專利名稱：流感免疫原組合物的制作方法
流感免疫原組合物
背景技術：
現有應用于人類和畜牧業(yè)的穩(wěn)定的獲得許可的疫苗在對抗所謂的“一型”病原 體一般是成功的。一型病原體(如麻疹、腮腺炎和風疹病毒)是那些通常(1)感染 或在嬰兒、幼兒、少年和青年引起大部分嚴重疾病；(2)攜帶有相對穩(wěn)定微生物基因 組；(3)具有引起自然恢復的自然疾病史；以及(4)誘導持久性記憶，與多克隆和多 抗原決定簇抗原識別相關。與此相反，二型病原體，比如流感病毒、HIV-1、瘧原蟲、支原體，如引起肺 結核的，錐體蟲、血吸蟲、利什曼蟲(Leishmania)、無形體屬(Anaplasma)、腸道 病毒(Enteroviruses)、星狀病毒(Astrovirases)、鼻病毒(Rhinovirases)、Norwalk
病毒、產毒素/病原性大腸桿菌、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)、鏈霉屬、不可分型 (nontypeable)嗜血桿菌屬流感病毒、肝炎C病毒、癌細胞等在相當對立的特征上有明 顯區(qū)別。例如，二型病原體(1)趨向于感染并在相當廣泛的宿主年齡范圍傳播，從孩 童到老年期都有感染發(fā)生和再發(fā)生；(2)在其基因組的特定區(qū)域存在微生物遺傳不穩(wěn)定 性(這種病原體成功進化的標志)；(3)在一些情況下，包括疾病的頻繁自然痊愈仍使宿 主保留對多種重復的年度傳染的缺陷和/或慢性/活躍或慢性/潛伏感染階段的建立； (4)包括寡克隆(oligoclonal)、針對極其有限的免疫抗原決定簇提供窄菌株特異性防護 早期免疫反應，或沒有防護和/或增強感染；以及(5)在感染或接種后引起免疫失調，如 抗原決定簇阻斷抗體、非典型初級免疫應答Ig亞型、記憶性交叉反應的恢復和不恰當的 THl和/或TH2細胞因子代謝。在免疫水平，觀察到懸殊的病原具有不同的發(fā)病機理和疾病結果，例如， HIV-I相對于人類鼻病毒。已經跨宿主和微生物種進化出高度成功的免疫系統(tǒng)規(guī)避策 略，例如欺騙性印記(Deceptiveimprinting)，并被選中和維持。因此，有脊椎動物免疫 系統(tǒng)的運行缺陷，例如源自病原體欺騙性印記的提高，對是否感染上HIV-I或60年內平 均每年感染2-6次普通感冒病毒的基本原理是一樣的。雖然一些與抗原傳遞和表達相關的進步提高了部分二型微生物致病體的免疫原 性，現有的疫苗技術并未能輕易地轉化為新的、廣泛有效和安全的，獲得許可的用于人 類疫苗。這大部分可能是因為對支配有脊椎的宿主防御反應系統(tǒng)在相似或不同的環(huán)境下 的起始、潛能開發(fā)、維持、激活、衰老和共進化基本規(guī)律了解缺乏?，F在在人類流感疫苗開發(fā)缺乏的是一種可以誘導免疫性和防護的組合物，該組 合物更少依賴于同型和亞型，因此不需要混合以及當前蛋基技術年復一年的生產操作的 多種亞型的生產。一種適合的新產品是可以在流感病毒的同亞型(intra-subtype)抗原 性變體和異亞型二者交叉中和，誘導免疫反應的流感重組體HA或NA亞基疫苗。在美國，流感是NIAID分類中的C型病原體，每年引起36000例死亡以及 220000例住院治療。作為一種呼吸道疾病，流感通過來自感染者的咳嗽或噴嚏產生的霧 滴和/或被污染的帶菌物傳播。高風險組包括兒童和老年人，感染流感通常會導致與流 感相關的繼發(fā)并發(fā)癥，肺炎、上呼吸道疾病并發(fā)癥(兒童中的中耳炎)及其他全身性疾
3病(如，心血管病等)。在歷史上，流感是最壞的流行性病源；1918年的西班牙流感導 致全世界超過4000萬人死亡。在美國，用于流感的年度直接醫(yī)療費(住院治療、正式 觀察、用藥等)估計為46億美元。此外，每年，因為流感失去高達1億1100萬個工作 日，美國商業(yè)一年內在有病的天數和失去的生產力中附帶損失70億美元。每年嚴重流感 流行的直接和間接成本(工作日損失、教學日損失等)至少為120億美元。在伴隨有次級細菌感染時，流感病毒是一種廣為人知的過度病態(tài)和死亡的原 因。并發(fā)癥包括肺炎、支氣管炎、充血性心力衰竭、心肌炎、腦膜炎、腦炎和肌炎。高 危并發(fā)癥人群是那些具有慢性肺或心血管紊亂、慢性護理處，包括療養(yǎng)院的患者，以及 85 歲或更老的人。 (Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP) for Prevention and Control of Influenza. MMWR, 1996, Vol 45; and Thompson 等人， JAMA 2003; 289:179-186)。在1976和1999之間，美國的老年人口已經加倍了，并因為 二次世界大戰(zhàn)后的嬰兒潮，預期在隨后的數年內增長到頂峰。在這一年齡階段的人與65 至69歲的人相比，16倍更易死于流感相關疾病。在1990另一個提高流感相關死亡的重 要貢獻因素是流感病毒ACH3N2)是一種優(yōu)勢病毒，一種更致命的形成最近流行的流感 病毒。流感是突變迅速以形成新的有毒菌株的單鏈核糖核酸(RNA)病毒。菌株一 般分為3組，流感A、B和C。病毒進一步根據2種表面糖蛋白，血凝素(HA)和神 經氨酸酶(NA)，進一步分為15種HA和9種NA亞型。最近由NIAID/NIH發(fā)起并 在1996-2004之間從紐約州收集的人類流感病毒的全染色體組分析顯示，盡管共享相同 的HA，共傳播在相同人群的多樣性，保守性，系統(tǒng)進化學(phylogenetically)上的明確 譜系會導致重組以及抗原上新型進化枝(clade)的產生。在人類流感A病毒的進化， HA的抗原性差異的仍是主要的選擇壓力，發(fā)現通過保守病毒譜系重組而非通過抗原性漂 移獲得抗原性的新型進化枝迄今在流感疫苗菌株篩選和生產年度方法依然具有重要的意 義(Holmes 等人，PLoS Biol. 2005 3 (9) :e300)。在年度全球病毒追蹤計劃和隨后的“反制(reactionary)，，疫苗生產問題中的核 心，是抗原變異的問題。抗原變異一種進化機制，保證了編碼單個蛋白抗原同族物的特 定病原體基因的迅速序列變化，一般包括多個、相關基因拷貝，引起病原體表面抗原結 構的改變。因此，宿主免疫系統(tǒng)在感染或再感染的過程中，不能很好的識別病原體，在 宿主可以繼續(xù)對抗疾病前，必須產生新的抗體以識別變化的抗原。因此，宿主不能完全 免疫病毒性疾病。這種現象代表了現在現代疫苗開發(fā)挑戰(zhàn)中的多個，如果不是，最難以 克服的問題中的一個。并不奇怪，感染或接種當前所有獲得許可的疫苗后產生的免疫反應是高度亞 型和菌株特異性的。實際上，這意味著在天然的、試驗性感染和接種中誘導的抗體僅 能中和同源病毒。亞型/菌株特異性的體液免疫反應似乎是因為多種基于血凝素分子 的球狀頭的抗原中心的相對免疫顯性(immunodominance) (Wiley等人，Nature, 1981; 289:373-378)。更確切的，抗體反應對應于HA球狀頭內的5個主要抗原中心。5個HA 抗原決定簇(A-E)中，2個位點，A和B，是最有免疫顯性的，并與最多數量的氨基酸 超變異性(hypervariability)相關，部分是因為點突變、缺失和N連接糖基化位點的偶然 插入的重現，已知統(tǒng)稱為病毒的“抗原漂移”(Cox & Bender, Semin. Virol. 1995; 6:359-70;Busch 等人，Sci. 286:1921, 1999; Plotkin & Dushoff, PNAS 100:7152, 2003; and Munoz & Deem, Vaccine 23,1144, 2005)。原始抗原效應，首次由Francis在 1953 描述(Ann. Int. Med. ,1953,399:203)，是 一種初級免疫應答，當不是通過同源，而是通過交叉反應疫苗或引入病毒亞型/菌株加 強時，結果是新型抗體可以更好地與之前的抗原而非引入抗原反應。由偶然的回憶引起免疫專一性的喪失給宿主的免疫系統(tǒng)造成了一個實際問題， 以獲得相等和有效的體液反應，對抗在感染和感染之間的病毒變化。因此，并不奇怪自 然感染和接種未能產生更多功能的交叉反應初級和記憶性免疫，因為所有對抗那些更小 免疫原性抗原決定簇的所有開發(fā)，這些可能是最為保守的并可獲得跨菌株免疫性，在抗 原級別上更低。免疫顯性抗原決定簇誤導免疫反應遠離抗原中更為保守的更低免疫原性 區(qū)域的免疫學現象最初被稱為“克隆優(yōu)勢(clonal dominance) ”(Kohler等人，JAcquir. Immune Defic. Syndr. 1992; 5:1158—68), which later was renamed as "Deceptive Imprinting" (K hler 等人，Immunol. Today 1994 (10) :475_8)。欺騙性印記之后免疫顯性的免疫機制并未完全被了解，且迄今未有一種機制可 以完全解釋特定抗原決定簇是如何以及為何已經進化為免疫調節(jié)的和免疫顯性的。在該 現象中觀察到的免疫反應的范圍包括高度菌株/專一特異性中和抗體的誘導在實驗動物 模型-病毒挑戰(zhàn)系統(tǒng)中可全程誘導非保護性/非中和性結合，封閉，以至在一些情況下 的病原體促進性抗體，防止宿主的免疫系統(tǒng)識別附近的相鄰抗原決定簇以與CD4T助細 胞反應，引發(fā)被動保護。在與宿主助T細胞和細胞毒素細胞介導的免疫性中觀察到通過 免疫顯性的相同免疫反應誘騙導致更窄的，集中于一組抗原決定簇(Gzyl等人，Virology 2004; 318 (2) :493-506; Kiszka 等人，J. Virol. 2002 76 (9) :4222_32; and Goulder 等人，J. Virol. 2000; 74 (12) :5679_90)。接種是防止疾病的最佳方法，現在每年根據世界范圍內對活躍病毒株的流行病 學監(jiān)視開發(fā)三價滅活病毒和修飾的活(稀釋的)流感疫苗。兩種疫苗都含有流感A和流 感B亞型。許可的流感疫苗由非活化的整體或化學剪切開的，由兩種流感A亞型(H1N1 和H3N2)制備的亞基和一個流感B亞型組成。流感疫苗的生產包括通過連續(xù)傳代或與 其它高產率菌株重組，對選定的變種修飾以在蛋中獲得高產率。選定的流感病毒在雞蛋 中培養(yǎng)，并從尿囊液中純化流感病毒粒子。整體或剪切開的病毒制劑然后通過失活劑， 如福爾馬林處理而殺死。美國市場超過90%的疫苗由兩家公司供應，Aventis Pasteur具 有超過50%的市場占有率，以及Chiron (PowderJect) (U.K.)。一種鼻腔疫苗， FluMist77,被批準并在2003首次出售。現有流感疫苗的局限包括
(1)在老年人中效力減弱。在老年人中，對疾病的防護率更低，特別是那些被 確診的老年人(Gorse等人，J. Infec. Dis. 190:11-19, 2004)。在>65歲的目標中，觀察對 三價亞病毒流感疫苗的明顯抗體反應少于30% (Powers & Belshe, J. Infec. Dis. 167:584-592, 1993)；
(2)在蛋中生產?，F有的生產過程依賴于雞蛋。流感病毒菌株必須在蛋中復制 良好，并且每年需要提供大量的蛋。每年的生產存在風險，因為需要找到合適的病毒組 合物；
5(3)不能應答晚期出現的和漂移菌株，比如九十年代后期的A/Sydney/5/97，或 應答一種潛在的流行性菌株，如1997年出現在香港的H5N1病毒；
(4)現有整體或分裂流感疫苗的防護是一種短期存在的，并且效力降低，因為 在流感的流行株中由于抗原變異發(fā)生了遺傳變化。理想狀況下，疫苗株是與疾病的流感 病毒菌株相匹配的。與最初從感染個體分離得到的流感病毒相比，在蛋生產的流感病毒 的血凝素可能發(fā)生變化(Oxford等人，J. Gen. Virol .72:185-189,1989;以及Rocha等人， J. Gen. Virol .74:2513-2518,1993)，降低了疫苗的潛在效力；
(5)在蛋中生產的疫苗對蛋有過敏性反應的人而言有副作用；以及
(6)現有許可的生產系統(tǒng)中，每一個感染流感病毒的雞蛋產生一份疫苗，且生 產周期大約是24周。因此，現有許可的流感疫苗未能(1)誘導可以中和普通的年度在流行病傳播 過程中出現的再發(fā)抗原性變體，以及亞型和重組病毒；(2)在老年人中誘導強效的免疫 反應；以及(3)由于副作用適用范圍有限，如，一些疫苗不能應用于兒童。

發(fā)明內容
本發(fā)明部分涉及具有增強的或新型免疫原性的新型流感抗原。一種可以作為改 善的疫苗的目標流感組合物，疫苗通過使用不同的種類的和/或新的可識別的抗原決定 簇對病毒或病毒亞基抗原修飾得到。更有效和快速的使用重組技術與新型免疫再聚焦(refocusing)技術相結合，通 過生成具有增強跨菌株有效性的流感疫苗，引起現行疫苗開發(fā)操作中亞基HA和/或組合 物的巨大改變，因此回避了現行的病毒全球年度追蹤操作，這樣節(jié)省數百萬美元，釋放 了醫(yī)療資源，包括每年遞增的用于在蛋中生產和制造疫苗的時間和勞動力，同樣挽救了 人類的生命。額外的特征和優(yōu)點將在此描述，在以下的詳細描述中將更為顯而易見。
具體實施例方式在此定義的流感為A、B和C型病毒。在人類中，A型是最具有毒性的，可 以導致季節(jié)性流行病或少見和罕見的，更為致命的全球性流行病。類型由多種血清型確 定，血清型反應了宿主對表達在病毒顆粒表面的抗原的免疫反應。病毒表面的攜帶了大 多數與疫苗防護相關的抗原決定簇的兩種結構是血凝素(HA或H)和神經氨酸酶(NA 或N)。已知至少有16種H亞型和至少9種N亞型。HA參與病毒的吸附和融合。NA 參與唾液酸酶活性?！耙吧汀币馕吨烊话l(fā)生的生物體。這一術語同樣與在天然發(fā)生的生物群體 中的天然發(fā)生的生物體中發(fā)現的自然發(fā)生的核酸和蛋白，自然發(fā)生這種情況可參見例如 從自然突變并通過遺傳漂移維持獲得的多態(tài)現象、自然選擇等等，并不包括通過，如重 組法獲得的具有序列的核酸或蛋白。“免疫原”和“抗原”在此可交換使用，是誘導抗體特異性免疫應答(體液介 導的)和/或T細胞源(細胞介導的)的分子，例如，含有結合到分子，或為CD4+或 CD8+T細胞所識別的病毒感染細胞表達的分子的抗體。該分子可以包含一個或多個特異
6性抗體或T細胞結合的位點。如本領域技術人員所知，這種位點稱為抗原決定簇或決定 簇?？乖梢允嵌嚯?、多核苷酸、多糖、脂類等，同樣可以是其結合，如糖蛋白或脂蛋 白。免疫原混合物或產品，或抗原性混合物或產品可以誘導特異性免疫應答，應答可以 是體液性、細胞性或兩者。疫苗是用于產生免疫保護反應的免疫原或抗原，也就是說，在宿主中，反應， 如抗體，減少免疫原或抗原的負面影響，或實質表達相同。如本領域技術人員所知，劑 量源自、外推和/或確定自臨床前和臨床研究。如本領域技術人員所知，可以運用多個 劑量，并出于保證延長預防性的或非反應態(tài)的需要。就本發(fā)明的目的，疫苗應用的成功 終點是引起誘導的免疫反應(例如體液和/或T細胞介導的)的存在，例如引起血清抗體 的產生，或由宿主內任何組織或器官產生的，結合目的抗原或免疫原的抗體。在一些實 例中，誘導的抗體在一些情況下與攜帶同源抗原或免疫原的混合物、分子等相結合，或 引導宿主中和、降低、防止和/或消除病原體，免于感染和/或引起臨床疾病。本發(fā)明的 目的免疫保護是這種抗病毒免疫反應(如結合免疫原或被感染細胞的抗體和/或T細胞) 存在于暴露的宿主中。這可以使用任何已知的免疫測定技術，如ELISA和/或血凝素抑 制試驗確定。另外，可以使用病毒中和實驗以確定例如流行中和抗病毒抗體的存在。就 本發(fā)明的目的，觀察宿主中的免疫保護，也就是流行抗流感抗體的存在，至少7天，至 少14天，至少21天，至少30天或更多作為目的疫苗效力的證據。另外，一般來說，約 為1:40的抗同源單一流感菌株的血凝抑制反應(HI)滴定度被用于使疫苗可作為候選疫 苗獲得的一個終點。在動物模型中，暴露后，任何在致命性的延遲都可以作為本發(fā)明目 的防護的證據。因此，在鼠暴露于病原性流感菌株的情況下，一般在暴露之后約10天出 現第一只鼠死亡。因此，如果暴露的鼠的首次死亡日延長了至少1天，至少2天，至少 3天或更多天，則被認為是本發(fā)明目的的保護。免疫保護的時間可至少為14天，至少21 天，至少28天，至少35天，至少45天，至少60天，至少3個月，至少4個月，至少5個 月，至少6個月，至少1年，至少2年或更長。優(yōu)選的，免疫保護在非近親系群體中觀察 免疫保護，并針對病原體的不同形式、亞型、菌株、變種、等位基因等。目的組合物可 以含有病毒顆粒，病毒的失活或稀釋(修飾的活體)或亞基，例如，NA或HA。組合物 還可以含有類病毒顆粒(VLP)，這對本領域技術人員來說是已知的，其表達病毒蛋白 質和抗原的結構如同發(fā)現的原始復制的病毒，但是在本發(fā)明中，表達免疫抑制的免疫顯 性抗原決定簇。正常情況下，VLP缺乏的病毒核酸或其可防止核酸復制部分，因此使得 VLP不具有傳染性。在另一個實例中，抗原、決定簇或其部分可以克隆進野生型病毒的 基因組中，替代同源的野生型基因。這樣重組病毒與缺乏免疫抑制分子的野生型病毒相 同。因此，例如，在蛋中可以很好傳代的病毒菌株可以被控制表達免疫抑制分子，而重組 病毒可使用現有的使用蛋的疫苗生產的材料和方法傳代，以獲得免疫抑制的疫苗?！懊庖唢@性抗原決定簇”是在宿主選擇性引起免疫反應以起效或功能消除的抗 原決定簇，可以是抗原上或抗原的其它抗原決定簇的部分或全部?！懊庖咭种埔豢乖瓫Q定簇”是修飾抗原決定簇，以基本上防止宿主的免疫系統(tǒng) 產生對抗所述抗原決定簇的抗體、助或細胞毒素T細胞。但是，超聲所述抗原決定簇或 抗原決定簇的反應性完全去除的免疫抑制并不是必須的。免疫再聚焦(IR)或免疫再聚焦技術(IRT)可被用于創(chuàng)造抗病原體表達免疫顯性抗原決定簇的有效疫苗。該技術最適用于進化出稱為欺騙性的印記以逃避宿主免疫 應答策略的生物，例如通過具有顯示有高水平抗原性漂移的免疫顯性抗原決定簇。這種 免疫顯性抗原決定簇一般以可以在不影響病原體存活性的情況下改變的多氨基酸的形式 存在?？乖拿庖唢@性抗原決定簇的免疫抑制可引起宿主生物體高滴定度抗體或抗抗 原上非主要抗原決定簇的T細胞反應和/或新的抗體滴定度或針對其他相關免疫沉默抗原 決定簇的T細胞反應的產生。這種免疫抑制的抗原可以作為對抗具有穩(wěn)定或高度變化和 /或保守的免疫顯性抗原決定簇的抗原的生物的有效疫苗。免疫顯性抗原決定簇可以通過檢查從感染上病原體的宿主生物體的血清或T細 胞反應性確認。評價血清是為了了解結合識別的，可能在宿主生物體引起免疫反應的抗 原的抗體的情況。如果免疫顯性抗原決定簇存在，基本上血清中的許多抗體將結合到免 疫顯性抗原決定簇，很少或沒有結合到其他存在的或在抗原的抗原決定簇。地識別免疫顯性抗原決定簇后，作為一種設計選擇，此所教導的使用本文所教 導的材料和方法如在和如本領域技術人員所知對免疫顯性抗原決定簇進行免疫抑制。這 種操作可以在核酸水平、在蛋白水平、在碳水化合物水平等，或其組合進行，操作如本 文所教導和本領域已經的方法進行。例如，N連接的碳水化合物(CHO)的存在可以通過多肽的一級氨基酸序列確 定。由天冬酰胺組成三聯(lián)體氨基酸序列，之后連接有任意氨基酸，且末端是絲氨酸或蘇 氨酸(N-X-S/T)，其中X是除脯氨酸或天冬氨酸之外的任意氨基酸，是添加N連接 CHO的位點?？墒褂帽绢I域技術人員的已知的操作方法和材料將N連接糖基化位點添加 到或從抗原決定簇去除。例如，顯示有分子級引入的N連接序列肽段(NXT/S)的HIVgpl20重組體， 這引起了在免疫顯性V3區(qū)添加了額外N連接多糖，獲得了新型的抗原性特性，如不能與 識別野生型V3抗原決定簇的抗體相結合，但是可誘導針對其他先前沉默或更少免疫原抗 原決定簇的抗體反應。額外的碳水化合物部分的存在并未降低HIV-I重組病毒的感染活 性。接種了重組糖蛋白的試驗動物在體外顯示有中度到高滴定度的中和同源和異源野生 型HIV-I 二者感染的抗體。因此，gpl20/160V3區(qū)內的免疫顯性抗原決定簇的免疫抑制 致使免疫反應重聚焦至其他位于同一抗原的中和抗原決定簇，參見美國專利5585250和 5853724。另外，免疫顯性抗原決定簇的特定氨基酸可被置換、替換或去除以抑制免疫原 性。免疫抑制可通過置換、替代或去除，例如，通過編碼抗原核酸的位點定向誘變免疫 顯性抗原決定簇的一個氨基酸、二個氨基酸、三個氨基酸或更多個實現。改變核酸和/ 或多肽的方法如本文所提供，并為本領域技術人員所知。免疫抑制可通過多種技術影響，例如改變、置換或去除抗原決定簇的特定氨基 酸，或例如在抗原決定簇附近添加糖基化位點。如本文所教導，變化可在多肽水平或多 核苷酸水平影響，操作方法是本領域技術人員所知的。因此，可通過添加、刪除或置換 抗原決定簇上或中目標區(qū)域的一個或多個分子、基團、混合等改變多肽。例如，特定的 氨基酸可化學合成或可被修飾以攜帶額外基團，比如多糖，比如聚乙二醇。在操作免疫原結構后，進行篩選分析以確定突變蛋白的結合，已知可結合流感的一個或多個免疫顯性抗原決定簇的抗體可用于確定是否有免疫抑制發(fā)生。例如，多肽 可合成包括一個或多個針對免疫顯性抗原決定簇的一級氨基酸序列的變化。另外，免疫 顯性抗原決定簇的核酸序列可序列被修改，以表示免疫抑制抗原決定簇。因此，核酸序 列可通過，例如，位點定向誘變以表達氨基酸置換插入、缺失等修飾，其中一部分可在 或鄰近免疫顯性抗原決定簇進一步引入修飾，比如引入糖基化位點，比如在或鄰近免疫 顯性抗原決定簇引起N糖基化或O糖基化等。獲得抗原決定簇突變蛋白(由野生型變異得到的突變抗原決定簇)等的一種 方法是“丙氨酸掃描突變”(Cunningham & Wells, Science 244:1081 1085 (1989);以及 Cunningham & Wells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6434-6437 (1991))。一個或多個基團 由丙氨酸(Ala)或聚丙氨酸基替代。那些置換被證明有功能靈敏性的然后可通過在或 對置換位點引入進一步或其他突變明晰。因此，在用于引入氨基酸序列變化的位點是預 定的情況下，突變本身的特性是不必預知的。類似的置換可以使用其他氨基酸進行，取 決于所需掃描基團的特性。一個更系統(tǒng)的用于識別氨基酸殘基以修飾的方法包括與免疫系統(tǒng)刺激或免疫顯 性抗體識別，以及極少或不參與免疫系統(tǒng)刺激或免疫顯性抗體識別相關基團的識別。對 相關基團進行丙氨酸掃描，測試每一種Ala突變株針對免疫顯性抗原決定簇或免疫顯性 抗體識別的免疫系統(tǒng)刺激減弱情況。在另一個實例中，那些極少或不與免疫系統(tǒng)刺激相 關的基團被選擇進行修飾。修飾可以包括一個或更多基團的刪除、鄰近目標基團的基團 置換或一個或更多基團的插入。但是，一般情況下修飾涉及使用另一個氨基酸置換基 團。保存性置換可以是第一置換。如果這種置換導致誘導免疫系統(tǒng)刺激或與已知的免 疫顯性抗體的反應性增強，則另一個保存性置換可被用于確定是否可獲得更多的實質變 化。更為實質性的修飾在于可以通過選擇與位點正?；鶊F特性在實質上更為不同的 氨基酸，影響免疫系統(tǒng)反應遠離免疫顯性抗原決定簇。因此，這種置換可以在保持(a) 置換區(qū)域內多肽骨架的結構，例如，板狀或螺旋構象；(b)目標區(qū)域分子的電荷性或疏 水性，或(C)側鏈的數量。例如，天然產生的氨基酸基于普通側鏈的特性可被分組
(1)憎水的甲硫氨酸(M或Met)，丙氨酸(A或Ala)纈氨酸(V或Val)，亮氨酸 (L或Leu)和異亮氨酸(I或lie)；
(2)中性的，親水性的半胱氨酸(C或Cys),絲氨酸(S或Ser),蘇氨酸(T或Thr), 天冬酰胺(N或Asn)和谷氨酰胺(Q或Gln)；
(3)酸性天冬氨酸(D或Asp)和谷氨酸(E或Glu)；
(4)堿性組氨酸(H或His),賴氨酸(K或Lys)和精氨酸(R或Arg)；
(5)影響鏈取向的基團甘氨酸(G或Gly)和脯氨酸(P或Pro),以及
(6)芳香族色氨酸(W或Trp),酪氨酸(Y或Tyr)和苯丙氨酸(F或Phe)。非保存性置換必須使用來自另一組的氨基酸替代氨基酸。保存性置換必須使用 來自同一組的氨基酸替代另一個氨基酸。優(yōu)選的氨基酸置換是那些抑制免疫顯性抗原決定簇，但是同樣可包括那些，例 如(1)降低對蛋白水解的敏感性，(2)降低對氧化的敏感性，(3)改變免疫系統(tǒng)刺激活
9性和/或(4)給其類似物帶來或修飾其他物理化學或功能特性。類似物可以包括各種非 自然發(fā)生肽序列的突變蛋白序列。例如，可在自然發(fā)生的序列中進行單個或多外氨基酸 置換(優(yōu)選為保守性氨基酸置換)。除非大量的改變，或改變R組或側鏈的結構，保守 性氨基酸置換一般將不會根本改變親本序列的結構特征(例如，氨基酸替換將不會趨向 于破壞出現在親本序列的螺旋，或破壞其他類型的表征親本序列的二級結構)(Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984) ； Introduction to Protein Structure, Branden & Tooze, eds., Garland Publishing, New York, NY (1991);以及 Thornton 等人 Nature 354:105 (1991))。一般的，生物學特性改變的抗原決定簇突變體的氨基酸序列將至少具有與親本 分子的氨基酸序列75%，至少80%,至少85%,至少90%和經常至少95%的同一性或類似 度。與親本氨基酸序列相關的同一性或類似度在此定義為候選序列與親本分子基團相同
(即相同的基團)或類似的(即基于上述普通側鏈特性，來自同一組的氨基酸基團)氨 基酸基團的百分比，如果需要，在矯正序列并引入缺口，以獲得最大百分比的序列同一 性。目標分子的共價修飾包括在本發(fā)明的范圍內。如果適用，這種修飾可以通過化 學合成或通過分子的酶或化學剪切完成。其他類型的分子共價修飾可以通過使用能與選 定的側鏈或與N末端或C末端基團反應的有機衍生物與目標分子的氨基酸基團反應被引 入。同樣，各種有機化學材料和方法可被應用于修飾抗原決定簇元件。例如，WO 05/35726教導多種用于在生物分子引入、修飾、改變、替代等等取代基。例如，半胱氨?；鶊F可以與α -鹵代乙酸酯(以及相應的胺)，比如氯乙酸或 氯乙酰胺反應，以獲得羧甲基或羧氨基甲基(carboxyamidomethyl)衍生物。半胱氨酰 基基團同樣可以通過，例如與溴三氟丙酮(bromotrifluoroacetone)、α-溴基-β-(5-咪 唑基)丙酸(α bromo- β - (5-imidozoyl) propionic acid)、磷酸氯乙?；?、N烷基馬來酰 亞胺(alkylmaleimides)、3-硝基-2-氮苯基二硫化物、甲基2-氮苯基二硫化物、對氯 汞苯甲酸、2-氯汞苯酚-4-硝基苯酚(2 chloromercura-4-nitrophenol)或氯代_7_硝基 苯并-2-乙二酸-1,3- 二唑反應獲得。組氨酰基團可以通過與焦碳酸二乙酯在pH5.5-7.0下反應得到。也可使用對溴 苯酰(bromophenacyl)溴化物，該反應優(yōu)選在0.1M 二甲胂酸鈉，pH6.0的條件下進行。 賴氨酰和α氨基末端基團可與琥珀酸或其他羧酸酐反應，以改變基團的電荷性。其他 用于獲得含α-氨基基團的合適試劑包括亞氨酸酯，比如，甲基吡啶亞胺甲酯(methyl picolinimidate)、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯氫化硼(chloroborohydride)、三硝基苯磺酸
(trinitrobenzenesulfonic acid)、O-甲基異脲(methylisourea)禾Π 2,4-2,4-戊二酮，以及 可使用二羥乙酸被氨基移換酶催化的氨基酸。精氨?；鶊F可以通過與一個或數個常規(guī)試劑，比如苯甲酰甲醛、2,3-丁二酮、1,2 環(huán)已二酮和茚三酮反應修飾。精氨酸基團衍生通常需要堿性反應條件。進一步，試劑可 與賴氨酸以及精氨酸ε氨基反應。酪氨?；鶊F的特定修飾可使用芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反應獲得。例如 N乙?；溥蚝退南趸淄榭煞謩e用于形成O-乙?；野滨ｎ愇锖?-硝基衍生物。
10
羧基側基(天冬氨?；蚬弱；?可通過與二亞胺碳(R-N=C=C-R')反應而被修 飾，其中R和R’可以是不同的烷基，比如1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)二亞胺碳 或 1-乙基-3- (4-氮翁-4,4- 二甲基戊基)二亞胺碳(l-ethy:i-3- (4-azonia-4,4-dimethyl pentyDcarbodiimide)。進一步，天冬氨酰基和谷?；鶊F可通過與銨離子反應轉變?yōu)殚T 冬酰胺(asparaginyl)和谷酰胺基基團。谷酰胺基和門冬酰胺基團通常在中性或堿性條件下脫去酰胺基，以分別形成谷 ?；吞於滨；鶊F。那些脫去酰胺基形成的基團落入本發(fā)明的范圍內。其他修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥化，絲氨酰或蘇氨?；鶊F的羥基的磷酸化， 賴氨酸、精氨酸和組氨酸的α -氨基的甲基化(Creighton ,Proteins !Structure and Molecular Properties ,W. H. Freeman Co. ,San Francisco ,pp. 79-86 (1983))，以及 N 末端胺的乙?；?任意C末端羧基的酰胺化。另一種共價修飾包括化學或酶化將糖苷連接到目標分子上。 根據使用的連接方式，糖可能是連接到(a)精氨酸和組氨酸；(b)自由羧基；(c)自由 巰基，比如半胱氨酸的自由巰基；(d)自由羥基，比如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸的自由 羥基；(e)芳香族基團，比如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳香族基團；或(f)谷氨酰胺 的酰胺基。這種方法描述在 W087/05330 和 Aplin Wriston ,CRC Crit .Rev. Biochem. ,pp. 259-306(1981)中。糖基團同樣可以使用酶法添加，例如，葡糖基轉移酶、唾液酸轉移 酶、半乳糖基轉移酶等。存在于目標分子中的任意碳水化物部分的去除可通過化學法或酶法實現。化 學法去糖基化，例如，將需要將分子與化合物，如三氟甲基磺酸，或等同化合物充分接 觸，引起除連接糖(N-乙酰氨基葡糖或N-乙酰半乳糖胺)外的大部分或所有糖的剪切， 同時保持分子的其余部分不受影響?；瘜W法去糖基化描述在，例如Hakimuddin等人， Arch. Biochem. Biophys. 259:52 (1987)和 Edge 等人，Anal. Biochem. 118:131 (1981)中。 酶法剪切分子中的碳水化物部分可以通過任意種類的糖苷內切酶和糖苷外切酶實現，酶 法剪切描述在，例如Thotakura等人，Meth. Enzymol. 138:350 (1987)中。因此，可使用 甘露糖苷酶、巖藻糖苷酶、氨基葡萄糖苷酶(glucosaminosidase)、半乳糖苷酶等。簡單分離編碼流感的HA、NA等的RNA或DNA，并使用常規(guī)操作測序(例如， 通過使用可特異性結合相關基因的寡聚核苷酸探針探針，Innis等人in PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic (1990),以及 Sanger 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 74:5463 (1977))。一旦分離，DNA可被植入表達載體中，然后再植入寄主細胞，比如E. coli細胞、NSO細胞、COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞，以在重組寄 主細胞中獲得目的蛋白的合成。RNA或DNA同樣可被修飾，例如，通過置換堿基以優(yōu)化 特定宿主中的密碼子選擇或通過將異源多肽共價連接到編碼序列。習語和術語及其組合，流感病毒、抗原、元件、亞基、HA、NA等及其組合的 “功能性片斷、部分、變體、衍生物或類似物”等及其組合，涉及具有與野生型或產生
變體、衍生物，類似物等的親本元素相一致的定性生物活性。例如，HA的功能性部分、 片斷或類似物可以如原始HA—樣刺激免疫反應，盡管反應可能針對HA上不同抗原決定簇。因此，包括在本發(fā)明范圍內的是病毒，或其部分或衍生物的目標功能等效體， 術語“功能等效體”包括病毒和其能夠刺激對抗流感的免疫反應的部分。
目標流感病毒的部分，比如攜帶ΗΑ、ΝΑ、M2或組合的膜或非膜制劑，以及任 意其他流感抗原的制劑，可以通過本領域的已知操作方法獲得。當一個或多個免疫顯性 非保護性抗原決定簇(IDNPEs，這同樣還包括刺激菌株特異性，但是范圍更窄的免疫性 的抗原決定簇)被移除或抑制時，例如，通過分子內修飾(例如刪除、電荷變化、添加一 個或多個N連接序列肽段等)并作為抗原提供給初始動物，針對IDNPE的變化可誘導新 的，對抗次要的或之前沉默的抗原決定簇的免疫反應級別，免疫反應水平為B和T細胞 水平中的一種或兩種(Garrity等人，J. Immunol. (1997) 159 (1) :279_89)。在此描述的技 術稱為“免疫再聚焦”。一旦改變造成，改變是否影響，比如，降低現已修飾的免疫顯性抗原決定簇的 反應性，“抑制的抗原決定簇，抗原等”如在此或如本領域技術人員所知的確定。這例 如，可以在體外通過確定抑制抗原與確定的與主要抗原決定簇反應的抗血清的反應性而 測試，比如通過ELISA或蛋白質印跡。證明降低了與確定抗血清反應性的候選者被選擇 在體外測試，以確定那些抑制的抗原是否具有免疫原性以及宿主是否會產生針對其免疫 反應。因此，例如，如本領域技術人員所知，針對抑制的抗原接種鼠，獲取血清并在體 外試驗中測試其與抗原的反應性?？寡迦缓罂梢栽谝吧筒《旧蠝y試，以確定抗體是 否仍可識別野生型抗原決定簇或野生型抗原。這可以在，例如ELISA或蛋白質印跡中完 成。后者可以是富有意義的，揭示了特定免疫顯性抗原決定簇是否是關聯(lián)的，并且如果 抗血清仍可與流感反應，其大小也許和攜帶與鼠抗血清反應的抗原決定簇的分子具有同 一性。那些候選的免疫抑制抗原極少或不與已知的可與親本免疫顯性抗原的抗血清反 應，在宿主中仍保持有免疫原性的，被選為候選疫苗用于進一步測試。候選者同樣可 刺激提高針對親本免疫顯性抗原的反應性，并結合免疫再聚焦用于免疫識別的抗原決定 簇。例如，在基于標準的抗病毒試驗中，鼠抗血清可被用于與多種流感菌株反應性的測 試，以確定抗體的普遍性，亦即抑制抗原上新識別的抗原決定簇對寬范圍的流感菌株是 否具有普遍性，以及抗體是否具有寬抗病毒活性。因此，重組HA(rHA)亞基蛋白疫苗可足夠有效保護對抗流感病毒同源株的威 脅。rHA在老年人中同樣可被用作免疫原。第二代，如本文所教導的免疫再聚焦HA 亞基疫苗同樣可誘導針對異源株的保護性免疫(Treanor等人，J. Infectious Diseases 2006; 193:1223-8)。在一個實例中，流感的HA和NA作為用于免疫保護反應的新靶標，被選為再聚 焦針對其他在HA和NA上的非主要位點的宿主免疫應答靶標，優(yōu)選那些在各種菌株等具 有寬范圍和廣譜活性的。例如，HA具有5個免疫顯性位點或抗原決定簇，記為A-E。位點A包括HA 型菌株的140-146氨基酸，并具有序列KRRSNKS (SEQ ID NO. 1)。與香港菌株相比， 在Wyoming菌株中，位點已經有連接有三個糖基化位點。因此，一個去除由位點A確定 的環(huán)結構的方法是，例如，通過使用例如GG替換KRRSNKS (SEQ ID NO. 1)序列。位點B包括HA的189-197氨基酸，其序列為SDQISLYAQ (SEQ ID NO. 2)。這 形成了與具有序列KYKY (SEQ ID NO. 3)的158-161氨基酸作用的螺旋。可以B位點制 造多種可能的變化，比如用NAS取代QIS ；用NIT取代SLY ；用NST在158取代KYK ；以及用NTS在159取代YKY，所有這些變化都在這4個位點引入N糖基化序列。位點C包括具有序列KCN的氨基酸276-278。NCT可以替換KCN。位點D包括在氨基酸201-220的大逆平行環(huán)。整個環(huán)可以被去除。同樣的， 糖基化位點NIT可在201-203位點替換RIT。位點E包括79-82氨基酸,FQNK(SEQ ID NO. 4)。糖基化位點NET可替換QNK。以上變化可結合，比如，在B位點的NST和NTS變化中的任何一個可與針對位 點C和/或E的建議的、示范性變化相結合。以上針對免疫顯性位點的改變可以通過克隆、位點定向誘變、擴增等如本領域 技術人員所知的方法獲得。因此，上述的A位點改變可以使用引物，A頂GGAACAAGCTCTGCTTGCggc ggtTTCTTTAGTAGATTGAATTGG (SEQ ID NO. 5)和 A 底CCAATTCAATCTACTAAAG AAaccgccGCAAGCAGAGCTTGTTCC (SEQ ID NO. 6)以獲得包含上述刪除并在刪除位點 插入 GG 二肽的序列 GTSSACGGFFSRLN(SEQ ID NO. 7)。B位點變化可以通過使用引物獲得，Bl頂CAAATCAGCCTATATGCTaatGC ATCAGGAAGAATCAC (SEQ ID NO. 8)和 Bl 底GTGATTCTTCCTGATGCattAGCAT ATAGGCTGATTTG(SEQ ID NO. 9)以獲得序列 QISLYANASGRI (SEQ ID NO. 10)；引 物 B2 頂CACCACCCGGTTACGGACaatGACacAATCAGCCTATATGCTCAAGC (SEQ ID NO. 11) and B2 底 GCTTGAGCATATAGGCTGATTgtGTCattGTCCGTAACCGGGTGGTG (S EQ ID NO. 12)以獲得序列 HHPVTDNDTISLYAQ(SEQ ID NO. 13)；弓丨物 B3 頂CGG ACAGTGACCAAATCAatCTAtcTGCTCAAGCATCAGGAAG(SEQ ID NO. 14)禾口 B3 底 CTTCCTGATGCTTGAGCAgaTAGatTGATTTGGTCACTGTCCG (SEQ ID NO. 15)以獲得 序列 DSDQINLSAQASG(SEQ ID NO. 16)；引物 B4 頂GAATTGGTTGACCCACTTA AAtTACAcATACCCAGCATTGAACGTGAC (SEQ ID NO. 17)和 B4 底GTCACGTTCA ATGCTGGGTATgTGTAaTTTAAGTGGGTCAACCAATTC (SEQ ID NO. 18)以獲得序列 NWLTHLNYTYPALNV(SEQ ID NO. 19)；和引物 B5 頂GAATTGGTTGACCCACTTA AAAaACAAAacCCCAGCATTGAACGTGACTATG (SEQ ID NO. 20)禾口 B5 底CATAGTC ACGTTCAATGCTGGGgtTTTGTtTTTTAAGTGGGTCAACCAATTC (SEQ ID NO. 21)以獲 得序列 NWLTHLKNKTPALNVTM (SEQ ID NO. 22)。C 位點改變可以使用弓丨物 C1 頂GATCAGATGCACCCATTGGCAAtTGCAgTTC TGAATGCATCACTCC (SEQ ID NO. 23)禾口 Cl 底GGAGTGATGCATTCAGAAcTGCAaT TGCCAATGGGTGCATCTGATC (SEQ ID NO. 24)以獲得序列 SDAPIGNCSSECIT (SEQ ID
NO. 25)。D 位點改變可以使用弓丨物 D1 頂CTATATGCTCAAGCATCAGGAAatATCACAG TCTCTACCAAAAG (SEQ ID NO. 26)和 Dl 底CTTTTGGTAGAGACTGTGATatTTCCTG ATGCTTGAGCATATAG (SEQ ID NO. 27)以獲得序列 LYAQASGNITVSTKRS (SEQ ID NO.
28)。E 位點改變可以使用引物 El 頂GATGGCTTCCAAAATAAGAcATGGGACCTTT TTGTTGAAC (SEQ ID NO. 29)禾口 El 底GTTCAACAAAAAGGTCCCATgTCTTATTTTG GAAGCCATC (SEQ ID NO. 30)以獲得序列 DGFQNKTWDLFVE (SEQ ID NO. 31)。
13
HAS 1 CAGTCCTCATCAGATCCTTG (SEQ ID NO. 32)， HAS 2 GGTAAGGGATATCTCCAGCAG (SEQ ID NO. 33)引物可被用于測序，以 HAS 3 cgcgattgcgccaaatatgcc (SEQ ID NO. 34)作為陰性對照。許多抗原性位點是富電荷的氨基酸基團。另一個方法是使用丙氨酸基團那些帶 電荷基團。這種變化的例子包括在A位點中KRR到AGA ； B位點中的KYKY (SEQ ID NO. 3)到 AYKY (SEQ ID NO. 35)和 SDQI 到 SAQI (SEQ ID NO. 36) ； C 位點中的 KCN 到ACN和D位點中的RIT到AIT。此外，在評價B位點中憎水酪氨酸基團的功能時，可以使用SLT替代SLY獲得突變。除B細胞抗原決定簇之外,T細胞抗原決定簇同樣可被免疫抑制。主要的CD4 抗原決定簇在基團177到199區(qū)域，含有在已結合的B位點外的MHC II型結合抗原 決定簇。在基團LYIWGVHHP(SEQ ID NO. 37)以抑制T細胞反應的突變包括使用 VYIW (SEQ ID NO. 38)或 VTIW (SEQ ID NO. 39)替代 LYIW ；以及使用 IHAG (SEQ ID NO. 40)替代 VHHP。為從管理機構，比如美國食品和藥品管理局或歐洲藥品管理局獲得人用產品 批準，生物學制劑必須滿足由相關管理機構確定的純度、安全和效力標準。為生產 滿足那些標準的疫苗，重組生物可培養(yǎng)在，例如被證明無傳染性海綿腦病(在此稱為
“TSE” )的培養(yǎng)基中。例如，質粒裝載有攜帶非抗生素選擇標記的疫苗編碼序列，因為使用抗生素抗 性標記在細菌中進行為人類設計的質粒的選擇及維持并不總是理想的，優(yōu)選的方案涉及 重組亞單位疫苗的使用。在一個實例中，本發(fā)明提供一種選擇策略，例如，通過使細 菌在含有所述分解酶的底物作為碳源的培養(yǎng)基中生長，分解酶被用作選擇標記。這種 分解酶的例子包括，但不限于，IacYZ編碼乳糖攝取和β-半乳糖苷酶(Genbank Nos. J01636, J01637, Κ01483或Κ01793)。其他在合成培養(yǎng)基中提供代謝優(yōu)勢的選擇標記 包括，但不限于，用于利用半乳糖的galTK(GenBank No. Χ02306)、用于利用蔗糖的 sacPA(GenBank No. J03006)、用于利用海藻糖的 trePAR(GenBank No. Z54245)、用于利 用木糖的xylAB(GenBank No. CAB 13644和AAB 41094)等。此外，選擇可以涉及運用 反義mRNA以遏制毒性等位基因，比如sacB等位基因(GenBankNo. NP_391325)。為測試，目標免疫原被施用于非人類哺乳動物，以獲得例如，臨床前數據。典 型的非人類哺乳動物包括非人類的靈長類動物、狗、貓、嚙齒類動物及其他哺乳動物。 這種哺乳動物可建立使用制劑治療疾病的動物模型，或被用于研究目標免疫原的毒性。 在那些實例中每一個，劑量增加研究可以哺乳動物中進行。在本文描述的用于制備新型疫苗和制劑的具體方法，對本發(fā)明而言并不是必須 的，或選自或可包括生理緩沖液(Feigner等人，美國專利5,589,466 (1996));磷酸鋁或磷 酸羥基鋁(aluminum hydroxyphosphate)(例如 Ulmer等人，Vaccine, I8:18 (2OOO)),單磷 酰脂 A (Monophosphoryl-Iipid A)(也稱為 MPL 或 MPLA) (Schneerson 等人 J. Immunol., 147:2136-2140 (1991)；例如 Sasaki 等人 Inf. Immunol., 65:3520-3528 (1997)；以及 Lodmell 等人 Vaccine, 18:1059-1066 (2000)), QS-21 皂甙(e.g. Sasaki 等人，J. Virol., 72:4931 (1998))；地塞米松(例如，Malone 等人，J. Biol. Chem. 269:29903 (1994)) ； CpG DNA 序列(Davis 等人，J. Immunol., 15:870 (1998));干擾素-a (Mohanty 等人，J.Chemother. 14(2):194-197, (2002)),脂多糖(LPS)拮抗劑(Hone 等人，J. Human Virol., 1: 251-256 (1998))等。出于被治療疾病的具體癥狀，制劑在此也可含有超過一種活性物質，優(yōu)選那些 活性互補并且彼此之間無不利影響的。例如，進一步提供助劑也許更為合適。這種組 合物中的分子以足夠有效實現預定目標的適當量存在。助劑可以在抗原施用前后相繼施用。目標免疫原可與第二組分使用，比如，作為一種治療方法，不同的治療性組分 相結合或混合，結合、在組合分離、在使用前混合等方式施用(參見，例如，Levine等 人，eds., New Generation Vaccines. 2nd Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1997)。治療齊Ll 可以是任何用于預定目的的藥物、疫苗等。因此，治療劑可以是生物制劑、小分子等。 目標免疫原可與例如，免疫抑制或不抑制的第二流感免疫原組合物同時或相繼施用。因 此，免疫抑制的目標抗原可與現有疫苗相結合，但是，如果現有疫苗是在蛋中制造的， 該方案中將盡量少使用現有疫苗。術語“小分子”及類似術語包括，但不限于，肽、模擬肽 (peptidomimetics)、氨基酸、氨基酸類似物、多核苷酸、多核苷酸類似物、碳水化合
物、脂、核苷酸、核苷酸類似物，分子量小于約lOOOOg/mol的有機或無機化合物(即包 括異有機物(heterorganic)和/有機金屬(organometallic)化合物)，分子量小于約 5000g/mol的有機或無機化合物，分子量小于約lOOOg/mol的有機或無機化合物，分子量 小于約500g/mol的有機或無機化合物，和鹽、酯或其組合及其他藥學可接受的，刺激免 疫反應或是免疫原性的，或具有所要求藥學活性混合物的形式。因此，本發(fā)明的免疫原 可以單獨施用或與其他類型的治療相結合，包括第二免疫原或用于將治療疾病的治療方 法。第二組分可為免疫刺激原(immunostimulant)。此外，本發(fā)明的免疫原可與各種效應分子比如異源肽、藥物、放射性核苷 酸(radionucleotides)等相結合，參見，例如 WO 92/08495 ； WO 91/14438 ； WO 89/12624 ；美國專利5314995 ；和EPO 396387。免疫原可與治療性物質比如抗生素(例 如，治療劑或放射性金屬離子(例如，α發(fā)射體，比如，例如Bi 213))或助劑相結合。 本發(fā)明的治療性混合物至少減輕一個與流感有關的癥狀。如本領域技術人員所知或如本 文所描述的，本發(fā)明的產品可以提供在藥學可接受的組合物中。術語“生理學可接受 的”，“藥理學可接受的”等意味著經聯(lián)邦州政府管理機構或列于美國藥典或其他一般 的，用于人類的認可藥典中。目標產品可以任何可接受的方式施用到哺乳動物中。引入的方法包括，但不限 于，不經腸道、皮下、腹膜內、肺內、鼻內、硬膜外、吸入和口服，如果用于抑制免疫 力的療法，病灶內施用。不經腸道的引入包括肌內、真皮內、靜脈內、動脈內或腹膜內 施用。產品或組合物可以任何方便的方式施用，例如，通過輸液或顆粒注射，通過透皮 或粘膜與皮膚層(例如，口腔粘膜、直腸腸粘膜等)吸收，并可與其他生物活性劑一起 施用。施藥可以是全身性的或局部的。此外，通過任何合適的方式，包括心室內和腦脊 髓膜內注射，將本發(fā)明的治療性產品或組合物引入中樞神經系統(tǒng)也許是理想的；心室內 注射可以通過心室內導管例如，連接到儲液囊，如Ommaya儲液囊而易化。此外，產品可與恰當地配合使用脈輸液，特別是目標產品的劑量衰減時。優(yōu)選的，制劑通過注射， 優(yōu)選靜脈或皮下注射給予，這部分取決于施用是否是短暫的或慢性的。已知有多種其他輸送系統(tǒng)，并可用于施用本發(fā)明的產品，包括，例如，脂質體、 微?；蛭⒛z囊包覆(參見 Langer, Science 249:1527 (1990)； Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein 等人，eds., (1989))?？砂谖⒛z囊中活性成分的制備是，例如，通過傳統(tǒng)技術，在膠質給藥 系統(tǒng)(例如，脂質體、白蛋白微球體、微乳液、納米顆粒和納米膠囊)或在巨乳液
(macroemulsions)中，例如，羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠 囊，分別應用界面聚合。這種技術公開在Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osal, Ed. (1980)。肺部施藥可以，例如通過吸入器或霧化器的使用，及具有霧化劑的制劑而實 現。目標組合物還可以以干粉組合物的形式施用到患者的肺，參見，例如美國專利 6,514,496。在需要治療的區(qū)域局部施用本發(fā)明的治療性產品或組合物也許是理想的；這可 以通過，例如而不是作為限制，局部輸液、表面施藥、注射、導管法、栓劑法或植入體
(implant)法實現，所述植入體是滲透性、非滲透性或膠狀材料，包括水凝膠或膜，比 如硅膠彈性體(sialastic)膜或纖維。優(yōu)選的，在施用本發(fā)明產品時，需要注意到使用的 材料不會吸收或吸附蛋白。在另一實例中，產品可以在控釋系統(tǒng)中輸送。在另一實例中，可以使用泵(參 見 Langer, Science 249:1527 (1990); Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald 等人，Surgery 88:507 (1980)；和 Saudek 等人，NEJM 321:574 (1989))。在另一 實例中，可以使用聚合材料(參見 Medical Applications of Controlled Release, Langer 等人， eds., CRC Press (1974) ； Controlled Drug Bioavailability, Drag Product Design and Performance, Smolen 等人，eds., Wiley (1984) ； Ranger 等人，J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); see also Levy 等人，Science 228:190 (1985); During 等人，Ann. Neurol. 25:351 (1989); and Howard 等人，J. Neurosurg. 71:105 (1989))。在另一實例，控釋系統(tǒng) 可置于治療目標附近。使用本目標產品時可以制備成緩釋制劑。緩釋制劑的合適例子包括含有免疫 原的固體憎水聚合物半滲透基質，其中基質可以具有一定的形狀，例如，膜狀或基片
(matrices)。這種緩釋基片的合適例子包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-甲基丙烯酸羥 乙酯)、聚(乙烯-乙烯醇))、聚乳酸(美國專利3773919)、L-谷氨酸和乙基-L-谷氨 酸共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙酯、可降解的乳酸_乙二酸共聚物(比如由乳酸-乙二 酸共聚物構成的可注射微球體)和聚D-(_)-3-羥丁酸。聚合物比如乙烯乙酸乙酯和乳 酸-乙二酸允許釋放分子超過100天，而一些水凝膠在短期內釋放細胞、蛋白和產品?？?以根據涉及的機制設計合理的穩(wěn)定策略。組合物可采用溶液、懸浮液、乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、粉末、緩釋制劑、 長效制劑等劑型。與常規(guī)的粘合劑和載體比如甘油三酸酯一起，組合物可配制成栓劑。 口服制劑可含有標準載體比如藥用級甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖鈉(sodium saccharine)、纖維素、碳酸鎂等。適當載體的例子描述在"Remington's Pharmaceutical
16Sciences," Martin.這種組合物將含有有效量的，優(yōu)選以純化形式存在的免疫原，與適當量 的載體一起，以對患者提供恰當的用藥方式。如本領域技術人員所知，制劑的構建要適 合施藥方式。用于儲存的產品的治療性制劑可以制成如凍干制劑或水溶液，水溶液通過將具 有所需純度的產品與本領域常用的任意藥學可接受的載體，稀釋劑，賦形劑或穩(wěn)定劑， 即緩沖劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、等滲劑(isotonifier)、非離子型表面活性劑、抗氧化劑及 其他各種添加劑混合得到，參見 Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Osol, ed.
(1980)。在應用的劑量和濃度下，這種添加劑對受體一般是無毒的，因此，賦形劑，稀 釋劑，載體等是藥學可接受的。免疫再聚焦多肽(包括抗原、部分抗原、抗原決定簇、決定簇等，可生產為基 本無污染蛋白，包括其他流感蛋白，與其他病毒或非病毒多肽相結合；作為可以在重組 病毒中表達或生產的目標IR多肽、VLP或與一種或多種病毒或細胞源蛋白相結合；作為 可作為純化分子表達或生產的IR多肽與一種或多種病毒或細胞源蛋白相結合；等)可以 基本以純態(tài)獲得或制取?！胺蛛x的”或“純化的”免疫原是基本上無源自獲取免疫原的 培養(yǎng)基的污染蛋白，或基本上無化學前體或其他含有化學合成組分的培養(yǎng)基中使用的化 學品。用語“基本上無亞細胞材料”包括處理細胞，其中細胞被打破以形成可從細胞的 亞細胞元件分離的組分，包括死細胞和細胞部件，比如細胞膜、細胞鬼影等，免疫原可 以從中分離或重組生產。因此，基本上無亞細胞材料的免疫原包括制備的免疫原含有小 于約30%、25%、20%、15%、10%、5%、2.5%或1% (干重)的亞細胞污染物，或任何 其他與目標產品不同的成分。在本文，在液體制劑中的術語“穩(wěn)定性”和“穩(wěn)定的”指與免疫原抗性有關 的免疫原在制劑中對熱和化學聚合、降解或斷裂在給定的生產、配制、運輸和儲藏條件 下，比如，1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月或更長時間。本發(fā)明的“穩(wěn) 定”制劑在給定的生產、配制、運輸和儲藏條件下，保持相等或大于80%、85%、90%、 95%、98%、99%或99.5%的生物活性。所述免疫原制劑的穩(wěn)定性可以由聚合、降解或 斷裂的程度確認，本領域技術人員所熟知的方法包括，但不限于，物理觀察，比如，使 用顯微鏡、粒子大小和數量的確定等，與參考相比較。術語“載體”，涉及與治療劑一起施用的稀釋劑、助劑、賦形劑或媒介。這種 生理學載體可以是滅菌的液體，比如水和油，包括那些石油、動物、植物或合成源的， 比如花生油、豆油、礦物油、芝麻油等。當藥用組合物是靜脈施用時，水是一種合適的 載體。鹽溶液和水性葡萄糖和甘油溶液也可用作液體載體，特別是可注射的溶液。合 適的藥用賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、凝膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅 膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、乙醇等。 如果需要，組合物同樣可含有少量潤濕或乳化劑，或pH緩沖劑。載體可包括鹽和/或緩 沖液。緩沖劑輔助維持pH在近生理條件范圍內。緩沖液優(yōu)選以約2mM到約50mM的 濃度存在。用于本發(fā)明的合適的緩沖劑包括有機和無機酸兩者，及其鹽，比如檸檬酸鹽 緩沖液(例如,檸檬酸一鈉_檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸鈉混合物、檸檬酸-檸檬 酸一鈉混合物等)、琥珀酸鹽緩沖液(例如，琥珀酸_琥珀酸一鈉混合物、琥珀酸-氫氧化鈉混合物、琥珀酸_琥珀酸二鈉混合物等)、酒石酸鹽緩沖液(例如，酒石酸_酒石酸 鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物等)、延胡索酸鹽緩沖液 (例如，延胡索酸-延胡索酸一鈉混合物、延胡索酸-延胡索酸二鈉混合物、延胡索酸一 鈉-延胡索酸二鈉混合物等)、葡萄糖酸鹽緩沖液(例如，葡糖酸-葡糖酸鈉混合物、葡 糖酸-氫氧化鈉混合物、葡糖酸-葡糖酸鉀混合物等)、乙二酸鹽緩沖液(例如，草酸-草 酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物等)、乳酸鹽緩沖液(例如， 乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)、和乙酸鹽緩沖 液(例如，乙酸_乙酸鈉混合物、乙酸_氫氧化鈉混合物等)。也可使用磷酸鹽緩沖液、 碳酸鹽緩沖液、組氨酸緩沖液、三甲胺鹽，比如Tris、HEPES及其他這種已知的緩沖液?？商砑臃栏瘎┮砸种莆⑸锷L，其添加量可在0.2%-l%(w/V)之間。用 于本發(fā)明的合適防腐劑包括苯酚、苯甲醇、間甲酚、十八烷基二甲基芐基溴化銨
(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride)、苯甲烴銨(benzyaconium)商化物(M 如，氯化物、溴化物和碘化物)、氯化六烴季銨、烷基對羥苯甲酸比如甲基或丙基對羥苯 甲酸、兒茶酚、間苯二酚、環(huán)己醇和3-戊醇。等滲劑的存在在于保證本發(fā)明液體組合物的生理等滲性，等滲劑包括多羥基糖 醇，優(yōu)選三羥基或更多羥基糖醇，比如甘油、赤藻糖醇(erythritol)、阿拉伯糖醇、木 糖醇、山梨糖醇和甘露醇。按重量計，相對與其他組分的相對量，多元醇可以約0.1到約 25%的量存在，優(yōu)選約1%到約5%。穩(wěn)定劑是一種寬范的賦形劑，其功能可從填充劑到添加劑，可使治療劑溶液化 或輔助防止降解或粘附到容器壁。典型的穩(wěn)定劑可以是多羥基糖醇；氨基酸，比如精 氨酸、賴氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、丙氨酸、鳥氨酸、L-亮氨酸、 2_苯丙氨酸、谷氨酸、蘇氨酸等；有機糖或糖醇，比如乳糖、海藻糖、木蘇糖、阿拉 伯糖醇、赤藻糖醇、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇(myoinisitol)、半乳 糖醇、甘油等，包括環(huán)多醇比如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫還原劑，比如尿 素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙酸鈉、硫甘油、α-硫代甘油、和硫代硫酸鈉；低分子 量多肽(即< 10個基團)；蛋白，比如人血清白蛋白、牛血清清蛋白、明膠或免疫球蛋 白；親水聚合物，比如聚乙烯吡咯烷酮、糖類、單糖，比如木糖、甘露糖、果糖或葡萄 糖；二糖，比如乳糖、麥芽糖和蔗糖；三糖，比如棉子糖；聚糖，比如右旋糖酐等。穩(wěn) 定劑可以0.1到lOOOOw/w每份免疫原的范圍存在。此外的雜項賦形劑包括填充劑，(例如淀粉)、螯合劑(例如EDTA)、抗氧化劑 (例如抗壞血酸、甲硫氨酸或維生素E)和助溶劑。在本文，術語“表面活性劑”是具有雙親結構的有機物，也就是由溶解性傾向 對立的基團構成，一般是油溶性烴鏈和水溶性離子基團。根據表面活性部分的電荷性， 表面活性劑可分為陰離子、陽離子和非離子型表面活性劑。在多種藥用組合物和生物材 料制劑中，表面活性劑經常用作潤濕、乳化、增溶和分散劑?？商砑臃请x子型表面活性劑或去垢劑(又名“潤濕劑”)以助于治療劑的溶 液化，以及保護治療性蛋白對抗攪動誘導的聚集，同樣使制劑在不引起蛋白變性的情況 下承受剪切面應力。合適的非離子活性劑包括聚山梨酸酯(20、80等)、聚環(huán)氧乙烷
(polyoxamers)、Pluronic ？ 多元醇和聚山梨酯(TWEEN -20 , TWEEN -80 等)。非離子活性劑可以約0.05mg/ml到約1.0mg/ml的范圍存在，優(yōu)選約0.07mg/ml到約0.2mg/ ml ο在本文，術語“無機鹽”為任何不含碳的，由金屬或類似金屬的基團替換部分 或所有酸式氫或酸得到的，在藥用組合物和生物材料制劑中通常作為強度調節(jié)劑的化合 物。最覺的無機鹽是NaCl、KCL NaH2P04等。本發(fā)明免疫原的液體制劑的pH在約5.0到7.0，或約5.5到約6.5，或約5.8到約 6.2，或約6.0，或約6.0到約7.5，或約6.5到約7.0之間。本發(fā)明涵蓋的制劑，比如液體制劑在商用冷藏柜和醫(yī)用或實驗室用冷凍機可創(chuàng) 造的溫度下，比如從約-20°C到約5°C具有儲存穩(wěn)定性，例如約60天、約120天、約180 天、約1年、約2年或以上，穩(wěn)定性通過，例如顯微觀察確定。本發(fā)明的液體制劑也具 有應用穩(wěn)定性，在室溫下，使用前具有至少數小時，比如1小時、2小時或約3小時的穩(wěn) 定性，穩(wěn)定性通過，例如顆粒分析確定。稀釋劑的例子包括磷酸緩沖鹽、用于緩沖對抗胃囊中胃酸的緩沖液，比如含有 蔗糖的檸檬酸鹽緩沖液(PH7.4)、單獨的碳酸氫鹽緩沖液(pH7.4)，或含有抗壞血酸、乳 糖或阿斯巴甜的碳酸氫鹽緩沖液(pH7.4)。載體的例子包括蛋白，例如，在脫脂乳中發(fā)現 的蛋白，糖，例如蔗糖，或聚乙烯吡咯烷酮。一般的，載體將以約0.1-90%(w/v)的濃 度使用，但是優(yōu)選的范圍為1-10%(w/v)。在活體內使用的制劑必須無菌的。這可以通過，例如通過無菌過濾膜過濾實 現。例如，本發(fā)明的亞細胞制劑可通過過濾滅菌。免疫原組合物將按與GMP要求一致的方式進行配制、醫(yī)治和施用?？紤]因素包 括疾病的嚴重程度、被治療的具體哺乳動物、具體患者的臨床情況、擾亂的原因、用藥 位點、施藥方法、施藥進程，及其他為醫(yī)生所知的因素。要使用的免疫原的“治療有效 量”受這種考慮支配，其最低用量應當足以防止、改善或治愈目標疾病、情況或紊亂。抗原的量是足以在目標宿主中誘導所需的體液和/或細胞介導的免疫反應的 量。本發(fā)明免疫原的施用量將有所變化，取決于目標的種類，宿主的物理特性，比如年 齡、體重等，優(yōu)選的給藥方式等。一般的，應用的劑量可以約10到約1500yg/次。作為 比較，現有的亞基制劑含有源自三種病毒亞型的組分。三價疫苗一般含有約7到約25 μ g 的來自3種選用菌株的HA。這可以作為目標疫苗組合物的滴定原點。在本文，術語“有效量”是足以降低目標疾病的嚴重程度和/或持續(xù)期、改 善其一個或多個癥狀、防止目標疾病的發(fā)展或引起的康復，或足以引起預防發(fā)展、再 發(fā)生、發(fā)作，或目標疾病或其一個或多個癥狀惡化的治療量。例如，基于基準或正常 水平，治療可以以至少以5%，優(yōu)選至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少 30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、 至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%，或至少100%的程度 提高宿主的幸存率或降低疾病的嚴重程度。在另一實例，治療性或預防性制劑的有效量 至少以5%，優(yōu)選至少10%、至少15、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少 40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、 至少80%、至少85%、至少90%、至少95%，或至少100%的程度減輕目標疾病的癥狀， 比如流感癥狀或病程。在此實用是與術語“治療有效量”相當的表述。
必要時，組合物還可以含有增溶劑和局部麻醉劑，比如利多卡因或其他“卡 因”麻醉劑以減輕注射位點的疼痛。一般的，在單位劑型中，組分是分離或共同混合供應的，例如，作為干燥凍干 粉末或無水濃縮物存在于密閉容器，比如安瓿或小袋并標明活化劑的量。當組合物通過 輸液施藥時，可在含有無菌藥用級水或鹽水的輸液瓶中配制。當組合物是通過注射施藥 的，可，例如在一套裝提供一安瓿的滅菌注射用水或鹽水，這樣組分可以施用前混合。 此外，安瓿可含有具有目標活化劑的液體，例如，在使用前以需稀釋的濃縮物或以用于 施藥的形式存在?？商峁┖袑ι鲜鑫蓙y的治療有用的材料的制品。制品可包括容器和標簽。合 適的容器包括，例如瓶、小瓶、注射器和試管。容器可由各種材料比如玻璃或塑料制 成。容器容納目標組合物，并可無菌入口(例如，容器可以是具有截止的靜脈溶液袋或 小瓶，可由皮下注射針刺破)。在容器上或與容器有關的標簽標明組合物是用于治療流感 的。制品可進一步包括含有藥學可接受緩沖液，比如磷酸緩沖鹽、Ringer溶液或葡萄糖 溶液的第二容器。它可進一步包括對商業(yè)和患者來說是合理的其他材料，包括緩沖液、 稀釋劑、過濾器、針、注射器和具有使用指南的包裝說明書。本發(fā)明同樣包括套裝，例如，含有目標免疫原組合物、其同源物、衍生物等， 作為，例如疫苗，并用于相同用作的說明等。說明可包括用于制備組合物、衍生物等的 方法。組合物可以液態(tài)或固態(tài)，一般為干燥或凍干的形式存在。套裝可包含合適的其 他試劑，比如緩沖液，再配制溶液及其他實現預期用途的必要組分。預期以預定的量包 裝組合試劑，并說明其用途，例如用于治療性用途。此外，可含有其他添加劑，比如穩(wěn) 定劑、緩沖液等。各種試劑的相對量可改變，以提供試劑溶液的濃縮物，這將提供柔性 的、經濟的空間，經濟的試劑等。套裝可包括給藥裝置，比如含有針的裝置，比如注射 器，裝置優(yōu)選的可與目標組合物預裝，在需要時給藥。在上文論述的任何參考的引證，不應認為任何這種參考對本發(fā)明而言是在先技 術。在此的引用所有參考，在此作為參考全文引入。現在通過以下非限制性的例子示例性說明本發(fā)明。實施例1
8個免疫抑制的并再聚焦的源自Wyoming菌株(H3N2)的血凝素基因按上述的方法進 行設計并工程化。例如，核苷酸通過位點定向誘變被替換，以將引起復雜的碳水化合物 修飾，和/或氨基酸的缺失和/或電荷變化的N連接序列肽段引入5個含有IDNPE的主 要免疫原的并劇烈變化位點中。N連接序列肽段的引入被用于最大化由每一改變引起的，特別是在更大的抗原 性位點的免疫抑制的效果，同時減少要求抑制的野生型氨基酸變化的數量，并最小化任 何對糖蛋白構象復雜性和受體結合區(qū)的影響。在一些情況下，只需要3個氨基酸變化。 抗原性位點B (187-196)結合B細胞和CD4助T細胞的IDNPE 二者。為加快研究，制備DNA和蛋白質亞單位疫苗二者。對DNA免疫，全長的血凝 素基因被克隆入pTriEx載體(invitrogen)，位于巨細胞病毒(CMV)啟動子之后。使用 pTriEx-HA結構瞬時轉染哺乳動物細胞顯示全長血凝素基因類似原始病毒蛋白質，表達 為三聚體并可從質膜提取物被溶劑化。
使用含有那8個突變的和一個未修飾的全長野生型HA糖蛋白的DNA結構免疫 9組遠親鼠。第10組使用空白pTriEx載體免疫作為陰性對照。除DNA表達載體之外，都產生了用于免疫的重組蛋白質。HA的膜外部分含有 用于三聚糖蛋白錨釘裝配并結合宿主細胞受體的區(qū)域。此外，跨膜和細胞質區(qū)的去除引 起重組HA三聚體被釋放到培養(yǎng)基表面。因此，HA基因的每一個變化都是在胞外域的尾 部進行的，并克隆到具有噬菌體T7啟動子的載體中。將胞外域載體轉染進入感染有表達 噬菌體T7 RNA聚合酶的重組牛痘病毒的細胞中，導致HA三聚體的產生，HA三聚體被 分泌到培養(yǎng)基質中。胞外域三聚體被純化用于蛋白免疫原。鼠被預分類。一組鼠用作陰性對照，另一組使用未修飾的(野生型)抗原免 疫。在另一組實驗，主群中的鼠通過將10微克突變的HA糖蛋白DNA(在0.1ml的 無菌水中)注射到四頭肌中免疫。5周后，使用第二 DNA免疫強化鼠。又4-5周后， 鼠再次通過2次皮下注射10微克純化的胞外域糖蛋白中的一個進行免疫強化。第一個蛋 白免疫原配制在完全弗氏助劑(Freund’ s Adjuvant)中，第二個在不完全弗氏助劑中。 在最終免疫2周后，鼠被安樂死并放血得到血清。測試血清以1)確定與突變株的反應性和野生型HA蛋白在蛋白質印跡和ELISA 中形式，2)通過肽ELISA識別線狀抗原決定簇，3)保護構象抗原決定簇免受蛋白酶的降 解，和4)通過血凝抑制反應和同源和異源流感菌株的病毒中和進行功能測試。HA特異性ELISA測量表明，來自使用免疫再聚焦HA亞基工程化得到的抗原 免疫的鼠得到的血清導致高滴定度抗血清的產生。所有組的鼠對野生型HA的滴定度在 1:100-300000之間。各種突變HA糖蛋白的下游選擇基于標準HI試驗中抗血清對HI抗 體的跨亞型能力。H3N2 A/Wyoming/03/2003 的 A2、Bi、B2、B3、CE、CEB4、CEB 5，以及
Dl突變株具有相等或更高的針對用于試驗的異源病毒亞型的跨亞型HI和/或病毒中和滴 定度。因此，在體外通過標準化和可接受的HI替代品和病毒中和試驗的測量表明，免 疫抑制和再聚焦導致產生的HA糖蛋白亞單位候選疫苗可引起顯著提高的跨亞型抗病毒防 護。突變株A2的突變在HA的抗原決定簇A中，其中KRRSNKS (SEQ ID NO. 1)被
GG替代。Bl突變發(fā)生在HA的抗原決定簇B，在氨基酸的197位(QIS到NAS)引入了糖 基化位點。B2突變發(fā)生在HA的抗原決定簇B中，在氨基酸189位點(SDQ到NVT)引 入了糖基化位點。B3突變發(fā)生在HA抗原決定簇B中，在氨基酸的193位點(SLYNIT) 引入了糖基化位點。CE含有兩個突變，在抗原決定簇C的276位(KCN—NCT)引 入了糖基化位點，并在抗原決定簇E的83位(NKK —NKT)引入了糖基化位點。CEB 4是在抗原決定簇B具有額外突變的CE，糖基化位點添加在158位(KYK —NST)。 CEB 5是在抗原決定簇B具有額外突變的CE，糖基化位點添加在159位。Dl的突變在 HA的抗原決定簇D中，在氨基酸的201位(RIT到NIT)引入了糖基化位點。在另一組實驗中，測試再聚焦多肽抗原的血球凝集素抑制滴定度和血清中和滴 定度，與不同的H3N2病毒菌株相比較。突變體來自A/Wyoming /2003菌株。M3具 有抗原決定簇B2 ； M5具有抗原決定簇CE ； M6具有上述的抗原決定簇B4CE。將鼠暴露于各種突變蛋白，A/Wyoming/2003菌株病毒作為野生型陽性對照，單獨載體作為 陰性對照。然后測試鼠血清對3個菌株，Wyoming菌株的同源菌株、Panama /1999和 Wellington /2004菌株的血球凝集素抑制滴定度。測試其他鼠血清對Wyoming菌株的同 源菌株、Korea /2003、Brisbane /9/2006 和 Brisbane/10/2007 菌株的血清中和滴定度。 來自暴露于單獨載體的鼠的對照血清未產生可與Wyoming、Panama和Wellington菌株反 應的特異性血球凝集素抑制抗體(滴定度=10)。暴露于野生型Wyoming病毒的鼠產生 了可與Wyoming和Wellington菌株反應的抗血清(滴定度=226)。與野生型相比，突 變株M5產生的抗血清與Wyoming和Wellington菌株的反應性是野生型的2倍多(滴定 度=2560)，與Panama菌株的反應性(滴定度=1920)僅略低。突變株M6產生的抗血 清與Panama和Wyoming菌株的反應性(滴定度分別為2560和1280)約為突變株M5水 平的一半。但是，當暴露于Wellington菌株時，突變株M6產生了高抑制性抗血清，具 有比所有其他滴定度高4倍的滴定度(滴定度=10240)。因此，當使用3處修飾的突變 蛋白時，除同源菌株外，免疫再聚焦引起針對其他2種菌株的更寬反應，并具有極高的 針對Wellington菌株的反應。在中和研究中，暴露于載體的鼠未產生特異性抗體。暴露 于Wyoming菌株的鼠產生的抗血清與Wyoming菌株反應強烈(滴定度=640)；對Korea 和Brisbane2006的滴定度是Wyoming的1/4 (滴定度=160)；與Brisbane2007基本沒 有反應性(滴定度=20)。在鼠抗血清中產生的M3突變蛋白在Wyoming、Brisbane2006 和Brisbane2007中的反應性是野生型免疫原的4倍(滴定度=2560)?？寡宀慌cKorea 菌株反應(滴定度=3)。暴露于M5的鼠產生的抗血清與Wyoming菌株反應(滴定度 =80)，是與Brisbane2006菌株反應性的兩倍(滴定度=160)，是與Korea菌株反應性的 30倍(滴定度=2560)。抗血清基本不與Brisbane2007菌株反應(滴定度=20)。因 此，通過目標抗原的免疫再聚焦實現了針對其他3個菌株的變寬的反應。實施例2
通過在21CFR610的規(guī)程評價重組免疫原的安全性、毒性和效力，規(guī)程包括(i ) 基本安全性試驗，以及( )急性和慢性毒性試驗。免疫原性數據來自可接受的，對人類流感疫苗反應良好的動物模型(例如豚 鼠、鼠、雪貂或棉鼠)。研究包括與劑量有關的和使用疫苗的不同劑量的免疫反應的評 價，疫苗含有用于最終產品的菌株。在相應動物模型的免疫原性研究被用于證明生產的 一致性，特別是在用于新型流感病毒制造過程的驗證階段。選定用于動物研究的合適的 非臨床終點包括死亡、體重下降、病毒排泄率、臨床癥狀比如發(fā)燒、眼鼻頒發(fā)物等。使用含有300 μ g目標免疫原的100 μ 1免疫原腹膜內接種雪貂組或其他合適的動 物組。使用合適的陰性和陽性對照。在感染后14天內監(jiān)測動物的一般健康和體重。與接受安慰劑的動物類似，在觀 察期中，接受免疫原的動物保持健康，并沒有體重減輕或顯示出明顯的疾病癥狀。在更嚴格的安全性實驗中，動物組被注射300 μ g的免疫原。在接種后一天，每一組中的3只動物被安樂死并分析脾、肺和肝組織均漿，以 確定免疫原的存在。在感染后第4、8、12和16周，每一組中的3只動物被安樂死，獲 取并分析其脾、肺和肝組織均漿以確定免疫原的存在。與接種安慰劑作為內部對照的動物相比，如果沒有觀察到不利健康的因素且動物體重以正常速率增加，則免疫原被認為是安全的。為評價免疫原的急性和慢性毒性，雪貂組真皮內接種300 μ g量級劑量(graded dose)的免疫原或鹽水。在接種3天后，每一組中的8只動物被安樂死以確定免疫原對動物的急性影響。 在接種28天后，每一組中剩余的8只動物被安樂死以評價對動物的任何慢性影響。在 兩個時間點，獲取每一只動物的體重。此外，宏觀病理學和注射部位的表現都被觀察。 在每一個時間點，取血用于血液化學分析，并進行內臟器官和注射部位的組織病理學分 析。其他動物在0、14和60天給予疫苗，總計3次，針對血凝素的免疫反應通過 ELISA測量，ELISA使用每隔10天從動物收集的血清。流感病毒的中和在收集的血清 中測量，例如，在首次接種80天后。應當清楚，在此優(yōu)選實例中描述的各種變化和修飾，對本領域技術人員來說是 顯而易見的。可在不脫離本發(fā)明構思和范圍，并在不減少其預定優(yōu)點的情況下，做出這 種變化和修飾。因此這種變化和修飾都將處于附加權利要求的范圍內。參考文獻
Thomas Francis, Jr. in Proceedings of the American Philosophical Society, Vol. 104, No. 6 (Dec. 15, 1960), pp. 572-578, according to The Swine Flu Episode and the Fog of Epidemics by Richard Krause in DCD ’ s Emerging Infectious Diseases Journal Vol. 12, No. 1 January 2006 published December 20, 2005。Garrity, R.R., G. Rimmelzwaan, A. Minassian, W.P. Tsai, G. Lin, J.J. de Jong, J. Goudsmit, and P. L. Nara. 1997. Refocusing neutralizing antibody response by targeted dampening of an immunodominant epitope. J. Immunol. 159:279—89。Kohler H, Goudsmit, J. Nara P. Clonal dominance: cause for a limited and failing immune response to HIV-I infection and vaccination. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 1992; 5(ll):1158-68。Andreansky, S.S., John Stambas, Paul G. Thomas, Weidong Xie, Richard J. Webby, and Peter C. Doherty Consequences of immunodominant epitope deletion for minor influenza virus-specific CD8+ T cell responses. J. Virol. 2005 Apr;79 (7) :4329_39。Nara, P. L., and R. Garrity. 1998. Deceptive imprinting: a cosmopolitan strategy for complicating vaccination. Vaccine 16:1780—7。Nara, P.L., R.R. Garrity, and J. Goudsmit. 1991. Neutralization of HIV-I: a paradox of humoral proportions. FASEB J. 5:2437-55。Nara, P. L., and G. Lin. 2005. HIV-1: the confounding variables of virus neutralization. Curr. Drag Targets Infect. Disord. 5:157-70。Trujiollo, J.D., N.M. Kumpula—McWhirter, K. J. Hotzel, M. Gonzalez, and W.P. Cheevers. 2004. Glycosylation of immunodominant linear epitopes in the carboxy-terminal region of the caprine arthritis-encephalitis virus surface envelope enhances vaccine-induced type-specific and cross-reactive neutralizing antibody responses. J. Virol. 78:9190—202。
權利要求
1.一種分離的組合物，含有在野生型病毒中不是免疫顯性的流感免疫原抗原決定簇。
2.根據權利要求1所述的組合物，含有血凝素。
3.根據權利要求1所述的組合物，含有神經氨酸酶。
4.根據權利要求1所述的組合物，含有流感病毒顆粒。
5.根據權利要求4所述的組合物，其中所述顆粒是滅活的。
6.根據權利要求1所述的組合物，其中所述組合物包括糖基化位點的添加或去除。
7.根據權利要求1所述的組合物，其中所述組合物包括氨基酸的添加、置換或去除。
8.根據權利要求1所述的組合物，含有類病毒顆粒。
9.根據權利要求1所述的組合物，表達在流感病毒的表面。
10.根據權利要求1所述的組合物，還包括藥學可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了用作流感免疫原的新型組合物。組合物可使宿主對正常不為宿主所識別的免疫原位點反應。
文檔編號A61P31/16GK102014953SQ200980113283
公開日2011年4月13日 申請日期2009年2月20日 優(yōu)先權日2008年2月21日
發(fā)明者G·J·托賓, G·林, P·L·奈良 申請人:生物模仿公司