專利名稱：丹參酮類化合物的抗腫瘤用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物藥用成分和抗腫瘤化合物領(lǐng)域，特別涉及的是從中藥丹參 (Salvia miltiorrhiza Bge.)中提取的具有明顯預(yù)防和治療腫瘤作用的有效成分丹參酮 類化合物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前全世界每年有數(shù)百萬人死于癌癥，新發(fā)病例還在逐年增加。我國(guó)13億人口中 每年有百萬人死于癌癥，癌癥已成為第一位死因。 目前，化療及放療為治療癌癥的首選，但對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性較差因而具有較大 的毒副作用以及某些腫瘤細(xì)胞對(duì)化療和放療處理的不敏感，因此在很大程度上限制了它們 在臨床中的應(yīng)用。近年來，為了開發(fā)出能特異性地殺傷癌細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞毒負(fù)作用較小 的藥物。因此，研究制備新的抗腫瘤藥物成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域的熱點(diǎn)。 丹參(Salvia miltiorrhiza Bge.)為唇形科丹參屬植物，為一常用中藥?，F(xiàn)代 藥理學(xué)研究表明丹參提取物具有抗腫瘤作用，其中主要研究了丹參酮IIA的抗非小細(xì)胞肺 癌、乳腺癌的作用，很少報(bào)道其它丹參酮類化合物的抗腫瘤作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種丹參酮類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述丹參
酮類化合物具有以下結(jié)構(gòu)通式
o 其中，&可以為H、 CH3、 CH2CH3、 CH2CH = C (CH3) 2、 0H、 0CH3、 NH2、 = 0、 A1'2等取代基 的任一種；R2可以為=CH2、CH3、 (CH3)2等取代基團(tuán)中的任一種。主要涉及以下4種化合物
4
l(丹參新酮) 2(1-oxomiltirone)
3(4-methylenemiltirone) 4(1，2-didehydromiltirone) 本發(fā)明的化合物所述的抗腫瘤包括腦瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、 宮頸癌、胃癌、食道癌等。 本發(fā)明的化合物也可以用于制備癌癥化學(xué)預(yù)防藥物、抗炎藥物及抑制腫瘤血管生 成的藥物。 以MTT法進(jìn)行抗腫瘤作用的篩選，結(jié)果顯示，本發(fā)明的丹參酮類化合物處理的腫 瘤細(xì)胞系如人髓白血病細(xì)胞(HL60)、腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U87)、乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、肺癌細(xì)胞 (H460)、人肝癌細(xì)胞(H印G2)、人前列腺細(xì)胞(PC3)、人結(jié)腸癌細(xì)胞(SW480)、人宮頸癌細(xì)胞 (Hela)隨著用藥濃度增高與相應(yīng)不加藥對(duì)照組相比細(xì)胞增殖活性分別下降了，說明化合物 呈濃度依賴性抑制腫瘤細(xì)胞增殖。 以MTT法進(jìn)行癌癥化學(xué)預(yù)防的篩選，結(jié)果顯示，本發(fā)明的丹參酮類化合物能顯著 誘導(dǎo)醌還原酶的表達(dá)。 以官腔形成法進(jìn)行腫瘤血管生成抑制作用研究，結(jié)果顯示，本發(fā)明的丹參酮類化 合物能顯著抑制腫瘤血管生成的作用。 本發(fā)明的化合物可與市售或者常用的載體結(jié)合，用于預(yù)防或者治療腫瘤和癌癥。 所述的藥物可以為片劑或者針劑。 本發(fā)明經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，所述丹參酮類化合物為有效的抗腫瘤劑。本發(fā)明用乙醇、氯 仿、甲醇和硅膠等低廉、常見的試劑從中藥材中分離得到丹參新酮類化合物單體，該方法簡(jiǎn) 單可靠，成本低，效率高，可進(jìn)行工業(yè)化大生產(chǎn)，有利于推廣應(yīng)用。


圖1為丹參酮類化合物1的腫瘤血管抑制試驗(yàn)結(jié)果。
5
圖2為丹參酮類化合物2的腫瘤血管抑制試驗(yàn)結(jié)果。
圖3為丹參酮類化合物3的腫瘤血管抑制試驗(yàn)結(jié)果。
圖4為丹參酮類化合物4的腫瘤血管抑制試驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下通過具體的實(shí)施方式的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。但不應(yīng) 將實(shí)施例理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不脫離本發(fā)明上述思想情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù) 知識(shí)和常規(guī)手段作出的各種替換手段或變更，均包含在本發(fā)明之內(nèi)。
實(shí)施例1化合物1-4的制備 丹參藥材(3kg)用8倍量的95%乙醇提取3次，乙醇提取物以石油醚、二氯甲烷、 正丁醇依次萃取。將二氯甲烷層(70g)溶于100mL乙酸乙酯，加70g200-300目層析硅膠拌 樣。以300g 200-300目層析硅膠濕法裝柱，將樣品加入，固定柱子。用石油醚沖洗柱子，
直到柱子內(nèi)充滿液體后換上石油醚乙酸乙酯(ioo : i)流動(dòng)相進(jìn)行洗脫。分別以石油 醚乙酸乙酯ioo : i，50 : i，20 : i，i6 : i，io : i，8 : i，6 : i，4 : i，3 : 1，2 : i， 1.5 : i，i : i，i : i.5，i : 2，i : 3，i : 5，i : io，i : so進(jìn)行洗脫，每個(gè)梯度洗脫容積
為1.6L，分成4瓶，每瓶400mL。將所得溶液濃縮，濃縮液轉(zhuǎn)移至10mL青霉素瓶，點(diǎn)板分析
后將相同樣品進(jìn)行合并。對(duì)石油醚乙酸乙酯8 : i洗脫的部分進(jìn)行分離，主要分離方法
為反相制備液相。以梯度乙腈/水60min內(nèi)從50%-93%進(jìn)行洗脫，26. 3min得2，46. 5min 得1，40min得4，3(再以77%乙腈等度洗脫純化)。其NMR數(shù)據(jù)分別參見表1和表2。
表1化合物1和2的核磁共振氫譜和碳譜數(shù)據(jù)(CDC13，力，500MHz， 13C， 125MHz)
_^__^￡__
1 29.3 3.04(2H,t,聲7.0Hz) 198.8 —218.61.71 (2H,m)36.62.90 (2H， t, J-8.0 Hz)
37.41.59 (2H,m)34.92.06 (2H, t， Hz)
434.0——36.1一
5148,7—153.8一
6133.77.74 (1H, d，風(fēng)5Hz)130.97.26 (1H, d, J"=8.5 Hz)
"7128.27.36 (1H, d， 《/=8.5 Hz)135.57.63 (m， d,J=8,5Hz)
8142.5—130.0一
9127.9一131.9一
10143.9_132.8一
11181.6—183.8一
12]80.5—183.1一
13134.1—146.5一
14139.57.36 (1H， s)137.87.07 (1H, s)
1526.42.87 (1H， m)27.02.33 (1H， m)
1621.21.12(3H,d,6.5Hz)21.51.33 (3H, s)
1721.2U2(3H， d，J-6.5 Hz)21.51.33 (3H，s)
1831.31.26 (3H, s)28.81.16 (3H, s)
1931.31.26(3H, s)28.8U7(3H, s) 表2化合物3和4的核磁共振氫譜和碳譜數(shù)據(jù)(CDC13，力，500MHz， 13C， 125MHz)
132.23.28 (2H， t， J=6,5 Hz)124.77.11 (m， d,".5 Hz)
223.33.03 (2H, m)129.26.33 (1H， m)
329.42.35 (2H， m)38.02.23 (2H, dd,4.0 Hz)
4145.5—34.0一
5138.1—148.0一
6131.17.12 (1H， d，風(fēng)OHz)130,67.86 (1H, d, J^7.5 Hz)
7127.97.85 (1H, d, >8.0 Hz)134.47.50 (1H， d， 《/=7.5 Hz)
8144.7—137.3一
9128.4一124.6一
10136.1_134.3一
11181.4_183.2一
12182.3一181.6一
13143.2一145.0一
14139.77.10 (1H， s)140.07.09 (1H， s)
1527.01.91 (1H, m)26.93.02 (1H， m)
1621.51.19 (3H， d,風(fēng)5 Hz)21.51.17 (3H, d,/=7.0 Hz)
1721,51.19 (3H, d,^6.5Hz)21.51.17 (3H， d,乂:7.0Hz)
18110.35,49 (1H, s), 5.06 (1H， s)28.31.25(3H, s)
19一一28.31.25 (3H， s) 實(shí)施例2化合物1-4的體外抗腫瘤作用實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)期的細(xì)胞每孔3X 104接種于96孔板上，12h后，棄上清，按以下分組給藥 正常對(duì)照組和加藥組(濃度0-100 ii M)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24h，棄上清，加入帶MTT的培養(yǎng)液50 ii 1培養(yǎng)4h (0. 5mg/mL)，加入100 y 1 DMS0，振蕩lh，于酶標(biāo)儀上570nm處測(cè)0D值。
結(jié)果顯示，加藥后，腫瘤細(xì)胞活性明顯下降，而且腫瘤細(xì)胞活性隨著藥物濃度的增 加而降低。結(jié)果詳見表3。 PC3(前列腺癌細(xì)胞)、U87(腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞)、Hela(宮頸癌細(xì) 胞)、SGC-7901 (胃癌細(xì)胞)，上述細(xì)胞株均購自中科院上海細(xì)胞生物研究所。
表3為丹參酮類化合物1-4的體外抗腫瘤試驗(yàn)結(jié)果。
化合物IC50(pg/mL)
PC3U87HelaSGC-7卯1
10.74 ± 0.070.50 ±0.090.11 ±0.031.89 ±0.08
20.23± 0.050.02± 0.010.10 ±0.011.04 ±0.12
3U6±0.130.36 ±0.090.25 ± 0.071.59 ±0.09
40.37 ±0.080.21 ±0.100.19 ±0.031.37±0.16
紫杉醇0.0620.045O細(xì)0.059 實(shí)施例3化合物1-4的醌還原酶誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)期的H印a lclc7細(xì)胞，每孔2Xl(^接種于96孔板上，24h后，棄上清，按一 下分組給藥正常對(duì)照組和加藥組(濃度0-100yM)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24h，棄上清，加 入洋地黃皂苷使細(xì)胞裂解，后加入帶MTT的培養(yǎng)液200 1培養(yǎng)5min (0. 5mg/mL)，于酶標(biāo)儀 上550nm處測(cè)OD值。 結(jié)果參見表4，表4顯示，加藥后，藥物能明顯誘導(dǎo)醌還原酶的表達(dá)，所述細(xì)胞均購 白ATCC。 表4丹參新酮類化合物1-4的醌還原酶誘導(dǎo)結(jié)果。
化合物醌還原酶誘導(dǎo)活性CD(昭/mL) ± SD (Heap lclc7)
10.92±0.21
20.40±0.08
31.04±0.17
40.46±0.15
4'-溴黃酮0.26±0.12 實(shí)施例4丹參酮化合物1-4的腫瘤血管生成抑制實(shí)驗(yàn) 制做加藥板分別取DMSO溶解的丹參酮儲(chǔ)備液(0， 1， 2X 200 ii M) 10 ii L于96孔板 中，每孔再加190iiL PBS稀釋，混勻。備用。 1.鋪膠取45 ii L GFR-Matrigel于預(yù)冷的96孔板中(45 ii L/wel1)，振動(dòng)使其鋪 平，勿引入氣泡。37t:培養(yǎng)箱中放置10min。取出待用。 2.配制細(xì)胞懸液取EAhy926細(xì)胞，消化，用低血清培養(yǎng)基(DMEM，2% FBS， 1%。雙 抗)終止消化，計(jì)數(shù)，離心，用低血清培養(yǎng)基重懸，配成細(xì)胞密度為3X105cell/mL的細(xì)胞懸 液。 3.接種在已鋪好膠的96孔板中加入90 ii L低血清細(xì)胞懸液，再加入10 y L稀釋 過的各濃度丹參酮藥液。 4.培養(yǎng)將板放入缺氧培養(yǎng)箱(37°C ， 95 % N2， 5 % C02)中連續(xù)培養(yǎng)6h。
5.拍照Leica光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野拍照。
8
結(jié)果顯示，加藥后，藥物能明顯抑制官腔的形成，所述細(xì)胞均購自ATCC(參見圖 1-4)。結(jié)果顯示，化合物l-4作用于細(xì)胞后，隨著化合物濃度的增加，能顯著抑制管腔的形 成，說明具有潛在的腫瘤血管生成抑制作用。
權(quán)利要求
一種丹參酮類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述丹參酮類化合物具有以下結(jié)構(gòu)通式其中R1為H、CH3、CH2CH3、CH2CH＝C(CH3)2、OH、OCH3、NH2、＝O、或Δ1，2中的任一種；R2為＝CH2、CH3或(CH3)2中的任一種；具體涉及以下4種化合物1(丹參新酮) 2(1-oxomiltirone)3(4-methylenemiltirone) 4(1，2-didehydromiltirone)F2009101550421C00011.tif,F2009101550421C00012.tif,F2009101550421C00013.tif
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種丹參酮類化合物制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的腫瘤包括腦瘤、前列腺癌、宮頸癌或胃癌。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種丹參酮類化合物制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述化合物在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種丹參酮類化合物制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述化合物在制備抑制腫瘤血管生成藥物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種丹參酮類化合物制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述化合物在制備醌還原酶誘導(dǎo)劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種丹參酮類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述的抗腫瘤包括腦瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、宮頸癌、胃癌、食道癌等。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，所述丹參酮類化合物呈濃度依賴性抑制腫瘤細(xì)胞增殖?；衔锬茱@著誘導(dǎo)醌還原酶的表達(dá)，能顯著抑制腫瘤血管生成的作用。因此也可用于制備癌癥化學(xué)預(yù)防藥物、抗炎藥物及抑制腫瘤血管生成的藥物。本發(fā)明用乙醇、氯仿、甲醇和硅膠等低廉、常見的試劑從中藥材中分離得到丹參新酮類化合物單體，該方法簡(jiǎn)單可靠，成本低，效率高，可進(jìn)行工業(yè)化大生產(chǎn)，有利于推廣應(yīng)用。本發(fā)明丹參酮類化合物具有以下結(jié)構(gòu)通式
文檔編號(hào)A61P35/00GK101732294SQ20091015504
公開日2010年6月16日 申請(qǐng)日期2009年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月14日
發(fā)明者孫芳, 馬忠俊 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)