專利名稱：：牛尾菜甾體皂苷提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及牛尾菜甾體皂苷提取物及其制備方法，還涉及牛尾菜甾體皂苷提取物在制備預(yù)防和/或治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎產(chǎn)品中的用途。
背景技術(shù)：
：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種常見的以關(guān)節(jié)組織慢性炎癥性病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的自身免疫性疾病。其主要的病理變化為關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜翳形成，軟骨與骨組織的侵蝕。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療的目的是阻止病程發(fā)展，即阻止關(guān)節(jié)炎癥和破壞進(jìn)程，預(yù)防功能喪失。雖然治療措施很多，但藥物治療仍是基礎(chǔ)。目前治療藥物包括非甾體抗炎藥、甾體抗炎藥和疾病調(diào)修抗風(fēng)濕病藥，但這些藥物均存在明顯的不良反應(yīng)。隨著對(duì)炎癥過(guò)程、分子遺傳學(xué)和生物技術(shù)發(fā)展，對(duì)病原學(xué)機(jī)制的認(rèn)識(shí)不斷深入，研究者努力尋找具有特異性的治療藥物。主要以炎性細(xì)胞因子為靶點(diǎn)、以炎癥介質(zhì)為靶點(diǎn)、以免疫活性細(xì)胞表面抗原為靶點(diǎn)、以信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為耙點(diǎn)。百合科菝葜屬植物牛尾菜SmilaxripariaA.DC的根和根莖資源豐富，具有補(bǔ)氣活血，舒筋通絡(luò)之功效，主治氣虛浮腫，筋骨疼痛，偏癱，頭暈頭痛，咳嗽吐血，骨結(jié)核，白帶[江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典，上海科學(xué)技術(shù)出版社，1985:427.]。SashidaY等從牛尾菜中分離鑒定了2個(gè)甾體皂苷類化合物新替告皂苷元3-0-0_卜吡喃鼠李糖基-(l—6)-|3-D-吡喃葡萄糖苷，新替告皂苷元3-0-13-D-吡喃葡萄糖基-(l—4)-[a-L-吡喃鼠李糖基-(1—6)]-P-D-吡喃葡萄糖苷][SashidaY，etal.Phytochemistry，31(7):2439-2443.];LiJ等從牛尾菜中分離鑒定了2個(gè)甾體皂苷類化合物3-0-a-L-妣喃鼠李糖基-(1—2)-[a-L-妣喃鼠李糖基-(1—6)]-13-D-妣喃葡萄糖-3P，20a-二醇-5a-呋甾-22(23)-烯-26-0-P_D_吡喃葡萄糖苷，3_0_a_L_吡喃鼠李糖基_(1—2)-[a-L-吡喃鼠李糖基-(1—6)]-13-D-吡喃葡萄糖-313，1613-二醇-5a-孕甾-20-酮-16-0-[5-羥基_4_甲基-戊酸-5_0-|3_D_吡喃葡萄糖酯][LiJ，etal.ChemPharmBull,54(10):1451-1454.]。目前未見高含量牛尾菜甾體皂苷提取物，特別是其中含有4種新化合物的一種或多種的產(chǎn)品；未見有關(guān)牛尾菜甾體皂苷在預(yù)防和/或治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎生物活性方面的研究報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是開發(fā)利用迄今為止應(yīng)用尚不廣泛的百合科菝葜屬植物牛尾菜SmilaxripariaA.DC，尤其是其甾體皂苷類成分。本案發(fā)明人通過(guò)對(duì)牛尾菜進(jìn)行細(xì)致深入的研究，發(fā)明了牛尾菜甾體皂苷提取物提取分離純化方法，進(jìn)一步對(duì)提取物化學(xué)成分進(jìn)行了研究，分離鑒定了提取物中含量高的化合物4種，均為新化合物，制得的提取物經(jīng)藥理活性研究證明，具有抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用，因而完成了本發(fā)明。本發(fā)明提供一種牛尾菜甾體皂苷提取物及其制備方法和用途。4本發(fā)明的牛尾菜甾體皂苷提取物中甾體皂苷重量百分含量為5095%。本發(fā)明提供牛尾菜甾體皂苷提取物的制備方法，該方法包括以下步驟a)牛尾菜粗粉用第一溶劑回流提取，濾過(guò)，提取液合并，提取液減壓濃縮；b)將步驟a)獲得的提取物加水溶解，經(jīng)大孔吸附樹脂柱色譜，用水洗脫至洗脫液近無(wú)色，棄去洗脫液；c)用第二溶劑洗脫至洗脫液近無(wú)色，棄去洗脫液；d)用第三溶劑洗脫至洗脫液近無(wú)色，收集洗脫液；e)將步驟d)獲得的洗脫液，經(jīng)脫色樹脂柱D941色譜，用第四溶劑洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮、干燥得牛尾菜留體皂苷提取物。在以上步驟中，其中步驟a)的第一溶劑為0100%乙醇水溶液；步驟b)大孔吸附樹脂包括非極性或弱極性大孔吸附樹脂。步驟c)的第二溶劑為1050%乙醇水溶液，步驟d)的第三溶劑為6090%乙醇水溶液，步驟e)的第四溶劑為90%乙醇水溶液。本發(fā)明提供牛尾菜甾體皂苷提取物的制備方法，優(yōu)選的包括以下步驟a)牛尾菜粗粉加5070%乙醇回流提取，濾過(guò)，提取液合并，減壓回收乙醇；b)將步驟a)獲得的提取物加水溶解，經(jīng)大孔吸附樹脂柱D101色譜，用水洗脫至洗脫液近無(wú)色，棄去洗脫液；c)用30%乙醇洗脫至洗脫液近無(wú)色，棄去洗脫液；d)用70%乙醇洗脫至洗脫液近無(wú)色，收集洗脫液；e)將步驟d)獲得的洗脫液，經(jīng)脫色樹脂柱D941色譜，6倍柱體積90%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮、干燥得牛尾菜留體皂苷提取物。本發(fā)明的牛尾菜甾體皂苷提取物，從牛尾菜根和根莖中提取，從中分離得到4種新化合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定如下化合物(1):16-0-P-D-吡喃葡萄糖基-(22S)-膽甾-5-烯_3|3，1613，22_三醇-3-0-a-L-吡喃鼠李糖基-(1—2)-[a-L-吡喃鼠李糖基-(1—6)]-13-D-吡喃葡萄糖苷OH(1)無(wú)定形固體，Liebermann-Burchard反應(yīng)呈藍(lán)綠色，Molish反應(yīng)呈紫色，"H-NMR和"C-NMR譜顯示甾體皂苷類化合物的特征，推測(cè)化合物(1)為甾體皂苷類化合物。HR-ESIMS顯示準(zhǔn)分子離子峰m/z1033.5499[M_H]—，結(jié)合13C_NMR和DEPT數(shù)據(jù)推測(cè)分子式為C51H86021(計(jì)算值C51H85021相對(duì)分子質(zhì)量1033.5583)。力-NMR譜示有甲基質(zhì)子信號(hào)S0.90(3H，s)，0.94(3H，d，J=6.2Hz)，0.95(3H，d，J=6.0Hz)，0.99(3H，s)，1.21(3H，d，J=7.2Hz)，與氧相連的次甲基質(zhì)子信號(hào)S3.82(lH，m)，4.31(lH，m)，4.53(1H，m)，烯氫質(zhì)子信號(hào)S5.28(lH，brd)。13C_NMR示有51個(gè)碳信號(hào)，其中27個(gè)甾體母核碳信號(hào)，結(jié)合DEPT和HMQC譜推測(cè)結(jié)構(gòu)中含有5個(gè)CH3，9個(gè)CH2，10個(gè)CH(其中3個(gè)與氧相連S73.23，78.20，82.68，1個(gè)烯碳S121.87)，3個(gè)季碳(其中1個(gè)烯碳S140.96)。綜合解析以上數(shù)據(jù)并和文獻(xiàn)[YinJ，etal.JNatProd，2003，66:646-650]對(duì)照，推測(cè)化合物(1)苷元為(22S)-膽甾_5-烯-3|3，1613，22-三醇，比較16-0-P_D_吡喃葡萄糖-(22S，25S)-膽甾-5-烯-3P，16P，22,26-四醇-3-O-a-L-吡喃鼠李糖基-(l—2)_[a-L_吡喃鼠李糖基_(1—4)]-13-D-吡喃葡萄糖苷和26-0-13-D-吡喃葡萄糖-(22R，25R)-膽甾_5-烯-313，1613，22，26-四醇-3-0-a-L_吡喃鼠李糖基-(1—2)-P_D_吡喃葡萄糖苷C-22化學(xué)位移進(jìn)一步證實(shí)22S構(gòu)型[SangSM，etal.FoodChem，2003，:499-506.;HayesPY，etal.Phytochemistry，2008，68:623-630.]，NOESY譜顯示16-H/22-H相關(guān)信號(hào)，進(jìn)一步證實(shí)16-0H相對(duì)構(gòu)型為P構(gòu)型。力-NMR示有四個(gè)糖端基質(zhì)子信號(hào)S4.74(1H，d，J=7.8Hz)，4.89(1H，d，J=7.2Hz)，5.37(1H，brs)和5.64(lH，brs)，兩個(gè)鼠李糖特征甲基質(zhì)子信號(hào)Sl.65(3H，d，J=6.2Hz)和1.71(3H，d，J=6.2Hz);13C_NMR示有四個(gè)糖端基碳信號(hào)S102.01，102.83，102.89和107.OO，兩個(gè)鼠李糖特征甲基碳信號(hào)S18.51和18.66?；衔?1)經(jīng)酸水解后HPLC法鑒定結(jié)構(gòu)中存在D-葡萄糖和L-鼠李糖[GuoHz，etal.Phytochemistry,2004，65:481-484.],H-NMR顯示葡萄糖端基質(zhì)子偶和常數(shù)J=7.2和J=7.8Hz推測(cè)葡萄糖為13構(gòu)型，13C-NMR顯示鼠李糖C-5位化學(xué)位移分別為S69.84和70.61推測(cè)鼠李糖為a構(gòu)型[ShaoB，etal.Phytochemistry,2007，68:623-630.]。綜合解析^-NMR，13C_NMR，DEPT，HMQC，HMBC譜并和文獻(xiàn)對(duì)照，化合物(1)糖部分?jǐn)?shù)據(jù)與RiparosideA相同[LiJ，etal.ChemPharmBull，2006，10:1451-1454.]。HMBC譜顯示葡萄糖端基質(zhì)子S4.74與苷元16位碳S82.68遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)，推測(cè)結(jié)構(gòu)中存在16-0-13-D-吡喃葡萄糖基。HMBC譜顯示葡萄糖端基質(zhì)子S4.89與苷元3位碳S78.20，鼠李糖端基質(zhì)子S5.64與葡萄糖2位碳S79.50，鼠李糖端基質(zhì)子S5.37與葡萄糖6位碳S67.08遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)，推測(cè)結(jié)構(gòu)中存在3-0-a-L鼠李糖-(l—2)_[a-L-鼠李糖-(l—6)]-|3_D_吡喃葡萄糖基。綜合分析以上數(shù)據(jù)，鑒定化合物(1)為16-0-13-D-吡喃葡萄糖-(22S)-膽甾-5-烯-313，1613，22-三醇-3-0-a-L-吡喃鼠李糖基-(1—2)-[a-L-吡喃鼠李糖基-(1—6)]-P_D_吡喃葡萄糖苷。該化合物未見文獻(xiàn)報(bào)道。力-NMR和"C-NMR數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)見表1。表1化合物(1)^-NMR和13C_NMR數(shù)據(jù)(C5D5N)No.sHscNo.5H11.05，1.7337.49116-O-Glucose21.72，2.1930.44114.74(d，/=7.8Hz)107.00d33.8278.20d23.96(t,J-5.4Hz)75.39d42.44，2.6539.53t33.96(o)78.94d5-140.96s44.54(o)71.82d65.28121.87d54.14(o)78.77d71.41,1.7432.11164.37(o)，4.46(o)63.01181.2931,79d3-O-Glucose90.8850.44d14.89(d，^7.2Hz)102.83d10-37.04s24.13(m)79.55d111.3821.15t33.84(o)75.34d121.12，2.0140.07143.97(o)75.66d13-42.45s54.16(o)76.77d140.8155.19d63.95(o)，4.33(o)67.11t151.65，1.9236.771RhamnoseI164.5382,68d15.64(1H,brs)102.89d171.9858.00d24.31(brs)72.59d180.9913.53q34.46(o)72.74d190.9019.45q44.29(o)73.91d202.5535.96d54.86(m)70.62d211.2112.62q61.71(d,/=6.2他)18.51q224.3173.23dRhamnoseII231.8133.7811。102.01d241.7536.95t24.65(m)72.29d251.6728.94d34.50(m)72.78d260.9523.06q44.19(o)74.03d270.9523.11q54.32(o)69.84d61.65(d,J-6.2Hz)18.66q化合物(2):26-0-e-D-妣喃葡萄糖基-(25S)-呋甾-5，20(22)-二烯-3P，26-二醇-3-0-a-L-吡喃鼠李糖基-(1—2)-[a-L-吡喃鼠李糖基-(1—6)]-PD_吡喃葡萄糖苷(2)無(wú)定形固體，Liebermann-Burchard反應(yīng)呈藍(lán)綠色，Molish反應(yīng)呈紫色，Ehrlich試劑反應(yīng)呈紅色？H-NMR和"C-NMR譜顯示甾體皂苷類化合物的特征，推測(cè)化合物(2)為呋甾皂苷類化合物。HR-ESIMS顯示準(zhǔn)分子離子峰m/z1029.5331[M_H]—，結(jié)合13C_NMR數(shù)據(jù)推測(cè)分子式為C51H82021(計(jì)算值C51H81021相對(duì)分子質(zhì)量1029.5270)。力-NMR譜示有甲基質(zhì)子信號(hào)S0.72(3H，s)，0.92(3H，s)，1.05(3H，d，J=6.6Hz)，1.64(3H，s)，與氧相連的次甲基質(zhì)子信號(hào)S3.97(lH，m)，4.81(1H，m)與氧相連的偕質(zhì)子信號(hào)S3.50(1H，dd，J=9.4，7.0Hz)和4.07(1H，dd，J=9.0，6.0Hz)。13C_NMR示有51個(gè)碳信號(hào)，其中27個(gè)甾體母核碳信號(hào)，結(jié)合HMQC譜推測(cè)結(jié)構(gòu)中含有4個(gè)CH3，10個(gè)CH2(其中1個(gè)與氧相連S75.25)，8個(gè)CH(其中2個(gè)與氧相連S78.49，84.53，1個(gè)烯碳S121.67)，5個(gè)季碳(其中3個(gè)烯碳S103.54，141.08，152.52)。NMR譜示有5，20(22)-二烯-呋甾皂苷元的典型特征Sl.64(3H，s，H-21)質(zhì)子信號(hào)，S103.54(C-20)，121.67(C-6)，141.08(C-5)，152.52(C-22)碳信號(hào)[YokosukaA，etal.JNatProd，2002，65:1293-1298.]。H2_26諧質(zhì)子的化學(xué)位移差值Sa-Sb=0.57，推測(cè)25S構(gòu)型，而25R構(gòu)型化學(xué)位移差值Sa-Sb<0.48[AgrawalPK.Steroids,2005，70:715-724.]，"C-NMR譜示有S33.77(C-25)，75.25(C-26)和17.21(C_27)碳信號(hào)進(jìn)一步證實(shí)25S構(gòu)型[YokosukaA，etal.JNatProd，2002，65:1293-1298.;DongM，etal.Tetrahedron,2001，74:501-506.]。綜合解析以上數(shù)據(jù)并和文獻(xiàn)對(duì)照[YokosukaA，etal.JNatProd，2002，65:1293-1298.]，鑒定化合物(2)苷元為(25S)-呋甾-5，20(22)-二烯-3P，26-二醇。力-NMR示有四個(gè)糖端基質(zhì)子信號(hào)S4.84(1H，d，J=7.8Hz)，4.91(1H，d，J=7.8Hz)，5.37(1H，brs)和5.65(lH，brs)，兩個(gè)鼠李糖特征甲基質(zhì)子信號(hào)Sl.67(3H，d，J=6.2Hz)和1.71(3H，d，J=6.2Hz);13C_NMR示有四個(gè)糖端基碳信號(hào)S101.99，102.80，102.88和105.19，兩個(gè)鼠李糖特征甲基碳信號(hào)S18.50和18.67。化合物(2)經(jīng)酸水解后HPLC法鑒定結(jié)構(gòu)中存在D-葡萄糖和L-鼠李糖[GuoHZ，etal.Phytochemistry，2004，65:481-484.],H-NMR顯示葡萄糖端基質(zhì)子偶和常數(shù)J=7.8Hz推測(cè)葡萄糖為P構(gòu)型，"C-NMR顯示鼠李糖C-5位化學(xué)位移分別為S69.83和70.61推測(cè)鼠李糖為a構(gòu)型[Shao8B，etal.Phytochemistry，2007，68:623-630.]。綜合解析'H-NMR，13C_NMR，HMQC，HMBC譜并和文獻(xiàn)對(duì)照，化合物(2)糖部分?jǐn)?shù)據(jù)與RiparosideA相同[LiJ，etal.ChemPharmBull,2006，10:1451-1454.]。HMBC譜顯示葡萄糖端基質(zhì)子S4.84與苷元26位碳S75.25遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)，推測(cè)結(jié)構(gòu)中存在26-0-!3-D-吡喃葡萄糖基。HMBC譜顯示葡萄糖端基質(zhì)子S4.91與苷元3位碳S78.49，鼠李糖端基質(zhì)子S5.37與葡萄糖6位碳S67.08，鼠李糖端基質(zhì)子S5.65與葡萄糖2位碳S79.50遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)，推測(cè)結(jié)構(gòu)中存在3-0-a-L鼠李糖-(l—2)-[a-L-鼠李糖-(l—6)]-e-D-吡喃葡萄糖基。綜合分析以上數(shù)據(jù)，鑒定化合物(2)為26-0-P-D-吡喃葡萄糖-(25S)-呋甾-5，20(22)-二烯-3|3，26-二醇-3-0-a-L-吡喃鼠李糖基-(1—2)-[a-L-吡喃鼠李糖基-(1—6)]-P_D_吡喃葡萄糖苷。該化合物未見文獻(xiàn)報(bào)道。力-NMR和"C-NMR數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)見表2。表2化合物(2)^-NMR和13C_NMR數(shù)據(jù)(C5D5N)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(3)無(wú)定形固體，Liebermann-Burchard反應(yīng)呈藍(lán)綠色，Molish反應(yīng)呈紫色，Ehrlich試劑反應(yīng)呈紅色？H-NMR和"C-NMR譜顯示甾體皂苷類化合物的特征，推測(cè)化合物(3)為呋甾皂苷類化合物。HR-ESIMS顯示準(zhǔn)分子離子峰m/z1031.5412[M_H]—，結(jié)合13C_NMR和DEPT數(shù)據(jù)推測(cè)分子式為C51H84021(計(jì)算值C51H83021相對(duì)分子質(zhì)量1031.5427)。力-NMR譜示有甲基質(zhì)子信號(hào)S0.70(3H，s)，0.71(3H，s)，1.06(3H，d，J=6.7Hz)，1.65(3H，s)，與氧相連的次甲基質(zhì)子信號(hào)S3.97(1H，m)，4.81(lH，m)，與氧相連的偕質(zhì)子信號(hào)S3.52(1H，dd，J=9.5，6.9Hz)和4.09(1H，dd，J=9.4，5.8Hz)。13C_NMR示有51個(gè)碳信號(hào)，其中27個(gè)甾體母核碳信號(hào)，結(jié)合DEPT和HMQC譜推測(cè)結(jié)構(gòu)中含有4個(gè)CH3，11個(gè)CH2(其中1個(gè)與氧相連S75.37)，8個(gè)CH(其中2個(gè)與氧相連S78.03，84.67)，4個(gè)季碳(其中2個(gè)烯碳S103.77，152.53。NMR譜示有20(22)-烯-呋甾皂苷元的典型特征Sl.65(3H，s，H-21)質(zhì)子信號(hào)，S103.77(C-20)，152.53(C-22)碳信號(hào)[YokosukaA，etal.JNatProd，2002，65:1293-1298.]。H2-26諧質(zhì)子的化學(xué)位移差值Sa-Sb=0.57，推測(cè)25S構(gòu)型，而25R構(gòu)型化學(xué)位移差值Sa-Sb<0.48[AgrawalPK.Steroids,2005，70:715-724.]，13C_NMR譜示有S33.83(C-25)，75.37(C-26)和17.32(C-27)碳信號(hào)進(jìn)一步證實(shí)25S構(gòu)型[OleszekW，etal.JAgricFoodChem，2001，49:4392-4396.;BedirE，etal.JNatProd，2000，63:1699-1701.]。"C-NMR譜示有S44.79(C_5)，54.47(C_9)和12.44(C-19)碳信號(hào)，推測(cè)A/B環(huán)trans構(gòu)型，5a-呋甾皂苷[WooMH，etal.JNatProd，1992，55:1129—1135.;SautourM，etal.JNatProd，2005，68:1489-1493.]。N0ESY譜顯示5_H/9_H，5_H/14_H，9_H/14_H，11-H/19-H3，11-H/18-H3，16-H/17-H相關(guān)信號(hào)，推測(cè)A/B環(huán)trans，B/C禾PC/D環(huán)trans，D/E環(huán)cis構(gòu)型。綜合解析以上數(shù)據(jù)并和文獻(xiàn)[YokosukaA，etal.JNatProd，2002，65:1293-1298.]對(duì)照，鑒定化合物(3)苷元為25(S)-5a-呋甾-20(22)-烯-3P，26-二醇。力-NMR示有四個(gè)糖端基質(zhì)子信號(hào)S4.84(1H，d，J=7.7Hz)，4.94(1H，d，J=7.8Hz)，5.40(1H，d，J=0.8Hz)和5.64(1H，brs)，兩個(gè)鼠李糖特征甲基質(zhì)子信號(hào)S1.67(3H，d，J=6.2Hz)和1.71(3H，d，J=6.2Hz);13C_NMR示有四個(gè)糖端基碳信號(hào)S102.19，102.32，102.94和105.21，兩個(gè)鼠李糖特征甲基碳信號(hào)S18.58和18.76。10化合物(3)經(jīng)酸水解后HPLC法鑒定結(jié)構(gòu)中存在D-葡萄糖和L-鼠李糖[GuoHZ，etal.Phytochemistry，2004，65:481-484.],H-NMR顯示葡萄糖端基質(zhì)子偶和常數(shù)J=7.7和J=7.8Hz推測(cè)葡萄糖為13構(gòu)型,C-NMR顯示鼠李糖C_5位化學(xué)位移分別為S69.92和70.72推測(cè)鼠李糖為a構(gòu)型[ShaoB，etal.Phytochemistry,2007，68:623-630.]。綜合解析^-NMR,C-NMR，DEPT，HMQC，HMBC譜并和文獻(xiàn)對(duì)照，化合物(3)糖部分?jǐn)?shù)據(jù)與RiparosideA相同[LiJ，etal.ChemPharmBull，2006，10:1451-1454.]。HMBC譜顯示葡萄糖端基質(zhì)子S4.84與苷元26位碳S75.37遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)，推測(cè)結(jié)構(gòu)中存在26-0-P_D_吡喃葡萄糖基。HMBC譜顯示葡萄糖端基質(zhì)子S4.94與苷元3位碳S78.03，鼠李糖端基質(zhì)子S5.40與葡萄糖6位碳S67.42，鼠李糖端基質(zhì)子S5.64與葡萄糖2位碳S79.71遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)，推測(cè)結(jié)構(gòu)中存在3-0-a-L鼠李糖-(l—2)-[a_L-鼠李糖-(l—6)]-|3_D_吡喃葡萄糖基。綜合分析以上數(shù)據(jù)，鑒定化合物(3)為26-0-P-D-吡喃葡萄糖-(25S)-5a-呋甾-20(22)-烯_3|3，26-二醇-3-0-a-L-吡喃鼠李糖基-(l—2)-[a_L_吡喃鼠李糖基-(1—6)]-e-D-吡喃葡萄糖苷。該化合物未見文獻(xiàn)報(bào)道。力-NMR和"C-NMR數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)如表3。表3化合物(3)^-NMR和13C_NMR數(shù)據(jù)(C5D5N)NO.sHscNo.sHsc10.92，1.5937.36126-O-Glucose21.65,2.1230.20114.84(d,h7,8Hz)105.21d33.9770,03d24.04(t'〉8.2Hz)75.31d41.41，1.8535.10134.26(o)78.68d51.0144.79d44.22(o)71.91d61.16，1.2129.12t53.93(o)78.52d70.83，1,5432.68t64.39(o)，4.56(o)63.01181.3535.15d3-O-Glucose90.5454.47d14.94(d，/=7.8Hz)102.32d10-35.96s24.13(t，J-9.4Hz)79.71d111.22，1.4221,58133.96(o)75.45d121.12,1.7140.05t43.91(o)75.53d13-43.88s54.22(o)76.85d140.8254.88d64.00(o)，4.37(o)67.42t151.46，2.1134.52tRh咖加seI164.8184.67d15.64(1H,brs)102.94d172.4564.79d24.66(brd，/=1.5Hz)72.63d180.7114.56q34.55(o)72.82d190.7012.44q44.32(o)73.95d20-103.77s54.88(m)70.72d211.6511.91q61.71(d，J-6,2Hz)18.58q22-152.53sRhamnoseII232.20，2.2723.77115.40(d,J-0.8Hz)102.19d241,48，1.8731,54124.60(brd，hl.8Hz)72.38d251.9733.83d34.49(m)72.82d263.52,4.0975.37t44.24(o)74.08d271.0617,32q4.34(o)69.92d61.67(d，J-6.2Hz)18.76q化合物(4):新替告皂苷元3-0-a-L-吡喃鼠李糖基-(1—2)-[a-L-吡喃鼠李糖基_(1—6)]-13-D-吡喃葡萄糖苷11白色粉末，Liebermann-Burchard反應(yīng)呈藍(lán)綠色，Molish反應(yīng)呈紫色，Ehrlich試劑反應(yīng)呈陰性？H-NMR和"C-NMR譜顯示甾體皂苷類化合物的特征，推測(cè)化合物(4)為螺甾皂苷類化合物。HR-ESIMS顯示準(zhǔn)分子離子峰m/z869.4877[M-H]—，結(jié)合13C_NMR數(shù)據(jù)推測(cè)分子式為C45H74016(計(jì)算值C45H73016相對(duì)分子質(zhì)量869.4899)。力-NMR譜示有甲基質(zhì)子信號(hào)S0.67(3H，s)，0.82(3H，s)，1.09(3H，d，J=7.2Hz)，1.20(3H，d，J=7.1Hz)。13C_NMR譜示有45個(gè)碳信號(hào)，其中27個(gè)甾體母核碳信號(hào)，結(jié)合HMQC譜推測(cè)結(jié)構(gòu)中含有4個(gè)CH3，11個(gè)CH2，9個(gè)CH(其中2個(gè)與氧相連S77.87，81.27)，3個(gè)季碳。"C-NMR譜示有S16.36(027)碳信號(hào)，推測(cè)25S構(gòu)型，而25R構(gòu)型S17.06(C-27)[SautourM，etal.JNatProd，2005，68:1489-1493.;SautourM，etal.PlantaMed，2006，72:667-670.]。13C_NMR譜示有S44.68(C-5)，54.44(C-9)和12.35(C-19)碳信號(hào)，推測(cè)A/B環(huán)trans構(gòu)型，5a-螺甾皂苷[RobosonVP，etal.Phytochemistry，1996，43:465-469.]。N0ESY譜顯示5-H/9-H，5-H/14-H，9-H/14-H，11-H/19_H3，11-H/18_H3，16—H/17—H相關(guān)信號(hào)，推測(cè)A/B環(huán)trans，B/C和C/D環(huán)trans，D/E環(huán)cis構(gòu)型。綜合以上數(shù)據(jù)并與文獻(xiàn)對(duì)照[RobosonVP，etal.Phytochemistry，1996，43:465-469.]，鑒定化合物(4)苷元為新替告皂苷元。^-NMR示有三個(gè)糖端基質(zhì)子信號(hào)S4.92(1H，d，J=7.8Hz)，5.38(1H，brs)和5.63(1H，brs)，兩個(gè)鼠李糖特征甲基質(zhì)子信號(hào)Sl.65(3H，d，J=6.2Hz)和1.70(3H，d，J=6.2Hz);13C-NMR示有三個(gè)糖端基碳信號(hào)S102.12，102.28和102.90，兩個(gè)鼠李糖特征甲基碳信號(hào)S18.51和18.69?；衔?4)經(jīng)酸水解后HPLC法鑒定結(jié)構(gòu)中存在D-葡萄糖和L-鼠李糖[GuoHZ，etal.Phytochemistry，2004，65:481-484.],H-NMR顯示葡萄糖端基質(zhì)子偶和常數(shù)J二7.8Hz推測(cè)葡萄糖為13構(gòu)型，"C-NMR顯示鼠李糖C-5位化學(xué)位移分別為S69.84和70.64推測(cè)鼠李糖為a構(gòu)型[ShaoB，etal.Phytochemistry，2007，68:623-630.]。綜合解析^-NMR，"C-NMR，HMQC，HMBC譜并和文獻(xiàn)對(duì)照，化合物(4)糖部分?jǐn)?shù)據(jù)與RiparosideA相同[LiJ，etal.ChemPharmBull,2006，10:1451-1454.]。HMBC譜顯示顯示葡萄糖端基質(zhì)子S4.92與苷元3位碳S77.87，鼠李糖端基質(zhì)子S5.38與葡萄糖612位碳S67.34，鼠李糖端基質(zhì)子S5.64與葡萄糖2位碳S79.68遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)，推測(cè)結(jié)構(gòu)中存在3-0-a-L鼠李糖-(l—2)_[a-L-鼠李糖-(l—6)]-|3_D_吡喃葡萄糖基。綜合分析以上數(shù)據(jù)，鑒定化合物(4)為新替告皂苷元3-0-a-L-吡喃鼠李糖基-(1—2)-[a-L-吡喃鼠李糖基-(l—6)]-|3-D-吡喃葡萄糖苷。該化合物未見文獻(xiàn)報(bào)道。力-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)如表4。表4化合物(4)^-NMR和13C_NMR數(shù)據(jù)(C5D5N)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>本發(fā)明的牛尾菜甾體皂苷提取物在制備預(yù)防和/或治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎產(chǎn)品中的用途。本發(fā)明采用注射弗氏完全佐劑建立實(shí)驗(yàn)性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型，該模型是評(píng)價(jià)抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物對(duì)免疫性炎癥作用的經(jīng)典模型，當(dāng)大鼠足趾內(nèi)注射弗氏完全佐劑致敏后，其病變分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種原發(fā)性病變主要表現(xiàn)為早期致炎局部的炎癥反應(yīng)，致炎后18h右足腫脹達(dá)峰值，持續(xù)3d后逐漸減輕；繼發(fā)性病變出現(xiàn)于致炎后15d左右，表現(xiàn)為對(duì)側(cè)(左后肢)和前肢腳的腫脹，耳和尾部出現(xiàn)"關(guān)節(jié)炎"小結(jié)，變應(yīng)性角膜翳以及體重下降等。細(xì)胞因子是一組由機(jī)體免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞合成、分泌產(chǎn)生的小分子物質(zhì)，具有多種生物學(xué)功能。與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎密切相關(guān)的細(xì)胞因子大部分由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和T細(xì)胞分泌，其中TNF-a、IL-l、IL-6為致病因子，IL-10、IL-4為保護(hù)因子。采用佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型研究牛尾菜甾體皂苷提取物對(duì)繼發(fā)性炎癥的作用，結(jié)果表明，牛尾菜甾體皂苷提取物800mg*kg—1和400mg*kg—1劑量組對(duì)佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠繼發(fā)性炎癥有明顯抑制作用，所給藥劑量范圍內(nèi)有明顯量效關(guān)系，可明顯降低血清中TNF-a、IL-IP和IL-6含量。角叉菜膠性大鼠足腫脹模型是一個(gè)常用于評(píng)價(jià)藥物抗炎作用的經(jīng)典的急性炎癥模型，當(dāng)給大鼠足跖內(nèi)注射角叉菜膠時(shí)能使大鼠局部毛細(xì)血管擴(kuò)張、血管通透性增高、滲出、水腫等一系列類似于人體急性炎癥的反應(yīng)。采用角叉菜膠性大鼠足腫脹模型研究牛尾菜甾體皂苷提取物對(duì)急性炎癥的作用，結(jié)果表明，牛尾菜甾體皂苷提取物800mgkg—1和400mgkg一1劑量組對(duì)角叉菜膠性足腫脹大鼠急性炎癥有明顯抑制作用，所給藥劑量范圍內(nèi)有明顯量效關(guān)系。醋酸扭體法小鼠模型和熱板法小鼠模型是常用的鎮(zhèn)痛藥篩選模型，操作簡(jiǎn)便、便于觀察、效果明顯，其優(yōu)點(diǎn)是剌激部位和剌激性質(zhì)的特異性較強(qiáng)。舔后足反射和扭體反射是小鼠受到傷害性剌激時(shí)發(fā)生的一種反應(yīng)，表現(xiàn)為受到熱的剌激造成疼痛，小鼠會(huì)表現(xiàn)舔后足的反應(yīng)。腹腔受到醋酸的剌激造成疼痛，小鼠會(huì)表現(xiàn)收縮腹部，伸展后肢，抬高臀部等扭體反應(yīng)，此類反射的初級(jí)中樞位于脊髓，反射弧較簡(jiǎn)單，剌激與反應(yīng)之間的對(duì)應(yīng)性好。因此，常作為反映大鼠肢體存在傷害性感受的客觀指標(biāo)，采用醋酸扭體法小鼠模型和熱板法小鼠模型研究牛尾菜甾體皂苷提取物鎮(zhèn)痛作用，結(jié)果表明，牛尾菜甾體皂苷提取物lOOOmgkg—1和500mgkg—1劑量組對(duì)醋酸所致小鼠疼痛反應(yīng)有明顯抑制作用，其中1000mg*kg—1劑量組作用強(qiáng)于阿司匹林組lOOmgkg—、所給藥劑量范圍內(nèi)有明顯量效關(guān)系，對(duì)熱板所致小鼠疼痛反應(yīng)同樣有明顯抑制作用。福爾馬林大鼠模型是一個(gè)較好的慢性疼痛模型，當(dāng)皮下注射福爾馬林立即引致C纖維自發(fā)活動(dòng)劇增，經(jīng)快速的單突出遞質(zhì)傳遞到脊髓投射神經(jīng)元，并繼以第二相傳入爆發(fā)，反映為廣動(dòng)力背角神經(jīng)元激活，引發(fā)疼痛。此外持續(xù)的C纖維剌激使廣動(dòng)力細(xì)胞對(duì)C纖維傳入表現(xiàn)出過(guò)強(qiáng)的放電，誘發(fā)中樞神經(jīng)痛覺易化狀態(tài)。其疼痛特點(diǎn)是疼痛分兩個(gè)時(shí)相，I相是由于直接剌激外周神經(jīng)末稍所致，II相則主要為炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生釋放引起，采用福爾馬林大鼠模型研究牛尾菜甾體皂苷提取物鎮(zhèn)痛作用，結(jié)果表明，牛尾菜甾體皂苷提取物800mgkg—、400mgkg—1和200mgkg—1劑量組對(duì)福爾馬林所致大鼠疼痛反應(yīng)的第一時(shí)相和第二時(shí)相均有明顯抑制作用。疼痛和炎癥是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的兩大主要癥狀，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明牛尾菜甾體皂苷提取物對(duì)免疫病理性炎癥及非特異性炎癥具有明顯的抑制作用，同時(shí)具有明顯的鎮(zhèn)痛作用。上述結(jié)果表明牛尾菜甾體皂苷提取物可用于制備預(yù)防和/或治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎產(chǎn)品，也可以含有牛尾菜甾體皂苷提取物的藥物組合物制備預(yù)防和/或治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎產(chǎn)品中。本發(fā)明牛尾菜甾體皂苷提取物的制備方法工藝簡(jiǎn)單，操作方便，技術(shù)易掌握，能耗小，溶劑可回收循環(huán)使用，生產(chǎn)成本低。本發(fā)明牛尾菜甾體皂苷提取物的制備方法優(yōu)點(diǎn)為其中甾體皂苷重量百分含量為5095%，含有4種新化合物的一種或多種，這是以前技術(shù)尚未報(bào)道的，由于含量高，從而提高了療效，滿足制備預(yù)防和/或治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎產(chǎn)品的需要。本發(fā)明還提供用本發(fā)明的牛尾菜甾體皂苷提取物以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑制備的藥物制劑。這些藥物制劑選自以下劑型片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、泡騰片劑、舌下片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、微囊劑、微球劑、顆粒劑、丸劑、滴丸劑、散劑、膏劑、口服液、混懸劑、溶液劑、氣霧劑、注射劑，注射乳劑、凍干粉針，還可以根據(jù)需要制備成緩釋或控釋制劑。本發(fā)明的含有牛尾菜甾體皂苷提取物的藥物制劑，在制備藥物制劑時(shí)可加入藥物可接受的載體，所述藥物可接受的載體來(lái)自抗氧劑、鏊合劑、表面活性劑、填充劑、崩解劑、濕潤(rùn)劑、溶劑、緩釋材料、腸溶材料、PH調(diào)節(jié)劑、矯味劑、色素等，常用載體如甘露糖醇、右旋糖苷、乳糖、葡萄糖、山梨醇、木糖醇、注射用水、注射用乙醇、氯化鈉、硅衍生物、纖維素、纖維素衍生物、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐溫80、瓊脂、碳酸鈣、聚乙二醇、環(huán)糊精、磷脂類材料、滑石粉、硬脂酸鎂、硬脂酸f丐等。以下通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，并非對(duì)本發(fā)明的限定，依照本領(lǐng)域公知的現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的實(shí)施方式并不限于具體實(shí)施例。具體實(shí)施方式實(shí)施例1取牛尾菜根和根莖粗粉20Kg，加8倍量水回流提取3次，每次2小時(shí)，濾過(guò)，提取液合并，減壓回收乙醇得提取物。取提取物加水溶解，加于HPD100大孔吸附樹脂柱上，用水洗脫至洗脫液近無(wú)色，棄去洗脫液，用10%乙醇洗脫至洗脫液近無(wú)色，棄去洗脫液，用90%乙醇洗脫至洗脫液近無(wú)色，收集洗脫液，90%乙醇洗脫液加于D941脫色樹脂柱上，用6倍柱體積90X乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮、干燥得牛尾菜甾體皂苷提取物215g，其中甾體皂苷含量52%。實(shí)施例2取牛尾菜根和根莖粗粉20Kg，加8倍量30%乙醇回流提取3次，每次2小時(shí)，濾過(guò)，提取液合并，減壓回收乙醇得提取物。取提取物加水溶解，加于HPD300大孔吸附樹脂柱上，用水洗脫至洗脫液近無(wú)色，棄去洗脫液，用50%乙醇洗脫至洗脫液近無(wú)色，棄去洗脫液，用90%乙醇洗脫至洗脫液近無(wú)色，收集洗脫液，90%乙醇洗脫液加于0941脫色樹脂柱上，用6倍柱體積90%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮、干燥得牛尾菜甾體皂苷提取物72g，其中甾體皂苷含量95%。實(shí)施例3取牛尾菜根和根莖粗粉20Kg，加8倍量50%乙醇回流提取3次，每次2小時(shí)，濾過(guò)，提取液合并，減壓回收乙醇得提取物。取提取物加水溶解，加于HPD400大孔吸附樹脂柱上，用水洗脫至洗脫液近無(wú)色，棄去洗脫液，用30%乙醇洗脫至洗脫液近無(wú)色，棄去洗脫液，用70%乙醇洗脫至洗脫液近無(wú)色，收集洗脫液，70%乙醇洗脫液加于D941脫色樹脂柱上，用6倍柱體積90%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮、干燥得牛尾菜甾體皂苷提取物136g，其中甾體皂苷含量88%。實(shí)施例4取牛尾菜根和根莖粗粉20Kg，加8倍量70%乙醇回流提取3次，每次2小時(shí)，濾過(guò)，提取液合并，減壓回收乙醇得提取物。取提取物加水溶解，加于DIOI大孔吸附樹脂柱上，用水洗脫至洗脫液近無(wú)色，棄去洗脫液，用30%乙醇洗脫至洗脫液近無(wú)色，棄去洗脫液，用70%乙醇洗脫至洗脫液近無(wú)色，收集洗脫液，70%乙醇洗脫液加于D941脫色樹脂柱上，用6倍柱體積90%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮、干燥得牛尾菜甾體皂苷提取物124g，其中甾體皂苷含量84%。實(shí)施例5取牛尾菜根和根莖粗粉20Kg，加8倍量90%乙醇回流提取3次，每次2小時(shí)，濾過(guò)，提取液合并，減壓回收乙醇得提取物。取提取物加水溶解，加于DIOI大孔吸附樹脂柱上，用水洗脫至洗脫液近無(wú)色，棄去洗脫液，用10%乙醇洗脫至洗脫液近無(wú)色，棄去洗脫液，用60%乙醇洗脫至洗脫液近無(wú)色，收集洗脫液，60%乙醇洗脫液加于0941脫色樹脂柱上，用6倍柱體積90%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮、干燥得牛尾菜甾體皂苷提取物166g，其中甾體皂苷含量73%。實(shí)施例6取牛尾菜根和根莖粗粉20Kg，加8倍量90%乙醇回流提取3次，每次2小時(shí)，濾過(guò)，提取液合并，減壓回收乙醇得提取物。取提取物加水溶解，加于DIOI大孔吸附樹脂柱上，用水洗脫至洗脫液近無(wú)色，棄去洗脫液，用30%乙醇洗脫至洗脫液近無(wú)色，棄去洗脫液，用80%乙醇洗脫至洗脫液近無(wú)色，收集洗脫液，80%乙醇洗脫液加于D941脫色樹脂柱上，用6倍柱體積90%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮、干燥得牛尾菜甾體皂苷提取物159g，其中甾體皂苷含量69%。實(shí)施例7牛尾菜甾體皂苷提取物用藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑制備的藥物制劑。這些藥物制劑選自以下劑型片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、泡騰片劑、舌下片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、微囊劑、微球劑、顆粒劑、丸劑、滴丸劑、散劑、膏劑、口服液、混懸劑、溶液劑、氣霧劑、注射劑，注射乳劑、凍干粉針，還可以根據(jù)需要制備成緩釋或控釋制劑，在制備藥物制劑時(shí)可加入藥物可接受的載體，所述藥物可接受的載體來(lái)自抗氧劑、鏊合劑、表面活性劑、填充劑、崩解劑、濕潤(rùn)劑、溶劑、緩釋材料、腸溶材料、pH調(diào)節(jié)劑、矯味劑、色素等，常用載體如甘露糖醇、右旋糖苷、乳糖、葡萄糖、山梨醇、木糖醇、注射用水、注射用乙醇、氯化鈉、硅衍生物、纖維素、纖維素衍生物、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐溫80、瓊脂、碳酸鈣、聚乙二醇、環(huán)糊精、磷脂類材料、滑石粉、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣。上述制備工藝均為本領(lǐng)域常規(guī)操作，在此不加贅述。實(shí)施例8牛尾菜甾體皂苷提取物為原料制得的藥物制劑不僅包括單獨(dú)使用牛尾菜甾體皂苷提取物的藥物制劑，還包括添加牛尾菜甾體皂苷提取物作為活性成分的藥物制劑。實(shí)施例9牛尾菜甾體皂苷提取物對(duì)佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠足腫脹的影響取雄性大鼠48只，其中40只大鼠右后足跖皮下注射弗氏完全佐劑(每毫升液體石蠟含8mgH37RV人型結(jié)核菌)100iiL致敏，正常對(duì)照組8只給予100yL液體石蠟，13d后致敏大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組，雷公藤多苷組(25mgkg—"，牛尾菜甾體皂苷提取物高劑量組(800mgkg-1)，中劑量組(400mgkg-1)和低劑量組(200mgkg-1)。各組動(dòng)物致敏后13d-24d每天ig給藥l次，對(duì)照組給予同體積蒸餾水(10mL*kg—0。分別于致敏后第18d、21d和24d測(cè)量大鼠右后足跖部周徑，計(jì)算大鼠右后足跖在不同時(shí)間內(nèi)的足跖腫脹度，足跖腫脹度=致炎后足跖周徑_致炎前足跖周徑，結(jié)果見表5。表5牛尾菜甾體皂苷提取物對(duì)佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠足腫脹的影響16組另IJ劑量(mg'kg-1)一上fLAn致敏后不同時(shí)間足腫脹程度(mm，iiSE)動(dòng)物18d21d24d模型對(duì)照組-86.6±0.868.5±1.2411.0±0.98雷公藤多苷2582.4±0.53**3.4±0.94**4.8±1.03**牛尾菜80085.1±0.855.0士0.82'6,9±1.06*甾體皂苷40084.8±0.595.6±0.658.0士0.82'提取物20084.8±0.776.2±0.779.4±0.82與模型對(duì)照組比較*P<0.05**P<0.01結(jié)果表明，牛尾菜甾體皂苷提取物800mgkg—1和400mgkg—1劑量組對(duì)佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠繼發(fā)性炎癥有明顯抑制作用，所給藥劑量范圍內(nèi)有明顯量效關(guān)系。實(shí)施例10牛尾菜甾體皂苷提取物對(duì)佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠炎性細(xì)胞因子的影響致敏后24d腹腔注射3%水合氯醛300mgkg—1麻醉，腹主動(dòng)脈采血，離心5min(3000rpm)分離血清。采用ELISA試劑盒分別測(cè)定TNF-a、IL_1P和IL-6含量，結(jié)果見表6。表6牛尾菜甾體皂苷提取物對(duì)佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠血清TNF-a、IL_1P和IL_6的影響組另IJ劑量(mg.kg-1)TNF-aIL-ipIL-6動(dòng)物Pgml/1PgmL-1Pg.mL1正常對(duì)照組-823.8±0.4538.1±0.5541.7士3.74模型對(duì)照組-825.7士0.58#50.3±4.36#57.5±4.63#雷公藤多苷25823.6±0.40**38.4±0.72*43.1士2.92'牛尾菜800823.7±0.49*38.1土0.79'39.6±2.29"甾體皂苷400824.0士0.54'39.9±0.95'48.5±7.41提取物200824.2±0.4541.2±0.8356.5±3.55與模型對(duì)照組比較*P<0.05**P<0.01;與正常對(duì)照組比較#P<0.05(^bSE)[OOSS]結(jié)果表明，牛尾菜甾體皂苷提取物800mgkg—1和400mgkg—1劑量組可明顯降低佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠血清中TNF-a、IL-113和IL-6含量。實(shí)施例11牛尾菜甾體皂苷提取物對(duì)角叉菜膠性大鼠足腫脹的影響取雄性大鼠50只，隨機(jī)分成模型對(duì)照組，布洛芬組(80mgkg—"，牛尾菜甾體皂苷提取物高劑量組(800mgkg—1)，中劑量組(400mgkg—1)和低劑量組(200mgkg—1)。每天ig給藥1次，連續(xù)6d，對(duì)照組給予同體積蒸餾水(lOmLkg—1)。各組動(dòng)物末次給藥lh后，右后足跖皮下注射無(wú)菌的1%角叉菜膠100yL致炎。分別于致炎后2h、3h和4h測(cè)量大鼠右后足跖部周徑，計(jì)算大鼠右后足跖在不同時(shí)間內(nèi)的腫脹度，足跖腫脹度=致炎后足跖周徑_致炎前足跖周徑，結(jié)果見表7。表7牛尾菜乙醇提取物對(duì)角叉菜膠性大鼠足腫脹的影響組別劑量(mg.kg-1)動(dòng)物致炎后不同時(shí)間足腫脹程度(mna±SE)2h3h4h模型對(duì)照組布洛芬組牛尾菜甾體皂苷提取物80800400200101010101016.8±0.747.9±0.87*12.7±1.03*14.5±0.72*15.4±0.9017.8±0.889.5士0.73'13.7±0.78*15.2±0.87*17.3±0.5418.5±0.8611.9±0.74*15.6±0.65*17.2±0.7418.6±0.50與模型對(duì)照組比較*P<0.05**P<0.01結(jié)果表明，牛尾菜乙醇提取物800mgkg—1和400mgkg—1劑量組對(duì)角叉菜膠性足腫脹大鼠急性炎癥有明顯抑制作用，所給藥劑量范圍內(nèi)有明顯量效關(guān)系。實(shí)施例12牛尾菜甾體皂苷提取物對(duì)醋酸所致小鼠疼痛反應(yīng)的影響取雄性小鼠70只，隨機(jī)分成模型對(duì)照組，阿司匹林組(lOOmgkg—1)，牛尾菜甾體皂苷提取物高劑量組(lOOOmgkg-1)，中劑量組(500mgkg-1)和低劑量組(250mgkg-1)，每天ig給藥1次，連續(xù)6d，對(duì)照組給予同體積蒸餾水(10mLkg—1)。各組動(dòng)物末次給藥后lh，腹腔注射0.8%的冰醋酸溶液0.3mL，注射醋酸后5min開始記錄10min內(nèi)小鼠的扭體次數(shù)，以腹部收縮、伸展后肢與軀干、臀部抬高為扭體反應(yīng)陽(yáng)性，結(jié)果見表8。表8牛尾菜甾體皂苷提取物對(duì)醋酸所致小鼠疼痛反應(yīng)的影響組別劑量(mg.kg-1)動(dòng)物模型對(duì)照組-14阿司匹林組10014牛尾菜100014甾體皂苷50014提取物25014扭體次數(shù)18.1±1.4210.6±1.49*8.2±1.14*12.9±1.94*14.7±1.71與模型對(duì)照組比較*P<0.05**P<0.01.結(jié)果表明，牛尾菜甾體皂苷提取物lOOOmg*kg—1和500mg*kg—1劑量組對(duì)醋酸所致小鼠疼痛反應(yīng)有明顯抑制作用，其中l(wèi)OOOmgkg—1劑量組作用強(qiáng)于阿司匹林lOOmgkg—1,所給藥劑量范圍內(nèi)有明顯量效關(guān)系。實(shí)施例13牛尾菜甾體皂苷提取物對(duì)熱板所致小鼠疼痛反應(yīng)的影響取雌性小鼠，預(yù)先進(jìn)行痛閾值篩選，取痛閾值在5-30s小鼠70只，兼顧體重與痛閾值隨機(jī)分成模型對(duì)照組，鹽酸嗎啡組(5mgkg—"，牛尾菜甾體皂苷提取物高劑量組(lOOOmgkg—1)，中劑量組(500mgkg—1)和低劑量組(250mgkg—1)。每天ig給藥1次，連續(xù)6d，對(duì)照組給予同體積蒸餾水(10mLkg—1)。末次給藥后lh熱板儀(50±0.5°C)測(cè)定小鼠痛閾值，小鼠60s后仍無(wú)反應(yīng)，取出小鼠，以60s計(jì)算。每只小鼠測(cè)定2次痛閾值，取其均值作為投藥前的痛閾值，結(jié)果見表9。表9牛尾菜甾體皂苷提取物對(duì)熱板所致小鼠疼痛反應(yīng)的影響18<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>與模型對(duì)照組比較*P<0.05<0.01結(jié)果表明，牛尾菜甾體皂苷提取物1000mgkg—1和500mgkg—1劑量組對(duì)熱板所致小鼠疼痛反應(yīng)有明顯抑制作用。實(shí)施例14牛尾菜甾體皂苷提取物對(duì)福爾馬林所致大鼠疼痛反應(yīng)的影響取雄性大鼠48只，隨機(jī)分成模型對(duì)照組，鹽酸嗎啡組(5mgkg—1)，阿司匹林組(100mgkg-1)，牛尾菜甾體皂苷提取物高劑量組(800mgkg-1)，中劑量組(400mgkg-1)和低劑量組(200mgkg—0，各組動(dòng)物每天ig給藥1次，連續(xù)6d，對(duì)照組給予同體積蒸餾水(10mLkg—1)。各組動(dòng)物末次給藥后lh，右后足趾皮下注射2.0%的福爾馬林溶液100L，觀察注射后0-5min(第一時(shí)相)和15-30min(第二時(shí)相)大鼠的疼痛反應(yīng)(舔致炎足)累積時(shí)間，結(jié)果見表10。表10牛尾菜甾體皂苷提取物對(duì)福爾馬林所致大鼠疼痛反應(yīng)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>與模型對(duì)照組比較*P<0.05**P<0.01結(jié)果表明，牛尾菜甾體皂苷提取物800mgkg—1，400mgkg—1和200mgkg—1各劑量組對(duì)甲醛所致大鼠疼痛反應(yīng)的第一時(shí)相和第二時(shí)相均有明顯抑制作用，說(shuō)明其對(duì)中樞及外周疼痛均有明顯抑制作用。權(quán)利要求牛尾菜甾體皂苷提取物，其特征在于從牛尾菜根和根莖中提取，其中含有4種新化合物的一種或多種，4種新化合物是化合物(1)16-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(22S)-膽甾-5-烯-3β，16β，22-三醇-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷；化合物(2)26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(25S)-呋甾-5，20(22)-二烯-3β，26-二醇-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷；化合物(3)26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(25S)-5α-呋甾-20(22)-烯-3β，26-二醇-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷；化合物(4)新替告皂苷元3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛尾菜甾體皂苷提取物，其特征在于從牛尾菜根和根莖中提取，其中含有4種新化合物，4種新化合物是化合物(1):16-0-|3-D-吡喃葡萄糖基-(22S)-膽甾-5-烯-313，1613，22-三醇-3-0-a-L-吡喃鼠李糖基-(1—2)-[a-L-吡喃鼠李糖基-(1—6)]-P_D_吡喃葡萄糖苷；化合物(2):26-0-P-D-吡喃葡萄糖基-(25S)-呋甾-5，20(22)-二烯-3|3，26-二醇-3-0-a-L-吡喃鼠李糖基-(1—2)-[a-L-吡喃鼠李糖基-(1—6)]-P_D_吡喃葡萄糖苷；化合物(3):26-0-13-D-吡喃葡萄糖基_(25S)-5a-呋甾-20(22)-烯_3P，26-二醇-3-0-a-L-吡喃鼠李糖基-(1—2)-[a-L-吡喃鼠李糖基-(1—6)]-P_D_吡喃葡萄糖苷；化合物(4):新替告皂苷元3-0-a-L-妣喃鼠李糖基-(1—2)-[a-L-妣喃鼠李糖基-(1—e)]-e-D-吡喃葡萄糖苷。3.權(quán)利要求12所述的牛尾菜甾體皂苷提取物，其特征在于其中甾體皂苷重量百分含量為5095%。4.權(quán)利要求13所述的牛尾菜甾體皂苷提取物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟a)牛尾菜粗粉用第一溶劑回流提取，濾過(guò)，提取液合并，提取液減壓濃縮；b)將步驟a)獲得的提取物加水溶解，經(jīng)大孔吸附樹脂柱色譜，用水洗脫至洗脫液近無(wú)色，棄去洗脫液；c)用第二溶劑洗脫至洗脫液近無(wú)色，棄去洗脫液；d)用第三溶劑洗脫至洗脫液近無(wú)色，收集洗脫液；e)將步驟d)獲得的洗脫液，經(jīng)脫色樹脂柱D941色譜，用第四溶劑洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮、干燥得牛尾菜留體皂苷提取物。在以上步驟中，其中步驟a)的第一溶劑為0100X乙醇水溶液；步驟b)大孔吸附樹脂包括非極性或弱極性大孔吸附樹脂。步驟c)的第二溶劑為1050%乙醇水溶液，步驟d)的第三溶劑為6090X乙醇水溶液，步驟e)的第四溶劑為90%乙醇水溶液。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的牛尾菜甾體皂苷提取物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟a)牛尾菜粗粉加5070%乙醇回流提取，濾過(guò)，提取液合并，減壓回收乙醇；b)將步驟a)獲得的提取物加水溶解，經(jīng)大孔吸附樹脂柱D101色譜，用水洗脫至洗脫液近無(wú)色，棄去洗脫液；c)用30%乙醇洗脫至洗脫液近無(wú)色，棄去洗脫液；d)用70%乙醇洗脫至洗脫液近無(wú)色，收集洗脫液；e)將步驟d)獲得的洗脫液，經(jīng)脫色樹脂柱D941色譜，6倍柱體積90X乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮、干燥得牛尾菜留體皂苷提取物。6.權(quán)利要求13所述的牛尾菜甾體皂苷提取物在制備預(yù)防和/或治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎產(chǎn)品中的用途。7.含有權(quán)利要求13所述的牛尾菜甾體皂苷提取物的藥物組合物在制備預(yù)防和/或治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎產(chǎn)品中的用途。全文摘要本發(fā)明提供了一種牛尾菜甾體皂苷提取物及其制備方法和用途。牛尾菜根和根莖0～100％乙醇水溶液提取，大孔吸附樹脂法分離牛尾菜甾體皂苷，其中甾體皂苷重量百分含量為50～95％，含有4種新化合物的一種或多種。制得的牛尾菜甾體皂苷提取物經(jīng)藥理活性研究證明，具有抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用，可用于制備預(yù)防和/或治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎產(chǎn)品。文檔編號(hào)A61K31/704GK101787068SQ20101011509公開日2010年7月28日申請(qǐng)日期2010年3月1日優(yōu)先權(quán)日2010年3月1日發(fā)明者師海波,王威,董方言,馬恒申請(qǐng)人:吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院