專利名稱：公豬去異味重組噬菌體疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用免疫學(xué)方法去除公豬內(nèi)源性異味物質(zhì)、改善肉質(zhì)的公豬去異味重組噬菌體疫苗，屬于分子生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
GnRH由丘腦下部的&iRH神經(jīng)元合成，以顆粒或囊泡的形式貯存于細(xì)胞內(nèi)，已從脊椎動(dòng)物和原索動(dòng)物的神經(jīng)組織中分離出13種不同的&iRH，所有哺乳動(dòng)物包括人類的&iRH 結(jié)構(gòu)是一樣的，其氨基酸序列為PTO0Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2， 即焦谷氨酸-組氨酸-色氨酸-絲氨酸-酪氨酸-甘氨酸-亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-甘酰肽。&iRH疫苗主動(dòng)免疫動(dòng)物后，可誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生特異性的抗&iRH的抗體，該抗體與動(dòng)物自身分泌的內(nèi)源性的&iRH結(jié)合并使其失去生物活性，從而導(dǎo)致下丘腦-垂體-性腺軸功能的破壞，抑制LH和FSH的釋放，進(jìn)而導(dǎo)致性腺內(nèi)分泌變化。對(duì)雄性動(dòng)物，導(dǎo)致類固醇激素分泌減少，睪丸及性腺萎縮，精子生成受阻；對(duì)雌性動(dòng)物，則導(dǎo)致乏情期延長(zhǎng)或不發(fā)情，卵泡發(fā)育、排卵及黃體形成受阻，卵巢、子宮萎縮。最終使動(dòng)物大部分甚至完全喪失生殖能力。在大多數(shù)家畜中，沒(méi)經(jīng)過(guò)去勢(shì)的雄性動(dòng)物要比經(jīng)過(guò)去勢(shì)的生長(zhǎng)更快、效率更高，并且酮體品質(zhì)更為優(yōu)良。Wood等人發(fā)現(xiàn)未經(jīng)去勢(shì)處理的公豬比去勢(shì)公豬生長(zhǎng)更快，飼料報(bào)酬更高。Kuhlers等人報(bào)道，未經(jīng)去勢(shì)的公豬與同等體重經(jīng)過(guò)去勢(shì)的相比，眼肌面積明顯增大。 Robertson等用&iRH免疫公牛，發(fā)現(xiàn)免疫牛睪丸萎縮，性欲降低“去勢(shì)”效果持續(xù)了 6個(gè)
月，并且其脂肪減少了 32 %，第10肋骨處眼肌面積增加了 50 %，而同時(shí)料重比降低了 12%。理論上生產(chǎn)未去勢(shì)的公豬能帶來(lái)明顯的經(jīng)濟(jì)效益，但在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中仍有許多不利因素需要克服。未去勢(shì)公豬在性成熟后具有明顯的攻擊性，對(duì)圈養(yǎng)設(shè)施要求增高，需要分性別單獨(dú)飼養(yǎng)，對(duì)飼養(yǎng)員的危險(xiǎn)也明顯增高。性成熟公豬爬跨頻繁，豬群撕咬打斗增多， 不但提高了受傷的幾率還降低飼料報(bào)酬，給生產(chǎn)過(guò)程帶來(lái)極大的不便。生產(chǎn)未去勢(shì)公豬的另一個(gè)問(wèn)題是這種豬肉在烹飪過(guò)程中發(fā)出令人不愉悅的味道，俗稱“豬臊味”。有研究表明， 出售未經(jīng)去勢(shì)的公豬肉有5%-35%的酮體具有另消費(fèi)者不適的異味。公豬的異味在發(fā)情期首次出現(xiàn)，在公豬達(dá)到70kg體重或4個(gè)月年齡時(shí)逐漸升高，脂肪中異味物質(zhì)含量較高的大多是體重大于95kg或生長(zhǎng)期大于5個(gè)月的未去勢(shì)公豬，但在去勢(shì)后會(huì)逐步消失，其性行為也在去勢(shì)后逐步消失轉(zhuǎn)而變得溫順。我國(guó)生豬養(yǎng)殖過(guò)程多采用手術(shù)去勢(shì)的方法來(lái)處理豬肉中的異味，這種方法簡(jiǎn)便徹底但也帶來(lái)很多負(fù)面作用。豬的睪丸是高度管狀且充滿神經(jīng)的， 只能對(duì)未發(fā)育的幼年豬進(jìn)行手術(shù)去勢(shì)，對(duì)于性成熟的大豬則不適用。同時(shí)手術(shù)去勢(shì)不僅降低豬的生產(chǎn)率和豬肉品質(zhì)，還具有諸多風(fēng)險(xiǎn)傷口出血、感染，嚴(yán)重的疝氣，使動(dòng)物發(fā)育不良或死亡。近年來(lái)已經(jīng)有多種方法被用來(lái)試圖克服手術(shù)去勢(shì)所帶來(lái)的弊端，例如，體內(nèi)植入激素法、化學(xué)去勢(shì)法。激素處理需要反復(fù)多的注射，化學(xué)法去勢(shì)能絕育但影響豬的生長(zhǎng)性能。因此，需要一種既能抑制豬肉中的異味物質(zhì)又不影響豬的生長(zhǎng)性能的方法。本發(fā)明涉及的免疫去勢(shì)法能夠很好的兼顧這二者的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種公豬去異味重組噬菌體疫
田ο本發(fā)明的公豬去異味重組噬菌體疫苗，以重組噬T7菌體為抗原，所說(shuō)的重組T7噬菌體表面表達(dá)有氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示的&iRH蛋白，所說(shuō)的&iRH蛋白由三份拷貝的GnRH基因插入T7噬菌體PlOB基因下游表達(dá)獲得。所述的三份拷貝的&1RH基因選自以下序列的核苷酸
1)具有SEQID NO 1所示核苷酸序列；
2)具有SEQID NO :1所示序列經(jīng)增加或減少拷貝數(shù)的核苷酸序列；
3)具有SEQID NO :1所示序列經(jīng)改變、缺失或增加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸但仍表達(dá)具有 GnRH主要抗原活性多肽的核苷酸序列。所說(shuō)的疫苗中還包含用于乳化重組T7噬菌體的白油佐劑。本發(fā)明的公豬去異味重組噬菌體疫苗的構(gòu)建方法，包括下列步驟
A、構(gòu)建重組噬菌體
(1)合成一段DNA序列，該DNA序列克隆至pUC-19載體多克隆位點(diǎn)中，DNA序列的5， 端有酶切位點(diǎn)EcoR I，3，端含有酶切位點(diǎn)Hind III，其DNA序列如SEQ ID NO 3所示；
(2)用限制性內(nèi)切酶EcoRI、Hind III將上述DNA序列從pUC-19載體上切下后插入T7 噬菌體多克隆位點(diǎn)的EcoR I和Hind III之間，構(gòu)建重組噬菌體；
(3)用T7噬菌體包裝蛋白組裝重組噬菌體，包裝產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖夾心法擴(kuò)增，用PCR方法篩選陽(yáng)性重組噬菌體，重組噬菌體展示3拷貝的&iRH蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示；
B、重組噬菌體的制備
甘油凍存的E. coli BL21菌株在LB體培養(yǎng)基平面上劃線接種，37°C過(guò)夜培養(yǎng)； 從平皿上挑取單菌落，接種5mL LB培養(yǎng)液，37°C、200轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，取3mL過(guò)夜培養(yǎng)物接種300mL LB培養(yǎng)液，培養(yǎng)至0D_=0. 8左右，挑取平皿上的單個(gè)噬菌斑，接種到培養(yǎng)好的BL21宿主菌中，37°C、100轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)，直至菌液由渾濁變?yōu)槌吻?，?PEG沉淀的方法回收噬菌體，并按常規(guī)的方法測(cè)定噬菌體滴度，將回收的噬菌體調(diào)整濃度為 2 X 1013pfu/mL,并按照4%。的比例加入甲醛溶液，37°C、100轉(zhuǎn)/分震蕩滅活過(guò)夜；
C、制備重組噬菌體油乳劑疫苗
1)疫苗油相的制備4mL司本80，2mL司本85，94mL10號(hào)礦物油，2g硬脂酸鋁，充分混勻，121°C高壓20分鐘；疫苗水相的制備94mL滴度為2X 1013pfu/mL的滅活噬菌體，4mL高壓滅菌吐溫-80，3000轉(zhuǎn)/分鐘攪拌均勻；
2)按照水相油相比1:3的比例在高速乳化器上乳化至穩(wěn)定的油包水結(jié)構(gòu)，即為制備的重組噬菌體油乳劑疫苗；
所述的公豬去異味重組噬菌體疫苗的構(gòu)建方法中，重組T7噬菌體的載體為T7 Select 415-lb。本發(fā)明具有如下技術(shù)效果(1)本發(fā)明利用噬菌體具有的病毒樣顆粒的佐劑的特性，用T7噬菌體載體制備的重組噬菌體疫苗能夠克服&iRH肽激素自身免疫原性較弱的不足，有效的提高免疫原性，刺激機(jī)體產(chǎn)生更高水平的抗體，抑制公豬睪丸的發(fā)育，控制豬肉中異味物質(zhì)的生成。(2)由于T7噬菌體易于培養(yǎng)、便于純化，用于生產(chǎn)基因工程疫苗具有多種優(yōu)勢(shì)，本發(fā)明制備的重組噬菌體去異味疫苗便于大規(guī)模生產(chǎn)、成本低廉。(3))免疫學(xué)方法更為人道，從而替代傳統(tǒng)的去勢(shì)方法，滿足現(xiàn)代規(guī)?；曫B(yǎng)管理的需要。


圖1為重組T7噬菌體的基因鑒定。泳道1為DL2000 DNA Marker ；泳道2為T7噬菌體載體對(duì)照；泳道3為重組T7噬菌體。圖2為重組噬菌體去異味疫苗免疫后的公豬&iRH抗體水平圖。圖3為重組噬菌體去異味疫苗免疫后的公豬睪酮水平圖。圖4為重組噬菌體去異味疫苗免疫后的公豬雙睪大小圖。圖5-1為重組噬菌體去異味疫苗免疫后的公豬睪丸切片圖。圖5-2為未去勢(shì)的公豬睪丸切片圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例中，
編碼如SEQ ID NO 3所示基因，是GnRH主要抗原表位，為常規(guī)技術(shù)。限制性內(nèi)切酶EcoR I、Hind III購(gòu)自大連寶生物生物工程公司。T7噬菌體載體、T7包裝蛋白、E. coli BL21購(gòu)自Novagen公司。T7噬菌體的提取為常規(guī)技術(shù)。T7噬菌體滴度的測(cè)定為常規(guī)技術(shù)。實(shí)施例1 構(gòu)建重組噬菌體
由商業(yè)公司合成一段DNA序列，該DNA序列已克隆至pUC-19載體多克隆位點(diǎn)中，DNA序列的5，端有酶切位點(diǎn)EcoR I，3，端含有酶切位點(diǎn)Hind III，其DNA序列如SEQ ID NO 3所示
用限制性內(nèi)切酶EcoR I、Hind III將上述DNA序列從pUC-19載體上切下后插入T7噬菌體多克隆位點(diǎn)的EcoR I和Hind III之間，構(gòu)建重組噬菌體。重組pUC-19載體雙酶切體系
權(quán)利要求
1.公豬去異味重組噬菌體疫苗，其特征在于，以重組噬T7菌體為抗原，所說(shuō)的重組T7 噬菌體表面表達(dá)有氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示的&iRH蛋白，所說(shuō)的&iRH蛋白由三份拷貝的&iRH基因插入T7噬菌體PlOB基因下游表達(dá)獲得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的公豬去異味重組噬菌體疫苗，其特征在于，所述的三份拷貝的&iRH基因選自以下序列的核苷酸1)具有SEQID NO 1所示核苷酸序列；2)具有SEQID NO :1所示序列經(jīng)增加或減少拷貝數(shù)的核苷酸序列；3)具有SEQID NO :1所示序列經(jīng)改變、缺失或增加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸但仍表達(dá)具有 GnRH主要抗原活性多肽的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的公豬去異味重組噬菌體疫苗，其特征在于，所說(shuō)的疫苗中還包含用于乳化重組T7噬菌體的白油佐劑。
4.權(quán)利要求1-3中任意一種公豬去異味重組噬菌體疫苗的構(gòu)建方法，其特征在于，包括下列步驟A、構(gòu)建重組噬菌體(1)合成一段DNA序列，該DNA序列克隆至pUC-19載體多克隆位點(diǎn)中，DNA序列的5， 端有酶切位點(diǎn)EcoR I，3，端含有酶切位點(diǎn)Hind III，其DNA序列如SEQ ID NO 3所示；(2)用限制性內(nèi)切酶EcoRI、Hind III將上述DNA序列從pUC-19載體上切下后插入T7 噬菌體多克隆位點(diǎn)的EcoR I和Hind III之間，構(gòu)建重組噬菌體；(3)用T7噬菌體包裝蛋白組裝重組噬菌體，包裝產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖夾心法擴(kuò)增，用PCR方法篩選陽(yáng)性重組噬菌體，重組噬菌體展示3拷貝的&iRH蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示；B、重組噬菌體的制備甘油凍存的E. coli BL21菌株在LB體培養(yǎng)基平面上劃線接種，37°C過(guò)夜培養(yǎng)； 從平皿上挑取單菌落，接種5mL LB培養(yǎng)液，37°C、200轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，取3mL過(guò)夜培養(yǎng)物接種300mL LB培養(yǎng)液，培養(yǎng)至0D_=0. 8左右，挑取平皿上的單個(gè)噬菌斑，接種到培養(yǎng)好的BL21宿主菌中，37°C、100轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)2_3小時(shí)，直至菌液由渾濁變?yōu)槌吻?，?PEG沉淀的方法回收噬菌體，并按常規(guī)的方法測(cè)定噬菌體滴度，將回收的噬菌體調(diào)整濃度為 2 X 1013pfu/mL,并按照4%。的比例加入甲醛溶液，37°C、100轉(zhuǎn)/分震蕩滅活過(guò)夜；C、制備重組噬菌體油乳劑疫苗。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的公豬去異味重組噬菌體疫苗，其特征在于，所述的重組T7噬菌體的載體為T7 Select 415-lb。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種公豬去異味重組噬菌體疫苗，所說(shuō)的疫苗以重組噬T7菌體為抗原，所說(shuō)的重組T7噬菌體表面表達(dá)有氨基酸序列如SEQ ID NO2所示的GnRH蛋白，所說(shuō)的GnRH蛋白由三份拷貝的GnRH基因插入T7噬菌體P10B基因下游表達(dá)獲得。本發(fā)明具有如下技術(shù)效果(1)用T7噬菌體載體制備的重組噬菌體疫苗能夠克服GnRH肽激素自身免疫原性較弱的不足，有效的提高免疫原性，刺激機(jī)體產(chǎn)生更高水平的抗體，抑制公豬睪丸的發(fā)育。(2)由于T7噬菌體易于培養(yǎng)、便于純化，用于生產(chǎn)基因工程疫苗具有多種優(yōu)勢(shì)，本發(fā)明制備的重組噬菌體去異味疫苗便于大規(guī)模生產(chǎn)、成本低廉。(3)免疫學(xué)方法更為人道，從而替代傳統(tǒng)的去勢(shì)方法，滿足現(xiàn)代規(guī)?；曫B(yǎng)管理的需要。
文檔編號(hào)A61K39/12GK102335422SQ20111030596
公開日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2011年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月11日
發(fā)明者侯繼波, 徐海, 王義偉 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院