專利名稱：具有抗心肌細胞凋亡功能的蛋白、其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種具有抗心肌細胞凋亡功能的蛋白及編碼該蛋白的多核苷酸。本發(fā)明還涉及采用高表達效率的表達系統(tǒng)表達該蛋白的制備方法以及該蛋白在制備心臟疾病藥物中的用途。
背景技術(shù)：
細胞凋亡(apoptosis)，又稱程序性細胞死亡(programmedcell death，PCD)。作為細胞生命的基本特征之一，細胞凋亡是一個主動的、高度有序的、由遺傳基因控制及一系列酶參與的細胞主動死亡過程，是細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束生命的過程。細胞凋亡對于多細胞有機體調(diào)控機體發(fā)育、維護內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、維持細胞群體及惡性病變過程中均起重要作用，在保證多細胞生物的健康生存過程中扮演著關(guān)鍵的角色。細胞凋亡是維持體內(nèi)細胞數(shù)量動態(tài)平衡的基本措施，許多疾病的發(fā)生與細胞凋亡失控有著密切的聯(lián)系。如神經(jīng)退行性疾病及缺血性心肌損傷就與細胞的過度凋亡有關(guān)。心臟是由有絲分裂后的處于終末分化狀態(tài)的心肌細胞組成的，即心肌細胞不再進行分裂和增殖。這就意味著心肌細胞的損傷和死亡及由此造成的心肌細胞數(shù)目減少在進化上并不能夠通過有效的心肌細胞分裂和增殖來彌補。心肌細胞的凋亡在成年人類心臟是一種正常的生理現(xiàn)象，有很多因素可引起心肌細胞發(fā)生凋亡，包括氧化應(yīng)激反應(yīng)、缺血缺氧、血管緊張素IKFasligand、機械張力、腫瘤壞死因子-α、β-腎上腺素拮抗劑、抗腫瘤藥蒽環(huán)霉素等等。凋亡的心肌細胞參與心血管系統(tǒng)的許多生理和病理變化過程，是導(dǎo)致多種心血管疾病發(fā)生和演變的重要細胞學基礎(chǔ)。越來越多的證據(jù)表明，心肌細胞凋亡與許多心臟疾病，如心肌梗塞、心力衰竭、原發(fā)性心肌病、 心肌肥厚以及抗腫瘤藥物蒽環(huán)霉素誘導(dǎo)所致的心肌毒性等有密切的關(guān)系。不同的因素可能通過不同的機制啟動誘導(dǎo)心肌細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活凋亡的執(zhí)行器從而造成細胞凋亡。心肌細胞是失去了分裂能力的終末分化細胞，其細胞周期的調(diào)節(jié)、促凋亡因子和抗凋亡因子的分布及凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程與有分裂能力的細胞不同。目前已發(fā)現(xiàn)，心肌細胞至少存在有兩條凋亡途徑一條由Bad —細胞色素-C — caspase-9 — caspase-3 — PARP構(gòu)成； 另一條由caspase-6禾口 Lamin A構(gòu)成。目前，心血管疾病是人類健康和生命的主要威脅，是人類健康的頭號殺手，全世界范圍內(nèi)每年有一千七百萬人死于心血管疾病，其死亡率已接近所有癌癥死亡率的總和。在我國，隨著人民生活水平日益提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，心血管疾病死亡率呈明顯上升趨勢， 已超過癌癥成為第一大致死原因。根據(jù)國家衛(wèi)生部2004年底公布的最新統(tǒng)計結(jié)果表明，我國18歲及以上居民高血壓患病率為18.8%，估計全國患病人數(shù)1.6億多，由此造成的心肌肥厚、心肌梗死、冠心病、以及心力衰竭等凋亡相關(guān)心臟疾病的病人達幾千萬。因此，本領(lǐng)域迫切需要了解與抗心肌細胞凋亡相關(guān)的蛋白，并利用其作用特性，將其改造成一個藥物分子，或?qū)⑵渥鳛橐粋€藥物的“靶分子”應(yīng)用到臨床治療中，這必將帶來巨大的經(jīng)濟效益和良好的社會效益。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種新型的具有抗心肌細胞凋亡功能的蛋白。本發(fā)明的另一個目的是提供編碼上述蛋白的多核苷酸。本發(fā)明的另一個目的是提供所述蛋白的制備方法及其用途。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。一方面，本發(fā)明提供了一種具有抗心肌細胞凋亡功能的蛋白，所述蛋白為包含 SEQ. ID. NO 1所示氨基酸序列的多肽、其生物活性功能片段、變體或衍生物。優(yōu)選地，所述蛋白為SEQ. ID. NO 1所示氨基酸序列的多肽。另一方面，本發(fā)明提供了編碼上述蛋白的多核苷酸以及與該多核苷酸互補的多核苷酸。在編碼上述蛋白的多核苷酸中，該多核苷酸優(yōu)選包含SEQ. ID. NO 2所示的多核苷酸序列；進一步優(yōu)選地，該多核苷酸為SEQ. ID. NO 2所示的多核苷酸序列。此外，本發(fā)明還提供包含上述多核苷酸的重組載體；優(yōu)選地，所述重組載體為本發(fā)明所提供的 pPIC9K-Cardiac Salvation。并且，本發(fā)明還提供包含上述的重組載體的宿主細胞；優(yōu)選地，所述宿主細胞為畢赤酵母；進一步優(yōu)選地，所述畢赤酵母為巴斯德畢赤酵母GS115。再一方面，本發(fā)明提供一種上述具有抗心肌細胞凋亡功能蛋白的制備方法，所述制備方法包括在表達可檢測量的所述蛋白的條件下轉(zhuǎn)錄和翻譯本發(fā)明所提供的上述多核苷酸。優(yōu)選地，該制備方法包括1)構(gòu)建所述具有抗心肌細胞凋亡功能的蛋白的多核苷酸序列；2)構(gòu)建包含步驟1)所構(gòu)建的多核苷酸序列的表達載體；3)將步驟2)構(gòu)建的表達載體用于轉(zhuǎn)化宿主細胞，并使所述多核苷酸序列在宿主細胞中表達；4)純化步驟3)中得到的蛋白。其中，步驟2)的表達載體優(yōu)選為pPIC9K-CardiaC Salvation ；并且優(yōu)選地，所述宿主細胞為畢赤酵母；進一步優(yōu)選地，所述畢赤酵母為巴斯德畢赤酵母GS115。又一方面，本發(fā)明提供上述蛋白在制備用于治療心肌細胞壞死引起的心臟疾病藥物中的用途；優(yōu)選地，所述心臟疾病包括心肌病、心肌梗死和心力衰竭。本發(fā)明的詳細描述如下本發(fā)明提供了編碼一種新的具有抗心肌細胞凋亡功能的蛋白Cardiac&ilvation 的多核苷酸序列，全長為375bp (含起始密碼子和終止密碼子)，該多核苷酸的具體序列見 SEQ ID NO :2。所述多核苷酸編碼了一個由123個氨基酸組成的蛋白(SEQ ID N0:1)，該蛋白容易穿過細胞膜，進入靶器官的細胞內(nèi)發(fā)揮生物學作用。根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方式
，本發(fā)明構(gòu)建了 Cardiac Salvation的真核表達載體，并且對核苷酸序列進行了一些改造，以提高在真核系統(tǒng)中的表達量以及表達產(chǎn)物的活性。本發(fā)明中采用高表達效率的畢赤酵母真核表達系統(tǒng)表達該蛋白，作用于經(jīng)hsL處理的原代大鼠心肌細胞和結(jié)扎心臟冠狀動脈后前降支的心肌梗死大鼠模型，檢測了該種新蛋白在細胞模型中和動物模型中的抗心肌細胞凋亡的效果。根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方式
，本發(fā)明可通過如下的技術(shù)方案得以實現(xiàn)1、真核表達載體 pPIC9K-Cardiac &ilvation 的構(gòu)建將編碼Cardiac Salvation的多核苷酸序列克隆入pPIC9K，同時在蛋白的N 端連上六聚組氨酸標簽(His Tag)以及腸激酶酶切位點，得到如圖1所示的重組質(zhì)粒 pPIC9K-Cardiac Mlvation。將重組載體轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌DH5 α進行擴增，酶切線性化之后，使用電轉(zhuǎn)化的方法將線性化的pPIC9K-Cardiac&ilvati0n轉(zhuǎn)入巴斯德畢赤酵母GS115， 使用組氨酸缺陷平板RDB篩選出成功參入外源基因的酵母，然后使用G418平板復(fù)篩，選出多拷貝重組子，并進行PCR驗證。挑取陽性克隆擴增后使用甲醇誘導(dǎo)表達，取上清濃縮，以抗組氨酸標簽的抗體進行Western Blot，驗證重組蛋白的表達。將驗證得到的三株菌株進行搖瓶表達。選用載量較大的M-IDA作為填料，進行鎳離子螯合親和層析，利用組氨酸蛋白標簽與金屬離子的相互作用，分離重組蛋白。發(fā)酵液經(jīng)過離心、超濾，在蛋白純化系統(tǒng)上經(jīng)鎳離子螯合親和層析分離純化，收集重組蛋白，用 Western Blot驗證蛋白表達。將收集到的重組蛋白經(jīng)過脫鹽柱脫鹽，使用重組腸激酶進行酶切消化去除Cardiac&ilvation的His標簽，后經(jīng)鎳離子螯合親和層析去除重組腸激酶， 流出液中即為目的蛋白，使用真空冷凍干燥儀去除蛋白收集液中的水分，最終獲得重組蛋白凍干粉末。本發(fā)明提供的制備方法采用目前表達效率最高的畢赤酵母真核表達系統(tǒng)，有利于 Cardiac &ilvation蛋白的規(guī)模化生產(chǎn)。根據(jù)本發(fā)明的另一個具體實施方式
，對本發(fā)明的Cardiac Salvation蛋白進行了下述生物活性測定1、Cardiac Salvation蛋白在細胞模型中的抗心肌細胞凋亡功能將!^asL和Cardiac Salvation蛋白共同處理原代培養(yǎng)大鼠心肌細胞，結(jié)果如圖2 所示，表明Cardiac Salvation蛋白可以阻斷!^asL造成的TUNEL陽性細胞增多；同時Cell Death ELISA實驗也證實Cardiac Salvation蛋白能阻斷!^asL所致的核小體DNA斷裂(圖 2B)。2、Cardiac Salvation蛋白在動物模型中的抗心肌細胞凋亡功能將Cardiac Salvation蛋白經(jīng)靜脈注射入大鼠，立即結(jié)扎心臟冠狀動脈后前降支， 造成心肌梗死模型。三天后取出心臟進行凋亡檢測，發(fā)現(xiàn)注射Cardiac&ilvation蛋白大鼠的心臟的TUNEL陽性細胞數(shù)目明顯少于不注射的對照組(圖3)。以上所示的實驗結(jié)果表明，Cardiac Salvation蛋白在細胞模型中和動物模型中均具有明顯的抗心肌細胞凋亡效果。本發(fā)明提供了一段新的多肽(命名為Cardiac Salvation)，在細胞模型和動物模型中的實驗均表明其具有明顯的抗心肌細胞凋亡功能。并且，可以采用高表達效率的畢赤酵母真核表達系統(tǒng)大量表達本發(fā)明的Cardiac Salvation蛋白并將其分離純化，從而將純化的蛋白改造成藥物分子，用于制備治療心肌細胞壞死相關(guān)的心肌病、心肌梗死和心力衰竭等心臟疾病的生物技術(shù)蛋白藥物。


以下，結(jié)合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方案，其中圖1為本發(fā)明的重組質(zhì)粒pPIC9K_Cardiac Salvation的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為Cardiac Salvation蛋白在細胞模型中的抗心肌細胞凋亡功能；其中，2A TUNEL法檢測細胞凋亡(R&D Systems) ；2B =Cell Death ELISA檢測細胞凋亡;圖3為Cardiac Salvation蛋白在動物模型中的抗心肌細胞凋亡功能；其中，3A 冠狀動脈結(jié)扎手術(shù)20天后測量心肌梗死面積；3B 冠狀動脈結(jié)扎手術(shù)2天后Cell Death ELISA檢測心肌細胞凋亡。
具體實施例方式以下參照具體的實施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明所用的真核表達質(zhì)粒pPIC9K和宿主菌畢赤酵母GSl 15購自invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；dNTP購自北京天根生物工程公司。引物的合成和核苷酸序列測序均由北京博尚公司完成。純化用的鎳柱購自GE公司。實施例1 構(gòu)津真核表汰質(zhì)粒oPIC9K-Cardiac Salvation和工程菌畢赤酵母 GS1151、真核表達質(zhì)粒 pPIC9K_Cardiac Salvation 的構(gòu)建采用全基因合成方法獲得基因序列SEQ. ID. NO :2，在該基因兩側(cè)加入酶切位點 SnabI和AvrII后，采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，將得到的序列與質(zhì)粒pPIC9K構(gòu)建得到重組質(zhì)粒 pPIC9K-Cardiac Salvation0將該重組載體轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌DH5 α (購自天根生化科技有限公司)進行擴增，分別使用SacI、Sail以及BglII進行酶切，經(jīng)過乙醇沉淀，ddH20溶解，得到濃度為5ug/ul的線性化質(zhì)粒。2、工程菌畢赤酵母GS115的制備選擇巴斯德畢赤酵母中的GS115，使用電轉(zhuǎn)化的方法將外源基因轉(zhuǎn)入GS115中，使用組氨酸缺陷平板RDB初篩后，使用G418平板復(fù)篩。電轉(zhuǎn)化步驟具體如下在含5mlYPD的50ml離心管中，培養(yǎng)畢赤酵母，30°C過夜。取0. 1-0. 5ml過夜培養(yǎng)物，接種含500ml新鮮培養(yǎng)基的2L搖瓶，過夜生長至0D600為1. 3-1. 5。4°C,1500g離心 5min收集細胞，用500ml預(yù)冷的滅菌水懸浮細胞。之后再離心，用250ml預(yù)冷的滅菌水懸浮細胞。離心后，用20ml預(yù)冷的IM山梨醇懸浮細胞。離心，用Iml預(yù)冷的IM山梨醇懸浮細胞，至終體積約1. 5ml。取80 μ 1上述細胞與20 μ g線性化DNA混合，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0. 2cm 電轉(zhuǎn)杯中，冰浴5min。使用Bio-Rad Gene Pulser進行電轉(zhuǎn)，設(shè)置參數(shù)為電壓1.5kV，電容 25 μ F，電阻200 Ω，電擊時長10ms。按照所述參數(shù)電擊兩次。立即加入Iml預(yù)冷的IM山梨醇至杯中，然后轉(zhuǎn)移至滅菌離心管中。分成200-600 μ 1等份，涂于RDB平板上。30°C培養(yǎng)， 約3-5天后克隆產(chǎn)生。將RDB平板上長出的重組子刮下重新懸浮，涂布于濃度為0. 75mg/ ml, 1. 5mg/ml和％ig/ml的G418平板。30°C培養(yǎng)，約2_5天后克隆產(chǎn)生。挑取G418平板中的酵母菌落，混勻在10 μ 1的無菌蒸餾水中，取1 μ 1進行菌落PCR。使用Α0Χ13’和5’端的引物檢驗?zāi)康幕蛟诮湍妇渲械牟迦肭闆r。McI和MlI線性化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化GS115后， 只產(chǎn)生表型為His+Mut+的菌株，而BglII線性化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后可以產(chǎn)生表型為His+Mut+和 His+Muts的菌株，具有His+Muts表型的菌株。實施例2 =Cardiac Salvation蛋白的誘導(dǎo)表達選取上一步中條帶明顯的HiS+Mut+表型的酵母菌，使用BMMY培養(yǎng)基30°C搖床培養(yǎng) 3-4天，每M小時補加甲醇，使其濃度保持在左右。分離上清，濃縮后用Western Blot 驗證表達情況。實施例3 =Cardiac &ilvation蛋白的分離純化選取Western Blot驗證結(jié)果為陽性的菌株，在500ml的 BufferedMethanol-complex Medium(BMMY)中誘導(dǎo)畢赤酵母表達重組蛋白，離心收集上清， 調(diào)pH到7. 9并使用0. 45 μ m的濾膜過濾。過柱的時候用緩沖液1 (IOmM pH7. 9含0. 25M NaCl的Tris-HCl緩沖液)平衡10個床體積，控制流速為lml/min。將過濾好的畢赤酵母培養(yǎng)基上樣，流速為lml/min，用緩沖液1再洗10個柱床體積，流速為lml/min，用含IOOmM 咪唑的緩沖液3 (10mMpH7. 9的Tris-HCl緩沖液含0. 25M NaCl以及300mM咪唑)進行階段洗脫，流速為anl/min，收集洗脫峰，洗脫5個柱床體積。將收集到的蛋白溶液使用真空離心干燥機(型號LNG-L96，廠商太倉華利達實驗室設(shè)備公司)進行濃縮。將濃縮后的蛋白樣品溶液采用接有GE的脫鹽柱的AKTA蛋白純化儀(型號=AKTApurifier 10，廠商GE) 進行脫鹽，收集蛋白峰，并使用離心凍干濃縮儀進行濃縮。實施例4 =Cardiac Salvation蛋白的生物活性鑒定1、Cardiac Salvation蛋白在細胞模型中的抗心肌細胞凋亡功能以200ng/ml FasL處理分別經(jīng)Cardiac Salvation蛋白處理過的大鼠原代培養(yǎng)心肌細胞(購買Wistar成年大鼠，處死后直接取心臟，經(jīng)過一系列處理后做成原代培養(yǎng)細胞，詳細步驟參照“Signaling Pathways in Reactive OxygenSpecies-Induced Cardiomyocyte Apoptosis，，，Riidiger von Harsdorf, Pei-Feng Li 禾口 Rainer Dietz, Circulation 1999 ；99 ；2934-2941) !^asL處理M小時后收集心肌細胞進行實驗分析。 TUNEL法檢測細胞凋亡，按照TUNEL檢測試劑盒(R&D Systems)說明進行。統(tǒng)計50個視野下共400個細胞。結(jié)果如圖2所示，表明Cardiac Salvation蛋白可以阻斷!^sL造成的 TUNEL陽性細胞增多(圖2A)。Cell Death ELISA檢測細胞凋亡，按照Cell Death ELISA 檢測試劑盒(Roche)說明進行。在405nm波長處用多功能酶標儀(型號Synergy 〗，廠商 BioTek)測光密度值，數(shù)據(jù)以倍增的方式表達。圖中的數(shù)據(jù)是4次獨立實驗的平均值Γρ < 0. 05vs FasL.)。數(shù)據(jù)證實Cardiac Salvation蛋白能阻斷!^asL所致的核小體DNA斷裂 (圖 2 。2、Cardiac Salvation蛋白在動物模型中的抗心肌細胞凋亡功能雄性韋氏大鼠Q50-300g)(購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)隨機分組，每組8只。實驗大鼠經(jīng)靜脈注射Cardiac Salvation蛋白(1. 0 μ M/kg體重)，立即結(jié)扎心臟冠狀動脈后前降支，造成心肌梗死模型。假手術(shù)組處理方法類似，只是冠狀動脈不結(jié)扎。冠狀動脈結(jié)扎手術(shù)20天后測量心肌梗死面積，注射Cardiac Salvation蛋白大鼠的心臟梗死面積小于不注射Cardiac Salvation蛋白的對照組大鼠心臟(圖3A)。冠狀
7動脈結(jié)扎手術(shù)2天后Cell Death ELISA檢測心肌細胞凋亡，按照Cell Death ELISA檢測試劑盒(Roche)說明進行。在405nm波長處用ELISA檢測儀測光密度值，數(shù)據(jù)以倍增的方式表達(圖:3B)。圖3A和;3B中的數(shù)據(jù)是4次獨立實驗的平均值Cp < 0. 05vs saline廣ρ <0. 05vs CardiacSalvation)，數(shù)據(jù)表明，Cardiac Salvation蛋白在動物模型中有對抗心肌細胞凋亡的功能。 以上實驗結(jié)果表明，Cardiac Salvation蛋白分子在細胞模型中和動物模型中都具有顯著的抗心肌細胞凋亡的作用。因此，可用其制備用于治療由心肌細胞壞死所引起的心肌病、心肌梗死和心力衰竭等心臟疾病的生物技術(shù)蛋白藥物。
權(quán)利要求
1.一種具有抗心肌細胞凋亡功能的蛋白，其特征在于，所述蛋白為包含SEQ. ID.N0 :1 所示氨基酸序列的多肽、其生物活性功能片段、變體或衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白為SEQ.ID. NO 1所示氨基酸序列的多肽。
3.編碼如權(quán)利要求1或2所述蛋白的多核苷酸。
4.與如權(quán)利要求3所述多核苷酸互補的多核苷酸。
5.一種編碼具有抗心肌細胞凋亡功能的蛋白的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含SEQ. ID. NO 2所示的多核苷酸序列；優(yōu)選地，所述多核苷酸為SEQ. ID. NO 2所示的多核苷酸序列。
6.包含如權(quán)利要求3-5中任一項所述的多核苷酸的重組載體；優(yōu)選地，所述重組載體為pPIC9K_Cardiac Salvation0
7.包含如權(quán)利要求6所述的重組載體的宿主細胞；優(yōu)選地，所述宿主細胞為畢赤酵母；進一步優(yōu)選地，所述畢赤酵母為巴斯德畢赤酵母GS115。
8.—種如權(quán)利要求1或2所述的蛋白的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括在表達可檢測量的所述蛋白的條件下轉(zhuǎn)錄和翻譯權(quán)利要求3-5中任一項所述的多核苷酸。
9.一種如權(quán)利要求1或2所述蛋白的制備方法，該制備方法包括1)構(gòu)建根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述蛋白的多核苷酸序列；2)構(gòu)建包含步驟1)所構(gòu)建的多核苷酸序列的表達載體；3)將步驟2)構(gòu)建的表達載體用于轉(zhuǎn)化宿主細胞，并使所述多核苷酸序列在宿主細胞中表達；4)純化步驟3)中得到的蛋白。
10.如權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法中步驟幻的表達載體為 pPIC9K_Cardiac Salvation ；優(yōu)選地，所述宿主細胞為畢赤酵母；進一步優(yōu)選地，所述畢赤酵母為巴斯德畢赤酵母GSl 15。
11.如權(quán)利要求1或2所述的蛋白在制備用于治療心肌細胞壞死引起的心臟疾病藥物中的用途；優(yōu)選地，所述心臟疾病包括心肌病、心肌梗死和心力衰竭。
全文摘要
本發(fā)明提供一種具有抗心肌細胞凋亡功能的蛋白，所述蛋白為包含SEQ.ID.NO1所示氨基酸序列的多肽、其生物活性功能片段、變體或衍生物。該蛋白由123個氨基酸組成，分子量為13.53KD，容易穿過細胞膜，進入靶器官的細胞內(nèi)發(fā)揮生物學作用，因此可將其制備成治療心肌細胞壞死相關(guān)的心肌病、心肌梗死和心力衰竭等心臟疾病的生物技術(shù)蛋白藥物。
文檔編號A61K38/16GK102363628SQ201110025369
公開日2012年2月29日 申請日期2011年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月24日
發(fā)明者周露玙, 李倩, 李培峰 申請人:中國科學院動物研究所