專利名稱：甘草苷芹糖制劑的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬藥物用途，涉及甘草苷芹糖制劑的用途，具體涉及甘草苷芹糖在制備治療鎮(zhèn)咳、祛痰和平喘藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
隨著全球經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，工業(yè)與民用污染源不斷增加，加之環(huán)境治理不力等因素，呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，其引起的死亡率也逐年上升。不過(guò)，這也給生產(chǎn)呼吸系統(tǒng)疾病藥物的企業(yè)創(chuàng)造了更廣闊的市場(chǎng)空間?？人浴⑻刀嗪痛⑹呛粑到y(tǒng)疾病的主要癥狀，應(yīng)用鎮(zhèn)咳、祛痰和平喘藥是對(duì)癥治療的重要手段。合理應(yīng)用鎮(zhèn)咳藥不僅可以減輕病人的痛苦，并可防止并發(fā)癥的發(fā)生和原發(fā)疾病的進(jìn)一步惡化。在中國(guó)藥品市場(chǎng)中，鎮(zhèn)咳、祛痰和平喘藥每年的市場(chǎng)份額約為300億元。因此，從中藥中尋找和提取鎮(zhèn)咳、祛痰和平喘藥具有良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種甘草苷芹糖在制備治療鎮(zhèn)咳、平喘和祛痰藥物中的應(yīng)用。所述制備以甘草苷芹糖單獨(dú)或與其它活性組份或輔料配合制成，制劑中以1000粒計(jì)，含甘草苷芹糖30克。初步的藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明的甘草苷芹糖可以改善急、慢性咳嗽、痰多和喘息癥狀。
本發(fā)明通過(guò)2種動(dòng)物鎮(zhèn)咳試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，枸櫞酸引起的豚鼠咳嗽模型和辣椒素引起的小鼠咳嗽模型。證明了甘草苷芹糖抑制枸櫞酸引起的豚鼠咳嗽反應(yīng)和辣椒素引起的小鼠咳嗽反應(yīng)，提示甘草苷芹糖具有很強(qiáng)的鎮(zhèn)咳作用；通過(guò)2種動(dòng)物祛痰試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，小鼠氣道酚紅排泄模型和蛙上腭和食道纖毛運(yùn)動(dòng)模型。證明了甘草苷芹糖促進(jìn)小鼠氣道酚紅排泄，增強(qiáng)蛙上腭和食道纖毛運(yùn)動(dòng)，提示甘草苷芹糖具有很強(qiáng)的祛痰作用；通過(guò)3種離體豚鼠氣管平滑肌試驗(yàn)方法，證明了甘草苷芹糖可直接松弛離體豚鼠氣管平滑肌，呈量效關(guān)系松弛CCH引起離體豚鼠氣管平滑肌收縮反應(yīng)，抑制CCH收縮的趨勢(shì)，提示甘草苷芹糖具有很強(qiáng)的平喘作用。
本發(fā)明所述甘草苷芹糖的英文名liquiritin apioside，分子式C26H30O13，分子量550，結(jié)構(gòu)式
本發(fā)明是以甘草苷芹糖為主要活性成分，單獨(dú)或加入常規(guī)的賦形劑、調(diào)味劑、防腐劑、潤(rùn)滑劑、濕潤(rùn)劑、粘合劑、增稠劑、增溶劑等藥物輔料，制成任何一種適于臨床上使用的劑型，如膠囊劑、片劑、口服液體劑等。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供甘草苷芹糖在制備改善咳嗽、痰多和喘息癥狀的保健食品中的應(yīng)用。甘草苷芹糖來(lái)源于天然植物，因此，可以將甘草苷芹糖制成保健食品，用于咳嗽、痰多和喘息癥狀的改善。
甘草苷芹糖(Liquiritin apioside)是從甘草總黃酮中分離純化獲得的一個(gè)天然藥物，屬于二氫黃酮類。至今為止尚未見(jiàn)有它制備成藥品和治療任何疾病或癥狀的報(bào)道。我們從甘草總黃酮中分離純化，經(jīng)四大圖譜(紅外、紫外、質(zhì)譜、核磁共振)檢測(cè)，證明它為甘草苷芹糖，分離純化的程度達(dá)到了99％以上。通過(guò)對(duì)甘草苷芹糖主要藥效學(xué)的評(píng)價(jià)，證實(shí)了甘草苷芹糖具有平喘、鎮(zhèn)咳和祛痰藥效，且證實(shí)其藥效明顯強(qiáng)于甘草黃酮，作用強(qiáng)度是甘草黃酮10倍以上。本發(fā)明提供的甘草苷芹糖來(lái)源于天然植物，原料來(lái)源豐富，制備成本低，藥物毒副作用小，適于實(shí)用，為臨床治療急、慢性咳嗽、痰多和喘息癥狀提供優(yōu)選天然藥物。



圖1是制劑處方組成篩選溶出度曲線。
圖2是甘草苷芹糖吸濕性曲線。
圖3是甘草苷芹糖膠囊制劑制備工藝流程圖。
圖4是甘草苷芹糖片對(duì)離體豚鼠氣管平滑肌直接松弛作用。
圖5是甘草苷芹糖片對(duì)CCH引起離體豚鼠氣管平滑肌收縮的解痙作用。
圖6是甘草苷芹糖片對(duì)CCH引起豚鼠離體氣管平滑肌的抑制作用。
圖7是甘草苷芹糖片對(duì)CCH引起豚鼠離體氣管平滑肌的解痙作用。

具體實(shí)施例方式 本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例一、甘草苷芹糖膠囊處方及制備工藝 1處方
2 處方依據(jù)及處方的篩選過(guò)程 2.1 處方依據(jù) 根據(jù)藥效學(xué)試驗(yàn)制訂甘草苷芹糖膠囊，規(guī)格甘草苷芹糖含量30mg/粒。
淀粉本方中為玉米淀粉，色澤好，吸濕性弱，產(chǎn)量大，價(jià)格低；為白色細(xì)微粉末，不溶于水和乙醇，在空氣中很穩(wěn)定，與大多數(shù)藥物不起作用，吸濕而不潮解，遇水膨脹，為最為廣泛的稀釋劑和崩解劑，本方中主要用作稀釋劑崩解劑。
羥丙基纖維素(L-HPC)本品為白色或白色或結(jié)晶性粉末，在水中不溶但可吸水溶脹，由于L-HPC粉末有很大的比表面積和孔隙率，故有較大的吸濕速度和吸水量，增加了膨脹性。本品用量，一般可為1％-5％左右，本方中用量為2％。
微粉硅膠，本品為輕質(zhì)的白色粉末，無(wú)臭無(wú)味，不溶于水及酸，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，與絕大多數(shù)藥物不發(fā)生反應(yīng)，良好的流動(dòng)性，對(duì)藥物有較大的吸附力，親水性能強(qiáng)，有利于藥物的吸收，本品用量一般僅為0.15％-3％，因?yàn)橹魉幐什蒈涨厶橇鲃?dòng)性差，本方中用于改善顆粒的流動(dòng)性，用量為1.5％。
硬脂酸鎂為白色粉末，細(xì)膩輕松，有良好的附著性，顆?；旌虾蠓植季鶆蚨灰追蛛x，僅少量即可顯示出良好的潤(rùn)滑作用，一般用量為0.3％-1％，本方中用量為0.5％。
2.2 處方的篩選過(guò)程 設(shè)計(jì)以下三個(gè)處方(1000粒)規(guī)格30mg/粒表1-1

按照以上三個(gè)處方試制樣品，并進(jìn)行以上處方篩選試驗(yàn)。
(1)、進(jìn)行溶出度試驗(yàn) ①、測(cè)定方法 按中國(guó)藥典2000年版第二部甘草苷芹糖膠囊溶出度測(cè)定法(附錄XC第二法)操作，以0.1mol/L醋酸鹽緩沖液(取無(wú)水醋酸鈉82g加水7500ml，用冰醋酸pH值至5.0，加水使成10000ml)為溶劑，轉(zhuǎn)速為每分鐘50轉(zhuǎn)，依法操作，按時(shí)取溶液經(jīng)0.8μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液在482nm處測(cè)定吸收度，計(jì)算溶出百分率。
②、溶出度測(cè)定結(jié)果 分別取供試品，按測(cè)定方法測(cè)定溶出度，取樣時(shí)間5，10，15，20，25，30，45，60min，結(jié)果見(jiàn)表1-1 1-2 三個(gè)處方溶出度測(cè)定結(jié)果

根據(jù)上表對(duì)應(yīng)的溶出度結(jié)果見(jiàn)表1-3及圖1。
表1-3 溶出度測(cè)定結(jié)果(n＝6 X±S)
結(jié)果表明處方3在20分鐘溶出度可達(dá)到86.8％，30分鐘溶出度幾乎達(dá)到最大。處方1、處方2在20分鐘吸光度僅有60分鐘的60％，30分鐘時(shí)溶出度為85％。根據(jù)中國(guó)藥典在30分鐘時(shí)溶出度達(dá)到80％，它們都符合藥典要求。
由此可見(jiàn)，處方3中低取代羥丙基纖維素(L-HPC)的用量?jī)H為2％，溶出速率明顯快于處方1、處方2，可見(jiàn)本方3中加入L-HPC之后，有助于膠囊的崩解而加快了主藥甘草苷芹糖溶出。
(2)、休止角試驗(yàn) 按處方1、2、3制成顆粒，經(jīng)口徑7cm的長(zhǎng)頸漏斗流下，并呈圓錐形狀，測(cè)其休止角，結(jié)果見(jiàn)表1-4 表1-4
可見(jiàn)處方2、3的休止角小于處方1，說(shuō)明處方2、3的流動(dòng)性好于處方1。
結(jié)論微粉硅膠能顯著改善顆粒的流動(dòng)性能。
綜上所述，處方3的溶出度、流動(dòng)性好于處方1、2，所以選定處方3。
3 生產(chǎn)工藝 3.1 制備方法 制法稱取處方量的甘草苷芹糖、淀粉、和L-HPC混合，過(guò)60目的篩三次，混合均勻；加入10％的淀粉漿適量制軟材，用16目制粒，600C干燥，用16目整粒后，加入微粉硅膠、硬脂酸鎂混合均勻，用0號(hào)膠囊制成1000粒。
3.2 工藝條件的篩選 按處方進(jìn)行試制1000粒樣品。
3.2.1 堆密度試驗(yàn) 將試制的顆粒裝入100ml量筒中，以一定的高度落下兩次，(每次保持條件一致，松緊適宜，稱其重量計(jì)算其堆密度，結(jié)果見(jiàn)表2-1 表2-1 堆密度試驗(yàn)數(shù)據(jù)(n＝3)
因此，根據(jù)以上數(shù)據(jù)可知，顆粒平均堆密度是0.46g/ml，每粒裝量要求為30m，所以選擇5號(hào)膠囊。
3.2.2 吸濕性試驗(yàn) 考察環(huán)境濕度對(duì)膠囊填充過(guò)程中影響程度，為此測(cè)定了顆粒的吸濕性。
稱取顆粒12份，每份約2g，精密稱定，將其置于不同相對(duì)濕度環(huán)境下放置7天，測(cè)其重量變化，結(jié)果見(jiàn)表2-2及圖2吸濕曲線。
表2-2 吸濕性測(cè)定數(shù)據(jù)表(n＝2)
相對(duì)濕度在40-90％條件下顆粒重量基本沒(méi)有變化，吸濕性沒(méi)有明顯增加。因此，可確定該品種的相對(duì)濕度要求不嚴(yán)格，在一般的生產(chǎn)環(huán)境下可以生產(chǎn)。不會(huì)因?yàn)樗謱?duì)藥物性質(zhì)及穩(wěn)定性造成影響。
4 工藝流程參見(jiàn)圖3。
二、甘草苷芹糖緩釋放片處方及制備工藝 1 制劑處方組成 1.1 每1000片含下列物質(zhì) 甘草苷芹糖 30g 硬脂酸 40g HMPC200g 聚乙烯吡咯烷酮(K30) 80g 30％丙烯酸樹(shù)脂IV號(hào) 適量 1.2 包衣液處方 (Y-1-7000) 60g(類白色) 乙醇1000ml 2.制備工藝 2.1 粘合劑的配制 精密稱取丙烯酸樹(shù)脂IV號(hào)適量，用95％乙醇配制成濃度為30％的溶液，備用。
2.2 片芯的制備 取處方量主藥甘草苷芹糖與輔料硬脂酸、HMPC、聚乙烯吡咯烷酮充分混勻后過(guò)60目篩，加入30％丙烯酸樹(shù)脂IV號(hào)適量，制成干濕適中的軟材，24目篩制粒，50℃烘干30分鐘，24目篩整粒，測(cè)定顆粒含量合格后，壓片即得。
2.3 包衣 2.3.1 包衣的依據(jù) 甘草苷芹糖緩釋片為薄膜衣片，同時(shí)考慮到美觀等因素，本品制成薄膜衣片。
2.3.2 包衣液的配制 稱取(Y-1-7000)適量，緩緩加入70％的乙醇溶液中，配制成6％的包衣液，在磁力攪拌器上不停地?cái)嚢?，直至完全溶解，即得?br> 2.3.3 取素片置包衣鍋內(nèi)，鍋轉(zhuǎn)速每分鐘30～40轉(zhuǎn)，鍋內(nèi)溫度為40～50℃，不間斷噴包衣液至素片上，直至均勻包上一層薄膜衣，干燥即得。
2.4 臨界相對(duì)濕度的測(cè)定 在一定溫度下，取按處方和工藝制得的顆粒適量，分別放置在不同的飽和鹽溶液中，放置5天后，取出稱重，以不同的飽和鹽溶液的相對(duì)濕度作橫坐標(biāo)，顆粒在不同的飽和鹽溶液中增重百分率作縱坐標(biāo)，作曲線圖，并作曲線的切線，所得兩切線的交點(diǎn)為臨界相對(duì)濕度，且從圖得出臨界相對(duì)濕度為74％。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)下表3-1。
表3-1 臨界相對(duì)濕度的測(cè)定 本品顆粒的臨界相對(duì)濕度為74％(>50％)，說(shuō)明本品顆粒在密封條件下不吸濕。
3.處方依據(jù) 3.1 劑量的確定 甘草苷芹糖緩釋片其規(guī)格為30mg/片，本品臨床上常規(guī)用量為每日30～90mg，在確定本品的劑量時(shí)，并考慮到方便病人服用，便于劑量調(diào)節(jié)，故確定為每片含甘草苷芹糖30mg。
3.2 處方篩選 3.2.1 輔料的干擾性試驗(yàn) 選擇在333nm波長(zhǎng)處無(wú)吸收干擾的輔料如HMPC、聚乙烯吡咯烷酮、糊精、淀粉、甘露醇、硬脂酸、丙烯酸樹(shù)脂等，按處方配比取一片量輔料，加入容器中照含量測(cè)定項(xiàng)下方法，測(cè)定定量溶液的吸收度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在333nm波長(zhǎng)處輔料無(wú)吸收。
3.2.2 處方篩選過(guò)程 甘草苷芹糖可溶于水，為了使藥物緩慢釋放，有效血藥濃度能維持較長(zhǎng)時(shí)間，以達(dá)到較好的治療目的，因此，我們制成甘草苷芹糖緩釋片，為骨架型。目前國(guó)內(nèi)常用的緩釋材料有聚乙烯吡咯烷酮、乙基纖維素、硬脂酸、羥丙甲纖維素、丙烯酸樹(shù)脂等。以每片含甘草苷芹糖30mg，采用上述控釋材料中的一種或數(shù)種以及不同規(guī)格、不同用量組方，進(jìn)行體外釋放度試驗(yàn)，從十多個(gè)緩釋處方中發(fā)現(xiàn)1、2號(hào)處方緩釋效果較好，但2號(hào)處方體外釋放度最好，且顆粒的可壓性、流動(dòng)性和處方的重現(xiàn)性均佳，故確定處方2為本緩釋片處方。
處方篩選過(guò)程如下表表3-2 3.2.3 試制的三批樣品檢測(cè)結(jié)果 根據(jù)確定的處方和制備工藝，試制了三批樣品，檢測(cè)結(jié)果如下 表3-3 從三批試制樣品檢測(cè)結(jié)果表明該品確定的處方和制備工藝可行。
3.2.4 以pH6.8的磷酸鹽緩沖液作為本品的釋放介質(zhì)，方法采用轉(zhuǎn)籃法(中國(guó)藥典2000年版二部附錄XC第一法)，轉(zhuǎn)速為每分鐘100轉(zhuǎn)，取樣點(diǎn)為1小時(shí)、3小時(shí)和10小時(shí)，據(jù)此我們重新測(cè)定了三批樣品及進(jìn)口片的釋放度，結(jié)果如下 表3-4 從三批試制樣品檢測(cè)結(jié)果表明該品確定的處方和制備工藝可行。
同時(shí)對(duì)試制的樣品(080906)進(jìn)行了影響因素試驗(yàn)(光照試驗(yàn)、高溫試驗(yàn)、高濕試驗(yàn))，方法與結(jié)果如下 (1)光照試驗(yàn) 在室溫條件下，本品去除外包裝將樣品平攤在平皿里，在4500lux光強(qiáng)度下放置5、10天后取樣檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)表4-1。
(2)高溫試驗(yàn) 本品去除上市包裝分別于60℃的烘箱中放置5、10天后取樣檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)表4-2。
(3)高濕試驗(yàn) 本品去除上市包裝分別放入恒濕器皿中，于25℃、相對(duì)濕度92.5％敞口放置考核5、10天后取樣檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)表4-3。
表4-1 光照試驗(yàn)結(jié)果
*指片芯色澤，薄膜衣均無(wú)變化(下同) 表4-2.高溫試驗(yàn)結(jié)果
表4-3.高濕度試驗(yàn)結(jié)果
4.各輔料在處方中的作用 4.1 A具有疏水性，阻止藥物的釋放。
4.2 羥丙甲纖維素為親水性高分子纖維素材料，遇水形成凝膠，降低水向片內(nèi)滲透的速率，延緩藥物的釋放，具有緩釋作用。國(guó)內(nèi)外已廣泛用于緩控釋制劑。
4.3 聚乙烯吡咯烷酮為親水性高分子材料，遇水形成凝膠，降低水向片內(nèi)滲透的速率，延緩藥物的釋放，具有緩釋作用。國(guó)內(nèi)外已廣泛用于緩控釋制劑 4.4 丙烯酸類樹(shù)脂商品名為“Eudragit”，因其取代基不同分成各種型號(hào)，國(guó)外已廣泛用來(lái)作為控緩釋制劑的材料，也用作腸溶衣材料，本處方選擇其作為粘合劑，利用其成膜性包裹藥物，阻止藥物在胃內(nèi)釋放速率。
4.5 B為潤(rùn)滑劑。
4.6 Opadry薄膜衣材料，主要成份為羥丙甲纖維素。
5.原輔料來(lái)源及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 5.1 甘草苷芹糖本實(shí)驗(yàn)室提取純化，含量純度為99％以上。
5.2 A符合中國(guó)藥典1995年版，上海延安油脂化工廠生產(chǎn)。
5.3 羥丙甲纖維素符合美國(guó)藥典(USP XXIII)，由上海Colorcon公司提供。
5.4 聚乙烯吡咯烷酮符合美國(guó)藥典，沈陽(yáng)東北制藥總廠生產(chǎn)。
5.5 丙烯酸樹(shù)脂IV符合中國(guó)藥典1995年版，由連云港制碘廠生產(chǎn)。
5.6 B符合中國(guó)藥典1995年版，由上海葡萄糖廠生產(chǎn)。
5.7 Opadry符合英國(guó)藥典，由上海Colorcon公司提供。
三、藥效學(xué)研究 參照國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局《新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則匯編(藥學(xué)藥理學(xué)毒理學(xué))》，設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)方案。選用2種鎮(zhèn)咳藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型、2種祛痰藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型和3種平喘試驗(yàn)方法，對(duì)甘草苷芹糖膠囊或片劑進(jìn)行了平喘、鎮(zhèn)咳和祛痰方面的研究。試驗(yàn)材料、方法和結(jié)果如下 1.材料 藥品與試劑 (1)枸櫞酸上?；瘜W(xué)試劑一廠，批號(hào)20070201，用蒸餾水配制成15％的濃度備用； (2)磷酸可待因片青海制藥廠，批號(hào)20060615；蒸餾水配制成0.5mg/ml混懸液； (3)Capsaicin(辣椒素)Sigma Chemical Company，lot123H78341，新鮮配制稱取Capsaicin 3mg，用10％乙醇1ml溶解，加10％吐溫801ml，研磨后加水至100ml。
(4)地西泮注射液江蘇濟(jì)川制藥有限公司，批號(hào)20060309； (5)酚紅試劑上海化學(xué)試劑三廠；批號(hào)20070615；精密稱取酚紅試劑2g，加生理鹽水至80ml。由于酚紅在生理鹽水不能完全溶解，因此置超聲波洗滌器內(nèi)超聲溶解30min，使酚紅顆粒均勻，配制成0.25％酚紅懸液。
(6)氫氧化鈉浙江蕭山化學(xué)試劑廠，批號(hào)20060726； (7)carbamylcholineSigma Chemical Company，lot0834 (8)異丙腎上腺素上海信宜制藥業(yè)有限公司，批號(hào)20070212 (9)甘草苷芹糖膠囊或片劑自制，批號(hào)20080206；將甘草苷芹糖10粒膠囊或片劑的原料藥加蒸餾水至100ml。整體試驗(yàn)劑量以mg/kg表示，離體試驗(yàn)以mol濃度。
動(dòng)物 (1)Hartley品系豚鼠，體重350-500g，雌雄不拘。(2)ICR品系小鼠，體重18～22g，雌雄各半。購(gòu)于浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)220010014。所有的操作和實(shí)驗(yàn)流程均遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前均自由進(jìn)食和進(jìn)水。(3)青蛙，體重25～45g，雌雄不拘。購(gòu)于市場(chǎng)。
2、方法 2.1、枸櫞酸引起的豚鼠咳嗽試驗(yàn) 2.1.1 分組共分5組，每組8～9只豚鼠，雌雄不拘。具體分組情況如下 A.生理鹽水對(duì)照組，以等量生理鹽水灌胃給藥 B.甘草苷芹糖 3mg/kg C.甘草苷芹糖 10mg/kg D.甘草苷芹糖 30mg/kg E.可待因 10mg/kg 2.1.2 篩選豚鼠用超聲波霧化器氣霧15％枸櫞酸2min后，10min內(nèi)咳嗽次數(shù)在10次以上的豚鼠作為實(shí)驗(yàn)豚鼠，棄去10次以下的豚鼠。24h后給豚鼠灌胃給藥(ig)，進(jìn)行藥物鎮(zhèn)咳試驗(yàn)。
2.1.3 給藥劑量和容積所有試驗(yàn)豚鼠均在枸櫞酸引咳前30min給藥1次。采用等容不等量灌胃給藥(ig)。
2.1.4 實(shí)驗(yàn)步驟將豚鼠放入20×10×10cm體積描記盒中，用高靈敏度壓力換能器將豚鼠呼吸頻率和容積信號(hào)輸入微機(jī)Pclab生物信號(hào)采集系統(tǒng)，記錄豚鼠咳嗽次數(shù)。豚鼠放入體積描記盒穩(wěn)定1min后，用超聲波霧化器氣霧15％枸櫞酸2min，計(jì)數(shù)自氣霧開(kāi)始10min內(nèi)的咳嗽次數(shù)，每一次咳嗽均以聽(tīng)到豚鼠咳嗽聲音和微機(jī)Pclab上見(jiàn)到的明顯的咳嗽記錄結(jié)合分析。
2.2、辣椒素誘導(dǎo)小鼠咳嗽試驗(yàn) 2.2.1 分組ICR小鼠，體重25-30g，♀

各半。共分5組，每組動(dòng)物數(shù)見(jiàn)表2，雌雄不拘。具體分組情況如下 A.生理鹽水對(duì)照組，以等量生理鹽水灌胃給藥 B.甘草苷芹糖 6mg/kg C.甘草苷芹糖 20mg/kg D.甘草苷芹糖 60mg/kg E.可待因 20mg/kg 2.2.2 篩選小鼠將小鼠放入特制的體積描記器中穩(wěn)定1min后，用超聲波霧化器氣霧30μmol/L辣椒素溶液15sec，即刻描計(jì)3min內(nèi)的咳嗽次數(shù)，3min內(nèi)咳嗽次數(shù)在10次以上的小鼠作為實(shí)驗(yàn)小鼠，棄去10次以下的小鼠。24h后給小鼠灌胃給藥(ig)，進(jìn)行藥物鎮(zhèn)咳試驗(yàn)。
2.2.3 給藥劑量和容積所有試驗(yàn)小鼠均在枸櫞酸引咳前30min給藥1次。采用等容不等量ig。
2.2.4 實(shí)驗(yàn)步驟辣椒素引咳前，每鼠ip地西泮0.5mg/只，以減少小鼠活動(dòng)所引起的實(shí)驗(yàn)觀察記錄干擾。實(shí)驗(yàn)時(shí)將小鼠放入特制的體積描記器中穩(wěn)定1min后，用超聲波霧化器以1ml/min霧化30μmol/L辣椒素溶液15sec，用壓力換能器將小鼠呼吸頻率和容積信號(hào)傳入微機(jī)Pclab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)，記錄小鼠在3min內(nèi)的咳嗽次數(shù)。每一次咳嗽均以聽(tīng)到小鼠咳嗽時(shí)張嘴表現(xiàn)和微機(jī)Pclab上見(jiàn)到的明顯的咳嗽記錄結(jié)合分析。
2.3、小鼠氣道酚紅分泌試驗(yàn) 2.3.1分組共分6組，每組9～12只小鼠，雌雄各半。具體分組情況如下 A.生理鹽水對(duì)照組，以等量生理鹽水灌胃給藥 B.甘草苷芹糖 6mg/kg C.甘草苷芹糖 20mg/kg D.甘草苷芹糖 60mg/kg E.甘草苷芹糖 120mg/kg F.氨溴索 200mg/kg 2.3.2 給藥劑量和容積所有試驗(yàn)小鼠饑餓過(guò)夜，均在注射酚紅前30min給藥一次。采用等容不等量ig。
2.3.3 實(shí)驗(yàn)步驟2.5％酚紅置電磁攪拌器上邊混合邊注射，2.5％酚紅0.2ml/10g體重ip，30min后脫臼處死動(dòng)物，低溫放置1h，待小鼠僵硬時(shí)解剖氣管(避免分離氣管時(shí)出血)，分離氣管，取喉結(jié)下至肺門的主氣管，每一氣管放置一支5ml試管內(nèi)，加生理鹽水1.0ml，震蕩洗滌30min后，加0.1ml 1mmol/L NaOH，混勻后150g離心10min，取上清液于酶標(biāo)儀(BIO-TEK，ELX800，USA)520nm測(cè)定含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制取12.5μg/ml酚紅倍比稀釋成5個(gè)濃度0.78、1.56、3.13、6.25、12.5μg/ml濃度酚紅液在酶標(biāo)儀520nm測(cè)得的A值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2.4、蛙上腭和食道粘膜纖毛運(yùn)動(dòng)試驗(yàn) 2.4.1 分組 A.生理鹽水對(duì)照組，以等量生理鹽水加入 B.甘草苷芹糖1×10-9～1×10-6mol/L4個(gè)濃度 C.陽(yáng)性對(duì)照藥乙酰膽堿組1×10-10～1×10-7mol/L4個(gè)濃度 2.4.2 實(shí)驗(yàn)步驟將毀腦和脊髓后的蛙固定于板上，分離口腔上腭至食道末端的粘膜，取2.5×1.5cm粘膜平貼于板上，加以固定，定時(shí)以任氏液濕潤(rùn)粘膜表面。每只試驗(yàn)的蛙食道粘膜均先用活性炭(半粒芝麻大小)測(cè)定一次2cm長(zhǎng)度的運(yùn)動(dòng)時(shí)間，作為粘膜標(biāo)本的篩選，剔除運(yùn)動(dòng)時(shí)間<80sec、>150sec的標(biāo)本。篩選合格的粘膜標(biāo)本以含受試藥物的任氏液濕潤(rùn)，用同樣大小的活性炭粒再測(cè)定一次運(yùn)動(dòng)2cm長(zhǎng)度的運(yùn)動(dòng)時(shí)間作為用藥后所需要的運(yùn)動(dòng)時(shí)間。
2.5、豚鼠離體氣管平滑肌收縮和松弛試驗(yàn) 2.5.1 分組Hartley豚鼠，

♀兼用，體重361±20g A.生理鹽水對(duì)照組，以等量生理鹽水加入 B.甘草苷芹糖1×10-7～1×10-4mol/L5個(gè)濃度 C.陽(yáng)性對(duì)照藥麻黃堿組1×10-7～1×10-4mol/L5個(gè)濃度 5.5.2 實(shí)驗(yàn)步驟擊昏豚鼠，動(dòng)脈放血致死，立即分離并取出氣管，置含氧的Krebs液中，制備成氣管標(biāo)本。然后將標(biāo)本置37℃ Krebs液水浴槽內(nèi)，通氧氣，氣管平滑肌靜息張力為1g。張力變化通過(guò)張力換能器輸入PCLab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)。標(biāo)本穩(wěn)定1h后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。
5.2.1 對(duì)氣管平滑肌直接松弛作用氣管平滑肌標(biāo)本在浴槽內(nèi)穩(wěn)定1h后，分別以10-9～10-3mol/L累積劑量加藥法加入甘草苷芹糖和麻黃堿藥物后，然后再加入10-6mol/L異丙腎上腺素，使其達(dá)最大松弛。計(jì)算時(shí)以10-6mol/L異丙腎上腺素的松弛反應(yīng)為100％。
5.2.2 對(duì)carbamylcholine(CCH)引起氣管平滑肌收縮的解痙作用氣管平滑肌標(biāo)本在浴槽內(nèi)穩(wěn)定1h后，先在浴槽內(nèi)加入10-6mol/L CCH，待氣管平滑肌收縮反應(yīng)達(dá)最大值并穩(wěn)定后，再分別以10-6～10-3.5mol/L累積劑量加藥法加入受試藥物，最后加入10-6mol/L異丙腎上腺素。計(jì)算時(shí)以10-6mol/L異丙腎上腺素的松弛反應(yīng)幅度為100％。
5.2.3 對(duì)CCH引起氣管平滑肌收縮的抑制作用先加入Krebs液(對(duì)照)或10-6～10-3mol/L受試藥物，5min后累積劑量加藥法加入10-6～10-4mol/L CCH，觀察收縮反應(yīng)幅度。以預(yù)先用Krebs液處理的CCH收縮幅度為100％，計(jì)算出受試藥物對(duì)CCH收縮反應(yīng)的抑制作用。
6、統(tǒng)計(jì)方法用微機(jī)和Sigma Stat統(tǒng)計(jì)軟件(Sigmastat 1.01 for Windows 95，1992，Jandel corporation，USA)具體方法見(jiàn)結(jié)果中的表注。ID50(95％可信限)、ED50(95％可信限)和EC25(95％可信限)用上海科學(xué)技術(shù)出版社POMS2.0版軟件計(jì)算。
3、結(jié)果 3.1、甘草苷芹糖對(duì)枸櫞酸引起的豚鼠咳嗽反應(yīng)的抑制作用 結(jié)果顯示，甘草苷芹糖能減少豚鼠的咳嗽次數(shù)，見(jiàn)表5。抑制咳嗽50％的劑量(ID)50(95％可信限)＝13.68(8.53～21.94)mg/kg。
表5.甘草苷芹糖對(duì)枸櫞酸引起豚鼠咳嗽反應(yīng)的抑制作用(x±SD)
統(tǒng)計(jì)方法T-test，與生理鹽水組比較**P<0.01 3.2、甘草苷芹糖對(duì)辣椒素引起小鼠咳嗽反應(yīng)的抑制作用 結(jié)果顯示，甘草苷芹糖能減少辣椒素引起小鼠咳嗽次數(shù)，見(jiàn)表6。ID50(95％可信限)＝18.33(12.17～27.63)ml/kg。
表6.甘草苷芹糖對(duì)辣椒素引起小鼠咳嗽反應(yīng)的抑制作用(x±SD)
統(tǒng)計(jì)方法T-TEST或Mann-Whitney Rank Sum Test，與生理鹽水組比較*P<0.01，**P<0.01，***P<0.001 3.3、甘草苷芹糖對(duì)小鼠氣道酚紅排泄的促進(jìn)作用 結(jié)果顯示，甘草苷芹糖能促進(jìn)小鼠氣道酚紅排泄，見(jiàn)表7。ED50(95％可信限)＝22.41(18.48～27.18)mg/kg。
表7.甘草苷芹糖片對(duì)小鼠氣道酚紅排泄的促進(jìn)作用(x±SD)
T-test或Mann-Whitney Rank Sum Test，與生理鹽水組比較*P<0.01，**P<0.01，***P<0.001 3.4.甘草苷芹糖對(duì)蛙上腭和食道粘膜纖毛運(yùn)動(dòng)的增強(qiáng)作用 甘草苷芹糖增強(qiáng)蛙上腭和食道纖毛運(yùn)動(dòng)，EC25(95％可信限)＝1.01(0.8～1.3)×10-9mol/L，見(jiàn)表8。
表8.甘草苷芹糖片對(duì)蛙上腭和食道粘膜纖毛運(yùn)動(dòng)的促進(jìn)作用(x±SD)

T-test或Mann-Whitney Rank Sum Test，與任氏液對(duì)照比較*P<0.01，**P<0.01，***P<0.001 3.5、甘草苷芹糖對(duì)離體豚鼠氣管平滑肌直接松弛作用 以累積劑量加藥法分別加入甘草苷芹糖10-7～10-4mol/L后，可見(jiàn)甘草苷芹糖呈量效關(guān)系松弛離體豚鼠氣管平滑肌，見(jiàn)表9和圖4。
表9 甘草苷芹糖對(duì)離體豚鼠氣管平滑肌直接松弛作用(x±SD)
統(tǒng)計(jì)方法Student-Newman-Keuls Method；與對(duì)照K-H液組比較*P<0.05； 3.6、甘草苷芹糖對(duì)CCH引起離體豚鼠氣管平滑肌收縮的解痙作用 以累積劑量加藥法分別加入10-9～10-6mol/L藥物后，可見(jiàn)甘草苷芹糖和麻黃堿均呈量效關(guān)系松弛CCH引起離體豚鼠氣管平滑肌收縮反應(yīng)，甘草苷芹糖與麻黃堿作用強(qiáng)度基本相同，見(jiàn)表9和圖5。
3.7、甘草苷芹糖對(duì)CCH引起離體豚鼠氣管平滑肌收縮的抑制作用 先加入甘草苷芹糖和麻黃堿10-6、10-5和10-4mol/L，再以累積加藥法加入CCH10-8～10-5.5mol/L?？梢?jiàn)甘草苷芹糖和麻黃堿有抑制CCH收縮的趨勢(shì)。見(jiàn)表10和圖6、7。
表10、甘草苷芹糖片對(duì)CCH引起離體豚鼠氣管平滑肌收縮的抑制作用(x±SD)
4 討論與小結(jié) 在本實(shí)驗(yàn)中，采用了2種動(dòng)物鎮(zhèn)咳試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，枸櫞酸引起的豚鼠咳嗽模型和辣椒素引起的小鼠咳嗽模型。甘草苷芹糖抑制枸櫞酸引起的豚鼠咳嗽反?yīng)和辣椒素引起的小鼠咳嗽反應(yīng)，提示甘草苷芹糖具有很強(qiáng)的鎮(zhèn)咳作用。
在本實(shí)驗(yàn)中，采用了2種動(dòng)物祛痰試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，小鼠氣道酚紅排泄模型和蛙上腭和食道纖毛運(yùn)動(dòng)模型。甘草苷芹糖促進(jìn)小鼠氣道酚紅排泄，增強(qiáng)蛙上腭和食道纖毛運(yùn)動(dòng)，提示甘草苷芹糖具有很強(qiáng)的祛痰作用。
在本實(shí)驗(yàn)中，采用了3種離體豚鼠氣管平滑肌試驗(yàn)方法，證明了甘草苷芹糖可直接松弛離體豚鼠氣管平滑肌，呈量效關(guān)系松弛CCH引起離體豚鼠氣管平滑肌收縮反應(yīng)，抑制CCH收縮的趨勢(shì)，提示甘草苷芹糖具有很強(qiáng)的平喘作用。
權(quán)利要求
1.一種甘草苷芹糖在制備鎮(zhèn)咳、平喘和祛痰藥物中的應(yīng)用，所述甘草苷芹糖的分子式C26H30O13，分子量550，其特征在于所述制備以甘草苷芹糖單獨(dú)或與其它活性組份或輔料配合制成，制劑規(guī)格為按每?；蚱什蒈涨厶?0mg。
2.一種甘草苷芹糖在制備改善咳嗽、痰多和喘息癥狀的保健食品中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種甘草苷芹糖鎮(zhèn)咳、平喘和祛痰藥物中的應(yīng)用，其特征在于所制備的制劑以甘草苷芹糖為活性成分，加入常規(guī)的賦形劑、調(diào)味劑、防腐劑、潤(rùn)滑劑、濕潤(rùn)劑、粘合劑、增稠劑或增溶劑中的一種或多種藥物輔料制成藥物制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種甘草苷芹糖制劑，其特征在于所述制劑劑型為膠囊劑、片劑或口服液體劑。
全文摘要
本發(fā)明提供一種甘草苷芹糖在制備鎮(zhèn)咳、平喘和祛痰藥物和保健品中的應(yīng)用。甘草苷芹糖單獨(dú)或與其它活性組份或輔料配合制成。經(jīng)過(guò)對(duì)甘草苷芹糖制劑的主要藥效學(xué)的評(píng)價(jià)，證實(shí)甘草苷芹糖有較強(qiáng)的平喘、鎮(zhèn)咳和祛痰藥效，可以改善急、慢性咳嗽、痰多和喘息癥狀。本發(fā)明的甘草苷芹糖制劑可制成任何一種適于臨床上使用的劑型，如膠囊劑、片劑、口服液體劑等。甘草苷芹糖來(lái)源于天然植物，原料來(lái)源豐富，制劑成本低，藥物毒副作用小，療效顯著。本發(fā)明為臨床治療急、慢性咳嗽、痰多和喘息癥狀提供優(yōu)選天然藥物。
文檔編號(hào)A61K31/7042GK101518541SQ20091009749
公開(kāi)日2009年9月2日 申請(qǐng)日期2009年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月7日
發(fā)明者謝強(qiáng)敏, 董新威, 吳希美, 睿 曹, 蔣俊霞 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)