多糖提取物所占質(zhì)量比為20%。
本發(fā)明還提供一種藥物組合物，其包含上述的免疫調(diào)節(jié)劑組合物及藥學上可接受的輔料。例如為藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑，其中所用的藥物組合物調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，特別是非特異性免疫應(yīng)答能力。
根據(jù)上述的免疫調(diào)節(jié)劑組合物或藥物組合物，其還可以包含抗原或抗原決定簇。所述抗原或抗原決定簇選自以下一種或多種疫苗的抗原或抗原決定簇:細菌疫苗、病毒疫苗、寄生蟲疫苗、腫瘤疫苗。所述藥物組合物和/或免疫調(diào)節(jié)劑組合物與抗原或抗原決定簇聯(lián)合給藥。
優(yōu)選地，所述抗原或抗原決定簇為具體可以為:流感病毒A全病毒滅活疫苗，或A群腦膜炎球菌多糖疫苗，BCG (卡介苗)疫苗，白喉類毒素疫苗、白喉/破傷風/百日咳疫苗、百日咳疫苗、破傷風類 毒素疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、風疹疫苗、乙肝疫苗、狂犬病疫苗、流感疫苗、SARS疫苗和瘧原蟲抗原。
相適應(yīng)地，本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑組合物和/或藥物組合物可以包括兩種或多種所述抗原或抗原決定簇。
本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑組合物和/或藥物組合物可以通過許多不同途徑進行給藥，如注射(其包括非腸道，皮下，皮內(nèi)和肌肉注射)鼻內(nèi)，粘膜，口腔，陰道內(nèi)，尿道或眼部給藥。
優(yōu)選地，在本發(fā)明中通過注射給藥。更優(yōu)選地，注射為皮內(nèi)注射。
優(yōu)選地，本發(fā)明中通過口服可接受的組合物來進行給藥。
本發(fā)明還涉及上述的免疫調(diào)節(jié)劑組合物或藥物組合物在制備預(yù)防或治療感染、過敏、腫瘤、免疫系統(tǒng)失衡、肺部相關(guān)慢性疾病的藥物中的應(yīng)用。這些細菌多糖可被表達于人或動物免疫細胞如中性粒細胞、巨噬細胞和DC細胞上的模式識別受體(PRR)特異性識別，啟動宿主的非特異免疫和炎癥反應(yīng)，繼而引發(fā)宿主的特異性免疫反應(yīng)。由于非特異性免疫反應(yīng)系統(tǒng)被激活，一方面啟動中性粒細胞、巨噬細胞、DC等免疫活性細胞內(nèi)的信號激活通路，刺激免疫活性細胞增殖、分化并分泌TNF-a、IL-12等細胞因子。IL-12等細胞因子促進ThO細胞向Thl細胞亞群轉(zhuǎn)化和IFN-Y分泌，產(chǎn)生Thl占優(yōu)勢的免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)Thl/Th2平衡，從而增強機體抗感染、過敏能力；同時部分多糖抗原在非特異性免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)上，激活特異性免疫反應(yīng)，產(chǎn)生特異性抗體從而殺滅入侵的微生物，消除感染；另一方面參與非特異性和特異性免疫的NK細胞、效應(yīng)T細胞等免疫細胞被活化，增強了機體免疫系統(tǒng)抗腫瘤的活性，從而在整體上增強人或動物抗感染、抗過敏、抗腫瘤的能力。因此，可用于預(yù)防和治療如下病癥中的一種或多種:感染(如細菌感染、病毒感染，例如乳頭瘤病毒造成的感染，或寄生蟲感染例如弓形蟲感染)、過敏(如包括過敏性哮喘、過敏性鼻炎、過敏性皮炎等)、腫瘤(如膀胱癌、肺癌、胃癌、宮頸癌等)、免疫系統(tǒng)失衡(例如兒童和老人的免疫系統(tǒng)失衡)、肺部相關(guān)慢性疾病(COPD，即慢性阻塞性肺病等)。
具體地，所述感染為單純皰疹病毒感染，所述過敏為被動皮膚過敏和哮喘，所述腫瘤為肺癌，所述免疫系統(tǒng)失衡為環(huán)磷酰胺所致白細胞減少癥，所述肺部相關(guān)慢性疾病為呼慢性阻塞性肺病。
優(yōu)選地，所述藥物為疫苗。對于疫苗接種來說組合物能以0.1至0.2ml水溶液的形式來提供，優(yōu)選生理鹽水緩沖液，并進行非腸道注射給藥，例如通過皮內(nèi)接種。本發(fā)明所述的疫苗優(yōu)選進行皮內(nèi)注射。在注射部位可能會發(fā)現(xiàn)輕微的腫脹和發(fā)紅，有時也會有搔癢。給藥的模式、給藥的劑量和次數(shù)可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方式進行優(yōu)化。
本發(fā)明的上述免疫調(diào)節(jié)劑組合物和/或藥物組合物可以以多種劑型通過多種途徑進行給藥，如注射(其包括非腸道、皮下、皮內(nèi)和肌肉注射)鼻腔、粘膜、口腔、陰道內(nèi)、尿道或眼部給藥。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明所述的免疫調(diào)節(jié)劑組合物或藥物組合物在制備藥物上的應(yīng)用，其劑型可為經(jīng)腸胃道給藥劑型和非經(jīng)腸胃道給藥劑型，優(yōu)選為注射劑、口服制劑、灌注劑以及滴劑，更優(yōu)選為舌下片劑、舌下滴劑、滴鼻劑、噴霧劑。
本發(fā)明提供了的免疫調(diào)節(jié)劑組合物由多種細菌多糖提取物組成，其中至少包含來源于分支桿菌屬細菌多糖提取物和肺炎球菌多糖提取物。該免疫調(diào)節(jié)劑組合物可刺激機體產(chǎn)生持續(xù)和作用顯著的免疫免疫調(diào)節(jié)功能，特別是非特異性免疫應(yīng)答能力以及在此基礎(chǔ)上繼發(fā)產(chǎn)生的特異性免疫反應(yīng)，同已上市的免疫調(diào)節(jié)劑相比，可在整體上提高人或動物抗感染、抗腫瘤和抗過敏能力。
另一個方面，本發(fā)明提供了的免疫調(diào)節(jié)劑組合物。其中至少包含來源于分支桿菌屬細菌多糖提取物和肺炎球菌多糖提取物，它們單獨或同其他細菌多糖提取物按一定比例組成本發(fā)明所涉及的免疫調(diào)節(jié)劑，之所以選用分支桿菌屬細菌多糖提取物和肺炎球菌多糖提取物作為本發(fā)明所提供的免疫調(diào)節(jié)劑的最核心組成物，這是因為:①分支桿菌屬的多種免疫制劑已批準上市。卡介菌是目前全球應(yīng)用最廣泛的菌苗之一，其安全性和有效性已獲得廣泛肯定，同時，由我國自行研制 的卡介菌多糖核酸注射液(該制劑中多糖占70 80% )已批準上市近三十年，其在調(diào)節(jié)人體的非特異性免疫能力，提高人體抗感染、抗過敏、抗病毒方面顯示了一定的療效和較高的安全性肺炎球菌是目前呼吸道最常見的致病菌之一，也是最常感染兒童、老人、免疫障礙患者以及患有各種慢性基礎(chǔ)疾病患者。肺炎球菌多糖疫苗已在預(yù)防肺炎球菌感染中取得較好的保護性效果，具有一定的非特異性免疫調(diào)節(jié)能力和較強的特異性免疫反應(yīng)應(yīng)答能力將分支桿菌屬細菌多糖提取物和肺炎球菌多糖提取物組合，并做為本發(fā)明所述免疫調(diào)節(jié)劑的核心成分，它們單獨或同其他細菌多糖提取物按一定比例組成本發(fā)明所涉及的免疫調(diào)節(jié)劑不僅能刺激人或動物產(chǎn)生較強而持續(xù)的非特異性反應(yīng)能力，而且也可產(chǎn)生較強而持續(xù)的特異性免疫反應(yīng)，從而在整體提升人或動物抗感染、抗腫瘤、抗過敏能力；④相對于一種細菌多糖引發(fā)的免疫應(yīng)答，通過多種細菌多糖引發(fā)的免疫調(diào)節(jié)作用(非特異性和特異性免疫)具有長期持續(xù)的特點；⑤相對于一種細菌多糖引發(fā)的免疫應(yīng)答，通過多種細菌多糖引發(fā)的免疫調(diào)節(jié)，具有可同時對抗多種細菌感染的能力，具有廣譜性。
本 發(fā)明提供的免疫調(diào)節(jié)劑或藥物組合物同目前已上市的干擾素、胸腺肽、靈芝多糖等免疫調(diào)節(jié)劑產(chǎn)品相比，它具有獨特而不可替代的優(yōu)勢:①它是一類非常獨特的免疫調(diào)節(jié)劑，它可主動持久刺激機體產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用，特別是提高了人和動物的非特異免疫反應(yīng)能力，因此加強了機體抵抗外來病原入侵和監(jiān)視腫瘤細胞免疫逃逸的第一道防線的能力，從而達到機體通過自身免疫調(diào)節(jié)作用來預(yù)防和治療疾病的目的；②它在疾病的預(yù)防作用在阻止一些傳染病疾病的發(fā)生和發(fā)展上更具有價值，特別是在類似SARS、HlNl等嚴重突發(fā)傳染病的預(yù)防上將發(fā)揮獨特而重要的作用。一種新發(fā)傳染病從病原確認到疫苗批準上市，一般需要5年的時間，最短也需要I 2年。在疫苗未上市之前，特別是在病原體未確定之前，使用該制劑將可降低該傳染病爆發(fā)和大流行的風險，降低該傳染病對人民健康和社會經(jīng)濟的影響；③它在一些特殊人群的疾病預(yù)防作用上也同樣更具有價值。兒童、老人、免疫障礙患者以及患有各種慢性基礎(chǔ)疾病患者是一類特別容易罹患各類感染性疾病和腫瘤的人群，使用本制劑將提高這類人群的免疫功能，可以減少疾病的發(fā)生，改善患者的生活質(zhì)量，減輕患者和社會的經(jīng)濟負擔；④它是一種廣譜的免疫調(diào)節(jié)劑和協(xié)同劑，它不僅對細菌、病毒等微生物引起的感染發(fā)揮作用，還可增強抗病毒制劑、抗生素、疫苗的治療和預(yù)防作用，同時對機體自身免疫失衡所引發(fā)的疾病如過敏性疾病等發(fā)揮治療和預(yù)防作用。
為讓本發(fā)明之上述和其它目的、特征和優(yōu)點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，作詳細說明如下。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
具體實施方式
實施例1:卡介菌的培養(yǎng)和多糖提取物的制備
1、菌體培養(yǎng):將液體低溫保藏的菌種(中國卡介苗制備用卡介菌株D2PB302，中國藥品生物制品檢定所菌苗室提供)室溫下溶解，接種于馬鈴薯蘇通培養(yǎng)基，37°C連續(xù)培養(yǎng)14 20天；或在37°C連續(xù)培養(yǎng)15天后轉(zhuǎn)種于改良的液體蘇通培養(yǎng)基，37°C連續(xù)培養(yǎng)14 20天。
其中，馬鈴薯蘇通培養(yǎng)基的制備方法可以是:
取洗凈新鮮土豆(I個)用穿刺器穿成圓柱，再用刀切成4公分長斜面，用流動飲用水沖洗土豆斜面I小時后用純化水沖洗土豆斜面塊；然后用蘇通培養(yǎng)基沖洗斜面塊。取蘇通培養(yǎng)基20ml,加入IOOml滅菌大管中；將沖洗后的土豆斜面放入裝有蘇通培養(yǎng)基的滅茵大管中，0.1lMPa的大氣壓121°C，滅菌20分鐘。放冷至室溫待接種。
蘇通培養(yǎng)基配制比例:
每IOOOml:
硫酸鎂0.5g 磷酸氫二鉀1.04g
味精8.0g枸櫞酸2.0g
甘油60ml10%檸檬酸鐵銨0.5ml
加純化水至IOOOml氨水調(diào)至ρΗ8.0左右
改良的液體蘇通培養(yǎng)基配方配制比例:
每IOOOml:
天冬素:4g檸蒙酸:2g K2HP04.3H20(AR):
0.5g MgS04.7H20 (AR):0.5g 檸檬酸鐵銨:0.05g
甘油(藥用):60ml
然后加I % (ff/V)硫酸鋅1ml，10磅20分鐘滅菌。
2、菌體收集:待菌體生長至對數(shù)期時，對培養(yǎng)瓶逐瓶檢查后，收集菌膜，加入適量去離子蒸餾水洗 滌，壓干后稱重；
3、多糖提取物的制備:
(I)菌體破碎和熱酚處理:
將收集的菌體按10: I的比例加入純化水，以組織搗碎勻漿機(12000rpm/min)破碎菌體，3minX 3次，將菌體搗碎，然后再加入與破碎菌懸液等量的熱苯酚(60 65°C )，在低速攪拌中保溫30分鐘 I小時。
(2)卡介菌多糖提取物的制備:
可通過透析或凝膠過濾的方法除去苯酚。將熱酚好的混合液自然沉淀I 10天，吸取上清液，管式離心機離心后，上清液裝入透析袋(截流分子量> 5000道爾頓)中在100倍體積的注射用水中透析I 10天，除去苯酚?；蚴巧锨逡和ㄟ^純化系統(tǒng)按30%的體積上樣于預(yù)先平衡的凝膠層析柱(層析用填料為GH-25或G-25，平衡液為0.9%生理鹽水)，采用紫外分光儀(波長采用260nm或280nm)檢測流出液，收集多糖目標峰，除去苯酚。
將透析好的上清液或通過凝膠層析收集的多糖峰中加入適量乙醇使含醇量60 85%,自然沉淀I 10天后，沉淀物用無水乙醇充分攪拌均勻、離心洗滌3次。然后用乙醚洗滌離心3次后，放至干燥器干燥，自然干燥后即為卡介菌多糖提取物。
(3)卡介菌多糖提取物的鑒定:
采用《中國生物制品規(guī)程》(2000)和《分子克隆第三版》等所提供的標準方法對制備的多糖提取物進行鑒別和含量測定，結(jié)果表明，在制備的多糖提取物中，多糖含量大于70% (W/W)，核酸含量為10 20% (W/W)，蛋白含量小于0.5% (W/W)。
其中多糖含量的測定參考《中國生物制品規(guī)程》(2000)版的恩酮法，核酸含量的測定參考《分子克隆第三版》，蛋白含量的測定參考《中國生物制品規(guī)程》(2000)版的1wry法。
實施例2:肺炎球菌的培養(yǎng)和多糖的提取
1、肺炎球菌的培養(yǎng):可采用培養(yǎng)瓶和發(fā)酵罐進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為本領(lǐng)域公知的肺炎球菌培養(yǎng)條件。
將1、5、6B、14、18C、19F及23F血清型肺炎球菌凍干菌種接種于10%脫纖維羊血普通瓊脂培養(yǎng)基，在36°C，5%的CO2環(huán)境中，靜止培養(yǎng)后傳種2代液體培養(yǎng)基，按接種量約108CFU/mL接種于一定體積得發(fā)酵罐中內(nèi)，于36°C進行攪拌培養(yǎng)，自培養(yǎng)2h后起每隔Ih取樣一次，在600nm波長下測OD值，用50%葡萄糖溶液調(diào)節(jié)糖濃度，以7.5mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5，間歇通入壓縮空氣，，待OD值到達1.5 1.7時(約7 9小時)終止培養(yǎng)。采用(V/V)重量體積比為I %的脫氧膽酸鈉或0.5%苯酚滅活細菌，離心(9000g，30分鐘)，收集上清。
2、肺炎球菌多糖提取物的制備:上清液超濾濃縮到原體積的1/5 1/2時，加入乙醇使其終濃度走到40%，離心去除核酸；上清中繼續(xù)加入乙醇使其終濃度達到70%，離心收集沉淀。重新溶解沉淀，加入2倍體積的冷酚抽提數(shù)次，去除蛋白；沉淀物用0.3mol/L乙酸鈉溶解，以等體積苯酚一乙酸鈉飽和液離心抽提，充分去除蛋白。吸取上清水相，用蒸餾水透析，透析后加入乙醇濃度使其終濃度達到80%以沉淀多糖，用無水乙醇洗2次，自然干燥后進行多糖測定。
3、肺炎球菌多糖提取物的鑒定
多糖按照(《歐洲藥典》1997年版)相應(yīng)要求進行測定。蛋白含量用Lowry氏法；核酸含量以分光光度法；甲基戊糖、氨基己糖及糖醛酸含量測定按照(《歐洲藥典》1997年版)所述方法進行。
采用上述標準標準方法對制備的多糖提取物進行鑒別和含量測定，結(jié)果表明，在制備的多糖提取物中，多糖含量大于60% (W/W)，核酸含量小于20% (W/W)，蛋白含量小于20% (W/W) ο
實施例3:金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)和多糖的提取
1、金黃色葡萄球菌的培養(yǎng):可采用培養(yǎng)瓶和發(fā)酵罐進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為本領(lǐng)域公知的肺炎球菌培養(yǎng)條件。
將C5、CS血清型金黃色葡萄球菌凍干菌種接種于固體培養(yǎng)基上進行活化，37°C培養(yǎng)18小時，將該培養(yǎng)物再次在新瓊脂培養(yǎng)上37°C培養(yǎng)4小時，以便獲得指數(shù)生長期的微生物。然后在基本液體培養(yǎng)基(lg/L 葡萄糖、120mg/L Fecl3 *6H20>400mg/LMgcl2 *6H20>10mg/L CaCl2.2H20、5mg/LZnCl2、58.5g/L NaCl、6g NH4Cl,6.8g NH4Cl' PH6.2 7.5，最適 6.5)進行培養(yǎng)。自培養(yǎng) 2h后起每隔Ih取樣一次，在600nm波長下測OD值，待OD值0D_彡1.5時，終止培養(yǎng)。
培養(yǎng)物通過苯酚-乙醇(終濃度2% V/V)處理來滅活，然后在25000g下離心30分鐘，收集沉淀物。
2、金黃色葡萄球茵多糖的提取:文獻中描述了各種細菌多糖的提取技術(shù)，并且可以在本發(fā)明中使用。例如可參考 Lee.J.C.1nfect Immunu 1993 ；67:1853 1858 ；DassyB等 J.Gen Microbiol.1991 ;137:1155 1162 ;Fattom A 等人，Infect Tmmun 1990 ；58:2367 2374。下面方法主要采用苯酚-乙醇法提取金黃色葡萄球菌多糖:離心獲得的細菌沉淀按10mg/ml溶度溶于生理鹽水后，加入等體積苯酚一乙酸鈉飽和液離心抽提，充分去除蛋白。吸取上清水相，用蒸餾水透析，透析后加入乙醇濃度使其終濃度達到40%，離心去除核酸，上清繼續(xù)加入乙醇至終濃度為80%以沉淀多糖，用無水乙醇洗2次，自然干燥后進行多糖測定。
3、金黃色葡萄球菌多糖的鑒定
采用《中國生物制品規(guī)程》(2000)和《分子克隆第三版》等所提供的標準方法對制備的多糖提取物進行鑒別和含量測定，結(jié)果表明，在制備的多糖提取物中，多糖含量為大于60% (W/W)，核酸含量小于20% (W/W)，蛋白含量小于為20% (W/W)。
除上述卡介菌、肺炎球菌、金黃色葡萄球菌，相關(guān)文獻中描述了其它細菌多糖的提取技術(shù)，并且可以在本發(fā)明中使用。
實施例4:免疫組合物的制備
從上述實施例中獲得的三種細菌多糖提取物，按表I配比成A、B、C、D、E五種免疫組合物(見表I)，然后將配比后的組合物溶解在生理鹽水中，其濃度為lmg/ml，除菌分裝后置于室溫備用。
表1:不同細菌多糖組合的免疫調(diào)節(jié)劑組合物
權(quán)利要求
1.一種免疫調(diào)節(jié)劑組合物，其特征在于，至少包含分支桿菌屬細菌多糖提取物和肺炎球菌多糖提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫調(diào)節(jié)劑組合物，其特征在于，所述免疫調(diào)節(jié)劑組合物中分支桿菌屬細菌多糖提取物所占重量比不低于20%，肺炎球菌多糖提取物所占重量比不低于 10%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的免疫調(diào)節(jié)劑組合物，其特征在于，所述分支桿菌屬細菌多糖提取物為卡介菌多糖提取物、草分枝桿菌多糖提取物或恥垢分枝桿菌多糖提取物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的免疫調(diào)節(jié)劑組合物，其特征在于，還包含葡萄球菌屬、鏈球菌屬、埃希菌屬、志賀菌屬、沙門菌屬、克雷伯菌屬的多糖提取物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫調(diào)節(jié)劑組合物，其特征在于，包含金黃色葡萄球菌多糖提取物、卡他布蘭漢氏菌多糖提取物、肺炎克雷伯桿菌多糖提取物、流感嗜血桿菌多糖提取物、草綠色鏈球菌多糖提取物、化膿性鏈球菌多糖提取物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的免疫調(diào)節(jié)劑組合物，其特征在于，所述免疫調(diào)節(jié)劑組合物中分支桿菌屬細菌多糖提取物所占重量比為20 80%，肺炎球菌多糖提取物所占重量比為10 70%，金黃色葡萄球菌多糖提取物所占質(zhì)量比為O 20%。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的免疫調(diào)節(jié)劑組合物，其特征在于，所述免疫調(diào)節(jié)劑組合物中分支桿菌屬細菌多糖提取物所占重量比為50%，肺炎球菌多糖提取物所占重量比為35%，金黃色葡萄球菌多糖提取物所占質(zhì)量比為15%。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的免疫調(diào)節(jié)劑組合物，其特征在于，所述免疫調(diào)節(jié)劑組合物中分支桿菌屬細菌多糖提取物所占重量比為70%，肺炎球菌多糖提取物所占重量比為10%，金黃色葡萄球菌多糖提取物所占質(zhì)量比為20%。
9.一種藥物組合物，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的免疫調(diào)節(jié)劑組合物及藥學上可接受的輔料。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫調(diào)節(jié)劑組合物或權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其特征在于，還包含抗原或抗原決定簇。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的免疫調(diào)節(jié)劑組合物或藥物組合物，其特征在于，所述抗原或抗原決定簇選自以下一種或多種疫苗的抗原或抗原決定簇:細菌疫苗、病毒疫苗、寄生蟲疫苗、腫瘤疫苗。
12.根據(jù)權(quán)利要求1 1所述的免疫調(diào)節(jié)劑組合物或藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物和/或免疫調(diào)節(jié)劑組合物與抗原或抗原決定簇聯(lián)合給藥。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抗原或抗原決定簇為卡介苗疫苗、白喉類毒素疫苗、白喉/破傷風/百日咳疫苗、百日咳疫苗、破傷風類毒素疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、風疹疫苗、乙肝疫苗、狂犬病疫苗、流感疫苗、SARS疫苗、瘧原蟲抗原、流感病毒A全病毒滅活疫苗或A群腦膜炎球菌多糖疫苗。
14.權(quán)利要求1所述的免疫調(diào)節(jié)劑組合物或權(quán)利要求9所述的藥物組合物在制備預(yù)防或治療感染、過敏、腫瘤、免疫系統(tǒng)失衡、肺部相關(guān)慢性疾病的藥物中的應(yīng)用。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，其特征在于，所述感染為單純皰疹病毒感染，所述過敏為被動皮膚過敏和哮喘，所述腫瘤為肺癌，所述免疫系統(tǒng)失衡為環(huán)磷酰胺所致白細胞減少癥，所述肺部相關(guān)慢性疾病為慢性阻塞性肺病。
16.根據(jù)權(quán)利要求15 所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物為疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫調(diào)節(jié)劑組合物及其藥物組合物和應(yīng)用。所述免疫調(diào)節(jié)劑組合物由多種細菌多糖提取物組成，其中至少包含來源于分支桿菌屬細菌多糖提取物和肺炎球菌多糖提取物。該免疫調(diào)節(jié)劑組合物可刺激機體產(chǎn)生持續(xù)和作用顯著的免疫調(diào)節(jié)功能，特別是非特異性免疫應(yīng)答能力以及在此基礎(chǔ)上繼發(fā)產(chǎn)生的特異性免疫反應(yīng)，同已上市的免疫調(diào)節(jié)劑相比，可在整體上提高人或動物抗感染、抗腫瘤和抗過敏能力。
文檔編號A61P11/00GK103157108SQ201110416789
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月13日
發(fā)明者寧云山 申請人:寧云山