專利名稱：乳腺癌細(xì)胞C35基因siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建以及抗腫瘤治療應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程領(lǐng)域，具體地說是乳腺癌細(xì)胞C35基因SiRNA序列設(shè)計、表達(dá)載 體的構(gòu)建及其中抗腫瘤治療中的研究和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的腫瘤治療方法有化療、手術(shù)、放療和內(nèi)分泌治療，給患者帶來了痛苦，不能 從根本上解決抗腫瘤問題。隨著對腫瘤細(xì)胞生長、增殖、凋亡的分子機(jī)制研究的深入，現(xiàn)代 腫瘤的治療已進(jìn)入生物治療時代，靶向性治療腫瘤已成為可能。近年來基因阻斷技術(shù)在基 因功能研究中有很大進(jìn)展，臨床治療研究也顯示了良好的前景，為我們設(shè)計抗腫瘤治療方 案提供了可借鑒的技術(shù)手段。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是最近幾年來發(fā)現(xiàn)和發(fā)展起來的新興基因 阻斷技術(shù)。自RNAi現(xiàn)象報道以來，科學(xué)家對其作用機(jī)制進(jìn)行了大量研究，目前認(rèn)為涉及包 括RnaseIII內(nèi)切酶Dicer等多步驟過程，最終產(chǎn)生有活性的21 23nt小干擾RNA(short interfering RNA, siRNA)，介導(dǎo)與其互補(bǔ)同源mRNA序列的特異性見解。其作用具有高效、 特異的特點，比反義寡核苷酸抑制目的基因的效果更好。從目前的研究報道來看，RNAi技 術(shù)主要用于基因功能和抗腫瘤研究，具有良好的效果。國內(nèi)外有關(guān)RNAi抗腫瘤的相關(guān)報道有很多，但是運用RNAi阻斷技術(shù)設(shè)計針對C35 基因不同編碼區(qū)的siRNA序列，進(jìn)一步構(gòu)建C35siRNA表達(dá)載體，至今未見國內(nèi)外報道。同 時在體外實驗轉(zhuǎn)染細(xì)胞后運用RT-PCR技術(shù)檢測抑制后基因表達(dá)的情況；此外在體外轉(zhuǎn)染 實驗中細(xì)胞模型中運用Western Blot對C35siRNA特異抑制C35蛋白進(jìn)行了研究，并運用 MTT、TUNEL和ArmexinV/PI流式細(xì)胞分析法實驗證實C35siRNA具有較強(qiáng)抑制乳腺癌細(xì)胞 生長的作用，亦未見報道。因此，本技術(shù)的理論意義和實際意義都將是十分重大的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了設(shè)計針對C35不同靶基因區(qū)siRNA序列，并以pTZU6+l為表 達(dá)載體，構(gòu)建一系列siRNA重組體，在體外實驗中系統(tǒng)研究其抑制C35表達(dá)的作用，為進(jìn)一 步在體內(nèi)抗腫瘤打下了良好的實驗基礎(chǔ)。本發(fā)明包括兩對C35siRNA序列的設(shè)計。本發(fā)明包括獨特的莖環(huán)結(jié)構(gòu)C35siRNA的設(shè)計，即正向和方向重復(fù)19nt單鏈DNA 通過中間折疊結(jié)構(gòu)的間隔，同時設(shè)計在一條核苷酸鏈上。本發(fā)明包括C35siRNA表達(dá)載體pSIRNAC35_l和pSIRNAC35_2的構(gòu)建。本發(fā)明包括在體外實驗轉(zhuǎn)染細(xì)胞后運用RT-PCR技術(shù)檢測抑制后基因表達(dá)的情況。本發(fā)明包括體外轉(zhuǎn)染實驗中細(xì)胞模型中運用Western Blot對C35siRNA特異抑制 C35蛋白進(jìn)行了研究。
本發(fā)明包括體外轉(zhuǎn)染試驗中運用MTT、TUNEL和Armexin V/PI流式細(xì)胞分析法技 術(shù)對乳腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡進(jìn)行了研究。
本發(fā)明所構(gòu)建的C35siRNA表達(dá)載體經(jīng)酶切鑒定、序列測定表明構(gòu)建成功，在體外 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞模型中，通過RT-PCR和Western Blot實驗均證實C35蛋白產(chǎn)物的表達(dá)受到明 顯抑制，通過MTT、TUNEL和ArmexinV/PI流式細(xì)胞分析法實驗證實乳腺癌細(xì)胞的生長受到 明顯抑制，腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，能較為明顯地證實C35siRNA具有抑制乳腺癌細(xì)胞中C35基 因的表達(dá)和腫瘤細(xì)胞的生長的作用。本發(fā)明所述的C35siRNA表達(dá)載體可作為一種新型抗腫瘤基因治療藥物，運用到 臨床治療中。可以將所述的C35siRNA作為基因藥物直接進(jìn)行裸DNA注射，導(dǎo)入機(jī)體的腫瘤 組織內(nèi)；或利用金包被DNA槍轟擊法，將構(gòu)建好的表達(dá)載體質(zhì)粒DNA包被在金微粒子表而， 用基因槍使包被DNA的金微粒子高速穿入腫瘤組織細(xì)胞；或作為主要活性組分，添加適用 的藥用輔料，制備抗腫瘤藥物。本發(fā)明提供了兩種靶向C35基因序列的SiRNA表達(dá)載體，在構(gòu)建針對C35基因 的siRNA表達(dá)載體時，根據(jù)siRNA的設(shè)計原則，分別選擇C35蛋白編碼區(qū)259nt-278nt，編 碼區(qū)282nt-300nt的核苷酸序列，設(shè)計相應(yīng)的siRNA ；用BLAST軟件進(jìn)行同源分析證實為 C35高度保守序列后，化學(xué)合成單鏈寡核苷酸；體外經(jīng)退火形成雙鏈DNA，與真核表達(dá)載體 PTZU6+1連接，酶切鑒定和序列測定分析表明成功構(gòu)建了兩種靶向C35基因序列的siRNA表 達(dá)載體。本發(fā)明人所設(shè)計的兩對C35siRNA序列為(1)序列C35編碼區(qū)259nt-278nt位核苷酸上游序列5，-TCTGAAGATCTCATTGAGGCCATCTTCGATGGCCTCAATGAGATCTTTTT-3，下游序列5，-CTAGAAAAAAGATCTCATTGAGGCCATCCGAAGATGGCCTCAATGAGATTC-3，(2)序列C35編碼區(qū)282nt-300nt位核苷酸上游序列5，-TCGAGGAGCCAGTAATGGAGAAACTTCGGTTTCTCCATTACTGGCTCTTTTT-3，下游序列5，-CTAGAAAAAGAGCCAGTAATGGAGAAACCGAAGTTTCTCCATTACTGGCTCC-3，上述C35基因序列的siRNA表達(dá)載體含有兩對序列中的一對。所述(1)的序列作用于C35編碼區(qū)259nt-278nt位核苷酸AGATCTCATTGAGGCCATC， 所述(2)序列作用于C35編碼區(qū)282nt-300nt位核苷酸GAGCCAGTAATGGAGAAAC。上述設(shè)計的任何一條siRNA序列能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA，即同一條siRNA序列包含 了 siRNA折疊體的兩條互補(bǔ)鏈。從5’端開始先為siRNA作用鏈序列，(即對相應(yīng)目的基因 序列的互補(bǔ)序列)，長度為19nt，中間以4nt的TTCG間隔形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，最后為siRNA作用 鏈的反向重復(fù)序列。本發(fā)明所述的C35 siRNA表達(dá)載體構(gòu)建，采用了 pTZTO+Ι表達(dá)載體，該載體含 RNApolIII啟動子U6，能介導(dǎo)C35siRNA在體內(nèi)的正確轉(zhuǎn)錄并根據(jù)目的序列的TTTTT末端適 時終止，尤其適合靶基因C35siRNA在體內(nèi)表達(dá)的需要?？朔艘酝鵶iRNA體外合成耗時、 昂貴的缺點，使siRNA在功能基因和抗腫瘤基因治療上的研究領(lǐng)域更為廣闊。本發(fā)明還提供了重組質(zhì)粒與空載體的酶切鑒定方法，以及通過簡單的酶切反應(yīng)快 速篩選重組菌落的方法。因為含C35siRNA的pTZL6+l載體僅比空質(zhì)粒多52bp，通過DNA電 泳比較分子量大小來篩選重組子顯然較為困難。本發(fā)明人根據(jù)PTZU6+1帶有Sal I與XbaI酶切位點，同時Xho I與Sal I識別的DNA序列相同，Xho I酶切后的粘端與Sal I酶切 位點匹配的特征，在設(shè)計每一條siRNA序列時，分別在5’端加入Xho 1、3’端加入Xba I識 別序列，并與PTZU6+1的Sal I與Xba I酶切片段連接，含C35siRNA的重組載體Sal I和 Xho I酶切位點均丟失，不能被上述酶酶切，因此，通過簡單的酶切反應(yīng)就可以快速篩選重 組菌落。本發(fā)明人對所述C35 siRNA表達(dá)載體進(jìn)行了大量的測試和應(yīng)用研究工作包括所述表達(dá)載體通過陽離子脂質(zhì)體介轉(zhuǎn)感染乳腺癌細(xì)胞T47D后，采用RT-PCR 法檢測C35基因抑制前后的變化，通過RT-PCR對腫瘤不同靶區(qū)siRNA特異抑制基因表達(dá)進(jìn) 行深入、細(xì)致研究。 包括采用C35的抗體對C35siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)C35蛋白進(jìn)行Western Blot檢測， 為C35siRNA體外抑制C35蛋白的表達(dá)提供實時、直觀的證據(jù)。包括體外轉(zhuǎn)染試驗中運用MTT、TUNEL和ArmexinV/PI流式細(xì)胞分析法技術(shù)對乳腺 癌細(xì)胞的增殖和凋亡進(jìn)行了研究。本發(fā)明所構(gòu)建的C35siRNA表達(dá)載體經(jīng)酶切鑒定、序列測定表明構(gòu)建成功，在體外 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞模型中，通過RT-PCR和Western Blot實驗均證實C35蛋白產(chǎn)物的表達(dá)受到明 顯抑制，通過MTT、TUNEL和Armexin V/PI流式細(xì)胞分析法實驗證實乳腺癌細(xì)胞的生長受到 明顯抑制，腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，能較為明顯地證實C35siRNA具有抑制乳腺癌細(xì)胞中C35基 因的表達(dá)和腫瘤細(xì)胞的生長的作用，可以直接用作抗腫瘤基因藥物或用于制備抗腫瘤的藥 物。


圖1 含獨特莖環(huán)結(jié)構(gòu)的C35siRNA設(shè)計2 :psiRNA-C35表達(dá)載體的構(gòu)建示意3 重組載體psiRNA_C35雙酶切鑒定圖其中1·psiRNA-C35-l 2. Sail 單酶切的 psiRNA_C35_l 3.雙酶切 EcoR I 和 HindIII 的 psiRNA_C35_l 4. Marker 5..雙酶切 EcoR I 和 HindIII 的 pTZU6+l 6. Sail 單酶切的 PTZU6+1 7. pTZU6+l 8. psiRNA_C35_2 9. Sail 單酶切的 psiRNA_C35_2 10.雙酶切 EcoR I 和 HindIII 的 psiRNA_C35_2 11. Marker
將重組的質(zhì)粒載體psiRNA-C35-l和psiRNA-C35_2送交測序公司測序，測序結(jié)果如下 psiRNA-C35-l
CGAAACACCGTCGAGAGATCTCATTGAGGCCATCTTCGGATGGCCTCAATGAGATCTTTTTTCTAGAGCGGA CTTCGGTCCGCTTTTTACTAGGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGG AAAAC
psiRNA-C35-2
TCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTCGAGGAGCCAGTAATGGAGAAACTTCGGTTTC TCCATTACTGGCTCTTTTTCTAGAGCGGACTTCGGTCCGCTTTTTACTAGGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACT GGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATC
通過酶切鑒定和測序結(jié)果表明，psiRNA-C35重組載體構(gòu)建成功，命名為psiRNA-C35_l 和 psiRNA-C35-2。圖4和圖5 半定量RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染psiRNA-C35的T47D細(xì)胞C35mRNA的表達(dá)抑制情 況，其中
圖4為C35和β -actin半定量RT-PCR電泳圖，圖中 1. Maker 2. psiRNA_C35_l 3. psiRNA_C35_2 4. pTZU6+l 5.脂質(zhì) 圖5為半定量RT-PCR抑制C35mRNA轉(zhuǎn)錄的效果，圖中 1.脂質(zhì)體 2. pTZU6+l 3. psiRNA-C35-l 4psiRNA_C35_2
瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，八組泳道中內(nèi)源基因β-actin基因擴(kuò)增片段條帶的亮 度相似，說明各組中模板量相似，而擴(kuò)張的目的基因情況存在明顯差異。其中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 PTZU6+1、psiRNA-C35-l和psiRNA-C35_2組的相對抑制率分別是轉(zhuǎn)染對照組 (脂質(zhì)體組) 的 95. 3%、40%和 28. 4%。
圖6和圖7 :ffestern-blot檢測轉(zhuǎn)染psiRNA_C35的T47D細(xì)胞C35蛋白的表達(dá)抑制情 況，其中
圖6為Westernblot分析轉(zhuǎn)染siRNA后C35蛋白的變化，圖中 1.月旨質(zhì)體 2.pTZU6+l 3. psiRNA-C35-l 4. psiRNA_C35_2 圖7為Westernblot檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞C35蛋白的表達(dá)效果，圖中 1.脂質(zhì)體 2. pTZU6+l 3. psiRNA-C35-l 4psiRNA_C35_2
利用Western Blot檢測轉(zhuǎn)染siRNA后T47D細(xì)胞中C35蛋白質(zhì)表達(dá)情況，結(jié)果顯 示，只轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體組和pTZTO+Ι的C35蛋白雜交帶要強(qiáng)于重組質(zhì)粒psiRNA-C35-l和 psiRNA-C35-2，進(jìn)一步證實了構(gòu)建的重組質(zhì)粒對于C35有抑制作用。應(yīng)用圖像系統(tǒng)分析結(jié) 果，以轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體組的蛋白帶為標(biāo)準(zhǔn)，其它組與之比較，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒PTZU6+1、psiRNA-C35-l 和psiRNA-C35-2組的相對抑制率分別是轉(zhuǎn)染對照組(脂質(zhì)體組)的94. 9%、29. 6%和 32. 2%
圖8為MTT檢測轉(zhuǎn)染psiRNA-C35的T47D細(xì)胞的生長增殖情況，圖中 1.月旨質(zhì)體 2.pTZU6+l 3. psiRNA-C35-l 4. psiRNA_C35_2 縱坐標(biāo)增值率(％ )72h細(xì)胞
實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析顯示，經(jīng)PSIC35轉(zhuǎn)染后的乳腺癌T47D細(xì)胞生長受到顯著抑制，抑制 率達(dá)83%。
圖9 =TUNEL檢測轉(zhuǎn)染psiRNA-C35的T47D細(xì)胞的凋亡樣形態(tài)，其中 圖9a 200倍視野下，轉(zhuǎn)染pTZU6+l空載體的T47D細(xì)胞(陰性對照) 圖9b 400倍視野下，轉(zhuǎn)染pTZU6+l空載體的T47D細(xì)胞(陰性對照) 圖9c 200倍視野下，轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體的T47D細(xì)胞(陰性對照) 圖9d 400倍視野下，轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體的T47D細(xì)胞(陰性對照) 圖9e 200倍視野下，轉(zhuǎn)染psiC35-l的T47D細(xì)胞 圖9f 400倍視野下，轉(zhuǎn)染psiC35-l的T47D細(xì)胞 圖9g 200倍視野下，轉(zhuǎn)染psiC35-2的T47D細(xì)胞 圖9h 400倍視野下，轉(zhuǎn)染psiC35-2的T47D細(xì)胞
200倍和400倍指不同的視野，轉(zhuǎn)染pTZTO+Ι空質(zhì)粒和脂質(zhì)體的細(xì)胞為陰性對照，細(xì)胞 狀態(tài)正常，胞核無凋亡特征性著染；經(jīng)PSIC35-1和pSIC352轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，較多細(xì)胞出現(xiàn)了 核中有棕黃色著染，細(xì)胞呈典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變，即表現(xiàn)為變小、變圓、核固縮。圖10 :AnnexinV/PI流式細(xì)胞分析法檢測轉(zhuǎn)染psiRNA-C35的T47D細(xì)胞的凋亡，檢測細(xì) 胞數(shù)量為IO6個細(xì)胞，培養(yǎng)時間為72h，其中
圖IOa 未經(jīng)處 理的T47D細(xì)胞(為系統(tǒng)對照)
只有細(xì)胞，沒加任何試劑。細(xì)胞正常。
Region Number % gated X—mean HPX-CV
Bl 41 0. 78 3. 3 0. 5
B2 1 0.02 24.6 0. 2
B3 5196 99.14 3.1 8.6
B4 3 0.06 15.0 0. 3
圖IOb 只加PI的T47D細(xì)胞(為系統(tǒng)陰性對照)
Bl 372 11.90 3.5 0.5
B2 4 0. 13 11. 2 0.3
B3 2751 87.98 3. 2 4. 1
B4 0 0.00 0.0 0.0
圖IOc 只加ArmexinV的T47D細(xì)胞(為實驗組陰性對照)
細(xì)胞+ArmexinV為實驗組陰性對照，正常細(xì)胞的凋亡率為19. 2%。
Bl 9 0. 16 3.6 2.1
B2 0 0.00 0.0 0.0
B3 4412 80.64 3.4 2. 3
B4 1050 19.19 116.9 0.2
圖IOd 轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體的T47D細(xì)胞，加ArmexinV和PI (為實驗組陰性對照)
只轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體的細(xì)胞，凋亡率為18. 5%。
Bl 250 3. 19 5.5 0.4
B2 376 4. 79 60.6 0.6
B3 6143 78. 30 3.6 7. 7
B4 1076 13. 72 100.8 0.9
圖IOe 轉(zhuǎn)染pTZU6+l空載體的T47D細(xì)胞，加ArmexinV和PI (為實驗組陰性對照)
只轉(zhuǎn)染PTZU6+1空質(zhì)粒的細(xì)胞，凋亡率為21.6%。
Region Number % gated X-mean HPX CV
Bl 143 2. 26 4.8 0.6
B2 419 6.61 90.6 0.2
B3 4825 76. 15 3. 51 8. 2
B4 949 14. 98 137. 2 0. 2
圖 IOf 轉(zhuǎn)染 psiC35-l 的 T47D 細(xì)胞，加 AnnexinV 和 PI
轉(zhuǎn)染pSIC35-l的細(xì)胞+AnnexinV和PI，細(xì)胞凋亡率為33.7%。
Bl 252 2. 52 4.8 0. 3
B2 777 7.78 118.3 0.2
B3 6373 63.81 3.7 7.2
B4 2586 25.89 201.6 0. 3圖 IOg 轉(zhuǎn)染 psiC352 的 T47D 細(xì)胞，加 AnnexinV 和 PI
轉(zhuǎn)染pSIC35-2的細(xì)胞+AnnexinV+PI 細(xì)胞凋亡率為33. 7%。
Bl 121 1.64 5.11.0
B2 540 7. 33 121. 5 0. 1
B3 3937 53.45 3.9 9.0
B4 2768 37. 58 194. 7 0. 具體實施例方式本發(fā)明的目的可以通過以下措施來達(dá)到本發(fā)明根據(jù)siRNA的設(shè)計原則，分別選擇C35蛋白編碼區(qū)259nt-278nt，編碼 區(qū)282nt-300nt的核苷酸序列，設(shè)計相應(yīng)的siRNA，用BLAST軟件進(jìn)行同源分析證實為 C35高度保守序列后，化學(xué)合成單鏈寡核苷酸，體外經(jīng)退火形成雙鏈DNA，與真核表達(dá)載體 PTZU6+1連接，酶切鑒定和序列測定分析表明成功構(gòu)建了兩種靶向C35基因序列的siRNA 表達(dá)載體。上述表達(dá)載體通過陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞T47D后，采用RT-PCR和 Western Blot實驗均證實C35siRNA具有較強(qiáng)抑制腫瘤細(xì)胞中C35基因表達(dá)的作用。通過 MTT,TUNEL和Armexin V/PI流式細(xì)胞分析法實驗證實乳腺癌細(xì)胞的凋亡，能較為明顯地抑 制乳腺癌細(xì)胞中C35基因的表達(dá)和腫瘤細(xì)胞的生長。具體實施方案如下
1. C35siRNA序列的設(shè)計與合成根據(jù)siRNA設(shè)計原則，分別選擇C35核心編碼區(qū)259nt_278nt，282nt_300nt的核 苷9178序列，設(shè)計下列相應(yīng)的siRNA序列。C35 編碼區(qū) 259nt-278ntsiRNA上游序列5，-TCTGAAGATCTCATTGAGGCCATCTTGGGATGGCCTCAATGAGATCTTTTT-3，下游序列5，-CTAGAAAAAAGATCTCATTGAGGCCATCCGAAGATGGCCTCAATGAGATTC-3，C35 編碼區(qū) 282nt_300nt上游序列5，-TCGAGGAGCCAGTAATGGAGAAACTTCGGTTTCTCCATTACTGGCTCTTTTT-3下游序列5，-CTAGAAAAAGAGCCAGTAATGGAGAAACCGAAGTTTCTCCATTACTGGCTCC-3，上述序列用BLAST軟件進(jìn)行同源分析證實為C35高度保守后，采用化學(xué)合成方法 合成單鏈寡核苷酸。2. DNA片段退火變?yōu)殡p鏈取等量100mmol/L的DNA合成片段，在退火緩沖液(lOOmmol/LNaCl)中于95°C保 溫5min后，緩慢降至室溫，然后用DNA純化試劑盒進(jìn)行純化。3.構(gòu)建PSIC35表達(dá)載體將純化的DNA片段分別與Sal I和Xba I雙酶切的轉(zhuǎn)錄載體pTZU6+l進(jìn)行連接， 轉(zhuǎn)化DH5 α大腸桿菌，經(jīng)Amp抗性篩選，用Sal I或HindIII和EcoR I酶切鑒定，分別篩選 出含目的基因的陽性克隆，并進(jìn)行序列分析加以確定。4. pSIC35體外對C35表達(dá)的抑制作用將兩種pSIC35按一定的比例轉(zhuǎn)染T47D細(xì)胞，同時設(shè)pSI對照。轉(zhuǎn)染后48h收集 細(xì)胞，采用以下手段證明PSIC35體外對C35表達(dá)具有明顯抑制作用①RT-PCR方法=Trizol試劑提取經(jīng)pSIC35轉(zhuǎn)染的T47D細(xì)胞(轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48h)總RNA，以lug總RNA起始逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，PCR擴(kuò)增C35基因，同時以內(nèi)源β -actin基因為對 照物，經(jīng)35次循環(huán)擴(kuò)增后，瓊脂糖凝膠電泳，觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞C35基因水平的變化。 RT-PCR體系引物序列第一對內(nèi)源對照β -actin基因的引物，上引物 5，-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3，，下引物5，-CTCCT TAATGTCACGCACGATTTC-3，；第二對是被 抑制的目的基因的引物，即C35基因的引物5，-CGGAATTCATGAGCGGGGAGCCGG-3，和5，-CGG GATCCTCACAGGATGACGCGGGAGGA-3，。結(jié)果顯示，C35siRNA對C35基因的表達(dá)有明顯的抑制作 用。②Western Blot方法經(jīng)pSIC35轉(zhuǎn)染的T47D細(xì)胞培養(yǎng)48h后，裂解得到蛋白樣 品，經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳(濃縮膠濃度5%，分離膠 濃度12% )后，根據(jù)蛋白Marker中分子量的位置，切去不需要部分，用C35抗體和內(nèi)參進(jìn) 行蛋白質(zhì)免疫印跡實驗，用Chemilucent ECLDetection System-Trial化學(xué)發(fā)光劑處理后， 應(yīng)用FUJIFILMLAS-4000/LAS-4000mini檢測系統(tǒng)，觀察經(jīng)轉(zhuǎn)染后C35蛋白的表達(dá)變化情況。 結(jié)果顯示，C35siRNA明顯抑制了 C35蛋白的表達(dá)，且具有高度的序列特異性。③MTT法檢測細(xì)胞增殖實驗T47D細(xì)胞接種到96孔板內(nèi)，經(jīng)pSIC35轉(zhuǎn)染后培養(yǎng) 68h，加入MTT，設(shè)一調(diào)零孔。4h后，倒掉培養(yǎng)液，加入DMSO，570nm/630nm酶標(biāo)儀檢測轉(zhuǎn)染后 T47D細(xì)胞的增殖情況有何變化。實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析顯示，經(jīng)PSIC35轉(zhuǎn)染后的乳腺癌T47D 細(xì)胞生長收到顯著抑制，證明C35siRNA可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。④TUNEL試劑盒檢測細(xì)胞凋亡實驗T47D細(xì)胞接種到24孔板內(nèi)，經(jīng)pSIC35轉(zhuǎn)染 后培養(yǎng)72h，經(jīng)4%多聚甲醛固定后，經(jīng)熒光標(biāo)記液標(biāo)記，綠色熒光顯示凋亡細(xì)胞，在熒光顯 微鏡下計數(shù)凋亡細(xì)胞；之后用converter-POD處理標(biāo)本后，經(jīng)DAB底物反應(yīng)，再經(jīng)復(fù)染、固定 后，用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行計數(shù)(200 500個細(xì)胞)并拍照。TUNEL法檢測顯示，經(jīng)pSIC35轉(zhuǎn) 染的細(xì)胞中，較多細(xì)胞出現(xiàn)了核中有棕黃色著染，細(xì)胞呈典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變，即表現(xiàn)為 變小、變圓、核固縮；而正常細(xì)胞的胞核不著染的現(xiàn)象，證明C35siRNA可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的 凋亡。⑤AnnexinV/PI流式細(xì)胞分析法T47D細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染后72h，用IXbindingbuffer 重懸細(xì)胞，使其溶液終濃度為IO7細(xì)胞/ml。轉(zhuǎn)移IOOul的細(xì)胞液到1.5ml流式管里。設(shè)置 陰性對照只加Armexin V和只加PI，其余各標(biāo)本同時各加入5ul的Armexin V和PI。輕柔 地混勻，黑暗中室溫放置15min。每管內(nèi)加入400ulIXbinding buffer，Ih內(nèi)用流式細(xì)胞儀 檢測凋亡細(xì)胞數(shù)目。實驗結(jié)果顯示，經(jīng)PSIC35轉(zhuǎn)染后的乳腺癌T47D細(xì)胞比正常細(xì)胞凋亡 率增加15%，C35siRNA具有明顯抑制腫瘤細(xì)胞生長、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的效果。在本發(fā)明中，運用分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)技術(shù)，設(shè)計了兩對C35基 因的siRNA序列并構(gòu)建了 PSIC35表達(dá)載體，在進(jìn)一步的體外實驗中，運用RT-PCR、 Western-Blot、MTT、TUNEL和AnnexinV/PI流式細(xì)胞分析法等實驗技術(shù)初步顯示了其具有 明顯、特異的抗乳腺腫瘤效應(yīng)。本發(fā)明的優(yōu)點在于(1).本發(fā)明設(shè)計了獨特的、具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的C35siRNA，即同一條siRNA序列包含 了 siRNA折疊體的兩條互補(bǔ)鏈。從5’端開始先為siRNA作用鏈序列(即對應(yīng)目的基因序 列的互補(bǔ)序列)，長度為19nt，中間以4nt的TTCG間隔形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，最后為siRNA作用鏈 的反向重復(fù)序列。
(2)本發(fā)明采用了 pTZTO+1表達(dá)載體，該載體含RNApolIII啟動子TO，能介導(dǎo) C35siRNA在體內(nèi)的正確轉(zhuǎn)錄并根據(jù)目的序列的TTTTT末端適時終止，尤其適合靶基因 C35siRNA在體內(nèi)表達(dá)的需要，克服了以往siRNA體外合成耗時、昂貴的缺點，使siRNA在功 能基因和抗腫瘤基因治療上的研究領(lǐng)域更為廣闊。 (3).上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染T47D細(xì)胞，采用RT-PCR法檢測C35基因抑制前后的變化， 通過RT-PCR對腫瘤不同靶區(qū)siRNA特異抑制基因表達(dá)，進(jìn)行深入、細(xì)致研究。(4).采用C35的抗體對C35siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)C35蛋白進(jìn)行WesternBlot檢測， 為C35siRNA體外抑制C35蛋白的表達(dá)提供實時、直觀的證據(jù)。(5)采用MTT、TUNEL和Annexin V/PI流式細(xì)胞分析法實驗檢測經(jīng)C35siRNA轉(zhuǎn)染 細(xì)胞的凋亡情況，為乳腺癌T47D細(xì)胞的體外增殖抑制和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡提供證據(jù)。
權(quán)利要求
一種構(gòu)建兩種靶向C35基因序列的siRNA表達(dá)載體，其特征在于在構(gòu)建針對C35基因的siRNA表達(dá)載體時，根據(jù)siRNA的設(shè)計原則，分別選擇C35蛋白編碼區(qū)259nt 278nt，編碼區(qū)282nt 300nt的核苷酸序列，設(shè)計相應(yīng)的siRNA；用BLAST軟件進(jìn)行同源分析證實為C35高度保守序列后，化學(xué)合成單鏈寡核苷酸；體外經(jīng)退火形成雙鏈DNA，與真核表達(dá)載體pTZU6+1連接，酶切鑒定和序列測定分析表明成功構(gòu)建了兩種靶向C35基因序列的siRNA表達(dá)載體。
2.如權(quán)利要求1所述的C35siRNA表達(dá)載體，其特征在于設(shè)計的兩對C35siRNA序列為C35 編碼區(qū) 259nt-278ntsiRNA上游序列5 ’ -TCTGAAGATCTCATTGAGGCCATCTTCGATGGCCTCAATGAGATCTTTTT-3 ’下游序列5 ’ -CTAGAAAAAAGATCTCATTGAGGCCATCCGAAGATGGCCTCAATGAGATTC-3 ’C35 編碼區(qū) 282nt-300nt上游序列5’ -TCGAGGAGCCAGTAATGGAGAAACTTCGGTTTCTCCATTACTGGCTCTTTTT-3’下游序列5’ -CTAGAAAAAGAGCCAGTAATGGAGAAACCGAAGTTTCTCCATTACTGGCTCC-3’
3.如權(quán)利要求1或2所述的C35siRNA表達(dá)載體，其特征在于設(shè)計的任何一條siRNA序 列能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA，即同一條siRNA序列包含了 siRNA折疊體的兩條互補(bǔ)鏈。從5’ 端開始先為siRNA作用鏈序列，長度為19nt，中間以4nt的TTCG間隔形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，最后為 siRNA作用鏈的反向重復(fù)序列。
4.如權(quán)利要求1所述的C35siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于采用了pTZTO+Ι表 達(dá)載體，該載體含RNApolIII啟動子TO，能介導(dǎo)C35siRNA在體內(nèi)的正確轉(zhuǎn)錄并根據(jù)目的序 列的TTTTT末端適時終止，尤其適合靶基因C35siRNA在體內(nèi)表達(dá)的需要。
5.如權(quán)利要求1所述的C35siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征還在于通過酶切反應(yīng)， 快速鑒定重組質(zhì)粒與空載體和快速篩選重組菌落的方法。
6.如權(quán)利要求1所述的C35siRNA表達(dá)載體的應(yīng)用研究，其特征在于所述表達(dá)載體轉(zhuǎn) 染T47D細(xì)胞，采用RT-PCR法檢測C35基因抑制前后的變化，通過RT-PCR對腫瘤不同靶區(qū) siRNA特異抑制基因表達(dá)進(jìn)行深入、細(xì)致研究。
7.如權(quán)利要求1所述的C35siRNA表達(dá)載體的應(yīng)用研究，其特征在于采用C35的抗體對 C35siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)C35蛋白進(jìn)行Western Blot檢測，為C35siRNA體外抑制C35蛋白 的表達(dá)提供實時、直觀的證據(jù)。
8.如權(quán)利要求1所述的C35siRNA表達(dá)載體的應(yīng)用研究，其特征還在于通過MTT、TUNEL 和ArmexinV/PI流式細(xì)胞分析法，實驗證實經(jīng)C35siRNA轉(zhuǎn)染的乳腺癌細(xì)胞的增殖受到明顯 抑制、腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，證明C35siRNA能較為明顯地抑制乳腺癌細(xì)胞中C35基因的表達(dá) 和腫瘤細(xì)胞的生長。
9.如權(quán)利要求1所述的C35siRNA表達(dá)載體的應(yīng)用，其特征在于所述的C35siRNA能特 異性的抑制C35基因的表達(dá)，明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，可作為一種 新型抗腫瘤基因治療手段運用到臨床治療中。
10.如權(quán)利要求1所述的C35siRNA表達(dá)載體的應(yīng)用，其特征在于將所述的C35siRNA作 為藥物直接進(jìn)行裸DNA注射，導(dǎo)入機(jī)體的腫瘤組織內(nèi)；或利用金包被DNA槍轟擊法，將構(gòu)建 好的表達(dá)載體質(zhì)粒DNA包被在金微粒子表面，用基因槍使包被DNA的金微粒子高速穿入腫 瘤組織細(xì)胞；或作為主要活性組分，添加制藥用輔料，制備抗腫瘤藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是乳腺癌細(xì)胞C35基因siRNA序列的設(shè)計，表達(dá)載體的構(gòu)建及其在抗腫瘤治療中的應(yīng)用。本發(fā)明根據(jù)siRNA的設(shè)計原則，分別選擇C35蛋白編碼區(qū)259nt-278nt，編碼區(qū)282nt-300nt的核苷酸序列，設(shè)計相應(yīng)的siRNA，用BLAST軟件進(jìn)行同源分析證實為C35高度保守序列后，化學(xué)合成單鏈寡核苷酸，體外經(jīng)退火形成雙鏈DNA，與真核表達(dá)載體pTZU6+1連接，酶切鑒定和序列測定分析表明成功構(gòu)建了兩種靶向C35基因序列的siRNA表達(dá)載體。上述表達(dá)載體通過陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞T47D后，采用RT-PCR和Western Blot實驗以及MTT、TUNEL利Annexin V/PI流式細(xì)胞分析法實驗均證實C35siRNA具有較強(qiáng)抑制乳腺癌細(xì)胞生長的作用，可以在制備抗腫瘤的藥物中應(yīng)用。
文檔編號A61P15/14GK101967495SQ200910013679
公開日2011年2月9日 申請日期2009年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月23日
發(fā)明者劉俏俏, 尹昆, 朱嵩, 譚效忠, 趙桂華, 閆歌 申請人:山東省寄生蟲病防治研究院