專利名稱：甾體皂苷類化合物及其在制備抗腫瘤藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬中藥制藥領(lǐng)域，涉及小百部中的甾體皂苷及其在制備抗腫瘤藥物中的新用途。
背景技術(shù)：
抗腫瘤藥物研究多年來一直是世界藥學(xué)研究的熱點和重點。抗腫瘤化學(xué)藥物因毒副作用大，而使其臨床應(yīng)用受到很大限制，因此近年來從天然來源中尋找新的具有抗腫瘤活性的藥物受到人們越來越多的關(guān)注。國內(nèi)外的學(xué)者從包括海洋生物在內(nèi)的天然產(chǎn)物中分離得到大量的具有生物活性的單體化合物，為抗腫瘤藥物的研究與開發(fā)提供了廣闊的前景。百合科(Liliaceae)天門冬屬(Asparagus L.)植物作為藥用植物有著悠久的歷史，《神農(nóng)本草經(jīng)》將天門冬列為上品，其后歷代本草均有收載，現(xiàn)為常用中藥之一。本屬植物化學(xué)成分復(fù)雜，國內(nèi)外已報道的同屬其他植物中含有皂苷、多糖、黃酮以及氨基酸等成分，其中皂苷類為主要成分并具有多種生物活性，如抑菌抗病毒、抗炎、細胞毒、免疫促進等。
小百部為天門冬屬(Asparagus L.)植物(Asparagus filicinus Buell.-Ham)的干燥根，味甘、微苦，性寒，用于潤肺止咳。近年來對小百部的研究僅集中在化學(xué)成分的分離及結(jié)構(gòu)鑒定上，從中分離得到了一些甾體皂苷類化合物，但是迄今為止尚未見關(guān)于這些化合物生物活性的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供新的抗腫瘤活性物質(zhì)，具體涉及小百部中的甾體皂苷類化合物，特別涉及其中的化合物菝葜皂苷元-3-O-[β-D-吡喃木糖基(1→2)]-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷(稱為小百部皂苷甲)，菝葜皂苷元-3-O-[α-L-吡喃阿拉伯糖基(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷(小百部皂苷乙)和小百部甙B。
本發(fā)明的進一步目的是提供上述小百部中的甾體皂苷類化合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。
本發(fā)明應(yīng)用現(xiàn)代藥理篩選方法，對植物藥中抗腫瘤活性物質(zhì)進行研究，從百合科天門冬屬植物小百部(Asparagus filicinus Buch.-Ham)中總皂苷部位提取活性物質(zhì)甾體皂苷類化合物并證實其有抗腫瘤活性。
本發(fā)明的活性甾體皂苷類化合物具有式I的化學(xué)結(jié)構(gòu) 其中，R1＝β-D-Xylose，R2＝α-L-Rhamnose，R3＝H；或，R1＝H，R2＝H，R3＝α-L-Arabinose；或，R1＝H，R2＝β-D-Xylose，R3＝α-L-Arabinose。
上述的甾體皂苷類化合物，當(dāng)R1＝β-D-Xylose，R2＝α-L-Rhamnose，R3＝H時，化合物為菝葜皂苷元-3-O-[β-D-吡喃木糖基(1→2)]-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷(1)(稱小百部皂苷甲)；當(dāng)R1＝H，R2＝H，R3＝α-L-Arabinose時，化合物為菝葜皂苷元-3-O-[α-L-吡喃阿拉伯糖基(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷(2)(稱小百部皂苷乙)；當(dāng)R1＝H，R2＝β-D-Xylose，R3＝α-L-Arabinose時，化合物為小百部甙B(3)。
本發(fā)明所述的甾體皂苷類化合物通過下述方法制備取小百部根莖粗粉6kg，用乙醇室溫冷浸(20L×3次)，合并提取液濃縮至無醇味，提取液加水稀釋至2L，正丁醇萃取(2L×3次)，合并正丁醇萃取液濃縮至干即得總皂苷170g?？傇碥?50g干法上樣進行硅膠柱層析，以氯仿、氯仿-甲醇、甲醇梯度洗脫，所得流分以不同洗脫劑進行反復(fù)硅膠柱層析、MCI和RP-18柱層析，分離得到化合物小百部皂苷甲(1)、小百部皂苷乙(2)和小百部甙B(3)。
其中，小百部皂苷甲(菝葜皂苷元-3-O-[β-D-吡喃木糖基(1→2)]-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷)(1)白色無定形粉末，[α]D22＝-60.5(c＝0.20mg/ml，甲醇)；分子量856；IR(KBr)νmax3442(OH)，2934(CH)，1449(OH)，1048(OH)，984，914，890，865cm-1；ESI-MSm/z 725[M+H-132]+，579[M+H-132-146]+，417[M+H-132-146-162]+；1H(400MHz，in pyridine-d5)和13CNMR(100MHz，in pyridine-d5)數(shù)據(jù)，見表1和2。
其中，小百部皂苷乙(菝葜皂苷元-3-O-[α-L-阿拉伯吡喃糖基(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷)(2)白色無定形粉末，[α]D22＝-25.0°(c＝0.22mg/ml，甲醇)；IR(KBr)νmax3417(OH)，2935(CH)，1450(OH)，1068(OH)，986，918，897，850cm-1；1H(400MHz，in pyridine-d5)和13C NMR(100MHz，in pyridine-d5)數(shù)據(jù)，見表1和2。
其中，小百部甙B(3)白色無定形粉末，[α]D22＝-48.0°(c＝1.37，甲醇-氯仿)；IR(KBr)νmax3440，2935，1440，985，920，895，850cm-1；ESI-MSm/z881[M+K]+，843[M+H]+，711[M-132-H]+，579[M-132-132+H]+，417[M-132-132-162+H]+；1HNMR(400MHz，in pyridine-d5)數(shù)據(jù)δppm0.79(3H，s，18-Me)，0.82(3H，s，19-Me)，1.05(3H，d，J＝7.04，27-Me)，1.14(3H，d，J＝7.04，21-Me)，4.83(1H，d，J＝7.82，glu-H-1)，5.07(1H，d，J＝7.43，Ara-H-1)，5.52(1H，d，J＝7.83，Xyl-H-1)。13C NMR(100MHz，inpyridine-d5)數(shù)據(jù)δppmδ30.3(C-1)，27.4(C-2)，74.4(C-3)，30.8(C-4)，36.8(C-5)，26.8(C-6)，26.6(C-7)，35.4(C-8)，40.1(C-9)，35.1(C-10)，21.0(C-11)，40.1(C-12)，40.7(C-13)，56.3(C-14)，32.0(C-15)，81.2(C-16)，62.8(C-17)，16.5(C-18)，23.7(C-19)，42.3(C-20)，14.8(C-21)，109.6(C-22)，26.2(C-23)，26.1(C-24)，27.4(C-25)，64.9(C-26)，16.1(C-27)，102.8(Glu-C-1)，74.7(Glu-C-2)，76.2(Glu-C-3)，79.8(Glu-C-4)，74.9(Glu-C-5)，68.0(Glu-C-6)，105.0(Xyl-C-1)，74.4(Xyl-C-2)，78.4(Xyl-C-3)，70.9(Xyl-C-4)，67.3(Xyl-C-5)，105.6(Ara-C-1)，72.4(Ara-C-2)，74.4(Ara-C-3)，69.7(Ara-C-4)，67.2(Ara-C-5)。
上述甾體皂苷經(jīng)體外SRB法抗腫瘤活性篩選試驗，結(jié)果證實所述化合物對人肺癌(A549)和乳腺癌(MCF-7)兩種腫瘤細胞株具有顯著細胞毒活性。(表3)。其中，小百部皂苷甲活性最強，對A549和MCF-7兩種腫瘤細胞株的EC50值分別為2.3和3.0μg/ml。小百部皂苷乙對A549細胞株的細胞毒活性顯著，EC50值為2.4μg/ml，對MCF-7細胞株的活性，EC50值為10.3μg/ml。小百部甙B對A549和MCF-7兩種腫瘤細胞株顯示中等強度的細胞毒活性，其EC50值分別為7.6μg/ml和10.4μg/ml。
表1是化合物1和2的苷元部分1H和13C NMR數(shù)據(jù)。
表2是化合物1和2的糖部分1H和13C NMR數(shù)據(jù)。
表3是本發(fā)明甾體皂苷類化合物對A549(人肺癌)和MCF-7(乳腺癌)兩種腫瘤細胞株體外細胞毒性實驗結(jié)果(EC50inμg/ml)。


圖1是小百部總皂苷部位提取分離流程圖。
具體實施例方式
實施例1制備總皂苷取小百部根莖粗粉6kg，用乙醇室溫冷浸(20L×3次)，合并提取液濃縮至無醇味，提取液加水稀釋至2L，正丁醇萃取(2L×3次)，合并正丁醇萃取液濃縮至干即得總皂苷170g。取總皂苷150g干法上樣進行硅膠柱層析，以氯仿、氯仿-甲醇、甲醇梯度洗脫，具體步驟如下1、氯仿-甲醇(7∶3)洗脫所得流份，氯仿-甲醇-水(4∶1∶0.2)進行反復(fù)硅膠柱層析，再經(jīng)RP-18柱(60～90％甲醇)得到白色無定形粉末20mg，即小百部皂苷甲(1)。采用波譜學(xué)和化學(xué)方法分析，其結(jié)構(gòu)確定為菝葜皂苷元-3-O-[β-D-吡喃木糖基(1→2)]-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷。
2、氯仿-甲醇(7∶3)洗脫所得流份，氯仿-甲醇-水(4∶1∶0.2)進行反復(fù)硅膠柱層析，再經(jīng)MCI柱(70～90％甲醇)得到白色無定形粉末4mg，即小百部皂苷乙(2)。采用波譜學(xué)和化學(xué)方法分析，其結(jié)構(gòu)確定為菝葜皂苷元-3-O-[α-L-吡喃阿拉伯糖基(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷。
3、氯仿-甲醇(6∶4)洗脫所得流份，氯仿-甲醇-水(7∶3∶0.5)進行反復(fù)硅膠柱層析，得到白色無定形粉末130mg，即小百部甙B(3)。
實施例2體外抗腫瘤試驗(SRB法)A549和MCF-7兩種腫瘤細胞株在含25mM HEPES、0.2％(w/v)碳酸氫鈉和100μg/ml卡那霉素的10％小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液4ml的T-25燒瓶中，37℃，5％CO2的條件下培養(yǎng)。經(jīng)胰蛋白酶消化后的細胞懸浮液加入96孔板中，細胞濃度為0.25-1×104/孔。腫瘤細胞加入不同濃度的待測組分在37℃培養(yǎng)72小時后，用冰冷的50％三氯乙酸固定并用0.4％的(SRB)染色，待染料溶解后，562nm下測定吸收值。細胞半數(shù)生長抑制時的藥物濃度EC50按照量效數(shù)據(jù)進行換算。每個實驗重復(fù)三次，吸收值差異小于5％，EC50差異小于30％。
本發(fā)明實驗采用的試劑、細胞株均為本領(lǐng)域公知技術(shù)，可市購。
表1

表2

表3

權(quán)利要求
1.式1的甾體皂苷類化合物， 其中，R1＝β-D-Xylose，R2＝α-L-rhamnose，R3＝H；或，R1＝H，R2＝H，R3＝α-L-Arabinose，或，R1＝H，R2＝β-D-Xylose，R3＝α-L-Arabinose。
2.按權(quán)利要求1所述的甾體皂苷類化合物，其特征是所述的化合物是菝葜皂苷元-3-O-[β-D-吡喃木糖基(1→2)]-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷。
3.按權(quán)利要求1所述的甾體皂苷類化合物，其特征是所述的化合物是菝葜皂苷元-3-O-[α-L-吡喃阿拉伯糖基(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷。
4.權(quán)利要求1或2或3所述的甾體皂苷類化合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。
5.按權(quán)利要求4的用途，其中所述的腫瘤是肺癌。
6.按權(quán)利要求4的用途，其中所述的腫瘤是乳腺癌。
7.按權(quán)利要求1所述的甾體皂苷類化合物的制備方法，其特征是通過下述步驟①取小百部根莖粗粉，用50％乙醇室溫冷浸，合并提取液濃縮至無醇味，提取液加水稀釋，正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液濃縮至干即得總皂苷；②總皂苷干法上樣進行硅膠柱層析，以氯仿、氯仿-甲醇、甲醇梯度洗脫，所得流分以不同洗脫劑進行反復(fù)硅膠柱層析、MCI和RP-18柱層析，分離得到所述的化合物。
全文摘要
本發(fā)明屬中藥制藥領(lǐng)域，涉及式1的甾體皂苷類化合物及其在制備抗腫瘤藥物中的新用途。本發(fā)明從百合科天門冬屬植物小百部(Asparagus filicinus Buch.－Ham)中總皂苷部位提取活性物質(zhì)甾體皂苷類化合物并通過體外抗腫瘤活性篩選試驗證實其有顯著抗腫瘤活性。所述化合物對人肺癌(A549)和乳腺癌(MCF－7)兩種腫瘤細胞株的EC
文檔編號A61P35/00GK101029073SQ200710038680
公開日2007年9月5日 申請日期2007年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月29日
發(fā)明者陳道峰, 周麗波, 李國雄 申請人:復(fù)旦大學(xué)