可殺鱗翅目昆蟲(chóng)、植物線(xiàn)蟲(chóng)和鞘銹菌的蘇云金芽孢桿菌及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物保護(hù)劑，尤其涉及一株可高效防治鱗翅目昆蟲(chóng)、植物寄生性線(xiàn)蟲(chóng) 和植物鞘銹菌的蘇云金芽孢桿菌。
【背景技術(shù)】
[0002] 蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一種昆蟲(chóng)病源細(xì)菌，為革蘭氏 陽(yáng)性桿菌，為國(guó)內(nèi)外著名的害蟲(chóng)生防菌。由于其對(duì)特定的昆蟲(chóng)具有毒性，且毒性大小依昆蟲(chóng) 的種類(lèi)不同。蘇云金芽孢桿菌制備的殺蟲(chóng)劑是對(duì)人類(lèi)和環(huán)境友好的安全型細(xì)菌殺蟲(chóng)劑，目 前Bt殺蟲(chóng)劑已被廣泛應(yīng)用。與化學(xué)農(nóng)藥相比，使用Bt殺蟲(chóng)劑防治害蟲(chóng)成本較高。若在生物防 治中使用超高效的細(xì)菌殺蟲(chóng)劑，就可降低其使用劑量和成本。因此，高效殺蟲(chóng)Bt菌株的篩選 獲得及其植物保護(hù)菌劑的制備方法研究就顯得很重要。
[0003] 有文獻(xiàn)報(bào)道了蘇云金芽孢桿菌可應(yīng)用于防治害蟲(chóng)和植物線(xiàn)蟲(chóng)，如中國(guó)專(zhuān)利 ZL200410050065.3公開(kāi)了一種蘇云金芽孢桿菌及其菌劑，該菌株或其菌劑能有效防治植物 線(xiàn)蟲(chóng)以及鱗翅目地下害蟲(chóng)外，還具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)等作用。但其發(fā)酵菌劑濃度需每升毫克 級(jí)以上，才能殺死害蟲(chóng)。中國(guó)專(zhuān)利ZL200910210143.4公開(kāi)了一種拮抗害蟲(chóng)的新穎蘇云金芽 孢桿菌，應(yīng)用于生物性控制蟲(chóng)害的技術(shù)領(lǐng)域，所需濃度也是每升毫克級(jí)以上。尤其是，目前 還沒(méi)有人從自然資源中尤其是植物組織雜質(zhì)中篩選出一株Bt菌同時(shí)具有三種植物保護(hù)功 能，即可高效殺死多種鱗翅目昆蟲(chóng)，植物寄生性線(xiàn)蟲(chóng)和植物鞘銹菌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明提供了一株可殺鱗翅目昆蟲(chóng)、植物線(xiàn)蟲(chóng)和鞘銹菌的蘇云金芽孢 桿菌。
[0005] 本發(fā)明米用的技術(shù)手段如下：一株蘇云金芽孢桿菌的微生物保藏號(hào)為CGMCC No . 11769，拉丁文名稱(chēng)為Bacillus thuringiensis，保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理 委員會(huì)普通微生物中心。
[0006] 優(yōu)選地，蘇云金芽孢桿菌的發(fā)酵物成分包括孢子、晶體和8種以上胞外蛋白，晶體 和胞外蛋白具有尚毒性。
[0007] 另一方面，一株蘇云金芽孢桿菌，應(yīng)用于殺害鱗翅目昆蟲(chóng)、植物線(xiàn)蟲(chóng)和鞘銹菌。
[0008] 優(yōu)選地，鱗翅目昆蟲(chóng)包括向日葵帶狀蛾、大菜粉蝶、菜青蟲(chóng)、菜尺蠖、黃地老虎、榆 樹(shù)尺蠖、歐洲玉米螟和東方玉米螟，植物線(xiàn)蟲(chóng)包括根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)和香蕉螺旋線(xiàn)蟲(chóng)，鞘銹菌包括雞 蛋花鞘銹菌。
[0009] 另一方面，一種菌劑，其活性成分為蘇云金芽孢桿菌的發(fā)酵物。
[0010] 優(yōu)選地，該菌劑應(yīng)用于防治植物病蟲(chóng)害。
[0011] 本發(fā)明所提供的蘇云金芽孢桿菌Bt 00-50-5菌株能產(chǎn)橢圓形孢子、菱形晶體和8 種以上孢外蛋白（分子量：170，133,60,45,27，15，13和71^ &)，其中，晶體和孢外蛋白具有高 毒性，可高效殺死鱗翅目昆蟲(chóng)，植物寄生性線(xiàn)蟲(chóng)和植物鞘銹菌。
[0012] 采用本發(fā)明的蘇云金芽孢桿菌Bt00-50-5發(fā)酵成菌劑，無(wú)需過(guò)濾，可將液體發(fā)酵物 直接使用，防治植物病蟲(chóng)害，或使用發(fā)酵物的冷凍真空干燥成固體粉末，利用率為100%。適 合大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1為本發(fā)明的蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵物各組分的形態(tài)，其中A、晶體和孢子混合物 的形態(tài);B、晶體形態(tài);C、孢子形態(tài)；
[0014]圖2為溶解Bt 00-50-5發(fā)酵產(chǎn)物孢外蛋白的葡聚糖凝膠G-75柱層析圖；
[0015]圖3為實(shí)施例2的分別使用本發(fā)明的蘇云金芽孢桿菌Bt00-50-5菌劑、自來(lái)水、化學(xué) 農(nóng)藥噴施正在生長(zhǎng)的白菜后的效果圖；
[0016]圖4為實(shí)施例3的不同劑量的蘇云金芽孢桿菌Bt 00-50-5菌劑對(duì)香蕉螺旋線(xiàn)蟲(chóng) H.Multicinctus防治效果圖，其中D10，D20和D40為蘇云金芽孢桿菌Bt00-50-5菌劑的稀釋 倍數(shù)，對(duì)照（Contro 1)為自來(lái)水；
[0017]圖5為實(shí)施例4的不同劑量的蘇云金芽孢桿菌00-50-5殺害根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)Meloidogyne incognita防治效果圖；其中D10，D20和D40為蘇云金芽孢桿菌Bt00-50-5菌劑的稀釋倍數(shù)， 對(duì)照（Contro 1)為自來(lái)水；
[0018] 圖6為實(shí)施例5的蘇云金芽孢桿菌Bt00-50-5菌劑對(duì)根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)Meloidogyne incognita的防效圖，其中G為正常的根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)，Η為Bt00-50-5菌劑處理過(guò)的根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)；
[0019]圖7為實(shí)施例6的蘇云金芽孢桿菌Bt00-50-5菌劑防治植物病原真菌雞蛋花鞘繡菌 的效果圖。其中：1和K分別為未處理的蛋花鞘繡菌培養(yǎng)36h、48h的孢子堆形態(tài);J和L分別為 用Bt00-50-5菌劑處理雞蛋花鞘繡菌培養(yǎng)36h、48h的孢子堆形態(tài);M、未處理的雞蛋花鞘繡菌 培養(yǎng)72h后的形態(tài);N、用Bt00-50-5菌劑處理雞蛋花鞘繡菌培養(yǎng)72h的孢子形態(tài)。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 以下對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于 限定本發(fā)明的范圍。
[0021] 本發(fā)明的蘇云金芽孢桿菌（生物菌株00-50-5)菌株微生物保藏號(hào)為CGMCC No. 11769;拉丁文名稱(chēng)為Bacillus thuringiensis，保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委 員會(huì)普通微生物中心(CGMCC);保藏地址:CGMCC，北京市朝陽(yáng)區(qū)北晨西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科 學(xué)院微生物研究所;保藏日期:2015年12月1日。
[0022]本發(fā)明蘇云金芽孢桿菌Bt00-50-5是從自然界中的向日葵組織碎片雜質(zhì)中篩選 的。本發(fā)明蘇云金芽孢桿菌Bt00-50-5的微生物特征為革蘭氏染色陽(yáng)性，能產(chǎn)橢圓形孢子、 菱形晶體和8種以上孢外蛋白，如圖1和圖2所示。其中，8種以上孢外蛋白（分子量：170,133， 60，45，27，15，13和7kDa)，經(jīng)測(cè)試毒性，7kDa的孢外蛋白毒性最高，133，60，45，27，15和13六 種孢外蛋白有毒，可高效殺死鱗翅目昆蟲(chóng)，植物寄生性線(xiàn)蟲(chóng)和植物鞘銹菌。
[0023] 通過(guò)對(duì)蘇云金芽孢桿菌Bt00-50-5菌株基因的核苷酸序列鑒定。Bt00-50-5DNA基 因組共含50萬(wàn)個(gè)以上核苷酸;合成6000多個(gè)不同功能的蛋白質(zhì)。蘇云金芽孢桿菌Bt00-50-5 還產(chǎn)生3個(gè)與溶解細(xì)胞有關(guān)的蛋白，分別為T(mén)oxin Doc蛋白毒素，芽孢桿菌溶血毒素 HBL和小 帶帶毒素 Zot，用于抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，加快溶解和滲透細(xì)胞，其氨基酸系列表與現(xiàn)有技術(shù)中的 蘇云金芽孢桿菌公開(kāi)的氨基酸序列表相似度非常高(相似度為98-100% )。
[0024] 但是本發(fā)明的蘇云金芽孢桿菌Bt00-50-5產(chǎn)生3個(gè)cry晶體蛋白（如cry22AAl-like 1:〇叉;[11)，4個(gè)071:細(xì)胞溶解蛋白毒素（如07七21^131：(?;[11)，一個(gè)￥1口營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞分泌蛋白（如 vip3BAl_like toxin);其中本發(fā)明的蘇云金芽抱桿菌Bt00-50_5的 1、cry22AAl_l ike toxin、2、cyt2Bal3toxin和3、vip3BAl_like toxin對(duì)應(yīng)的具體DNA核苷酸系列表見(jiàn)附表。其 氨基酸序列表與現(xiàn)有技術(shù)中的蘇云金芽孢桿菌公開(kāi)的氨基酸序列表相似性較低(相似度為 24.11to 35.58%)，如蘇云金芽孢桿菌財(cái)00-50-5的0巧224&1-1丨1?5毒蛋白序列與蘇云金芽 孢桿菌cry22Aal序列相比，最多32.58%相一致。這些已知Bt菌毒蛋白可以殺許多種類(lèi)的害 蟲(chóng)，特別是vip3Bal-l ike，具有更廣泛的植物保護(hù)功能。
[0025] 蘇云金芽孢桿菌Bt 00-50-5菌株有三種不同的活性，均可高效殺死鱗翅目昆蟲(chóng)， 植物寄生性線(xiàn)蟲(chóng)和植物鞘銹菌。其中本發(fā)明殺死植物鞘銹菌的蘇云金芽孢桿菌Bt00-50-5 為國(guó)內(nèi)外首次篩選獲得，防治植物病害蟲(chóng)效果最佳。
[0026] 蘇云金芽孢桿菌Bt00-50-5的具體篩選方法：
[0027]將野外采集的向日葵樣本編號(hào)，如00-01到00-80,在冷庫(kù)儲(chǔ)存。每5個(gè)儲(chǔ)存的樣品 (100克:如00-01 和00-02，^-00-05混合在一起;如00-46，00-47，^-00-50混合在一起），用破 碎機(jī)把植物組織破碎。放置，自然沉降，過(guò)夜后去沉淀，用上面的懸浮液作為生物活性測(cè)定 樣品。高效殺蟲(chóng)細(xì)菌篩選的靶標(biāo)昆蟲(chóng)是向日葵帶狀蛾。用人工飼料飼養(yǎng)向日葵帶狀蛾，每管 (共25管)一個(gè)有微孔泡沫條，滴上不同濃度的樣品懸浮液，含0.05%Triton X-100，加入一 頭二齡幼蟲(chóng)，3天后記錄死亡蟲(chóng)數(shù)。如那組混合樣品有毒性，再分別用每一個(gè)樣品制備懸浮 液，進(jìn)行活性測(cè)定。找到可殺蟲(chóng)的樣品。接著用可殺蟲(chóng)的懸浮液，接種到牛肉膏-蛋白胨細(xì)菌 培養(yǎng)基平板，在30°C細(xì)菌生長(zhǎng)12小時(shí)，挑選單獨(dú)菌落，再轉(zhuǎn)接到另一個(gè)牛肉膏-蛋白胨細(xì)菌 平板培養(yǎng)12小時(shí)，然后再選擇單獨(dú)的細(xì)菌菌落的一半，再次轉(zhuǎn)接到牛肉膏-蛋白胨細(xì)菌平板 培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)4天。細(xì)菌染色鑒定：用苯酚-堿性品紅染色液染色，如發(fā)現(xiàn)著色的菱形晶 體和橢圓形的孢子。最后將上代細(xì)菌的另一半菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)并生測(cè)，SDS-聚丙烯酰胺電泳 鑒定，如Bt 00-50-5含133,000(含原毒素)和60,000道爾頓(含毒素)大小的蛋白。其中培養(yǎng) 基選用牛肉膏和蛋白胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基含0.5%牛肉膏和1%蛋白胨，用自來(lái)水稀釋?zhuān)?NaOH調(diào)節(jié)pH到7.2，于121°C滅菌20分，冷卻后放置24小時(shí)備用。
[0028]蘇云金芽孢桿菌Bt00-50-5的發(fā)酵方法為常規(guī)方法，本發(fā)明的蘇云金芽孢桿菌 Bt00-50-5菌劑為蘇云金芽孢桿菌Bt00-50-5的發(fā)酵產(chǎn)物，包含晶體，孢子，上清液孢外蛋白 和少數(shù)營(yíng)養(yǎng)體。
[0029]通過(guò)生物活性測(cè)試證明蘇云金芽孢桿菌Bt00-50-5晶體和胞外蛋白均可殺菜尺蠖 (Trichoplusia ni);孢子沒(méi)有毒性，其殺蟲(chóng)特性不同于已報(bào)道的其它Bt菌株。其發(fā)酵產(chǎn)物 可全部回收，可采用冷凍旋轉(zhuǎn)噴霧干燥法進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵制備菌粉或制備菌劑。經(jīng)測(cè)試，由于 蘇云金芽孢桿菌Bt00-50-5的發(fā)酵物成分包含晶體(有毒），孢子(負(fù)責(zé)遺傳、再生），孢外蛋 白（有毒)和少數(shù)營(yíng)養(yǎng)體菌劑，這不同于傳統(tǒng)的蘇云金芽孢桿菌菌劑的制備方法。傳統(tǒng)的蘇 云金芽孢桿菌由于發(fā)酵上清液含的孢外蛋白毒性太低，所以一般要將發(fā)酵物經(jīng)過(guò)板框過(guò)濾 掉孢外蛋白，剩下的孢子和晶體混合物為殺蟲(chóng)劑，發(fā)酵物利用率較低、工藝繁雜導(dǎo)致菌劑制 備成本高。
[0030] 蘇云金芽孢桿菌Bt00-50-5發(fā)酵成菌劑，無(wú)需過(guò)濾，可將液體發(fā)酵物直接使用，防 治植物病蟲(chóng)害，或使用發(fā)酵物的冷凍真空干燥劑，利用率為100%。適合大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。
[0031] 實(shí)施例1:測(cè)試蘇云金芽孢桿菌Bt00-50-5菌劑(包含晶體，孢子，上清液孢外蛋白 和少數(shù)營(yíng)養(yǎng)體)的生物殺菌活性。
[0032]蘇云金芽孢桿菌Bt00-50-5菌劑對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性實(shí)驗(yàn)如下：
[0033]供試?yán)ハx(chóng)或線(xiàn)蟲(chóng)：向日葵帶狀蛾、大菜粉蝶、菜青蟲(chóng)、菜尺蠖、黃地老虎、榆樹(shù)尺蠖、 歐洲玉米螟、東方玉米螟。
[0034]向日葵帶狀蛾采用每管一蟲(chóng)測(cè)定法:用人工飼料飼養(yǎng)幼蟲(chóng);每管頂部打孔，放入一 個(gè)有微孔的泡沫條，滴上不同濃度的Bt菌劑懸浮液，含0.05 % Triton X-100，每管加入一頭 二齡幼蟲(chóng)，3天后記錄死亡蟲(chóng)數(shù)。
[0035]大菜粉蝶采用浸葉法，剪抱球甘藍(lán)葉片，浸入不同濃度的Bt菌劑懸浮液，含0.05 % Triton X-100，30秒，在濾紙上干燥，每瓶加入10頭二齡幼蟲(chóng)，3天后記錄死亡蟲(chóng)數(shù)。