專(zhuān)利名稱(chēng)：抗新i型鴨肝炎病毒3d蛋白單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及抗體工程技術(shù)，具體為涉及抗新I型鴨肝炎病毒 3D蛋白單克隆抗體。
背景技術(shù)：
I型鴨病毒性肝炎是由I型鴨病毒性肝炎病毒(duck hepatitisvirus serotype I，DHV-I)引起雛鴨的一種急性高度致死性傳染病。I型鴨肝炎病毒(DHV-IC)屬小RNA病毒科(Picornaviridae)，其病毒核衣殼為對(duì)稱(chēng)的二十面體，無(wú)囊膜，無(wú)血凝性，直徑大小為 20-40nm。1994年Kim等在韓國(guó)發(fā)現(xiàn)一種新I型鴨肝炎病毒，命名為DHV-1C，并報(bào)道了此新 I型鴨肝炎病毒基因序列，分析結(jié)果表明DHV-I與DHV-IC屬于同一個(gè)病毒屬的不同血清型， 同源性為68. 5% -73. 2%。由5'非編碼區(qū)(5' UTR)、一個(gè)大的開(kāi)放閱讀框(Open Reading Frame, 0RF)、3'非編碼區(qū)(3' UTR)和Poly(A)尾巴組成，ORF編碼2249個(gè)氨基酸多聚蛋白。該蛋白在病毒包裝過(guò)程中，裂解為結(jié)構(gòu)蛋白VP0、VP1、VP3和非結(jié)構(gòu)蛋白2A、2B、2C、3A、 ;3B、3C和3D。全長(zhǎng)為7792bp，3D基因位于基因組的6050bp_7408bp，全長(zhǎng)l!358bp，編碼453個(gè)氨基酸(Kim M C,Kwon Y K, Joll S J. Recent Korean isolates of duck hepatitis virus reveal the presence of anew gene—and serotype when compared to duck hepatitis virus type 1 typestratus. Arch Virol,2007,152(11) :2059-2072.)。3D 蛋白是病毒 RNA 依賴(lài)的RNA聚合酶，又稱(chēng)病毒相關(guān)抗原，是非結(jié)構(gòu)蛋白，催化病毒RNA的合成。本研究以純化的新I型鴨肝炎病毒3D蛋白為抗原進(jìn)行抗新I型鴨肝炎病毒3D蛋白單抗的制備，期望篩選到能與新I型鴨肝炎病毒反應(yīng)的單抗。以新I型鴨肝炎病毒3D重組蛋白制備特異性單克隆抗體可為新I型鴨肝炎病毒的研究提供必要的試劑和技術(shù)手段， 對(duì)探討3D蛋白在新I型鴨肝炎病毒形成及其致病方面具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供抗DHV-IC 3D蛋白單克隆抗體。本發(fā)明的單抗隆抗體是用純化的DHV-IC 3D重組蛋白為抗原，通過(guò)雜交瘤細(xì)胞方法獲得的，能夠特異識(shí)別DHV-IC感染細(xì)胞病毒3D蛋白的單克隆抗體。DHV-IC 3D重組蛋白是將DHV-IC 3D基因克隆與原核表達(dá)載體pET-30a，在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，純化的3D重組蛋白。該單克隆抗體的具體制備方法如下1、根據(jù)DHV-IC 3D基因cDNA序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到全長(zhǎng)3D基因， 將DHV-IC N株3D基因克隆于原核表達(dá)載體pET-30a，在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá) 3D蛋白；進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)及Westernblot分析鑒定后，裂解表達(dá)菌體，分離包涵體，用pH 8. O的尿素裂解沉淀，離心后取上清經(jīng)鎳親和層析過(guò)柱純化(購(gòu)自Qiagen公司，Valencia， CA公司)，將純化后蛋白用6mol/L尿素進(jìn)行梯度透析復(fù)性獲得3D重組蛋白。2、用DHV-IC 3D重組蛋白免疫BALB/c小鼠，取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合，以HAT培養(yǎng)基(購(gòu)自^witrogen公司)選擇性培養(yǎng)后，經(jīng)3D重組蛋白和His 蛋白進(jìn)行雙重ELISA篩選和有限稀釋法克隆化，獲得分泌抗3D蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2D9 ；將雜交瘤細(xì)胞注BALB/c小鼠誘生腹水，對(duì)獲得抗3D蛋白單克隆抗體特性進(jìn)行鑒定。3、以ELISA測(cè)定抗3D蛋白單克隆抗體的腹水效價(jià)，間接免疫熒光鑒定抗3D蛋白單克隆抗體與DHV-IC病毒蛋白的反應(yīng)性和特異性，用單克隆抗體亞型測(cè)定試劑盒(Zymed Laboratories, Inc.)鑒定抗3D蛋白單克隆抗體的Ig亞類(lèi)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是⑴本發(fā)明提供的DHV-IC 3D重組蛋白制備方法簡(jiǎn)單，純度高； (2)本發(fā)明提供抗DHV-IC 3D蛋白的單克隆抗體特異性強(qiáng)，制備方法簡(jiǎn)單；(3)抗DHV-IC 3D蛋白單克隆抗體可用于3D蛋白結(jié)構(gòu)和功能研究。具體地，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供分泌抗新I型鴨肝炎病毒3D蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，其保藏號(hào)為CGMCC No. 4580。另一方面，本發(fā)明提供針對(duì)新I型鴨肝炎病毒3D蛋白的單克隆抗體，其由保藏號(hào)為CGMCC No. 4580的雜交瘤細(xì)胞系分泌。再一方面，本發(fā)明提供用于治療新I型鴨肝炎病毒病的藥物組合物，其包含上述定義的單克隆抗體。在另一個(gè)發(fā)明，本發(fā)明提供用于治療新I型鴨肝炎病毒病的試劑盒，其包含上述定義的單克隆抗體。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供上述定義的單克隆抗體在制備用于治療新I型鴨肝炎病毒病的藥物中的應(yīng)用。在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及所述單克隆抗體在制備檢測(cè)新I型鴨肝炎病毒的藥物中的應(yīng)用。雜交瘤細(xì)胞株2D9，于2011年2月23日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，100101)，保藏號(hào)為CGMCC No. 4580。


圖1為DHV-IC 3D基因PCR產(chǎn)物(A)禾Π pET 30a_3D酶切鑒定圖(B)，其中A中的泳道1 :3D基因的PCR產(chǎn)物；泳道M =DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；B中的泳道1 :pET30a_3D的BamHl 和Hind III雙酶切產(chǎn)物；泳道M :2kb DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。圖 2 為 DHV-IC 3D 表達(dá)蛋白的 SDS-PAGE(A)和 1Western blotting(B)鑒定圖，其中泳道M是蛋白質(zhì)Marker,泳道2-5分別是BL21 (DE3) /pET30a_3D在1、2、3和4小時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)的菌體，泳道1是BL21(DE;3)/pET-30a載體誘導(dǎo)表達(dá)菌體；圖(B)泳道2和1分別是 BL21 (DE3) /pET30a-3D和BL21 (DE3) /pET_30a誘導(dǎo)表達(dá)菌體在鴨抗DHV-ICN株陽(yáng)性血清下的 Western blotting 結(jié)果。圖3為3D蛋白單克隆抗體209的Wfestern blotting鑒定圖，圖中泳道1是3D蛋白，泳道2是大腸桿菌菌體蛋白，泳道M是蛋白質(zhì)Marker。圖4為抗3D蛋白單克隆抗體2D9的IFA鑒定圖，圖中A和B分別是單克隆抗體 2D9與N株感染的鴨胚成纖維細(xì)胞及正常鴨胚成纖維細(xì)胞的反應(yīng)結(jié)果，其中A圖表示單克隆抗體2D9可以檢測(cè)出N株病毒感染的鴨胚成纖維細(xì)胞的3D蛋白，顯示綠色熒光；B圖表示未感染病毒的鴨胚成纖維細(xì)胞沒(méi)有熒光。
具體實(shí)施例方式下文將參考實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，所述實(shí)施例僅是意圖舉例說(shuō)明本發(fā)明，而不是意圖限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍由后附的權(quán)利要求具體限定。實(shí)施例1. DHV-IC 3D重組蛋白的制備根據(jù)DHV-IC序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增DHV-IC 3D基因，將其克隆于原核表達(dá)載體 PET-30a,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)DHV-1C3D蛋白；收集表達(dá)菌體，凍融3 次后，離心分離包涵體，用PH 8.0的尿素裂解沉淀，經(jīng)鎳親和層析純化，獲得DHV-IC 3D重組蛋白，最后該蛋白經(jīng)6M尿素進(jìn)行梯度透析復(fù)性。1). 3D重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)DHV-IC 3D核苷酸序列(SEQ ID NO 1)設(shè)計(jì)合成特異性引物，上游引物3DF 5’ TCGGGATCCGCTATTGTTGAGAAAAAGTATTCAG3’ (SEQ ID NO 2 下劃線(xiàn)為 BamHl 位點(diǎn))，下游引物 3DR 5 CAGAAGCTTTTATATAATCATGCAGGCAGTATATG 3，(SEQ ID NO :3，下劃線(xiàn)為 Hind III 位點(diǎn))。以PCR從DHV-ICN株(哈爾濱獸醫(yī)研究所)按常規(guī)方法反轉(zhuǎn)錄的cDNA中擴(kuò)增3D基因(PCR 反應(yīng)條件為:94°C 5min ；94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 3min，32 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin, 4°C保存)。擴(kuò)增片段大小為1359bp (見(jiàn)圖1A)。pET30a(購(gòu)自Novagen公司)經(jīng)BamHl/ Hind III雙酶切消化后，將擴(kuò)增的3D基因連接到原核表達(dá)載體pET-30a的BamHl/Hind III 位點(diǎn)間，轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO，提取轉(zhuǎn)化細(xì)菌的質(zhì)粒，以上述PCR反應(yīng)和BamHl/Hind III酶切鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒(PCR反應(yīng)結(jié)果參見(jiàn)圖1A，酶切結(jié)果參見(jiàn)圖1B)，經(jīng)序列測(cè)定驗(yàn)證，獲得 3D重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-3D。陽(yáng)性重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a_3D轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)(購(gòu)自 Invitrogen 公司)，SDS-PAGE 和 Western blotting 表明(圖 2)，表達(dá)的 65. 8kDa 重組 3D 蛋白(泳道幻可被DHV-IC病毒陽(yáng)性血清所識(shí)別，空載體pET30a誘導(dǎo)蛋白(泳道1)不能被DHV-IC病毒陽(yáng)性血清所識(shí)別。其中DHV-IC病毒陽(yáng)性血清是利用由哈爾濱獸醫(yī)研究所的 DHV-IC病毒N株免疫番鴨制備，即將純化的100 μ gDHV-lC N株與弗氏佐劑等比例混合，充分乳化，制備免疫抗原，免疫4周齡鴨。免疫3次，每次IOOyg/每只(0.2mL)；第一次以弗氏完全佐劑免疫抗原，肌肉注射；間隔14天，用弗氏不完全佐劑免疫抗原進(jìn)行第二次免疫； 間隔14天，用不加佐劑的免疫抗原進(jìn)行三免，肌肉注射；免疫10天后，采血，分離DHV-IC病毒陽(yáng)性血清。2). DHV-IC 3D重組蛋白的表達(dá)與純化以氯化鈣法將重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a_3D轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，取陽(yáng)性克隆用 LB液體培養(yǎng)基(含50 μ g/mL Kan)，37°C 250r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日按1 100的比例接種于含IOmL新鮮LB培養(yǎng)基IOOmL錐形瓶中，37 °C 300r/min振蕩培養(yǎng)，當(dāng)OD6tltl = 0.6 時(shí)，加入終濃度為ImM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)池，40C 12000r/min離心30sec，收集菌體，凍融三次， 40C 12000r/min離心lOmin，SDS-PAGE分析裂解菌體的上清和沉淀，分析3D蛋白的表達(dá)情況。加入5倍體積8M尿素溶解沉淀，振蕩至溶液澄清，4°C 12000r/min離心lOmin，棄沉淀， 上清轉(zhuǎn)移至鎳離子親和層析柱中(購(gòu)自Qiagen公司，Valencia，CA)，振蕩lh，由pET_30a 表達(dá)的帶有His標(biāo)簽的VP3表達(dá)蛋白與鎳離子螯合，先后用2倍體積柱床體積pH = 8. 0的 8M尿素溶液，3倍柱床體積pH = 6. 3的8M尿素，3倍柱床體積pH = 5. 9的8M尿素和5倍柱床體積pH = 4. 5的8M尿素洗脫柱床，收集洗脫液Iml/管；用SDS-PAGE分析洗脫液，經(jīng) 6mol/L尿素進(jìn)行梯度透析復(fù)性，獲得高純度的3D重組蛋白。實(shí)施例2.抗3D蛋白單克隆抗體的制備用等量弗氏佐劑(Sigma公司)乳化純化的IOOug 3D重組蛋白，免疫6周齡雌性 BALB/c小鼠，15天后用不完全弗氏佐劑(Sigma公司)乳化等體積蛋白進(jìn)行二次免疫，二次免疫后十天斷尾采血用ELISA方法檢測(cè)小鼠血清效價(jià)，此時(shí)小鼠血清效價(jià)已經(jīng)明顯上升， 經(jīng)第三次免疫后檢測(cè)小鼠血清效價(jià)，陽(yáng)性值達(dá)1. 0以上，P/N大于10時(shí)取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0在聚乙二醇anvitrogen公司)作用下進(jìn)行細(xì)胞融合，用HAT培養(yǎng)基(購(gòu)自 Invitrogen公司)進(jìn)行選擇性培養(yǎng)；以純化的3D重組蛋白和His蛋白(購(gòu)自KPL)為檢測(cè)抗原，用雙重ELISA方法對(duì)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行篩選，陽(yáng)性雜交瘤經(jīng)連續(xù)5次有限稀釋法克隆化，獲得穩(wěn)定分泌抗3D蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2D9，將其于2011年2月23 日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院 3號(hào)，100101)，保藏號(hào)為CGMCC No4580 ；將雜交瘤細(xì)胞注入致敏小鼠腹腔誘生腹水，獲得抗 N株3D蛋白單克隆抗體2D9。具體如下。1).小鼠免疫分別將純化的DHV-IC 3D重組蛋白與弗氏佐劑等比例混合，充分乳化，制備3D免疫抗原，免疫6周齡BALB/c小鼠8只(購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。免疫3次， 每次IOOyg/每只(0. 2mL)；第一次以弗氏完全佐劑免疫抗原，背部皮下多點(diǎn)注射；間隔20 天，用弗氏不完全佐劑免疫抗原進(jìn)行第二次免疫，腹腔注射；間隔20天，用不加佐劑的3D免疫抗原進(jìn)行三免，肌肉注射；免疫15天后，尾靜脈采血，以3D重組蛋白為檢測(cè)抗原，用間接 ELISA方法測(cè)定免疫小鼠血清的抗體水平，免疫小鼠抗體滴度達(dá)到1 4000以上，表明小鼠獲得良好免疫效果。2).雜交瘤細(xì)胞株的建立i)細(xì)胞融合細(xì)胞融合前3天，以不加佐劑的3D重組蛋白尾靜脈注射小鼠，每只 100 μ g(0. ImL)，無(wú)菌取脾臟，分離脾細(xì)胞，計(jì)數(shù)后按5 1的比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞 (2 X IO7)混合，在PEG4000作用下進(jìn)行細(xì)胞融合(《實(shí)用免疫學(xué)》，楊廷彬主編，長(zhǎng)春出版社， 1994年12月出版)；用HAT選擇培養(yǎng)基(購(gòu)自^witrogen公司)重懸，置5% CO2 37°C進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，5天后半量換液，10天后改為HAT培養(yǎng)基(購(gòu)自hvitrogen公司)。待細(xì)胞克隆長(zhǎng)至1/4-1/2培養(yǎng)孔時(shí)，取細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測(cè)分泌抗體。ii).雜交瘤細(xì)胞篩選分別用純化的3D重組蛋白和His蛋白(購(gòu)自KPL公司)作為檢測(cè)抗原，對(duì)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中的分泌抗體進(jìn)行雙重ELISA檢測(cè)，篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。用0. 05M碳酸鹽包被緩沖液(PH9.6)稀釋純化的VP3重組蛋白或His蛋白，按IOOyL 0. 045 μ g/孔加入酶標(biāo)板中，37°C包被Ih后轉(zhuǎn)入4°C過(guò)夜；用含0. 05%吐溫20的PBS緩沖液(PBST)洗滌3次， 加5%脫脂奶粉37°C封閉lh，每孔加入雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清100μ L，37°C孵育池；PBST洗 3次，加入1 5000倍稀釋的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體(購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，37°C孵育lh，PBST洗4次，加入顯色底物OPD-H2O2 (購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，避光反應(yīng)IOmin后，用2M 終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀讀取OD49tl值，以與陰性O(shè)D49tl值的比值大于2. 1判為陽(yáng)性。3D重組蛋白陽(yáng)性而His蛋白陰性檢測(cè)的雜交瘤細(xì)胞孔為陽(yáng)性克隆。iii).有限稀釋法克隆化獲得雜交瘤細(xì)胞系和保藏用HT培養(yǎng)基將雜交瘤細(xì)胞稀釋至20個(gè)/ml，每孔0. Iml接入96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞含量分別為2個(gè)/孔和1個(gè)/孔，置5% (X)2 37°C培養(yǎng)，5-7天觀(guān)察細(xì)胞克隆生長(zhǎng)情況，選取單克隆生長(zhǎng)孔細(xì)胞上清，以ELISA檢測(cè)分泌抗體；對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行連續(xù)5次克隆，獲得穩(wěn)定分泌抗VP3蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2D9，使其抗體分泌陽(yáng)性率達(dá)95%以上。雜交瘤細(xì)胞株2D9擴(kuò)大培養(yǎng)，500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，將細(xì)胞沉淀用37°C提前預(yù)熱的DMEM凍存液(含7份DMEM+2份血清+1份二甲亞砜)重懸，每管2ml分裝，-70°C 凍存細(xì)胞。該雜交瘤細(xì)胞株于2011年2月23日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC，中國(guó)，北京)，保藏號(hào)為CGMCC-4580。3).抗3D蛋白單克隆抗體2D9的制備。成年雌性BALB/c小鼠經(jīng)0. ^iil/只降植烷腹腔注射，致敏1周后，腹腔注射雜交瘤細(xì)胞2D9懸液5 X IO6-I X IO7, 7-10天后采集腹水，12000g離心5min，收集上清。上清加入等量 PH7. 2 巴比妥緩沖鹽水(VBS ；0. 004mol/L 巴比妥，0. 15mol/L NaCl, 0. 8mmol/L Mg2+， 0. 3mmol/L Ca2+)稀釋?zhuān)幻縄Oml稀釋腹水中加150mg 二氧化硅(Sigma公司)，混勻，懸液在室溫孵育30分鐘，搖動(dòng)；2000g離心20分鐘，即得到澄清的單克隆抗體2D9腹水，_70°C凍存。4).抗3D蛋白單克隆抗體2D9的腹水效價(jià)的測(cè)定。首先抗3D蛋白單克隆抗體2D9腹水用PBS緩沖液1000倍稀釋?zhuān)缓蟊侗认♂專(zhuān)?D 重組蛋白O μ g/ml) 100 μ L/孔包被的酶標(biāo)板(購(gòu)自Corning公司)，37°C孵育池；加入倍比稀釋(1 2000)的抗3D蛋白單克隆抗體2D9腹水100μ 1，37°C孵育lh，PBST洗滌3次后加入1 5000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體，37°C孵育lh，PSBT洗滌后，加入顯色底物OPD-H2O2 (購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，避光反應(yīng)lOmin，用2M H2SO4終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀讀取OD49tl值，以與陰性O(shè)D49tl值比值大于2. 1判為陽(yáng)性，以陽(yáng)性孔的最大稀釋度為抗3D蛋白單克隆抗體2D9腹水效價(jià)。結(jié)果測(cè)得單克隆抗體2D9腹水的ELISA效價(jià)分別為6. 4Χ10Λ實(shí)施例3.抗3D蛋白單克隆抗體2D9的特性鑒定以純化3D重組蛋白為檢測(cè)抗原用間接ELISA方法測(cè)定抗3D蛋白單克隆抗體2D9 的腹水效價(jià)；以間接免疫熒光鑒定抗3D蛋白單克隆抗體2D9與DHV-IC病毒蛋白的反應(yīng)性和特異性；用Zymed Laboratories，Inc公司亞型測(cè)定試劑盒鑒定抗3D蛋白單克隆抗體2D9 重鏈和輕鏈的Ig亞型。i).抗3D蛋白單克隆抗體2D9與DHV-IC的反應(yīng)性和特異性鑒定以間接免疫熒光測(cè)定抗3D蛋白單克隆抗體與DHV-IC病毒蛋白的反應(yīng)性和特異性。雞胚成纖維細(xì)胞DFl經(jīng)DHV-IC病毒(哈爾濱獸醫(yī)研究所)感染Mh，PBS洗兩次；100 μ 1/孔加入甲醇固定，Ih后棄固定液，分別加入單克隆抗體2D9的細(xì)胞培養(yǎng)上清， 100μ 1/孔，37°C孵育Ih ;PSB洗滌3次，加入1 100稀釋的FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體(購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，37°C孵育30min ；PBS洗滌后，加入PBS 100 μ 1，熒光顯微鏡觀(guān)察并照相。結(jié)果單克隆抗體2D9株均特異識(shí)別DHV-ICC病毒3D蛋白(圖4Α)，而陰性對(duì)照則沒(méi)有熒光(圖4B)。ii).抗3D蛋白單克隆抗體的Ig亞型測(cè)定。利用Zymed Laboratories, Inc.公司亞型測(cè)定試劑盒測(cè)定抗3D蛋白單克隆抗體 Ig亞型。結(jié)果顯示，單克隆抗體2D9的重鏈為IgGl，輕鏈均為κ。
權(quán)利要求
1.分泌抗新I型鴨肝炎病毒3D蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，其保藏號(hào)為CGMCC No.4580。
2.針對(duì)新I型鴨肝炎病毒3D蛋白的單克隆抗體，其由保藏號(hào)為CGMCCNo.4580的雜交瘤細(xì)胞系分泌。
3.用于治療新I型鴨肝炎病毒病的藥物組合物，其包含權(quán)利要求2所述的單克隆抗體。
4.用于治療新I型鴨肝炎病毒病的試劑盒，其包含權(quán)利要求2所述的單克隆抗體。
5.權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在制備用于治療新I型鴨肝炎病毒病的藥物中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在制備檢測(cè)新I型鴨肝炎病毒的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明是一種新I型鴨肝炎病毒3D蛋白單克隆抗體，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及基因工程和免疫學(xué)技術(shù)。將新I型鴨肝炎病毒3D蛋白抗原純化。用純化抗原免疫BALB/c小鼠，經(jīng)融合、間接ELISA篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞和有限稀釋法克隆化后，獲得分泌抗鴨肝炎IC型病毒3D蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2D9，保藏號(hào)為CGMCC-4580；其ELISA效價(jià)為1×10-6以上，能特異識(shí)別新I型鴨肝炎病毒感染細(xì)胞的病毒3D蛋白，其Ig亞型重鏈為IgG1，輕鏈為κ。本發(fā)明為新I型鴨肝炎病毒的檢測(cè)、新I型鴨肝炎病毒3D蛋白結(jié)構(gòu)和功能研究以及病毒的致病機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A61K39/42GK102242083SQ201110112160
公開(kāi)日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2011年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月26日
發(fā)明者馮新暢, 劉明, 孟凡依, 張?jiān)?申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所