專利名稱：T細胞免疫原基因ti及其在口蹄疫蛋白亞單位疫苗和滅活疫苗中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及獸醫(yī)藥領域，尤其是一種T細胞免疫原基因TI及其在口蹄疫蛋白亞單位疫苗和滅活疫苗中應用。
背景技術：
口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease, Fffl))是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一種急性、熱性、高度接觸傳染性的動物疫病。主要侵染豬、牛、羊等偶蹄動物，被國際獸疫局列為必須通報的烈性傳染病。該病傳播途徑多、傳播速度快，曾多次在世界范圍發(fā)生大流行。FMDV 是小 RNA 病毒科(Picornaviridae)，口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)的成員該病毒有七個血清型，分別為0、A、C、Asia 1、SATl、SAT2、SAT3，每個血清型又可產生很多基因亞型，血清型之間無交叉保護反應。FMDV的核酸為單股正鏈的RNA分子，基因組全長約 8500個堿基，只含有一個大的開放閱讀框，表達產生的聚蛋白逐級裂解產生病毒的結構蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4)和非結構蛋白(Lab，2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)，結構蛋白組裝產生病毒的衣殼結構。病毒衣殼蛋白是誘導產生中和抗體的主要免疫原，而結構蛋白與非結構蛋白均含有誘導細胞免疫的T細胞抗原表位。早期通過單抗與免疫逃逸突變株的序列分析研究表明，在0型FMDV(OlBFS)至少存在5個功能獨立的中和性抗原表位，組成抗原位點的區(qū)段主要包括VPl的G-H環(huán)以及其 C端氨基酸，VP2上的31，70 73，75和77位氨基酸，VPl的B-C環(huán)上的43和44位點氨基酸；VP3上的58位氨基酸，VPl 149位氨基酸(Crowther et al. ,1993)等參與構成五個中和表位。這5個中和表位除了位點1為線性表位外，其余均為構象表位。利用合成肽免疫實驗動物和牛的試驗似乎證明位點1是最優(yōu)勢的抗原表位，但是有的試驗結果顯示疫苗免疫后針對位點2的抗體應答水平高于位點1 (Samuel，1997)；其中針對G-H環(huán)位點的免疫顯然是最重要的，因為不同血清型病毒，在G-H環(huán)附近的變異幅度最大，而且G-H環(huán)是病毒結合細胞受體的部位(Grubman and Baxt, 2004) 0 T細胞表位對于誘導產生更高水平的中和抗體、盡早的清除病毒具有重要的作用，Cooke and Westover(2008)綜合分析了不同血清型病毒抗原位點區(qū)域的差異，結果顯示B-細胞與T-細胞抗原位點區(qū)域顯示出很明顯的血清型特征，已經發(fā)現(xiàn)在FMDV的結構蛋白以及非結構蛋白3A與3D上均存在T-細胞表位，有些 T-細胞表位在血清型間比較保守，有些在毒株之間差異較大；其中VP4，VP1，3A，3D蛋白中均含有保守的T細胞表位，這些表位可能更易被宿主細胞表達的MHC分子識別，因而在分子疫苗設計中受到更多的關注。
發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種T細胞免疫原基因TI及其在口蹄疫蛋白亞單位疫苗和滅活疫苗中應用。一種T細胞免疫原基因Tl，其具有SEQ ID NO=I的核苷酸序列。
進一步的，其具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列。T細胞免疫原基因TI在口蹄疫蛋白亞單位疫苗和滅活疫苗中應用。結果顯示，與滅活疫苗或OA-VPl單獨免疫組相比，添加TI抗原后滅活疫苗或 OA-VPl免疫組小鼠均能產生高水平的特異性中和抗體(P < 0. 5)；且⑶4+T細胞數(shù)量顯著增多(P < 0. 01)，IFN- γ產生水平顯著升高(P < 0. 01)。說明TI抗原具有很好的誘導特異性體液與細胞免疫應答的作用，是一種很好的免疫增效劑，可作為口蹄疫蛋白亞單位疫苗和滅活疫苗中的一種有效成份，以提高疫苗的免疫效果。本發(fā)明設計并合成了包含兩個通用T細胞表位與來自口蹄疫病毒結構蛋白與非結構蛋白的多個細胞表位的串聯(lián)表達基因，以期這種表達產物能夠作為一種T細胞免疫原，用于蛋白亞單位疫苗和滅活疫苗，提高疫苗免疫后保護性中和抗體的水平和免疫持續(xù)期。在本發(fā)明中，設計并串聯(lián)表達了 0和Asia 1兩個型的VPl結構蛋白，用作蛋白亞單位疫苗的雛形來驗證所表達T細胞免疫原的免疫增效作用。在小鼠體內的初步免疫試驗結果表明，所表達的T細胞免疫原具有很好的免疫增效作用，有望用于發(fā)明口蹄疫蛋白亞單位疫苗或作為滅活疫苗中的免疫增效成份，來提高傳統(tǒng)疫苗的免疫效果。本發(fā)明也為口蹄疫疫苗發(fā)明提供了一種新的思路。
圖1為表達蛋白TI的SDS-PAGE檢測.M為蛋白分子質量標準，1為未誘導TI對照，2為誘導后TI表達產物，3為TI誘導表達培養(yǎng)上清，4為TI誘導表達產物的沉淀，5和 6為純化后的TI表達產物；圖2為表達蛋白OA-VPl的SDS-PAGE檢測.M為蛋白分子質量標準，1為未誘導 OA-VPl對照，2為誘導后OA-VPl表達產物，3為OA-VPl誘導表達培養(yǎng)上清，4為OA-VPl誘導表達產物的沉淀，5為透析濃縮后的OA-VPl表達產物.；圖3為免疫小鼠血清0型FMDV中和抗體效價測定；圖4為免疫小鼠血清Asial型FMDV中和抗體效價測定；圖5為各組小鼠脾⑶4+T細胞和⑶8+T細胞亞群數(shù)量流式檢測結果.A F分別為1 6組，G為對照組.Q2區(qū)顯示⑶4+T細胞數(shù)，Q2-1區(qū)顯示⑶8+T細胞數(shù)。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。1材料與方法1.1 試劑Ni-NTA His · Bind Resins 購自 Novagen 公司；脂多糖(LPS)購自 Sigma 公司； RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清購自GIBCO公司；青霉素、鏈霉素混合雙抗購自晶美公司；小鼠淋巴細胞分離液(EZ-S印TM MouselX)購自達科為公司；IgG^i-FITC，IgGl-PerCP，CD4-PE， IgG2a-PE, CD3-PerCP, CD8-FITC 購自美國 BD 公司；Mo μ se IFN- y ELISA Kit II 檢測試劑盒購自美國BD公司。1. 2T細胞免疫原的設計與表達
設計并合成了 T細胞免疫原基因TI 其由口蹄疫病毒VP1、VP4、3A、3D蛋白共11 個T細胞表位基因，麻疹病毒的泛T細胞表位基因以及來自耶爾森氏菌屬的侵襲素基因組成的串聯(lián)編碼基因，各表位之間以兩個甘氨酸相連，核苷酸序列為SEQ ID NO 1 :CCATGGCCA AGTTCGTGGCTGCTTGGACCCTGAAAGCTGCTGCTGGCGGCTCCATCATCAACAACTACTACATGCAGCAGTACCAG AACAGCATGGGGGGCACACAGAACAACGATTGGTTCTCCAAGCTGGCCTCCAGCGCTTTCAGCGGACTGTTTGGAGG AGGAAGGACCCTGCCTACATCCTTCAACTACGGAGGAAGGAGGCAGCACACCGACGTGAGCTTTGGCGGAGCCGCCA TCGAGTTCTTTGAAGGGATGGTGCACGATTCCATCAAAGGAGGAGTGGACGTGCTGCCAGTGGAGCACATCCTGTAC ACAAGGATGATGATCGGCAGATTCTGCGGAGGGGTGGTGGCCAGCGACTACGATCTGGACTTCGAAGCCCTGAAGCC CCACTTTAAATCCCTGGGACAGACCATCACACCAGCCGACAAGAGCGGCGGAACCGCCAAATCCAAGAAATTCCCCA GCTACACCGCCACAIACCAGTTTTGA ；其蛋白序列為SEQ ID NO 2 AKFVAAffTLKAAA (通用 T 細胞表位)-GG-VP4(2C1_34)-GG-VP4(62_81)-GG-VP1 (157_165)-GG_VP ι (26-34) -GG-3A(21_35) -GG-3D(182_201)-GG-3D(342-37i)"GG-TAKSKKFPSYTATYQF (Invasin)，即MAKFVAAWTLKAAAGGSIINNYYMQQYQNSMGGTQNNDWFSKLASSAFSGLFGGGRTLPTSFNYGGRR QHTDVSFGGAAIEFFEGMVHDSIKGGVDVLPVEHILYTRMMIGRFCGGVVASDYDLDFEALKPHFKSLGQTITPAD
KSGGTAKSKKFPSYTATYQF各組成蛋白序列及功能見表1。表1融合蛋白TI的序列及功能
Protein and sequence Promiscuous T helper (Th) cell epitopes AKFYAAWTLKAAAi'51
VP4
Function
a promiscuous T helper (Th) site for broad immunogenicity in multiple species
權利要求
1.一種τ細胞免疫原基因Tl，其特征在于，其具有SEQ ID NO :1的核苷酸序列。
2.根據(jù)權利要求1所述的T細胞免疫原基因Tl，其特征在于，其具有SEQID NO :2的氨基酸序列。
3.T細胞免疫原基因TI在口蹄疫蛋白亞單位疫苗和滅活疫苗中應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種包含口蹄疫病毒VP1，VP4，3A和3D蛋白上多個T細胞表位與兩個通用T細胞表位的T細胞免疫原，命名為TI，其具有SEQID NO1的核苷酸序列；同時表達了O和Asia 1兩個血清型口蹄疫病毒VP1蛋白的串聯(lián)編碼基因，表達產物命名為OA-VP1。TI抗原具有很好的誘導特異性體液與細胞免疫應答的作用，是一種很好的免疫增效劑，可作為口蹄疫蛋白亞單位疫苗和滅活疫苗中的一種有效成份，以提高疫苗的免疫效果。
文檔編號A61K48/00GK102168088SQ20101060158
公開日2011年8月31日 申請日期2010年12月23日 優(yōu)先權日2010年12月23日
發(fā)明者劉在新, 盧曾軍, 孫普, 曹軼梅, 李冬 申請人:中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所