專利名稱：半胱胺在制備治療癌癥的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種半胱胺在制備治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
化療是目前臨床治療癌癥非常有效和常用的方法。但嚴(yán)重的副作用和癌細(xì)胞的抗 藥性往往會導(dǎo)致治療的中斷或者失敗?，F(xiàn)在常用的化療藥物及相應(yīng)的副作用有環(huán)磷酰胺 (CTX)副作用為骨髓抑制、出血性膀胱炎；異磷酰胺(IFO)副作用為出血性膀胱炎、骨髓抑 制；順鉬(DDP)副作用為腎臟毒性、消化道反應(yīng)、耳毒性、神經(jīng)毒性；卡鉬(CARBO)副作用為 骨髓抑制；米托蒽醌(Mx)副作用為心臟毒性、骨髓抑制；氨甲蝶呤(MT)副作用為腎毒性、 肺纖維化、口腔潰瘍；阿糖胞苷(Ara-C)副作用為肝損害；博來霉素(BLM)副作用為肺纖維 化；平陽霉素(PYM)肺纖維化；紫杉醇(TAXOL)副作用過敏、心臟傳導(dǎo)障礙、末梢神經(jīng)炎；長 春新堿(VCR)末梢神經(jīng)炎，外滲皮膚損害；5-氟尿嘧啶(5-FU)副作用為腹瀉；鬼臼素(足 葉乙甙，VP-16)副作用為骨髓抑制；和美新(TOPO)副作用為骨髓抑制；阿霉素(ADR)副作 用為心臟毒性、骨髓抑制、消化道和腎臟毒性等。因此出現(xiàn)大量復(fù)合的抗癌藥物或者組合抗癌藥，其中專利有CN101040859A、 CN101495148A、CN101040959A、CN101273963A、CN101495148A 等；這些組合要的成分涉及到 烷化劑、抗代謝物類藥物、抗生素類抗癌藥、植物生物堿類藥物、蒽二酮類藥物、天然產(chǎn)物、 激素、激素拮抗劑和其它藥物放射增敏劑鉬配位復(fù)合物腎上腺皮質(zhì)抑制劑免疫抑制劑功 能性治療劑基因治療劑反義治療劑酪氨酸激酶抑制劑單克隆抗體免疫毒素放射性免疫綴 合物癌癥疫苗干擾素白細(xì)胞介素取代脲類紫杉烷類C0X-2抑制劑。半胱胺又稱β —疏基乙胺(簡稱CS)，可從動物毛發(fā)中提取，也可化學(xué)合成，作為 半胱氨酸的脫羧產(chǎn)物，半胱胺是輔酶A分子的組成成分及動物體內(nèi)的生物活性物質(zhì)，在體 內(nèi)具有重要的生理作用。半胱胺在家禽生產(chǎn)中的應(yīng)用有調(diào)節(jié)激素水平，促進(jìn)動物生長；提高 營養(yǎng)物質(zhì)的消化代謝；提高動物機(jī)體免疫力。半胱胺在現(xiàn)今臨床醫(yī)療中的應(yīng)用有治療白內(nèi) 障和胱氨酸病，放射病綜合征，急性和慢性金屬中毒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是針對化療效果和嚴(yán)重副作用，提供半胱胺在制備治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。利用半胱胺添加到目前使用的化療藥物中可制成新的治療癌癥的組合藥劑。這種 組合藥劑使用時可降低化療藥物的有效劑量即可達(dá)到治療效果，從而降低化療藥物產(chǎn)生的 副作用。本發(fā)明還提供一種治療癌癥的組合藥劑，其有效成分包括半胱胺和化療藥物。所述治療癌癥的組合藥劑中還包括醫(yī)學(xué)上可接受的輔料。本發(fā)明組合藥物的兩種成分可以一起給藥或分開給藥， 藥劑形式可以是，但不限 于片劑、膏劑、膠囊、粉劑、注射劑、溶液劑等。
本發(fā)明制備出的抗癌組合藥劑可以通過以下方式給藥局部給藥(topical)直接用藥于要影響的身體部位，包括表皮給藥，吸入給藥， 灌腸給藥。消化道給藥(enteral) 口服給藥，本技術(shù)中的增敏劑和化療藥物可以制成片劑、 膠囊、藥水等，其他的還有插管、肛門給藥等。非消化道給藥(parenteral)靜脈注射，動脈注射，肌肉注射，皮下注射，骨髓注射，皮內(nèi)注射，透皮給藥，粘膜給藥，吸入給藥等。其他給藥方式腹腔注射、硬膜外腔注射、脊髓注射、眼球玻璃體注射等。本治療癌癥的藥物可以分開給藥，組分半胱胺優(yōu)選的給藥方式有靜脈注射、肌肉 注射等常規(guī)給藥方式，因為在半胱胺治療急性金屬中毒(如四乙基鉛中毒)和防治放射病 的臨床應(yīng)用中，靜脈注射被認(rèn)為是首選的可靠的給藥方式。而在臨床上治療慢性金屬中毒 的給藥方式，首選為肌肉注射，所以這兩種注射方式是被臨床驗證的，半胱胺安全、可靠的 給藥方式，只是根據(jù)吸收速率等的不同，需要依臨床實例進(jìn)行選擇。另外高劑量半胱胺可能 會引起胃潰瘍，所以在高劑量給藥的情況下盡量避免口服給藥。該治療癌癥的組合藥劑可以用于治療人體各種實體瘤包括起源于大腦、中樞神 經(jīng)系統(tǒng)、腎臟、肝、膽囊、頭頸部、口腔、甲狀腺、皮膚、黏膜、腺體、血管、骨組織、淋巴結(jié)、肺 臟、食管、胃、乳腺、胰腺、眼睛、鼻咽部、子宮、卵巢、子宮內(nèi)膜、子宮頸、前列腺、膀胱、結(jié)腸、 直腸的原發(fā)或轉(zhuǎn)移的癌或肉瘤或癌肉瘤的藥物。本治療癌癥的組合藥劑雖沒有應(yīng)用于臨床，但細(xì)胞實驗證明，在使用半胱胺和化 療藥劑時，化療藥劑可比單使用化療藥劑是減量。醫(yī)生可根據(jù)具體對患者的病情了解和化 療效果，在安全劑量下確定劑量。組分半胱胺臨床用于治療急性金屬中毒和防治放射病劑 量，一般是靜脈注射，劑量是0.3g/次，一天1-2次。臨床使用本發(fā)明組合藥劑中的半胱胺 時，可以參考其臨床使用安全劑量使用，在安全劑量下，使用劑量越高療效越好。建議臨床 應(yīng)用的劑量參考現(xiàn)有的臨床使用劑量。比如，單獨(dú)但其中組分阿霉素臨床使用的劑量一般 在30-100mg/m2，高劑量會達(dá)到300mg/m2，在與半胱胺共同使用時可酌情減量。實驗證明半胱胺只需協(xié)同低劑量的化療藥物便可有效的殺死癌細(xì)胞及化療藥抗 性癌細(xì)胞，即證明本發(fā)明的藥劑在癌細(xì)胞及抗性癌細(xì)胞的化療中大大降低抗癌藥物的使用 量從而降低化療的副作用。本發(fā)明提供的半胱胺在制備治療癌癥的藥物中的應(yīng)用，通過低 劑量的半胱胺增進(jìn)癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性，從而實現(xiàn)了通過低劑量的化療藥物有效殺 死癌細(xì)胞。本發(fā)明大大提高化療藥物的藥效，降低了化療的副作用。利用該原理設(shè)計了本發(fā)明的抗癌藥物，它包含普通化療藥物和輔劑半胱胺?？拱?藥劑中半胱胺協(xié)助低劑量化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞和化療藥物抗性細(xì)胞，大大增強(qiáng)化療藥物 的化療效果從而降低化療藥物的副作用。而由于半胱胺容易獲得、價格低廉，化學(xué)成分單一且生物毒性低，更使得半胱胺的 這項臨床應(yīng)用顯得意義非凡。半胱胺作為臨床藥物用于白內(nèi)障和胱氨酸病的治療未發(fā)現(xiàn)其 副作用，這也增強(qiáng)了此組合藥物的可實施性和成功率，使本組合抗癌藥物作為臨床藥物更 具有實用性。


圖1 半胱胺引起HeLa細(xì)胞自噬(穩(wěn)定表達(dá)eGFP_LC3細(xì)胞中的綠色點(diǎn)狀聚集)圖2 半胱胺引起293A細(xì)胞自噬(穩(wěn)定表達(dá)eGFP_LC3細(xì)胞中的綠色點(diǎn)狀聚集)圖3 半胱胺引起B(yǎng)16，MCF細(xì)胞自噬(內(nèi)源性的蛋白LC3I向LC3II型轉(zhuǎn)化)圖4 半胱胺在HeLa細(xì)胞中引起細(xì)胞自噬的時間效應(yīng)圖5 半胱胺在HeLa細(xì)胞中引起細(xì)胞自噬的劑量效應(yīng)圖6 半胱胺在HeLa細(xì)胞中，導(dǎo)致自噬相關(guān)蛋白P62的增多圖7 高劑量半胱胺能導(dǎo)致細(xì)胞死亡(MTT檢測法)圖8 半胱胺促進(jìn)低濃度化療藥物阿霉素(doxorubicin)殺死HeLa細(xì)胞實驗(碘化丙啶，PI染色)。圖9 半胱胺促進(jìn)低濃度化療藥物阿霉素(doxorubicin)殺死B16細(xì)胞的實驗(碘化丙啶，PI染色)。圖10 半胱胺促進(jìn)低濃度化療藥物阿霉素(doxorubicin)殺死MCF-7細(xì)胞的實驗 (碘化丙啶，PI染色)。圖11 半胱胺促進(jìn)低濃度化療藥物阿霉素(doxorubicin)殺死阿霉素抗性細(xì)胞 (MCF-7/ADR細(xì)胞)的實驗(碘化丙啶，PI染色)圖12 =HeLa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Atg5siRNA降低自噬水平，相應(yīng)的降低自噬帶來的細(xì)胞殺 傷(碘化丙啶，PI染色)圖13 不同濃度的半胱胺促進(jìn)濃度化療藥物阿霉素(doxorubicin)殺死癌細(xì)胞 (碘化丙啶，PI染色)
具體實施例方式下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實施例1、半胱胺可以HeLA癌細(xì)胞自噬在穩(wěn)定表達(dá)LC3_eGFP的人宮頸癌HeLa 細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，以自噬促進(jìn)劑rapmycin作為陽性對照實驗方法1、篩選穩(wěn)定表達(dá)LC3_eGFP的人宮頸癌細(xì)胞(LC3_eGFP/HeLa)方法如下(1)人宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞(購自中科院上海細(xì)胞所)接種在裝有DMEM培養(yǎng)基 的(美國GIBCO公司)24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，密度約3-5X104/孔，在37°C，5% (體積百分含 量)CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，待用。(2)Lipofectamine2000每孔1. 5 μ 1，溶解在100 μ 1無血清無抗生的素DMEM培養(yǎng) 基中，充分混合后室溫孵育5min，質(zhì)粒LC3-eGFP (美國invitrogen公司)為每孔2 μ g，溶 解在100 μ 1 DMEM無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)中，充分混合后室溫 孵育5min后兩種溶解混合均勻，室溫孵育20-25min。(3)過夜培養(yǎng)的細(xì)胞用DMEM(無血清無抗生素)培養(yǎng)基洗滌2次后加入步驟(2) 孵育過的混合物，在37°C，5% (體積百分含量)CO2培養(yǎng)條件培養(yǎng)30min，每孔補(bǔ)充培養(yǎng)基 DMEM完全培養(yǎng)基300 μ 1，繼續(xù)培養(yǎng)。(4)轉(zhuǎn)染48hr后，細(xì)胞按1 15稀釋后轉(zhuǎn)接到裝有DMEM培養(yǎng)基的(美國GIBCO公 司)24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，并加入0. 5mg/ml的G418抗生素篩選細(xì)胞(美國Sigma公司)，每三天換一次培養(yǎng)基。十天后在熒光顯微鏡下挑出穩(wěn)定表達(dá)LC3-eGFP的綠色陽性克隆LC3_eGFP/ HeLa細(xì)胞，待用。2、將經(jīng)步驟1篩選后獲得的LC3-eGFP/HeLa細(xì)胞接種在裝有DMEM培養(yǎng)基的(美 國GIBCO公司)24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24孔板細(xì)胞密度約為3_5 X IO4/孔，在37°C，5 % (體 積百分含量)CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，待用。3、步驟2的24孔中加入終濃度為1. 5mM的半胱胺(圖1中半胱胺)，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，在培養(yǎng)24小時后進(jìn)行熒光顯微鏡觀察拍照，以沒有任何處理的細(xì)胞作為陰性對照(圖1 中對照)，以自噬促進(jìn)劑雷帕霉素(終濃度為200nM，美國Sigma公司)作為引起自噬的陽性 對照(圖1中雷帕霉素)，同時用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA，終濃度為2mM)和1. 5mM 的半胱胺共同處理24小時來進(jìn)一步證明半胱胺引起自噬的能力(圖1中半胱胺+3-甲基 嘌呤)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染eGFP-LC3質(zhì)粒后，表達(dá)的eGFP_LC3蛋白在正常情況下均勻彌散于細(xì)胞質(zhì) 中，但在細(xì)胞發(fā)生自噬時，eGFP-LC3就會聚集在自噬泡的膜上形成點(diǎn)狀聚集。結(jié)果顯示結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明，1. 5mM半胱胺處理LC3-eGFP/HeLa后，均勻彌散于細(xì)胞質(zhì)中GFP-LC3蛋白聚集在自噬小體的膜上形成綠色的點(diǎn)狀聚集，而且LC3點(diǎn)狀聚集可以被 自噬特異的抑制劑3-甲基嘌呤抑制(圖1)，說明半胱胺引起LC3點(diǎn)狀聚集的是細(xì)胞自噬的 表現(xiàn)。實施例2 半胱胺誘導(dǎo)293A細(xì)胞自噬在穩(wěn)定表達(dá)LC3_eGFP的人胚腎細(xì)胞293A 中誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，以自噬促進(jìn)劑rapmycin作為陽性對照實驗方法1、篩選穩(wěn)定表達(dá)LC3_eGFP的人胚腎細(xì)胞(LC3_eGFP/293A)方法如下(1)293A人胚腎細(xì)胞(購自中科院上海細(xì)胞所)接種在裝有DMEM培養(yǎng)基的(美國 GIBCO公司)24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，密度約3-5 X IO4/孔，在37°C，5% (體積百分含量)CO2培 養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，待用。(2)配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物，方法如下Lipofectamine2000每孔1. 5 μ 1，溶解在100 μ 1 DMEM (無血清無抗生素)培養(yǎng)基中，充分混合后室溫孵育5min，LC3_eGFP為每孔2 μ g，溶解 在100 μ 1 DMEM (無血清無抗生素)培養(yǎng)基中，充分混合后室溫孵育5min后兩種溶解混合 均勻，室溫孵育20-25min。(3)過夜培養(yǎng)的細(xì)胞用DMEM(無血清無抗生素)培養(yǎng)基洗滌2次后加入步驟(2) 獲得的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，在37°C，5% (體積百分含量)CO2培養(yǎng)條件培養(yǎng)30min，補(bǔ)充培養(yǎng)基DMEM 完全培養(yǎng)基300μ 1，37°C，繼續(xù)培養(yǎng)。(4)轉(zhuǎn)染48hr后，細(xì)胞按1 15稀釋后轉(zhuǎn)接DMEM培養(yǎng)基的(美國GIBCO公司)24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，并加入0. 5mg/ml的G418篩選細(xì)胞，每三天換一次培養(yǎng)基。十天后在熒光顯 微鏡下挑出穩(wěn)定表達(dá)LC3-eGFP的綠色陽性克隆，待用。2、經(jīng)篩選后的LC3_eGFP/293A細(xì)胞接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度約為 3-5 X IO4/孔，過夜培養(yǎng)，待用。3、步驟2的24孔中加入終濃度為1. 5mM的半胱胺(圖2中半胱胺)，誘導(dǎo)細(xì)胞自 噬，在培養(yǎng)24小時后進(jìn)行熒光顯微鏡觀察拍照。以沒有任何處理的細(xì)胞作為陰性對照(圖2 中對照)，以自噬促進(jìn)劑雷帕霉素(終濃度為200nM，美國Sigma公司)作為引起自噬的陽性對照(圖1中雷帕霉素)，同時用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA，終濃度為2mM)和1. 5mM 的半胱胺共同處理24小時來進(jìn)一步證明半胱胺引起自噬的能力(圖1中半胱胺+3-甲基 腺嘌呤)。結(jié)果顯示1、HeLa細(xì)胞接種在DMEM培養(yǎng)基的(美國GIBCO公司)24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24孔板細(xì)胞密度約為3-5 X IO4/孔，在37°C，5 % (體積百分含量)CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，待用。2、分別加入終濃度為1.5mM半胱胺處理，分別在在37°C，5% (體積百分含量) CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0hr、5hr、12hr、18hr、24hr后收集，用細(xì)胞裂解液(購自碧云天公司)裂 解細(xì)胞，再加入電泳上樣緩沖液(購自碧云天公司)沸水煮IOmin后，制成電泳樣品。然 后進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳后濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(購自美國Amersham公司)。 用 anti_LC3 (Novus 公司)作為一抗，anti-rabbit (Promega 公司)為二抗，進(jìn)行 Western blot。以anti-GAPDH(美國密理博公司)作為一抗檢測GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶) 作為參考來定量對照組與實驗組的蛋白量(甘油醛-3-磷酸脫氫酶，是細(xì)胞內(nèi)的組成型蛋 白，在各個細(xì)胞內(nèi)的水平一致)。結(jié)果顯示結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明，半胱胺在HeLa細(xì)胞中引起細(xì)胞自噬效果是隨處理時 間的延長而增強(qiáng)的(圖4)。實施例5 半胱胺在HeLa細(xì)胞中引起細(xì)胞自噬的劑量效應(yīng)內(nèi)源性的蛋白LC3I向 自噬標(biāo)志蛋白LC3II型轉(zhuǎn)化實驗方法1、HeLa細(xì)胞接種在DMEM培養(yǎng)基的(美國GIBCO公司)24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24孔 板細(xì)胞密度約為3-5 X IO4/孔，在37°C，5 % (體積百分含量)CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，待用。2、各孔分別加入終濃度為0. 5mM、1. OmM, 1. 5mM或2. OmM的半胱胺，無任何處理的 細(xì)胞為對照組(圖5中的對照)，以自噬促進(jìn)劑終濃度為200nM雷帕霉素處理(美國Sigma 公司)作為引起自噬的陽性對照(圖5中的雷帕霉素)，在37°C，5% (體積百分含量)CO2培 養(yǎng)箱，細(xì)胞培養(yǎng)24hr后收集細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液(購自碧云天公司)裂解細(xì)胞，再加入電泳 上樣緩沖液(購自碧云天公司)沸水煮IOmin后，制成電泳樣品。然后進(jìn)行12% SDS-PAGE 電泳后濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(購自美國Amersham公司)。用anti-LC3 (Novus公 司)作為一抗,anti-rabbit (Promega公司)為二抗，進(jìn)行Western blot。以 anti-GAPDH(美 國密理博公司)作為一抗檢測GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)作為參考來定量對照組與 實驗組的蛋白量(甘油醛-3-磷酸脫氫酶，是細(xì)胞內(nèi)的組成型蛋白，在各個細(xì)胞內(nèi)的水平一 致)結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明，在LC3_eGFP/293A中1. 5mM半胱胺就可以引起 eGFP-LC3綠色點(diǎn)狀聚集，eGFP_LC3點(diǎn)狀聚集可以被自噬特異的抑制劑3-MA抑制(圖2)， 說明半胱胺引起eGFP-LC3點(diǎn)狀聚集的是細(xì)胞自噬的表現(xiàn)。實施例3 半胱胺引起黑色素瘤細(xì)胞B16和人乳腺癌MCF-7細(xì)胞自噬內(nèi)源性的蛋 白LC3I (微管相關(guān)蛋白LC3I)向自噬標(biāo)志蛋白LC3II型轉(zhuǎn)化黑色素瘤細(xì)胞B16和人乳腺癌MCF-7細(xì)胞自噬時，內(nèi)源性的蛋白LC3I向自噬標(biāo)志 蛋白LC3II型轉(zhuǎn)化，因此下述通過檢測內(nèi)源性的蛋白LC3I向自噬標(biāo)志蛋白LC3II型轉(zhuǎn)化來確定黑色素瘤細(xì)胞B16和人乳腺癌MCF-7細(xì)胞是否發(fā)生自噬。
實驗方法1、分別將黑色素瘤細(xì)胞B16 (購自中科院上海細(xì)胞所)或人乳腺癌MCF-7細(xì)胞 分別接種在DMEM培養(yǎng)基的(美國GIBCO公司)24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24孔板細(xì)胞密度約為 3-5 X IO4/孔，370C，過夜培養(yǎng)，待用。2、分別加入終濃度為1.5mM半胱胺處理，在37°C，5% (體積百分含量)CO2培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)24小時后收集，用細(xì)胞裂解液(購自碧云天公司)裂解細(xì)胞，再加入電泳上樣緩 沖液(購自碧云天公司)沸水煮IOmin后，制成電泳樣品。然后進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳 后濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(購自美國Amersham公司)，以無任何處理的黑色素瘤細(xì) 胞B16做為對照組。用anti-LC3 (Novus公司)作為一抗，anti-rabbit (Promega公司)為 二抗，進(jìn)行Western blot。以anti_GAPDH(美國密理博公司)作為一抗檢測GAPDH(甘油 醛-3-磷酸脫氫酶)作為參考來定量對照組與實驗組的蛋白量(甘油醛-3-磷酸脫氫酶， 是細(xì)胞內(nèi)的組成型蛋白，在各個細(xì)胞內(nèi)的水平一致)。結(jié)果顯示結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明，在黑色素瘤細(xì)胞B16和人乳腺癌MCF-7中，相對于對 照，半胱胺處理后LC3II蛋白量大大增加，說明半胱胺在黑色素瘤細(xì)胞B16，人乳腺癌MCF-7 中也能引起細(xì)胞自噬，因為增強(qiáng)內(nèi)源性的蛋白LC3I向蛋白LC3II型轉(zhuǎn)化是發(fā)生細(xì)胞自噬的 標(biāo)志(圖3)。實施例4 半胱胺在HeLa細(xì)胞中引起細(xì)胞自噬的時間效應(yīng)內(nèi)源性的蛋白LC3I向 自噬標(biāo)志蛋白LC3II型轉(zhuǎn)化實驗方法結(jié)果顯示結(jié)果如圖5所示，結(jié)果表明，半胱胺在HeLa細(xì)胞中引起細(xì)胞自噬效果是隨半胱胺 濃度的增加而增強(qiáng)的(圖5)。實施例6 半胱胺在HeLa細(xì)胞中，導(dǎo)致自噬底物蛋白p62的增多以自噬抑制劑 3-MA作為陰性對照細(xì)胞自噬能降解細(xì)胞內(nèi)的錯誤折疊的蛋白或者受損傷的細(xì)胞器，P62蛋白也是細(xì) 胞自噬的底物，細(xì)胞發(fā)生完整的自噬時會降解細(xì)胞內(nèi)的P62蛋白，如果細(xì)胞自噬的下游被 阻斷就會阻斷P62的降解，所以p62蛋白的增多可以間接的說明自噬的非完整性。實驗方法1. HeLa細(xì)胞接種在裝有DMEM培養(yǎng)基的(美國GIBCO公司)24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 24孔板細(xì)胞密度約為3-5X IO4/孔，在37°C，5% (體積百分含量)CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)， 待用。2.各孔處理分別為加入終濃度1. 5mM半胱胺、2mM 3-甲基腺嘌呤、1. 5mM半胱胺 和2mM 3-甲基腺嘌呤的組合，將未做任何處理的細(xì)胞做為對照，分別于37°C，5% (體積 百分含量)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24hr后收集細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液(購自碧云天公司)裂解細(xì) 胞，再加入電泳上樣緩沖液(購自碧云天公司)沸水煮IOmin后，制成電泳樣品。然后進(jìn) 行12% SDS-PAGE電泳后濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(購自美國Amersham公司)。用 anti-p62 (BIOMOL^W]) ^l, anti-rabbit (Promega ) ^J—^l, ii^T Western blot,以anti-GAPDH作為一抗檢測GAPDH (甘油醛-3-磷酸脫氫酶)作為參考來定量對照組與實 驗組的蛋白量(甘油醛-3-磷酸脫氫酶，是細(xì)胞內(nèi)的組成型蛋白，在各個細(xì)胞內(nèi)的水平一 致)結(jié)果顯示結(jié)果如圖6所示，結(jié)果表明半胱胺處理組與對照組比較自噬底物p62增多(見圖 6)，說明細(xì)胞自噬的下游通路可能被阻斷，這對細(xì)胞的生存是有害的。實施例7 半胱胺對細(xì)胞活力的影響噻唑藍(lán)法(MTT)法檢測細(xì)胞死亡實驗方法1、HeLa細(xì)胞接種在DMEM培養(yǎng)基的(美國GIBCO公司)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，96孔 板細(xì)胞密度約0. 8-1 X IO4/孔，37°C,5% (體積百分含量)CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，待用。2、細(xì)胞培養(yǎng)板各孔中分別加入終濃度為0mM、0. 5mM、lmM、l. 5mM、2. OmM,2. 5mM、 3. 0mM、4. OmM的半胱胺。37°C,5% (體積百分含量)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24hr后，按照步驟3 的方法檢測細(xì)胞死亡率。3、96孔細(xì)胞經(jīng)上述處理后，每孔加入5mg/ml MTT (噻唑藍(lán))10 μ 1，在37°C，5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)孵育約2-4小時后，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)紫色晶體后，小心吸去上清液后，每孔加入 100 μ 1 DMSO(二甲基亞砜)，放于暗處2小時。搖勻后，酶標(biāo)儀檢測其570nm處的紫外吸 收。隨著細(xì)胞死亡越多在570nm處的吸收值就越小，將OmM半胱胺處理的細(xì)胞的吸收值設(shè) 為100%活細(xì)胞，然后按比例計算細(xì)胞存活力。結(jié)果顯示結(jié)果如圖7所示，結(jié)果表明，低濃度半胱胺對細(xì)胞活力沒有影響，高濃度的半胱胺 可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡(圖7)。實施例8 半胱胺促進(jìn)低濃度化療藥物阿霉素(doxorubicin)殺死癌HeLa細(xì)胞的 實驗用碘化丙碇(PI)染色法檢測實驗方法1、HeLa細(xì)胞接種在DMEM培養(yǎng)基的(美國GIBCO公司)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，96孔 板細(xì)胞密度約0. 8-1 X IO4/孔，37°C,5% (體積百分含量)CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，待用。2、細(xì)胞培養(yǎng)板中各孔處理分別為終濃度為1. 5mM半胱胺(圖8中的CS)、0. 75 μ g/ ml阿霉素(圖8中的Dox)、終濃度為1. 5mM半胱胺和0. 75 μ g/ml阿霉素的組合(圖8中 的D0X+CS)，其中以不加低劑量阿霉素(圖8中的CS)和不加1. 5mM(終濃度)半胱胺(圖 8中的D0X)為對照。培養(yǎng)24hr后，按照步驟3的方法檢測細(xì)胞死亡率。3、細(xì)胞用2 μ g/ml赫斯特(Hochest33342，購自碧云天公司)和5 μ g/ml碘化丙碇 (PI)染色15分鐘，然后在顯微鏡下拍照。Hochest33342專門用來染細(xì)胞核，用來計數(shù)總細(xì) 胞數(shù)量，PI染死細(xì)胞，它能穿透正在死亡或已經(jīng)死亡的細(xì)胞的細(xì)胞膜插入雙鏈DNA中，不能 進(jìn)入活細(xì)胞，死細(xì)胞占所有細(xì)胞的百分比為細(xì)胞的死亡率。結(jié)果顯示結(jié)果如圖8所示，結(jié)果表明，低濃度的半胱胺和低劑量的阿霉素幾乎不引起癌細(xì) 胞死亡，而二者協(xié)同作用則引起HeLa細(xì)胞大量的死亡65. 5士2. 6% (圖8)。實施例9 半胱胺促進(jìn)低濃度化療藥物阿霉素(doxorubicin)殺死黑色素瘤癌細(xì) 胞B16的實驗
實驗方法1、黑色素瘤癌細(xì)胞B16細(xì)胞接種在DMEM培養(yǎng)基的(美國GIBCO公司)96孔細(xì)胞 培養(yǎng)板中，96孔板細(xì)胞密度約0. 8-1 X IO4/孔，37°C，5% (體積百分含量)CO2培養(yǎng)箱中過
夜培養(yǎng)，待用。2、細(xì)胞培養(yǎng)板中各孔處理分別為終濃度為1.5mM半胱胺(圖9中的CS)、0. 8 μ g/ ml阿霉素(圖9中的Dox)、終濃度為1. 5mM半胱胺和0. 8 μ g/ml阿霉素的組合(圖9中的 D0X+CS)，其中以不加低劑量阿霉素(圖9中的CS)和不加1.5mM(終濃度)半胱胺(圖9 中的D0X)為對照。培養(yǎng)24hr后，按照實施例8的方法檢測細(xì)胞死亡率結(jié)果顯示結(jié)果如圖9所示，結(jié)果表明低濃度的半胱胺和低劑量的阿霉素幾乎不引起癌細(xì)胞死亡，而二者協(xié)同作用則加大B16細(xì)胞的死亡21. 892士 1.053% (圖9)。實施例10 半胱胺促進(jìn)低濃度化療藥物阿霉素(doxorubicin)殺死人乳腺癌 MCF-7的實驗實驗方法1、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞接種在DMEM培養(yǎng)基的(美國GIBCO公司)96孔細(xì)胞培養(yǎng) 板中，96孔板細(xì)胞密度約0. 8-1 X IO4/孔，37°C，5% (體積百分含量)CO2培養(yǎng)箱中過夜培
養(yǎng)，待用。2、細(xì)胞培養(yǎng)板中各孔處理分別為終濃度為1. 5mM半胱胺(圖10中的CS)、0. 8μ g/ ml阿霉素(圖10中的Dox)、終濃度為1. 5mM半胱胺和1. 0 μ g/ml阿霉素的組合(圖9中 的D0X+CS)，其中以不加低劑量阿霉素(圖10中的CS)和不加1. 5mM(終濃度)半胱胺(圖 10中的D0X)為對照。培養(yǎng)24hr后，按照實施例8的方法檢測細(xì)胞死亡率結(jié)果顯示結(jié)果如圖10所示，結(jié)果表明，低濃度的半胱胺和低劑量的阿霉素幾乎不引起癌細(xì) 胞死亡，而二者協(xié)同作用則加大MCF-7細(xì)胞的死亡54. 23士2. 146% (圖10)。實施例11 半胱胺促進(jìn)低濃度化療藥物阿霉素(doxorubicin)殺死耐藥性人乳腺 癌細(xì)胞系MCF-7/ADR的實驗實驗方法1、篩選阿霉素耐藥性人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/ADR細(xì)胞方法如下人乳腺癌細(xì)胞系 MCF-7接種在DMEM培養(yǎng)基的(美國GIBCO公司)24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入終濃度0. 01 μ M 的阿霉素，37°C，5% (體積百分含量)CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)兩個月后，再加入0. 1 μ M的阿霉素， 經(jīng)第二輪篩選培養(yǎng)兩個月后，提高藥物濃度至1 μ Μ，篩選培養(yǎng)3個月后得到穩(wěn)定的阿霉素 耐藥性人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/ADR細(xì)胞。2、將耐藥性人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/ADR細(xì)胞接種在DMEM培養(yǎng)基的(美國GIBCO 公司)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，96孔板細(xì)胞密度約0. 8-1 X IO4/孔，37°C,5% (體積百分含量) CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，待用。3、細(xì)胞培養(yǎng)板中各孔處理分別為終濃度為1.5mM半胱胺(圖11中的CS)、20yg/ ml阿霉素(圖11中的Dox)、終濃度為1. 5mM半胱胺和20 μ g/ml阿霉素的組合(圖11中 的D0X+CS)，其中以不加低劑量阿霉素(圖11中的CS)和不加1. 5mM(終濃度)半胱胺(圖 11中的D0X)為對照。培養(yǎng)24hr后，按照實施例8的方法檢測細(xì)胞死亡率結(jié)果顯示
結(jié)果如圖11所示，結(jié)果表明，低劑量半胱胺和阿霉素幾乎不引起耐藥性細(xì)胞死 亡，而二者協(xié)同作用則引起癌細(xì)胞大量的死亡44. 23士 1.8%。實施例12 =HeLa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Atg5siRNA降低自噬水平，相應(yīng)的降低自噬帶來的細(xì) 胞殺傷實驗方法l、HeLa細(xì)胞接種在DMEM培養(yǎng)基的(美國GIBCO公司)2個60mm的細(xì)胞培養(yǎng)板中， 細(xì)胞密度約為2 X IO5/孔，37°C,5% (體積百分含量)CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，待用。2、siRNA 轉(zhuǎn)染Lipofectamine2000 每孔 1. 5μ 1，溶解在 100μ 1 DMEM(無血清無 抗生素)培養(yǎng)基中，充分混合后室溫孵育5min，與哺乳細(xì)胞無同源性的陰性對照siRNA(購 于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)和Atg5siRNA(購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)各2yg 分別溶解在100 μ 1 DMEM (無血清無抗生素)培養(yǎng)基中，充分混合后室溫孵育5min后兩種 溶解混合均勻，室溫孵育20-25min。3、過夜培養(yǎng)的細(xì)胞用DMEM(無血清無抗生素)培養(yǎng)基洗滌2次后，分別加入孵育 過對照siRNA和Atg5siRNA，在37°C，5% (體積百分含量)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，補(bǔ)充培 養(yǎng)基DMEM完全培養(yǎng)基300 μ 1，繼續(xù)培養(yǎng)。4、轉(zhuǎn)染對照siRNA的細(xì)胞培養(yǎng)液中和Atg5siRNA的細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入1. 5mM 半胱胺處理，未做任何處理的細(xì)胞作為對照。5、半胱胺處理24hr后收集細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液(碧云天公司)裂解細(xì)胞，沸水煮 IOmin后，12% SDS-PAGE電泳后濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(Amersham公司)。用抗體 anti_Atg5 (santa 公司)禾口 anti_LC3 (Novus 公司)為一抗 anti-rabbit (Promega 公司)為 二抗，進(jìn)行Western blot。相對于對照siRNA處理的細(xì)胞(圖12右圖中consiRNA)，在轉(zhuǎn) 染Atg5siRNA的細(xì)胞中自噬的水平降低了(圖12右圖中Atg5siRNA)。6、轉(zhuǎn)染對照siRNA的細(xì)胞培養(yǎng)液中和轉(zhuǎn)染Atg5siRNA的細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入終 濃度為1. 5mM半胱胺(圖12左圖中的CS)、20 μ g/ml阿霉素(圖12左圖中的Dox)、終濃度 為1. 5mM半胱胺和20 μ g/ml阿霉素的組合(圖12左圖中的D0X+CS)，其中以不加低劑量阿 霉素(圖12左圖中的CS)和不加1.5mM(終濃度)半胱胺(圖12左圖中的D0X)為對照。 培養(yǎng)24hr后，按照實施例8的方法檢測細(xì)胞死亡率。結(jié)果顯示結(jié)果如圖12所示，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染Atg5siRNA的細(xì)胞，半胱胺引起自噬的能力減弱 (圖12右圖)，相應(yīng)的半胱胺促進(jìn)阿霉素引起細(xì)胞死亡的能力也減弱(圖12左圖，圖12左 圖中control siRNA為轉(zhuǎn)染對照siRNA的細(xì)胞，Atg5siRNA為轉(zhuǎn)染Atg5siRNA的細(xì)胞)。實施例13 半胱胺協(xié)同阿霉素殺傷腫瘤實驗方法1、B16細(xì)胞接種在有DMEM培養(yǎng)基的(美國GIBCO公司)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37°C，5% (體積百分含量)C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長滿培養(yǎng)瓶將細(xì)胞消化并離心下來。2、將1x106個細(xì)胞接種于C57小鼠(購自于上海史萊克公司)，待腫瘤長一周達(dá)到 時0. 5mm3給藥，老鼠隨機(jī)分成四組，對照組給生理鹽水，半胱胺組500mg/kg(相對于老鼠 體重)的劑量給藥，阿霉素組5mg/kg(相對于老鼠體重)的劑量給藥，組合藥組500mg/kg 半胱胺和5mg/kg阿霉素(相對于老鼠體重)共同給藥，每隔一天給藥一次。
3、兩周以后將老鼠段頸處死，將腫瘤剝離下來稱重，統(tǒng)計腫瘤大小來衡量半胱胺 協(xié)同阿霉素殺傷腫瘤的作用(圖13)結(jié)果顯示結(jié)果如圖13所示，結(jié)果表明，半胱胺能大大加強(qiáng)阿霉素殺傷癌細(xì)胞的能力(圖 13)。上述實施例1-13的實驗說明，通過低劑量的半胱胺增進(jìn)癌細(xì)胞對化療藥物的敏 感性，從而實現(xiàn)了通過低劑量的化療藥物有效殺死癌細(xì)胞。實驗證明半胱胺只需協(xié)同低劑 量的化療藥物便可有效的殺死癌細(xì)胞及化療藥抗性癌細(xì)胞，即證明本發(fā)明的藥劑在癌細(xì)胞 及抗性癌細(xì)胞的化療中大大降低抗癌藥物的使用量從而降低化療的副作用。因此可以利用 該原理設(shè)計本發(fā)明的抗癌藥物，它包含普通化療藥物和輔劑半胱胺?？拱┧巹┲邪腚装穮f(xié) 助低劑量化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞和化療藥物抗性細(xì)胞，大大增強(qiáng)化療藥物的化療效果從而 降低化療藥物的副作用。本治療癌癥的組合藥劑雖沒有應(yīng)用于臨床，但細(xì)胞實驗證明，在使用半胱胺和化 療藥劑時，化療藥劑可比單使用化療藥劑是減量。醫(yī)生可根據(jù)具體對患者的病情了解和化 療效果，在安全劑量下確定劑量。組分半胱胺臨床用于治療急性金屬中毒和防治放射病劑 量，一般是靜脈注射，劑量是0. 3g/次，一天1-2次。臨床使用本發(fā)明組合藥劑中的半胱胺 時，可以參考其臨床使用安全劑量使用，在安全劑量下，使用劑量越高療效越好。建議臨床 應(yīng)用的劑量參考現(xiàn)有的臨床使用劑量。比如，單獨(dú)但其中組分阿霉素臨床使用的劑量一般 在30-100mg/m2，高劑量會達(dá)到300mg/m2，在與半胱胺共同使用時可酌情減量。
權(quán)利要求
半胱胺在制備治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。
2.一種治療癌癥的組合藥劑，其活性成分為半胱胺和化療藥物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合藥劑，其特征在于所述治療癌癥的組合藥劑中還包括 醫(yī)學(xué)上可接受的輔料。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述組合藥劑，其特征在于所述化療藥物為阿霉素。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任意一項所述的組合藥劑，其特征在于所述癌癥包括起源于 大腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟、肝、膽囊、頭頸部、口腔、甲狀腺、皮膚、黏膜、腺體、血管、骨組織、 淋巴結(jié)、肺臟、食管、胃、乳腺、胰腺、目艮睛、鼻咽部、子宮、卵巢、子宮內(nèi)膜、子宮頸、前列腺、膀 胱、結(jié)腸或直腸的原發(fā)或轉(zhuǎn)移的癌或肉瘤或癌肉瘤。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合藥劑，其特征在于所述癌癥為宮頸癌、乳腺癌、黑色素 瘤或腎癌。
7.半胱胺在提高癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性中的應(yīng)用。
8.半胱胺在制備腫瘤細(xì)胞抑制劑中的應(yīng)用。
9.半胱胺和化療藥物在制備腫瘤細(xì)胞抑制劑中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤細(xì)胞為人宮頸癌細(xì)胞HeLa 細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7或黑色素瘤癌細(xì)胞B16細(xì)胞；所述化療藥物為為阿霉素。
全文摘要
本發(fā)明公開了半胱胺在制備治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的半胱胺在制備治療癌癥的藥物中的應(yīng)用，通過低劑量的半胱胺增進(jìn)癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性，從而實現(xiàn)了通過低劑量的化療藥物有效殺死癌細(xì)胞。本發(fā)明大大提高化療藥物的藥效，降低了化療的副作用。
文檔編號A61K31/145GK101797242SQ20101014370
公開日2010年8月11日 申請日期2010年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月7日
發(fā)明者萬小妹, 張力, 溫龍平 申請人:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)