專利名稱：關(guān)于使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的核酸遞送產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法
關(guān)于使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的核酸遞送產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方
法發(fā)明背景 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明在藥物遞送且特別地基于陽(yáng)離子脂質(zhì)體的疫苗領(lǐng)域中。在實(shí)施方案中，本 發(fā)明提供了制備用于遞送分子以誘導(dǎo)針對(duì)病毒抗原的免疫應(yīng)答或者治療或預(yù)防病毒疾病 的配體靶向的(例如，抗體或抗體片段靶向的)脂質(zhì)體的方法。遞送系統(tǒng)的特異性得自靶 向性配體。
背景技術(shù)：
疫苗代表針對(duì)可高度傳播的感染性病原體的強(qiáng)大武器，并且在過去一個(gè)世紀(jì)中已 用于顯著減少感染性疾病的負(fù)擔(dān)。然而，由感染性疾病造成的對(duì)全球健康的威脅并未后退， 而是已變成全國(guó)和全球優(yōu)先考慮的事情。病毒病原體例如結(jié)核和瘧疾的影響繼續(xù)在全球規(guī) 模上感受到，并且新出現(xiàn)的病原體例如HIV/AIDS、SARS冠狀病毒和最近出現(xiàn)的大流行性流 感或‘禽流感’病毒對(duì)公共衛(wèi)生提出新挑戰(zhàn)。大多數(shù)疫苗技術(shù)涉及滅活的疫苗制劑、基于蛋白質(zhì)亞單位或在性質(zhì)方面活減毒 的。例如，關(guān)于流感疫苗的目前生產(chǎn)和制造技術(shù)基于雞蛋接種并且仍是時(shí)間和成本密集過 程。其為活減毒病毒的天花疫苗與免疫妥協(xié)群體中的嚴(yán)重不利事件相關(guān)。因此，目前的疫 苗技術(shù)是過時(shí)的并且不足以滿足關(guān)于疫苗的全國(guó)或全球需求。因此，存在開發(fā)新疫苗技術(shù)的迫切需要，所述新疫苗技術(shù)將解決由高度易變和新 出現(xiàn)的病原體造成的挑戰(zhàn)。本發(fā)明通過提供基于陽(yáng)離子脂質(zhì)體的藥物遞送系統(tǒng)滿足了這些 需要，所述藥物遞送系統(tǒng)用于在誘導(dǎo)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答中使用以及用于治療或預(yù)防患者 中的病毒疾病。發(fā)明概述在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備配體靶向的(例如，蛋白質(zhì)/肽靶向的、抗 體或抗體片段靶向的)陽(yáng)離子脂質(zhì)體的方法。在合適的實(shí)施方案中，此種方法包括制備配 體(例如，轉(zhuǎn)鐵蛋白、半乳糖、L-37pA、抗體或抗體片段)，并且使配體與陽(yáng)離子脂質(zhì)體混合， 以形成配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體。適當(dāng)?shù)?，配體與陽(yáng)離子脂質(zhì)體直接結(jié)合/復(fù)合，但不與陽(yáng) 離子脂質(zhì)體化學(xué)綴合。在其他實(shí)施方案中，配體可以與陽(yáng)離子脂質(zhì)體化學(xué)綴合。隨后，配體 靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體與編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子，和/或編碼一 種或多種白介素的一種或多種核酸分子混合，以形成配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物。在 合適的實(shí)施方案中，使用抗體片段，例如，F(xiàn)ab片段、或單鏈Fv片段，例如抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單 鏈Fv (TfRscFv)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該方法可以進(jìn)一步包括使配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì) 體與包含1([1(01)1(1(1(]5-1(01)1(此0101(0 (SEQ ID NO 1)肽的肽混合。適當(dāng)?shù)?，配體(例如，蛋白質(zhì)/肽、抗體或抗體片段)與陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約1 1 至約1 100、適當(dāng)?shù)丶s1 10至約1 50(w W)、更適當(dāng)?shù)丶s1 20至約1 40范圍 的比混合。在示例性實(shí)施方案中，陽(yáng)離子脂質(zhì)體包含二油酰基三甲基磷酸銨(D0TAP)與二油?；字Ｒ掖及?DOPE)和/或膽固醇(chol)的混合物；或雙十八烷基二甲基溴化銨 (DDAB)與二油?；字Ｒ掖及泛?或膽固醇的混合物。核酸適當(dāng)?shù)匾约s0. 1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子比 約10摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子；至約10摩爾編碼一種或多種病 毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子比約0. 1摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸 分子的摩爾比存在。例如，可以利用約1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核 酸分子比約1摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子的比。在示例性實(shí)施方案 中，陽(yáng)離子免疫脂質(zhì)體與編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子、和編碼一種 或多種白介素的一種或多種核酸分子，以約1 1至約1 40(yg總核酸yg脂質(zhì)體)、 適當(dāng)?shù)丶s1 5至約1 20(yg總核酸yg脂質(zhì)體)，例如約1 10(yg總核酸yg 脂質(zhì)體)的重量比混合?？梢杂珊怂岱肿泳幋a的病毒蛋白質(zhì)例子包括但不限于，選自下述的病毒蛋白質(zhì) HIV病毒蛋白質(zhì)，流感病毒蛋白質(zhì)，甲型、乙型或丙型肝炎病毒蛋白質(zhì)、SARS病毒蛋白質(zhì)，禽 流感病毒蛋白質(zhì)，埃博拉病毒蛋白質(zhì)，西尼羅病毒蛋白質(zhì)，和天花病毒蛋白質(zhì)?？梢杂珊怂?分子編碼的白介素例子包括但不限于，選自IL-l、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、 IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18 和 IL-23 的白介素。在合適的實(shí)施方案中， 核酸編碼IL-2、IL-12和IL-15。本發(fā)明還提供了通過本發(fā)明的各種方法制備的陽(yáng)離子免 疫脂質(zhì)體復(fù)合物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了配體靶向的(例如，蛋白質(zhì)/肽、抗體或抗 體片段靶向的)陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，其包含陽(yáng)離子脂質(zhì)體、配體(例如，蛋白質(zhì)/肽、抗體 或抗體片段)、編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子、和編碼一種或多種白介 素的一種或多種核酸分子，其中配體與陽(yáng)離子脂質(zhì)體直接復(fù)合但不化學(xué)綴合。在進(jìn)一步的 實(shí)施方案中，配體可以與脂質(zhì)體化學(xué)綴合。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的各種脂質(zhì)體復(fù)合物的藥物組合物。本發(fā)明的另外的 藥物組合物包括第一配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，其包括陽(yáng)離子脂質(zhì)體、配體(例如， 蛋白質(zhì)/肽、抗體或抗體片段)和編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子，其 中配體與陽(yáng)離子脂質(zhì)體直接復(fù)合但不化學(xué)綴合。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，配體可以與陽(yáng)離 子脂質(zhì)體化學(xué)綴合。在合適的實(shí)施方案中，藥物組合物還進(jìn)一步包括第二配體靶向的陽(yáng)離 子脂質(zhì)體復(fù)合物，其包括陽(yáng)離子脂質(zhì)體、配體(例如，蛋白質(zhì)/肽、抗體或抗體片段)和編碼 一種或多種白介素的一種或多種核酸分子，其中配體與陽(yáng)離子脂質(zhì)體直接復(fù)合但不化學(xué)綴 合。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，配體可以與陽(yáng)離子脂質(zhì)體化學(xué)綴合。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了將一種或多種活性劑遞送給哺乳動(dòng)物的抗原呈遞細(xì)胞(APCs)的方法，其包括給哺乳動(dòng)物施用抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈Fv(TfRscFv)靶向的 陽(yáng)離子免疫脂質(zhì)體復(fù)合物，所述復(fù)合物包括陽(yáng)離子脂質(zhì)體、TfRscFv和一種或多種活性劑， 其中TfRscFv與陽(yáng)離子脂質(zhì)體直接結(jié)合/復(fù)合，但不化學(xué)綴合。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中， TfRscFv可以與陽(yáng)離子脂質(zhì)體化學(xué)綴合。適當(dāng)?shù)?，該方法將試?例如，核酸)遞送給專業(yè) 和非專業(yè)APCs，包括位于肝、脾、淋巴結(jié)、腸和/或呼吸道中的APCs。本發(fā)明還提供了在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)針對(duì)病毒抗原的免疫應(yīng)答的方法，其包括給哺 乳動(dòng)物施用本發(fā)明的各種陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物、或本發(fā)明的藥物組合物。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中的病毒疾病的方法，其包括給哺乳動(dòng)物施用本發(fā)明的各種陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物、或本發(fā)明的藥物組合物。附圖簡(jiǎn)述本專利或申請(qǐng)文件包含以彩色作出的至少一個(gè)附圖。本專利或?qū)＠暾?qǐng)公開物與 一個(gè)或多個(gè)彩色附圖的拷貝將在請(qǐng)求且支付必要費(fèi)用后由USPTO或事務(wù)所提供。

圖1顯示在用脂質(zhì)體(包括或不包括HoKC肽)轉(zhuǎn)染的H印3B細(xì)胞中的螢光素酶 活性，所述脂質(zhì)體與抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈抗體片段(sc)和螢光素酶報(bào)道基因復(fù)合。圖2顯示在用3種不同脂質(zhì)體(A、D和G)轉(zhuǎn)染的原代黑猩猩肝細(xì)胞中的螢光素酶 表達(dá)，所述脂質(zhì)體與sc、Gal或L-37-pA和表達(dá)螢光素酶報(bào)道基因的DNA復(fù)合。所有數(shù)據(jù)顯 示為平均值+SD (η = 3)。圖3顯示蛋白質(zhì)印跡，其顯示與未處理小鼠(UT)比較，在來自用20-25 μ g表達(dá) EGFP的DNA接種的一式兩份小鼠的肝提取物中的GFP表達(dá)，所述表達(dá)EGFP的DNA和與脂質(zhì) A 綴合的 TfRscFv 配體(sc) (scLA)、與脂質(zhì) A 和 HoKC 綴合的 TfRscFv 配體(sc) (scLAHK)、 與脂質(zhì)D和HoKC綴合的TfRscFv配體(sc) (scLDHK)、與脂質(zhì)G和HoKC綴合的TfRscFv配 體(sc) (scLGHK)、與脂質(zhì)A綴合的半乳糖(GalLA)和與脂質(zhì)A綴合的L_37pA (L_37pALA)復(fù)
合O圖4顯示用表達(dá)HCV抗原NS3-NS5B的DNA質(zhì)粒(pAG410)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的蛋白質(zhì)印 跡。印跡用針對(duì)NS5B的單克隆抗體(左)和來自慢性感染的黑猩猩的血清(右)進(jìn)行探 測(cè)。圖5顯示在pSCMV和CMV啟動(dòng)子下的IL_2的比較表達(dá)。圖6顯示在i. v.注射scL復(fù)合的或游離的PAG410后小鼠肝中的NS3的DNA PCR 擴(kuò)增。圖7顯示在用SCL-HCV/SCL-IL12接種的小鼠中HCV重組痘苗病毒復(fù)制的抑制。圖8A和8B顯示在首次用于實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物(Chl601)和恢復(fù)的動(dòng)物(Chl587)的疫 苗接種和用HCV攻擊過程中的HCV抗HVRl抗體(條)和RNA譜(黑色三角)?？笻VRl表 示為P/N比。P/N通過將測(cè)試血清的0D405除以對(duì)于來自相同黑猩猩的疫苗前樣品獲得的 0D405進(jìn)行計(jì)算。截?cái)嘀凳荘/N = 2。圖9A-9C顯示在2只恢復(fù)的黑猩猩(Chl588和Chl606)和1只首次用于實(shí)驗(yàn)的黑 猩猩(Ch6394)的基于T細(xì)胞的疫苗接種和用HCV攻擊過程中的疾病曲線圖。RNA滴度(黑色 方塊)、ALT水平(黑色三角)。免疫接種的動(dòng)物的HCV攻擊在第O周時(shí)執(zhí)行(100CID5(1cHCV)。圖10A-10C顯示在用scL-HCV免疫接種且用重組腺病毒加強(qiáng)的(Chl611和 Ch6407)，或用scL-空載體免疫接種且用非重組腺病毒加強(qiáng)的(Ch0257)黑猩猩中針對(duì)肽庫(kù) 的elispot應(yīng)答。圖1IA-IIC顯示在攻擊前和后在免疫接種的(Ch6407和1611)和對(duì)照(Ch 0257) 黑猩猩中的Elispot應(yīng)答。圖12A-12C顯示在疫苗接種的(Ch6407和1611)和對(duì)照(Ch 0257)黑猩猩中的肝 內(nèi)細(xì)胞因子mRNA水平。圖13顯示在對(duì)照(Ch 0257)和疫苗接種的(Ch6407和1611)黑猩猩中在攻擊后 的HCV RNA滴度。
圖14顯示在對(duì)照(Ch 0257)和疫苗接種的(Ch6407和1611)黑猩猩中在攻擊后 的血清ALT水平。圖15顯示在慢性感染的黑猩猩中的PBMC T細(xì)胞應(yīng)答。圖16A-16C顯示在IN施用質(zhì)粒DNA，隨后進(jìn)行后續(xù)螢光素底物注射后的BALB/c小 鼠的光學(xué)圖像，所述質(zhì)粒DNA表達(dá)螢光素酶基因，且作為游離(裸露)質(zhì)粒DNA (LUC) (B)或 封裝在scL納米免疫脂質(zhì)體復(fù)合物中(scLLUC) (C)。小圖A代表未處理對(duì)照。圖17A-17C顯示在IV施用質(zhì)粒DNA，隨后進(jìn)行后續(xù)螢光素底物注射后的BALB/c小 鼠的光學(xué)圖像，所述質(zhì)粒DNA表達(dá)螢光素酶基因，且作為游離(裸露)質(zhì)粒DNA (LUC) (B)或 封裝在scL納米免疫脂質(zhì)體復(fù)合物中(scLLUC) (C)。小圖A代表未處理對(duì)照。發(fā)明詳述在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明實(shí)施方案的配體靶向的(例如，蛋白質(zhì)/肽、抗體 或抗體片段靶向的)陽(yáng)離子脂質(zhì)體或陽(yáng)離子聚合物復(fù)合物適當(dāng)?shù)赝ㄟ^簡(jiǎn)單有效的非化學(xué) 綴合方法進(jìn)行制備，其中所需復(fù)合物的組分以限定比和限定順序混合在一起。在另外的實(shí) 施方案中，配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體或陽(yáng)離子聚合物復(fù)合物可以通過化學(xué)綴合方法進(jìn)行制 備，其中配體經(jīng)由化學(xué)鍵與陽(yáng)離子脂質(zhì)體的表面化學(xué)綴合。術(shù)語(yǔ)“免疫復(fù)合物”、“免疫脂質(zhì)體”、“復(fù)合物”、“納米復(fù)合物”、“免疫納米復(fù)合物”、 “脂質(zhì)體復(fù)合物”和“納米免疫脂質(zhì)體”自始至終可互換用于指本發(fā)明的陽(yáng)離子脂質(zhì)體。用 于在本發(fā)明的實(shí)踐中使用的示例性陽(yáng)離子脂質(zhì)體及其生產(chǎn)方法公開于2006年9月14日提 交的美國(guó)公開專利申請(qǐng)?zhí)?003/0044407和美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/520，796中，所述申請(qǐng)各自 的公開內(nèi)容通過弓I用整體合并入本文。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“約”指所述值以及在所述值10%內(nèi)的值。例如，“約lOOnm” 包括90nm至IlOnm的值，包括在這個(gè)范圍之間的值。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“配體”指任何合適的靶向性部分，其可以與陽(yáng)離子脂質(zhì)體 化學(xué)綴合，或直接結(jié)合/復(fù)合但不化學(xué)綴合。用于在本發(fā)明的實(shí)踐中使用的示例性配體包 括但不限于，蛋白質(zhì)(例如，轉(zhuǎn)鐵蛋白或葉酸)、肽(例如，L-37pA)、抗體、抗體片段(包括 Fab'片段和單鏈Fv片段)和糖(例如，半乳糖)、以及其他靶向性分子。其中依照本發(fā)明實(shí)施方案的復(fù)合物通過簡(jiǎn)單有效的非化學(xué)綴合進(jìn)行制備的示例 性方法和組合物公開于2006年9月14日提交的美國(guó)公開專利申請(qǐng)?zhí)?003/0044407和美國(guó) 專利申請(qǐng)?zhí)?1/520,796中。其中依照本發(fā)明實(shí)施方案的復(fù)合物經(jīng)由化學(xué)綴合進(jìn)行制備的 示例性方法和組合物公開于2001年10月1日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?9/914，046中。這 些專利申請(qǐng)各自的公開內(nèi)容通過弓I用整體合并入本文。在示例性實(shí)施方案中，完整抗體或抗體片段可以用作配體以制備本發(fā)明的復(fù) 合物。在一個(gè)合適的實(shí)施方案中，使用抗體片段，包括抗體的Fab片段和單鏈Fv片段 (scFv)。一種合適的抗體是抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(抗TfR)單克隆抗體，并且合適的抗體片段 是基于抗TfR單克隆抗體的scFv。合適的抗TfR單克隆抗體是5E9(參見例如，Hayes, B. F.,等人， “Characterization of a Monoclonal Antibody (5E9) that Defines a Human Cell Surface Antigen of Cell Activation, " J. Immunol. 127 347-352 (1981)； Batra, J.K., 等 人’ “Single-chainImmunotoxins Directed at the Human Transferrin ReceptorContaining Pseudomonas Exotoxin A or Diphther ia Toxin Anti-TFR(Fv)-PE40 and DT388-Anti_TFR(Fv)，“ Mol. Cell. Biol. 11 =2200-2205 (1991)； 其公開內(nèi)容通過引用合并入本文)?；?E9抗體的scFv包含關(guān)于由這種MAb識(shí)別的TfR 表位的完全抗體結(jié)合位點(diǎn)(作為分子量約26，000的單條多肽鏈)。scFv通過使來自重和 輕鏈的組分VH和VL可變結(jié)構(gòu)域分別與適當(dāng)設(shè)計(jì)的肽連接而形成，所述適當(dāng)設(shè)計(jì)的肽使第 一個(gè)可變區(qū)的C末端與第二個(gè)的N末端橋接，順序?yàn)閂H-肽-VL或VL-肽-VH0另外的配體 例如本文中描述的那些也可以在本發(fā)明的實(shí)踐中使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，將半胱氨酸部分加入scFv的C末端中。盡管不希望受理論束 縛，但相信提供游離巰基的半胱氨酸可能增強(qiáng)在化學(xué)綴合和非化學(xué)綴合實(shí)施方案中抗體和 脂質(zhì)體之間的復(fù)合物形成。無論用或不用半胱氨酸，蛋白質(zhì)可以在大腸桿菌(E. coli)包含 體中表達(dá)并且隨后重折疊以產(chǎn)生活性形式的抗體片段。除非希望在復(fù)合物形成中使用立體穩(wěn)定免疫脂質(zhì)體，否則在制備本發(fā)明的示例性 非化學(xué)綴合復(fù)合物中的第一個(gè)步驟包括使陽(yáng)離子脂質(zhì)體或脂質(zhì)體組合與選擇的抗體或抗 體片段混合。廣泛多樣的陽(yáng)離子脂質(zhì)體在本發(fā)明復(fù)合物的制備中有用。公開的PCT申請(qǐng) TOggAsszo描述了數(shù)種陽(yáng)離子脂質(zhì)體的制備。合適脂質(zhì)體的例子包括磷脂酰膽堿(PC)、 磷脂酰絲氨酸(PS)以及包含二油?；谆姿徜@(DOTAP)與二油酰基磷脂酰乙醇胺 (DOPE)和/或膽固醇(chol)的混合物；雙十八烷基二甲基溴化銨(DDAB)與二油?；字?酰乙醇胺和/或膽固醇的混合物的那些?？梢愿淖冎|(zhì)的比例以對(duì)于特定靶細(xì)胞類型最 佳化治療分子的攝取效率。脂質(zhì)體可以包含一種或多種陽(yáng)離子脂質(zhì)和一種或多種中性或 輔助脂質(zhì)的混合物。一種或多種陽(yáng)離子脂質(zhì)與一種或多種中性或輔助脂質(zhì)的所需比為約 1 (0.5-3)，優(yōu)選1 (1_2)(摩爾比)。合適的配體，例如蛋白質(zhì)/肽、抗體或抗體片段，是與靶細(xì)胞的表面結(jié)合，并且優(yōu) 選與在靶細(xì)胞上差異表達(dá)的受體結(jié)合的那些。配體在室溫下以及以約1 10至約1 50、 適當(dāng)?shù)丶s1 20至約1 40(w w)范圍的配體(例如，蛋白質(zhì))脂質(zhì)比(重量重 量)與陽(yáng)離子脂質(zhì)體或聚合物混合。允許配體(例如，蛋白質(zhì)/肽、抗體或抗體片段)和脂質(zhì)體在室溫下溫育短時(shí)間 段，一般約10-15分鐘，隨后使混合物與選擇的治療或診斷劑混合。可以與脂質(zhì)體復(fù)合物復(fù) 合的治療分子或試劑的例子包括基因、高分子量DNA(基因組DNA)、質(zhì)粒DNA、反義寡核苷 酸、肽、核酶、核酸(包括siRNA和反義)、小分子、病毒顆粒、免疫調(diào)節(jié)劑、用于成像的造影 齊U、蛋白質(zhì)和化學(xué)試劑。配體(例如，蛋白質(zhì)/肽、抗體或抗體片段)和脂質(zhì)體組合與治療試劑以在 約0.5 1至約1 40(yg試劑nmol總脂質(zhì))、適當(dāng)?shù)丶s1 10至約1 20 (μ g 試劑nmol總脂質(zhì))范圍中的比混合，并且在室溫下溫育短時(shí)間段，一般約10-15 分鐘。脂質(zhì)體復(fù)合物的大小一般在約50-500nm范圍內(nèi)，如通過動(dòng)態(tài)光散射使用 Malvern ZETASIZER 3000 或 Malvern ZETASIZER NANO-ZS 測(cè)量的。參見美國(guó)公開 專利申請(qǐng)?zhí)?003/0044407和美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/520，796，其公開內(nèi)容通過引用整體合并 入本文。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用于形成復(fù)合物的脂質(zhì)體是立體穩(wěn)定脂質(zhì)體。立 體穩(wěn)定脂質(zhì)體是親水聚合物例如PEG、聚(2-乙基丙烯酸)、或聚(η-異丙基丙烯酰胺 (PNIPAM)已整合到其內(nèi)的脂質(zhì)體。當(dāng)與治療劑復(fù)合時(shí)，此種修飾的脂質(zhì)體可以是特別有用的，因?yàn)樗鼈円话悴幌笪慈绱诵揎椀目杀容^脂質(zhì)體一樣快速地通過網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)從血流中 清除。為了制備本發(fā)明的立體穩(wěn)定脂質(zhì)體復(fù)合物，抗體或抗體片段、脂質(zhì)體和治療或診斷劑 的混合順序與上文闡述的順序相反。在第一個(gè)步驟中，如上所述的陽(yáng)離子脂質(zhì)體首先如上 所述以在約0.5 1至約1 40(yg試劑nmol脂質(zhì))、適當(dāng)?shù)丶s1 10至1 20 ( μ g 試劑nmol脂質(zhì))范圍中的比與治療劑混合。以約0.1 100 (nmol PEG nmol脂質(zhì))、 適當(dāng)?shù)丶s0.5 50，例如1 40(nmol PEG nmol脂質(zhì))的比，向這種脂復(fù)合物中加入溶 于生理學(xué)上可接受的緩沖液中的PEG聚合物溶液。所得到的溶液在室溫下溫育足以允許聚 合物整合到脂質(zhì)體復(fù)合物內(nèi)的時(shí)間。配體(例如，蛋白質(zhì)/肽、抗體或抗體片段)隨后在室 溫下和以在約1 5至約1 40(w w)范圍中的配體(例如，蛋白質(zhì))脂質(zhì)比與穩(wěn)定 脂質(zhì)體復(fù)合物混合。依照本發(fā)明制備的脂質(zhì)體復(fù)合物可以配制為藥理學(xué)上可接受的制劑用于體內(nèi)施 用。復(fù)合物可以與藥理學(xué)上相容的媒介物或載體組合。組合物可以配制例如用于靜脈內(nèi)施 用于哺乳動(dòng)物，例如待通過施用在復(fù)合物中的治療分子或其他有效負(fù)荷獲益的人患者。復(fù) 合物具有如此合適的大小，使得它們?cè)陟o脈內(nèi)施用后遍及機(jī)體分布。備選地，復(fù)合物可以經(jīng) 由其他施用途徑進(jìn)行遞送，例如瘤內(nèi)(IT)、損傷內(nèi)(IL)、氣溶膠、透皮、經(jīng)口、內(nèi)窺鏡、局部、 肌內(nèi)(IM)、皮內(nèi)(ID)、眼內(nèi)(10)、腹膜內(nèi)(IP)、經(jīng)皮(TD)、鼻內(nèi)(IN)、大腦內(nèi)(IC)、器官內(nèi) (例如，肝內(nèi))、緩慢釋放埋植劑或皮下施用，或經(jīng)由使用滲透或機(jī)械泵的施用。用于經(jīng)由此 種方法遞送的制劑的制備和使用此種方法的遞送是本領(lǐng)域眾所周知的。復(fù)合物可以就靶細(xì)胞類型進(jìn)行最佳化，通過脂質(zhì)的選擇和比、配體(例如，蛋白質(zhì) /肽、抗體或抗體片段)與脂質(zhì)體的比、配體和脂質(zhì)體與治療劑的比、以及配體和治療劑的 選擇。依照本發(fā)明的方法制備的復(fù)合物可以以試劑盒形式提供，用于在核酸、治療分子 或經(jīng)由復(fù)合物的其他有效負(fù)荷的系統(tǒng)遞送中使用。合適的試劑盒可以在分別的合適容器中 包括脂質(zhì)體、配體(例如，蛋白質(zhì)/肽、抗體或抗體片段)、和核酸、治療或診斷劑。組分可以 在無菌條件下以合適順序混合，并且在合理時(shí)間段內(nèi)施用于患者，一般在制備后約30分鐘 至約24小時(shí)。試劑盒組分優(yōu)選作為溶液或作為干粉提供。以溶液形式提供的組分優(yōu)選連 同合適緩沖劑、滲透性控制試劑等一起在無菌注射用水中配制。完整的復(fù)合物還可以配制 為干粉(凍干的)(參見例如，美國(guó)公開專利申請(qǐng)?zhí)?005/0002998，其公開內(nèi)容通過引用整 體合并入本文)。
如其公開內(nèi)容通過引用合并入本文的美國(guó)公開專利申請(qǐng)?zhí)?003/0044407和美 國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/520，796中自始至終討論的，自始至終描述的陽(yáng)離子免疫脂質(zhì)體復(fù)合 物已成功地將各種治療和診斷劑遞送給腫瘤細(xì)胞，經(jīng)由使用抗轉(zhuǎn)鐵蛋白單鏈抗體片段 (TfRscFv)靶向。特別地，核酸分子例如反義和siRNA以及質(zhì)粒DNA (例如p53和RB94)已 使用本發(fā)明的免疫脂質(zhì)體復(fù)合物成功地遞送(參見美國(guó)公開專利申請(qǐng)?zhí)?003/0044407和 美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/520，796)。小分子也已通過自始至終公開的方法和脂質(zhì)體遞送(參見， 2007年5月11日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/798，296，其公開內(nèi)容通過引用整體合并入本 文)。如自始至終討論的，目前已發(fā)現(xiàn)疫苗構(gòu)建體可以進(jìn)行制備、靶向且有效轉(zhuǎn)染無論存在 于機(jī)體何處中的抗原呈遞細(xì)胞(APCs)，包括但不限于，肝臟肝細(xì)胞、枯否細(xì)胞、肝竇狀上皮 細(xì)胞(LSEC)和樹突細(xì)胞(使用TfRscFv作為靶向性部分)。
用于疫苗接種的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于在哺乳動(dòng)物(如本文所使用的，哺乳動(dòng)物 包括犬、貓、豬、綿羊、馬、牛、大鼠、小鼠、黑猩猩、猴、類人猿等以及人)中使用陽(yáng)離子脂質(zhì) 體復(fù)合物在病毒復(fù)制的原始位點(diǎn)處誘導(dǎo)針對(duì)病毒抗原的免疫應(yīng)答的方法，所述原始位點(diǎn)例 如具有丙型肝炎病毒(HCV)的肝，且特別地抗原呈遞細(xì)胞(APC)。作為一個(gè)例子，在HCV中， T細(xì)胞應(yīng)答已確定為在感染后的病毒復(fù)制位點(diǎn)(肝)處更快速和更有效。因此，本發(fā)明提供 了模擬在HCV恢復(fù)的哺乳動(dòng)物中發(fā)生的T細(xì)胞初敏的方法，其通過陽(yáng)離子脂質(zhì)體以遞送重 組質(zhì)粒DNA和病毒載體化免疫接種而在體內(nèi)誘導(dǎo)靶向位于肝中的細(xì)胞(例如，枯否細(xì)胞、肝 竇狀上皮細(xì)胞、樹突細(xì)胞和肝細(xì)胞)的免疫應(yīng)答(例如，預(yù)防疫苗)。本發(fā)明還提供了用作 免疫治療劑的疫苗以用于預(yù)防和治療慢性(和急性)病原體感染。將各種配體靶向的陽(yáng)離 子脂質(zhì)體復(fù)合物遞送給機(jī)體的正常細(xì)胞(即，非腫瘤細(xì)胞)的能力是出乎意料和令人驚訝 的結(jié)果。應(yīng)當(dāng)理解盡管本發(fā)明的示例性方法用于治療哺乳動(dòng)物(例如，人)，但本發(fā)明的方 法、脂質(zhì)體制劑和組合物還可以用于治療其他動(dòng)物，包括鳥類、魚類等。本發(fā)明的陽(yáng)離子免疫脂質(zhì)體復(fù)合物適當(dāng)?shù)卦谄浔砻嫔习罐D(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈 抗體分子(TfRscFv)。已確定這種靶向性分子增強(qiáng)表達(dá)病毒蛋白質(zhì)的封裝/結(jié)合核酸(例 如，質(zhì)粒DNA)的遞送和經(jīng)由APCs的攝取。參見例如，美國(guó)公開專利申請(qǐng)?zhí)?003/0044407 和美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/520,796。此外，本發(fā)明提供了在相同免疫脂質(zhì)體復(fù)合物中表達(dá)白介 素(IL)佐劑的核酸的同時(shí)施用以刺激免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子增強(qiáng)細(xì)胞因子是由機(jī)體中的細(xì)胞響應(yīng)激活刺激釋放的小蛋白質(zhì)( 25kDa)。它們 通過與特定受體結(jié)合以自分泌和旁分泌的方式誘導(dǎo)應(yīng)答，以調(diào)節(jié)先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng) 答。通過共施用純化的蛋白質(zhì)(Berzofsky J.A.，等人，Immunological Reviews, 170 151-172(1999))或表達(dá)所需細(xì)胞因子產(chǎn)物的DNA質(zhì)粒(Toka F.N.，等人，Immunological Reviews, 199 :100_112 (2004))，它們已廣泛用于改善疫苗活性。關(guān)于這些佐劑的基因遞送 的大多數(shù)研究已集中于肌內(nèi)或皮內(nèi)施用途徑，靜脈內(nèi)遞送未得到廣泛評(píng)估(參見Toka)。 CD4細(xì)胞基于其細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄和分泌分成個(gè)2個(gè)主要類型。Thl細(xì)胞的特征在于它們 分泌IL-2和γ干擾素(IFN-γ)，而Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IL-5和IL-10。佐劑可以誘導(dǎo)向 Thl或Th2方向傾斜的T細(xì)胞應(yīng)答，這可能對(duì)疫苗的結(jié)果產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。為了改善免疫接種 且刺激有效的Thl類型應(yīng)答，表達(dá)IL-2、IL-12或IL-15的核酸例如質(zhì)粒適當(dāng)?shù)卦陉?yáng)離子脂 質(zhì)體中結(jié)合/封裝，如自始至終描述的。IL-2 大部分IL_2(15. 5_kDa糖蛋白)由CD4Thl型細(xì)胞產(chǎn)生，并且它的主要作用 是刺激輔助和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)生長(zhǎng)、自然殺傷(NK)細(xì)胞、淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞、 單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。已知IL-2在抗原特異性免疫應(yīng)答的起始和維持中起重要作用，并且 已顯示其增強(qiáng)由數(shù)種DNA疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。機(jī)制看起來是DCs中的⑶48和⑶80表達(dá) 上調(diào)以及其在⑶8+T細(xì)胞上各自的配體⑶2和⑶28的上調(diào)(參見Toka)。IL-12 人IL-12是由2個(gè)亞單位p35和p40組成的異二聚體。它是由巨噬細(xì)胞和 DCs響應(yīng)病原體感染而產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，并且誘導(dǎo)IFN- γ產(chǎn)生。這種細(xì)胞因子支持Thl 超過Th2細(xì)胞的分化，并且使先天性抗性與適應(yīng)性免疫連接。在用基于DNA的HCV疫苗免 疫接種的小鼠中，IL-12DNA的遞送改善CTL應(yīng)答和核_rVV的清除。
IL-15 :IL_15是以多效性和多功能方式起作用的14kDa糖蛋白。它由廣泛多樣的 細(xì)胞表達(dá)，包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、DCs、枯否細(xì)胞、肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。它具有與IL-2共 同的許多生物活性，因?yàn)?種細(xì)胞因子使用相同的受體組分。IL-15可以增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì) 胞裂解活性和CTL，并且誘導(dǎo)來自NK和T細(xì)胞的IFN- γ產(chǎn)生。此外，當(dāng)誘導(dǎo)抗病毒⑶8+記 憶T細(xì)胞應(yīng)答時(shí)，它誘導(dǎo)CD8+記憶和效應(yīng)T細(xì)胞的增殖，使得它成為用于包括作為佐劑的 吸引人的候選物。在示例性實(shí)施方案中，陽(yáng)離子脂質(zhì)體包括單鏈轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體，含或不含HK肽 (scL 或 scLHK)以及表達(dá) HCV 基因組的 NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B (NS3-NS5B)部分的一 種或多種質(zhì)粒(scL-HCV或scLHK-HCV)。然而，應(yīng)當(dāng)指出，如自始至終描述的，表達(dá)任何一種 或多種病毒蛋白質(zhì)的任何核酸分子都可以與本發(fā)明的脂質(zhì)體一起封裝/結(jié)合。在疫苗接種的首次用于實(shí)驗(yàn)的黑猩猩中的結(jié)果表明，全身性scL-HCV方法(包括表達(dá)作為佐劑的IL-12的質(zhì)粒DNA，且用重組腺病毒加強(qiáng))可以觸發(fā)HCV特異性免疫應(yīng)答。 HCV復(fù)制在攻擊后顯著抑制并且與HCV特異性T細(xì)胞應(yīng)答相關(guān)。在評(píng)估T細(xì)胞應(yīng)答的小 鼠細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)中，在接種后用表達(dá)HCV NS3蛋白質(zhì)的重組痘苗病毒的“攻擊”還顯示在 scL-HCV/IL組中病毒復(fù)制的抑制，這些結(jié)果支持這種方法用于預(yù)防疫苗接種以誘導(dǎo)針對(duì)病 毒抗原的免疫應(yīng)答的用途。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備配體靶向的(例如，蛋白質(zhì)/肽、抗 體或抗體片段靶向的)陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物的方法。在合適的實(shí)施方案中，此種方法包括 制備配體(例如，蛋白質(zhì)/肽、抗體或抗體片段)，并且使配體與陽(yáng)離子脂質(zhì)體混合，以形成 配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體，其中配體與陽(yáng)離子脂質(zhì)體直接結(jié)合/復(fù)合，但不化學(xué)綴合。配體 靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體隨后與編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子、和編碼一 種或多種白介素的一種或多種核酸分子混合，以形成配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物。在 另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備配體靶向的(例如，蛋白質(zhì)/肽、抗體或抗體 片段靶向的)陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物的方法。在合適的實(shí)施方案中，此種方法包括制備配體 (例如，蛋白質(zhì)/肽、抗體或抗體片段)，并且使配體與陽(yáng)離子脂質(zhì)體混合，以形成配體靶向 的陽(yáng)離子脂質(zhì)體，其中配體經(jīng)由化學(xué)綴合與陽(yáng)離子脂質(zhì)體直接復(fù)合。配體靶向的陽(yáng)離子脂 質(zhì)體隨后與編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子、和/或編碼一種或多種白 介素的一種或多種核酸分子混合，以形成配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物。如本文所描述的，通過在加工過程中使一種或多種核酸分子與脂質(zhì)體簡(jiǎn)單混合， 核酸分子適當(dāng)?shù)赜帽景l(fā)明的脂質(zhì)體復(fù)合物封裝、包含或復(fù)合/結(jié)合。核酸分子脂質(zhì)體復(fù) 合物的合適比由普通技術(shù)人員容易地確定。在示例性實(shí)施方案中，核酸以約1摩爾編碼一 種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子比約1摩爾編碼一種或多種白介素的一種或 多種核酸分子的摩爾比存在。例如，編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的核酸分子與編碼一種或 多種白介素的核酸分子以約0. 1 10至約10 0.1、適當(dāng)?shù)丶s0.5 1至約2 1、和更 適當(dāng)?shù)丶s1 1范圍中的摩爾比混合在一起，以形成核酸溶液，例如，在與脂質(zhì)體復(fù)合前，盡 管也可以使用在這些范圍外的另外的摩爾比。在其他實(shí)施方案中，核酸分子可以分開地與 脂質(zhì)體復(fù)合(即，在不同溶液中)，同時(shí)仍維持所需摩爾比。適當(dāng)?shù)?，核酸分子與脂質(zhì)體復(fù)合物的摩爾比在約0.5 1至約1 40(yg總核 酸Pg脂質(zhì)體)、適當(dāng)?shù)丶s1 5至約1 20(yg總核酸yg脂質(zhì)體)、更適當(dāng)?shù)丶s1 10(yg總核酸yg脂質(zhì)體)范圍中。如本文所使用的，核酸分子與脂質(zhì)體復(fù)合物的 摩爾比包括兩種核酸“群體”，即核酸總量包括編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核 酸分子、和編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子。如自始至終描述的，用于遞送核酸分子的所需陽(yáng)離子脂質(zhì)體的例子包括包含二油 酰基三甲基磷酸銨(DOTAP)與二油?；字Ｒ掖及?DOPE)和/或膽固醇(chol)的混合 物；和雙十八烷基二甲基溴化銨(DDAB)與DOPE和/或膽固醇的混合物的那些?？梢愿淖?脂質(zhì)的比例以對(duì)于特定靶細(xì)胞類型最佳化核酸分子的攝取效率。脂質(zhì)體可以包含一種或多 種陽(yáng)離子脂質(zhì)和一種或多種中性或輔助脂質(zhì)的混合物。一種或多種陽(yáng)離子脂質(zhì)與一種或多 種中性或輔助脂質(zhì)的所需比為約1 (0.5-3)，優(yōu)選1 (1_2)(摩爾比)。在本發(fā)明的實(shí) 踐中有用的各種脂質(zhì)的比的例子包括但不限于LipA D0TAP/D0PE1 1 摩爾比LipB DDAB/D0PE1 1 摩爾比LipC DDAB/D0PE1 2 摩爾比LipD DOTAP/Chol1 1 摩爾比LipE DDAB/Chol1 1 摩爾比LipG DOTAP/DOPE/Chol 2:1: 1 摩爾比LipH DDAB/DOPE/Chol 2:1: 1 摩爾比(D0TAP = 二油?；谆姿徜@，DDAB =雙十八烷基二甲基溴化銨；DOPE = 二油 ?；字Ｒ掖及罚籧hol =膽固醇)。如自始至終討論的，在合適的實(shí)施方案中，在本發(fā)明的組合物和方法中使用的配 體是抗體片段，例如單鏈Fv片段，例如抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈Fv(TfRscFv)。適當(dāng)?shù)?，抗體或 抗體片段與陽(yáng)離子脂質(zhì)體以在約1 1至約1 100、適當(dāng)?shù)丶s1 10至約1 50(w W)、 更適當(dāng)?shù)丶s1 30或約1 33(抗體或抗體片段脂質(zhì))范圍中的比混合，以形成靶向的 陽(yáng)離子免疫脂質(zhì)體。在另外的實(shí)施方案中，脂質(zhì)體還可以包含與脂質(zhì)體結(jié)合的內(nèi)體破裂肽， 例如由 Sigma-Genosys (The Woodlands, TX)制造的 K[K(H)KKK] 5_K(H)KKC(HoKC) (HK) (SEQ ID N0:1)肽。內(nèi)體破裂肽HoKC可以幫助試劑在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中釋放。在示例性實(shí)施方案中，陽(yáng)離子脂質(zhì)體制劑A(以1 1摩爾比的DOTAP DOPE)、 Β(以 ι IWDDAB DOPE)、G(以 ι ι ι 的dotap DOPE 膽固醇)禾口Η(以 Ι Ι Ι 的DDAB DOPE 膽固醇)或自始至終討論的任何脂質(zhì)制劑，使用如本文所描述的乙醇注 射法進(jìn)行制備。每種脂質(zhì)體制劑還適當(dāng)?shù)匕ㄒ钥傊|(zhì)的5摩爾百分比的MPB-D0PE。因 為HoKC肽(K [K (H) KKIC5-K(H) KKC)攜帶末端半胱氨酸，所以MPB-DOPE包括在所有脂質(zhì)體 組合物中，以允許肽與脂質(zhì)體綴合。Lip-HoKC脂質(zhì)體使用攜帶馬來酰亞胺基團(tuán)的陽(yáng)離子脂 質(zhì)體(Lip-MPB)和肽之間的偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行制備。將在半胱氨酸上具有游離巰基的0. Immol 肽等分試樣加入溶于IOmM HEPES, pH 7.4溶液中的2讓01 Lip-MPB，并且在室溫下旋轉(zhuǎn) (20-30r. p. m.) 2小時(shí)。所得到的Lip-HoKC具有1. 4mM的脂質(zhì)濃度。 完全復(fù)合物以與用于產(chǎn)生不含HoKC的TfRscFv Lip DNA復(fù)合物等同的方 式形成。此處，還通過輕輕倒轉(zhuǎn)以特定比使抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈抗體片段(TfRscFv)與 Lip-HoKC混合，并且在室溫下溫育10分鐘。隨后將DNA加入TfRscFv Lip-HoKC溶液中， 通過輕輕倒轉(zhuǎn)混合，并且再次在室溫下溫育15分鐘，這之后加入右旋糖或蔗糖至5-10%的終濃度，并且再次通過輕輕倒轉(zhuǎn)混合。關(guān)于TfRscFv Lip-HoKC DNA復(fù)合物的合適比是 0.3mg 7nmol Img0在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括制備配體(例如，蛋白質(zhì)/肽、抗體或抗 體片段)，并且使配體與陽(yáng)離子脂質(zhì)體的表面化學(xué)綴合，以形成陽(yáng)離子免疫脂質(zhì)體。陽(yáng)離子 脂質(zhì)體隨后與編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子、和編碼一種或多種白介 素的一種或多種核酸分子混合，以形成配體靶向的脂質(zhì)體復(fù)合物。用于使配體(例如，蛋白 質(zhì)/肽、抗體或抗體片段)與陽(yáng)離子脂質(zhì)體化學(xué)綴合的示例性方法、組合物、比和條件公開 于2001年10月1日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?9/914，046，其公開內(nèi)容通過引用整體合并入 本文。用于在本發(fā)明的實(shí)踐中使用的示例性核酸分子包括DNA和RNA，包括質(zhì)粒和載體。 編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的核酸分子可以編碼任何病毒蛋白質(zhì)。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ) “蛋白質(zhì)”、“肽”和“多肽”可互換用于意指2個(gè)或更多個(gè)氨基酸的任何一條或多條鏈，并且 不指特定長(zhǎng)度的產(chǎn)物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白質(zhì)”、“氨基酸鏈”或用于指2個(gè)或 更多個(gè)氨基酸的一條或多條鏈的任何其他術(shù)語(yǔ)，包括在術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”、“多肽”和“肽”的定 義內(nèi)。可以由使用本發(fā)明遞送的核酸編碼的病毒肽/蛋白質(zhì)的例子包括病毒病原體(例如，流感、HIV、埃博拉、痘病毒(天花)、西尼羅病毒、SARS等)等?？梢杂杀景l(fā)明中利用的 核酸編碼的病毒蛋白質(zhì)的另外例子包括但不限于，腺病毒多肽，甲病毒多肽，杯狀病毒多肽 例如杯狀病毒衣殼抗原，冠狀病毒多肽，溫?zé)岵〔《径嚯模２├《径嚯?，腸病毒多肽，黃 病毒多肽例如西尼羅病毒E糖蛋白，肝炎病毒(AE)多肽例如甲型肝炎、乙型肝炎和/或丙 型肝炎，皰疹病毒多肽例如單純皰疹病毒或水痘帶狀皰疹病毒糖蛋白，免疫缺陷病毒多肽 例如人免疫缺陷病毒包膜或蛋白酶，感染性腹膜炎病毒多肽，流感病毒多肽例如A型流感 多肽例如血凝素或胞外M2蛋白質(zhì)(M2e)、神經(jīng)氨酸酶或核蛋白，白血病病毒多肽，馬爾堡病 毒多肽，正粘病毒多肽，乳頭狀瘤病毒多肽，拉沙熱多肽，副流感病毒多肽例如血凝素/神 經(jīng)氨酸酶，副粘病毒多肽，細(xì)小病毒多肽，瘟病毒多肽，細(xì)小RNA病毒多肽例如脊髓灰質(zhì)炎 病毒衣殼多肽，痘病毒多肽例如痘苗病毒多肽(例如，天花)，狂犬病病毒多肽例如狂犬病 病毒糖蛋白G，呼腸病毒多肽，逆轉(zhuǎn)錄病毒多肽和輪狀病毒多肽。編碼此種病毒蛋白質(zhì)的核 酸分子是本領(lǐng)域可獲得的，包括包含此種核酸分子的載體和質(zhì)粒。例如，公共數(shù)據(jù)庫(kù)例如 GENBANK 包含可以在本發(fā)明的實(shí)踐中利用的核酸分子的各種例子。編碼一種或多種白介素的核酸分子也是本領(lǐng)域眾所周知的，并且可從公共數(shù)據(jù)庫(kù) 例如GENBANK 中容易獲得?？梢杂杀景l(fā)明實(shí)踐中有用的核酸分子編碼的示例性白介素 包括但不限于，IL-l、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、 IL-15、IL-17、IL-18和IL-23。在合適的實(shí)施方案中，核酸編碼IL_2、IL-12或IL-15。本發(fā)明還提供了根據(jù)自始至終描述的方法制備的陽(yáng)離子免疫脂質(zhì)體復(fù)合物。例 如，本發(fā)明提供了配體靶向的(例如，蛋白質(zhì)/肽、抗體或抗體片段靶向的)陽(yáng)離子脂質(zhì)體 復(fù)合物，其包含陽(yáng)離子脂質(zhì)體、配體(例如，蛋白質(zhì)/肽、抗體或抗體片段)、編碼一種或多種 病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子、和編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子，其 中配體與陽(yáng)離子脂質(zhì)體直接復(fù)合/結(jié)合，但不化學(xué)綴合。配體(例如，蛋白質(zhì)/肽、抗體或 抗體片段)經(jīng)由在配體和脂質(zhì)體之間的相互作用(例如，靜電、范德華或其他非化學(xué)綴合的相互作用)與脂質(zhì)體適當(dāng)?shù)亟Y(jié)合。一般而言，當(dāng)非化學(xué)綴合時(shí)，接頭或間隔分子(例如，聚 合物或其他分子)不用于使配體和脂質(zhì)體附著。如本文所描述的，在另外的實(shí)施方案中，配體(例如，蛋白質(zhì)/肽、抗體或抗體片 段)與陽(yáng)離子脂質(zhì)體化學(xué)綴合，例如經(jīng)由在包含馬來酰亞胺基團(tuán)或其他巰基反應(yīng)基團(tuán)的陽(yáng) 離子脂質(zhì)體和配體(例如，蛋白質(zhì)/肽、抗體或抗體片段)上的硫原子之間的化學(xué)相互作 用。隨后將核酸加入脂質(zhì)體中，以形成脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物，或可以首先加入核酸，并且隨后 與配體復(fù)合。此種方法公開于2001年10月1日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?9/914，046中，其 公開內(nèi)容通過引用整體合并入本文。包含核酸的轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)綴合的脂質(zhì)體(Tf-Lip-DNA)根據(jù)先前描述的配制方法(Xu,等人，“Transferrin-Iiposome-mediatedsystemic p53 gene therapy in combination with radiation resultsin regression of human head and neck cancer xenografts, “ HumGene Ther. 10(18) :2941_2952· (1999)，其公開內(nèi)容通過引用整體合并 入本文)進(jìn)行制備。與輻射組合的轉(zhuǎn)鐵蛋白-脂質(zhì)體介導(dǎo)的全身性Ρ53基因療法導(dǎo)致人頭 與頸癌異種移植物的消退。簡(jiǎn)言之，對(duì)于合適的制備，使25ml Tf(5mg/ml，鐵飽和的全-轉(zhuǎn) 鐵蛋白；Sigma, St. Louis, MO)和50ml Lip (2mM總脂質(zhì))加上75ml水在聚丙烯管中混合， 并且在室溫下溫育5-15分鐘，伴隨頻繁搖動(dòng)。將在120ml 20mM HEPES緩沖液，pH 7. 4中的 10微克質(zhì)粒DNA加入管中，立即且充分混合，并且在室溫下溫育20分鐘，伴隨頻繁搖動(dòng)。隨 后將30微升50%右旋糖溶液加入管中。最終DNA 脂質(zhì)Tf比為約1 10 12.5(mg/ nmol/mg)。在另外的實(shí)施方案中，HEPES緩沖液可以由水替換。核酸分子可以封裝在陽(yáng)離子脂質(zhì)體內(nèi)，包含在陽(yáng)離子脂質(zhì)體的烴鏈區(qū)域內(nèi)，與陽(yáng) 離子脂質(zhì)體的內(nèi)部或外部單層(例如，首基區(qū)域)結(jié)合，或其任何組合。適當(dāng)?shù)?，本發(fā)明的 陽(yáng)離子免疫脂質(zhì)體是單層脂質(zhì)體(即，單個(gè)雙層)，盡管也可以使用包含數(shù)個(gè)同心雙層的多 層脂質(zhì)體。本發(fā)明的單個(gè)雙層陽(yáng)離子脂質(zhì)體包含其中可以封裝核酸分子的內(nèi)部水容積。它 們還包含具有烴鏈區(qū)域(即，脂質(zhì)的脂質(zhì)鏈區(qū)域)的單個(gè)雙層，其中可以包含已是中性或大 部分不帶電的核酸分子。此外，核酸分子可以與脂質(zhì)體膜的任一或兩個(gè)，內(nèi)部單層和/或外 部單層(即，脂質(zhì)的首基區(qū)域)復(fù)合或結(jié)合，例如經(jīng)由帶負(fù)電核酸分子和帶正電陽(yáng)離子脂質(zhì) 體之間的電荷-電荷相互作用。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，核酸分子可以在本發(fā)明的陽(yáng)離子 脂質(zhì)體復(fù)合物的任何或所有這些區(qū)域中封裝/結(jié)合/復(fù)合。如自始至終討論的，適當(dāng)?shù)睾怂岱肿右约s0. 1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的 一種或多種核酸分子比約10摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子；至10摩 爾編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子比約0.1摩爾編碼一種或多種白介 素的一種或多種核酸分子的摩爾比存在；特別地，約1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的 一種或多種核酸分子比約1摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子可以在脂 質(zhì)體復(fù)合物中使用。自始至終還描述了脂質(zhì)、靶向性配體和核酸分子的合適量/比。在示例 性實(shí)施方案中，編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子、編碼一種或多種白介 素的一種或多種核酸分子、和脂質(zhì)體，以約0.5 1至約1 40(yg總核酸yg脂質(zhì))、適 當(dāng)?shù)丶s1 5至約1 20(yg總核酸“8脂質(zhì))，例如約1 10(yg總核酸yg脂質(zhì)) 的重量比存在。本發(fā)明的示例性脂質(zhì)體組合物包括以約1 10 0.33(yg總核酸yg 脂質(zhì)μ g單鏈抗體)重量比的總核酸、脂質(zhì)和配體，例如單鏈抗體(例如，TfRscFv)。
可以由在本發(fā)明的陽(yáng)離子脂質(zhì)體中利用的核酸分子編碼的示例性病毒蛋白質(zhì)包括自始至終討論的那些，例如，HIV病毒蛋白質(zhì)，流感病毒蛋白質(zhì)，SARS病毒蛋白質(zhì)，甲型、 乙型和/或丙型肝炎病毒蛋白質(zhì)，禽流感病毒蛋白質(zhì)和天花病毒蛋白質(zhì)，以及其他?？梢杂?在本發(fā)明的陽(yáng)離子脂質(zhì)體中利用的核酸分子編碼的示例性白介素包括自始至終描述的那 些，包括 IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、 IL-17、IL-18 和 IL-23,并且適當(dāng)?shù)?，IL-2、IL-12 和 IL-15。在示例性實(shí)施方案中，將用于在本發(fā)明的實(shí)踐中使用的編碼病毒蛋白質(zhì)和/或白 介素的核酸置于核酸啟動(dòng)子，例如，如美國(guó)公開專利申請(qǐng)?zhí)?007/0065432中描述的啟動(dòng)子 下游。本發(fā)明還提供了包含自始至終描述的配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物的藥物組 合物。在合適的實(shí)施方案中，藥物組合物進(jìn)一步包括選自下述的一種或多種賦形劑一種或 多種抗菌劑(例如，兩性霉素B、金霉素、慶大霉素、新霉素)、一種或多種防腐劑(例如，芐 索氯銨、EDTA、甲醛、2-苯氧乙醇)、一種或多種緩沖劑(例如，磷酸鹽緩沖劑、硼酸鈉、氯化 鈉)、一種或多種表面活性劑(聚山梨醇酯20、80)、一種或多種蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑(例如，白蛋 白、乳糖、谷氨酸鉀)、糖例如蔗糖或右旋糖、和佐劑(例如，氫氧化鋁、磷酸鋁)。另外的賦 形劑是本領(lǐng)域眾所周知的，并且可以容易地在本發(fā)明的實(shí)踐中使用。本發(fā)明還提供了包括第一配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物的藥物組合物，所述復(fù) 合物包括陽(yáng)離子脂質(zhì)體、配體(例如，蛋白質(zhì)/肽、抗體或抗體片段)、和編碼一種或多種病 毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子，其中配體與陽(yáng)離子脂質(zhì)體直接復(fù)合/結(jié)合，但不化學(xué)綴 合。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，配體可以與陽(yáng)離子脂質(zhì)體化學(xué)綴合。藥物組合物還適當(dāng)?shù)匕?括第二配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，所述復(fù)合物包括陽(yáng)離子脂質(zhì)體、配體(例如，蛋白 質(zhì)/肽、抗體或抗體片段)、和編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子，其中配體與 陽(yáng)離子脂質(zhì)體直接復(fù)合/結(jié)合，但不化學(xué)綴合。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，配體可以與陽(yáng)離子 脂質(zhì)體化學(xué)綴合。在特定的此種實(shí)施方案中，編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的核酸分子在與編碼一種 或多種白介素的核酸相同的組合物中遞送，而不是與相同陽(yáng)離子脂質(zhì)體封裝/結(jié)合，它們 與2種(或更多種)不同陽(yáng)離子脂質(zhì)體結(jié)合，并且隨后在相同組合物(即，2種不同脂質(zhì)體 群體混合在一起)中遞送。在其他實(shí)施方案中，編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)和編碼一種或 多種白介素的核酸分子可以一起包含在相同質(zhì)粒載體內(nèi)。本發(fā)明還包含給哺乳動(dòng)物施用2 種分開的免疫脂質(zhì)體組合物，一種包含編碼病毒蛋白質(zhì)的核酸，并且一種包含編碼白介素 的核酸。自始至終描述了本發(fā)明的藥物組合物使用的合適脂質(zhì)、靶向性分子和核酸分子的 例子、以及此種組分的比。本發(fā)明還提供了將一種或多種活性劑遞送給哺乳動(dòng)物的抗原呈遞細(xì)胞(APCs) 的方法。在合適的實(shí)施方案中，此種方法包括給哺乳動(dòng)物施用抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈 Fv(TfRscFv)靶向的陽(yáng)離子免疫脂質(zhì)體復(fù)合物，其包括陽(yáng)離子脂質(zhì)體、TfRscFv和一種或多 種活性劑，其中TfRscFv與陽(yáng)離子脂質(zhì)體直接復(fù)合/結(jié)合，但不化學(xué)綴合。在進(jìn)一步的實(shí)施 方案中，TfRscFv與陽(yáng)離子脂質(zhì)體化學(xué)綴合。本發(fā)明的此種方法可以用于將試劑遞送給在機(jī) 體的任何器官或組織中的APCs，例如肝、淋巴結(jié)、腸和/或呼吸道中的APCs。適當(dāng)?shù)兀珹PCs 可以是例如專業(yè)或非專業(yè)APCs?！皩I(yè)APCs”指在其表面上表達(dá)MHCII類分子的那些。
在合適的實(shí)施方案中，遞送的試劑是核酸分子，盡管也可以遞送其他試劑，例如化學(xué)試劑，包括小分子，以及肽和蛋白質(zhì)。試劑可以遞送給專業(yè)以及非專業(yè)APCs，包括位于肝、 脾、淋巴結(jié)、腸和/或呼吸道中的APCs。在示例性實(shí)施方案中，遞送的試劑編碼一種或多種 病毒蛋白質(zhì)(例如，HIV病毒蛋白質(zhì)、埃博拉病毒蛋白質(zhì)、流感病毒蛋白質(zhì)、SARS病毒蛋白 質(zhì)、禽流感病毒蛋白質(zhì)或天花病毒蛋白質(zhì))和/或一種或多種白介素(例如，IL-1、IL-2、 IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18 或 IL-23)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)針對(duì)病毒抗原的免疫應(yīng)答的方法，其包括給哺乳動(dòng)物施用配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物。在合適的實(shí)施方案中， 陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物包括陽(yáng)離子脂質(zhì)體；與陽(yáng)離子脂質(zhì)體直接復(fù)合/結(jié)合但不化學(xué)綴合的 配體；與陽(yáng)離子脂質(zhì)體結(jié)合的編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子；和與陽(yáng) 離子脂質(zhì)體結(jié)合的編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案 中，配體與陽(yáng)離子脂質(zhì)體化學(xué)綴合，例如，通過配體上(例如，在抗體或抗體片段上)的硫基 團(tuán)和脂質(zhì)體上的基團(tuán)例如馬來酰亞胺基團(tuán)之間的化學(xué)綴合。自始至終描述了示例性配體， 并且包括但不限于半乳糖、L-37pA、抗體和抗體片段(例如，scFv抗體片段例如抗轉(zhuǎn)鐵蛋白 受體單鏈 Fv (TfRscFv))。如本文所使用的，“誘導(dǎo)針對(duì)病毒抗原的免疫應(yīng)答”指通過其觸發(fā)哺乳動(dòng)物(例如 任何哺乳動(dòng)物，例如人)的免疫系統(tǒng)，以鑒定且去除或以其他方式響應(yīng)病毒抗原的存在的 過程。抗原包括引起針對(duì)其的抗體產(chǎn)生的任何病毒物質(zhì)。通過誘導(dǎo)針對(duì)一種或多種特定病 毒抗原的免疫應(yīng)答，哺乳動(dòng)物從而接種疫苗，并且通過抗原的任何進(jìn)一步妥協(xié)將導(dǎo)致抗原 的應(yīng)答/清除?？梢援a(chǎn)生針對(duì)其的免疫應(yīng)答的病毒抗原例子包括本領(lǐng)域已知的任何病毒抗原，包括自始至終描述的那些，例如與肝炎(甲型、乙型或丙型)病毒、流感病毒、HIV病毒、埃博 拉病毒、SARS病毒、禽流感病毒、天花病毒等相關(guān)的抗原。陽(yáng)離子脂質(zhì)體靶向APCs的能力 使得核酸分子能夠直接且有效地遞送給參與引發(fā)免疫應(yīng)答的細(xì)胞，從而提供在哺乳動(dòng)物中 誘導(dǎo)針對(duì)病毒抗原的免疫應(yīng)答的非常有效和有力的方法。自始至終描述了可以由在本發(fā)明的治療方法中利用的核酸分子表達(dá)的合適病毒蛋白質(zhì)，并且包括但不限于HIV病毒蛋白質(zhì)、埃博拉病毒蛋白質(zhì)、流感病毒蛋白質(zhì)、SARS病 毒蛋白質(zhì)、禽流感病毒蛋白質(zhì)和天花病毒蛋白質(zhì)?？梢杂珊怂岱肿泳幋a的示例性白介素包 括自始至終描述的那些，例如 IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、 IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18和IL-23。在示例性實(shí)施方案中，在本發(fā)明的各種方法 中遞送的配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體進(jìn)一步包括這樣的肽，所述肽包括與陽(yáng)離子脂質(zhì)體結(jié)合 的 K [K (H) KKK] 5-K (H) KKC (HoKC) (SEQ ID NO 1)肽。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中的病毒疾病的方法。 適當(dāng)?shù)?，該方法包括給哺乳動(dòng)物施用陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，其中陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物包括 陽(yáng)離子脂質(zhì)體；與陽(yáng)離子脂質(zhì)體直接復(fù)合但不化學(xué)綴合的配體；與陽(yáng)離子脂質(zhì)體結(jié)合的編 碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子；和與陽(yáng)離子脂質(zhì)體結(jié)合的編碼一種或多 種白介素的一種或多種核酸分子。施用方法包括但不限于，靜脈內(nèi)(IV)、瘤內(nèi)(IT)、損傷內(nèi) (IL)、氣溶膠、透皮、經(jīng)口、內(nèi)窺鏡、局部、肌內(nèi)(IM)、皮內(nèi)(ID)、眼內(nèi)(10)、腹膜內(nèi)(IP)、經(jīng)皮(TD)、鼻內(nèi)(IN)、大腦內(nèi)(IC)、器官內(nèi)(例如，肝內(nèi))、緩慢釋放埋植劑或皮下施用，或經(jīng)由使 用滲透或機(jī)械泵的施用。它們可以作為推注或作為輸注進(jìn)行施用。在另外的實(shí)施方案中， 配體可以使用本文描述的各種方法或本領(lǐng)域已知的其他方法與陽(yáng)離子脂質(zhì)體化學(xué)綴合?？梢允褂帽景l(fā)明的方法治療或預(yù)防的病毒疾病例子包括本領(lǐng)域已知的任何病毒疾病，包括但不限于，自始至終描述的那些，例如肝炎(甲型、乙型或丙型)、流感、HIV、埃博 拉、SARS、禽流感、天花等。因此，除在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)針對(duì)病毒抗原的免疫應(yīng)答外，本發(fā)明 還提供了治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中的病毒疾病的方法。這包括已在近期時(shí)間段(例如，小于 約1年、適當(dāng)?shù)匦∮诩s6個(gè)月或小于約1個(gè)月)內(nèi)感染的哺乳動(dòng)物，以及具有慢性感染的哺 乳動(dòng)物(例如，已感染例如1年或更久的哺乳動(dòng)物)。自始至終描述了用于在本發(fā)明的治療或預(yù)防方法中使用的示例性配體，并且包 括，各種肽和蛋白質(zhì)，例如轉(zhuǎn)鐵蛋白、半乳糖、L-37PA、抗體和抗體片段(例如單鏈Fv抗體片 段，例如抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈Fv(TfRscFv))。自始至終描述了可以由核酸分子編碼的示例 性病毒蛋白質(zhì)和白介素，所述核酸分子使用本發(fā)明的各種治療和預(yù)防方法遞送。在示例性 實(shí)施方案中，在本發(fā)明的各種治療和預(yù)防方法中遞送的配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體進(jìn)一步包 括這樣的肽，所述肽包括與陽(yáng)離子脂質(zhì)體結(jié)合的K[K (H) KKIC5-K(H) KKC(HoKC) (SEQ ID NO 1)肽。本發(fā)明還提供了在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)針對(duì)病毒抗原的免疫應(yīng)答的方法，其包括給哺 乳動(dòng)物施用通過自始至終描述的各種方法制備的配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物。此外， 治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中的病毒疾病的方法包括給哺乳動(dòng)物施用通過本發(fā)明的各種方法/ 過程制備的配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物。自始至終描述了用于在這些方法中使用的合 適配體、脂質(zhì)體和核酸。在本發(fā)明的各種治療/預(yù)防方法中(包括誘導(dǎo)免疫應(yīng)答和治療或預(yù)防病毒疾病， 以及遞送給APCs)，本發(fā)明的各種脂質(zhì)體復(fù)合物可以經(jīng)由任何所需途徑施用。示例性遞送途 徑包括但不限于，靜脈內(nèi)、經(jīng)口、局部、經(jīng)由吸入、肌內(nèi)注射、瘤內(nèi)注射、皮內(nèi)注射、經(jīng)皮注射、 皮下注射、腹膜內(nèi)注射、鼻內(nèi)注射、眼內(nèi)注射或滴劑、顱內(nèi)注射、器官內(nèi)施用(例如肝內(nèi))或 其他途徑，例如緩慢釋放埋植劑或經(jīng)由滲透或機(jī)械泵。它們可以作為推注或作為輸注進(jìn)行 施用。本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明的各種配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物的藥物組合 物。本發(fā)明的藥物組合物還可以進(jìn)一步包括一種或多種賦形劑，例如一種或多種抗菌劑、一 種或多種防腐劑、一種或多種緩沖劑和/或一種或多種表面活性劑。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了包含2種或更多種配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì) 體復(fù)合物的藥物組合物。例如，組合物可以包括第一配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，其包 括陽(yáng)離子脂質(zhì)體、配體和編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子。在合適的實(shí) 施方案中，配體與陽(yáng)離子脂質(zhì)體直接復(fù)合，但不化學(xué)綴合。在其他實(shí)施方案中，配體與陽(yáng)離 子脂質(zhì)體化學(xué)綴合。組合物可以進(jìn)一步包括第二配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，其包括陽(yáng)離子脂質(zhì) 體、配體和編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子。適當(dāng)?shù)?，配體與所述陽(yáng)離子脂質(zhì) 體直接復(fù)合，但不化學(xué)綴合，而在其他實(shí)施方案中，配體與陽(yáng)離子脂質(zhì)體化學(xué)綴合。雖然下文闡述的實(shí)施例描述了用于遞送丙型肝炎病毒(HCV)蛋白質(zhì)的免疫脂質(zhì)體復(fù)合物的產(chǎn)生，以及HCV感染的哺乳動(dòng)物的預(yù)防性疫苗接種/治療，但應(yīng)當(dāng)理解編碼任何病毒蛋白質(zhì)的核酸分子都可以在本發(fā)明的各種方法中利用，并且在自始至終描述的免疫脂 質(zhì)體復(fù)合物中結(jié)合/封裝。由核酸分子編碼的最終病毒蛋白質(zhì)對(duì)形成本發(fā)明的免疫脂質(zhì)體 復(fù)合物的能力沒有影響。簡(jiǎn)單地，核酸分子的負(fù)電荷看起來允許核酸分子在陽(yáng)離子免疫脂 質(zhì)體中結(jié)合/封裝。因此，本發(fā)明并不限于HCV蛋白質(zhì)的遞送，并且相反，包括編碼任何病 毒蛋白質(zhì)和/或任何一種或多種白介素的任何核酸(例如，質(zhì)粒、載體)的遞送。此外，編碼不同病毒蛋白質(zhì)的數(shù)種不同核酸可以與免疫脂質(zhì)體復(fù)合物一起封裝/ 結(jié)合，并且，本發(fā)明因此提供了用于疫苗接種/治療廣泛多樣的病毒感染的復(fù)合物和方法， 所述復(fù)合物和方法使用單個(gè)脂質(zhì)體系統(tǒng)，或使用多個(gè)不同的脂質(zhì)體復(fù)合物。對(duì)于相關(guān)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員顯而易見的是，無需背離本發(fā)明的范圍或其任何 實(shí)施方案，即可對(duì)本文描述的方法和應(yīng)用進(jìn)行其他合適的修飾和改變。目前已詳細(xì)描述了 本發(fā)明，這通過參考下述實(shí)施例將更容易理解，所述實(shí)施例僅用于舉例說明的目的并且不 希望是本發(fā)明的限制。實(shí)施例1基于陽(yáng)離子脂質(zhì)體的丙型肝炎病毒(HCV)疫苗接種和治療系統(tǒng)的制備和使用與在黑猩猩中天然感染不誘導(dǎo)不受HCV再感染的保護(hù)(Farci P.，等人，Science 258 140 (1992) ；Prince A.M.，等人，J. Infect. Dis.，165 :438_443 (1992))的先前想法形 成對(duì)比，目前顯而易見的是盡管再感染的確發(fā)生，但在恢復(fù)的人和黑猩猩中存在導(dǎo)致再感 染后病毒復(fù)制的立即控制和快速清除的記憶免疫應(yīng)答。從HCV自發(fā)恢復(fù)后，靜止HCV特 異性記憶T細(xì)胞可以數(shù)十年地在外周血中檢測(cè)出，在許多情況下不存在可檢測(cè)的HCV抗 體(Takaki A.，等人，Nat. Med.，6 :578_582 (2000))。HCV特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答也在肝中 持續(xù)，如在恢復(fù)的黑猩猩中證實(shí)的，并且介導(dǎo)對(duì)再感染的保護(hù)性免疫(參見例如，Bassett S.E.，等人，Hepatology, 33 :479_1487 (2001))。與初次感染比較，二次感染具有短持續(xù) 時(shí)間且在血液和肝中具有減少的病毒滴度，并且減少肝炎癥，如通過丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 水平(ALT)指示的(Bassset等人)?；颊哐芯勘砻?，類似的記憶應(yīng)答也在先前暴露后的 人中存在，所述記憶應(yīng)答可以快速控制且清除HCV感染(MehtaS.H.，等人，Lancet, 359 1478-1483(2002))。如自始至終描述的，本發(fā)明提供了基于T細(xì)胞的疫苗，其集中于HCV的 非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，且有效遞送給APCs (包括但不限于在肝中的那些)用于預(yù)防和治療。肝是 HCV復(fù)制的主要位點(diǎn)，并且因此在肝中免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)模擬在天然感染過程中誘導(dǎo)的免疫 應(yīng)答，并且在攻擊后導(dǎo)致保護(hù)或病毒的快速清除。丙型肝炎病毒(HCV)是具有單鏈、正義RNA基因組的包膜病毒。RNA長(zhǎng)度是 9. 6kb，并且由 341個(gè)堿基的5'非翻譯區(qū)(NTR)、編碼所有病毒特異性蛋白質(zhì)的長(zhǎng)開放讀 碼框( 3011個(gè)氨基酸)和3' NTR組成?；蚪MRNA的翻譯不依賴于帽，并且由充當(dāng)內(nèi) 部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的5' NTR介導(dǎo)。所得到的多聚蛋白通過2種宿主和2種病毒蛋白酶進(jìn) 行共翻譯和翻譯后切割，以產(chǎn)生下述產(chǎn)物NH2-C-El-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5 B-C00H。結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(C、E1和E2)位于N末端；非結(jié)構(gòu)(NS)組分在其余部分中編碼(關(guān)于 綜述參見(Major Μ. Ε.，等人，Hepatitis C Viruses. In =FieldsVirology, Knipe D. Μ.和 Howley P.M.(編輯)，Lippincott, ffilliams& Wilkins，第 1127-1161 頁(yè)(2001)，其公開 內(nèi)容通過引用整體合并入本文)。與所有RNA病毒一樣，HCV RNA復(fù)制是易錯(cuò)的，導(dǎo)致變體的連續(xù)產(chǎn)生。此種變體提供可以快速適應(yīng)選擇壓力例如由免疫應(yīng)答施加的壓力的庫(kù)或“準(zhǔn) 種”。這種變異性可能對(duì)于HCV存活和進(jìn)化是重要的，但它也使得關(guān)于HCV分子生物學(xué)、發(fā) 病機(jī)理、免疫應(yīng)答和最終疫苗開發(fā)的精確研究變得困難。HCV的傳播一般通過腸胃外途徑，但也的確發(fā)生粘膜傳播，例如性和母嬰傳播。在 慢性丙型肝炎的治療中已取得顯著進(jìn)展。用聚乙二醇化IFN-α和利巴韋林的目前療法在 約50%病例中清除HCV感染，但治療仍是非常昂貴的，需要6-12個(gè)月的治療，并且攜帶嚴(yán)重 副作用的顯著危險(xiǎn)。預(yù)防疫苗在美國(guó)和全世界對(duì)于HCV相關(guān)疾病的最后控制是重要的。還 需要免疫方法以進(jìn)行治療。盡管具有嵌合人肝的SCID小鼠模型的開發(fā)，但黑猩猩仍是唯一建立的關(guān)于HCV感 染的動(dòng)物模型(在Grakoui A.，等人，H印atoiogy，33 :489_495 (2001)中綜述)。因此，它 是其中可以施用實(shí)驗(yàn)疫苗并且評(píng)估其有效性的唯一模型。參與黑猩猩免疫系統(tǒng)的許多蛋 白質(zhì)與人直向同源物等同或非常緊密相關(guān)，從而使得檢測(cè)所需的試劑是可互換的。由于極 端的成本，不可能在黑猩猩中測(cè)試所有有希望的HCV疫苗方法。迄今為止的疫苗研究已使 用正常免疫能力小鼠以測(cè)試許多免疫接種策略(參見例如，F(xiàn)orns X.，等人，Vaccine, 17 1992-2002(1999))。表達(dá)人I類MHC分子的轉(zhuǎn)基因小鼠已用于特異性HCV表位分析和替代 保護(hù)系統(tǒng)(Qiao Μ.，等人，Hepatology, 37 :52_59 (2003))。迄今的疫苗策略已基于重組蛋 白質(zhì)、病毒載體、病毒樣顆粒和基于DNA的免疫接種。存在急性感染的清除中涉及針對(duì)HCV NS3的免疫應(yīng)答的強(qiáng)烈支持(Di印older H. Μ.，等人，J. Virol，71 :6011-6019 (1997))。這種 抗原目前視為任何HCV T細(xì)胞疫苗的重要組分。報(bào)告已指出在表達(dá)NS3蛋白質(zhì)的構(gòu)建體中 包括NS4A在小鼠中導(dǎo)致更佳的表達(dá)和改善的免疫應(yīng)答(Frelin L.，等人，Gene Ther. , 10 686-699 (2003))。也已鑒定廣泛的多特異性T細(xì)胞應(yīng)答在HCV感染的清除中是重要的，因 此NS5A和NS5B蛋白質(zhì)將是重要的T細(xì)胞疫苗組分。HCV與美國(guó)40-60%的慢性肝病相關(guān)。在這些患者中，三分之一繼續(xù)發(fā)展進(jìn)行性 纖維化和肝硬化(Liang Τ. J.，等人，· Ann. Intern. Med.，132 :296_305 (2000))。丙型肝炎 目前已取代乙型肝炎成為日本的肝細(xì)胞癌(HCC)主因，并且根據(jù)⑶C，每年僅在美國(guó)就存在 8，000-10，000例由于HCV相關(guān)肝硬化和癌癥的死亡。HCV相關(guān)HCC的機(jī)制未知。主要假定 它由經(jīng)過多年感染的慢性免疫介導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷和再生誘導(dǎo)。HCV核心基因產(chǎn)物已顯示與 許多細(xì)胞蛋白質(zhì)相互作用。它包含核定位信號(hào)，具有RNA結(jié)合活性，并且已顯示在細(xì)胞中執(zhí) 行多種功能，例如反式激活和阻遏(Matsumoto M.，等人，J.Virol, 71 1301-1309 (1997))。 鑒定HCV核心的反式激活子或阻遏子功能的這些研究已使用比生物水平高數(shù)個(gè)數(shù)量級(jí)的 體外表達(dá)水平。然而，此種蛋白質(zhì)以低水平表達(dá)數(shù)十年可能在受感染細(xì)胞中導(dǎo)致不利事件， 這可能對(duì)HCC進(jìn)展起作用。對(duì)抗HCC的最佳方法是通過預(yù)防、早期檢測(cè)和更佳治療。因此， 通過預(yù)防丙型肝炎病毒感染，還可以預(yù)防HCC。關(guān)于HCV復(fù)制的主要儲(chǔ)庫(kù)被認(rèn)為是肝，與受感染個(gè)體中的肝病理學(xué)一致，盡管仍未鑒定支持HCV復(fù)制的特定細(xì)胞類型。正常肝在介導(dǎo)免疫應(yīng)答中起重要作用。與大多數(shù)器 官不同，存在抗原在肝中的呈遞可以導(dǎo)致幼稚T細(xì)胞激活的證據(jù)(Bertolino P.，等人，Cell Biol,80 :84-92(2002))。在進(jìn)入肝后，血液中的抗原首先與竇狀細(xì)胞群體——肝竇狀上皮 細(xì)胞(LSEC)和枯否細(xì)胞接觸?？乖f送給肝導(dǎo)致T細(xì)胞的局部激活(可能通過上述2種 細(xì)胞，這兩者已顯示充當(dāng)抗原呈遞細(xì)胞)?？乖诟沃械某蔬f可以導(dǎo)致T細(xì)胞初敏或T細(xì)胞耐受。與陽(yáng)離子免疫脂質(zhì)體用于癌癥治療和腫瘤靶向的用途(如在美國(guó)公開專利申請(qǐng) 號(hào)2003/0044407和美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/520，796中)相反，呈現(xiàn)的實(shí)施例利用TfRscFv-脂 質(zhì)體(包括或不包括HK肽)復(fù)合物，以將待有效攝取的表達(dá)HCV蛋白質(zhì)的DNA(受體介導(dǎo) 的內(nèi)吞作用和增強(qiáng)的內(nèi)體釋放)和呈遞的抗原遞送給T細(xì)胞，無論它們存在于機(jī)體內(nèi)何處 (包括在肝中)。TfRscFv的存在提供了受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，以使陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物有效移動(dòng) 到細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)HK肽增強(qiáng)(盡管不是必需的)DNA內(nèi)體釋放到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。已執(zhí)行在體外使用數(shù)種脂質(zhì)體復(fù)合物以測(cè)定在體內(nèi)用于肝細(xì)胞的最合適制劑的 比較研究。測(cè)試了 2種肝細(xì)胞特異性配體——半乳糖(GAL)(與去唾液酸糖蛋白受體結(jié)合) 和L-37pA (與清道夫受體SR-Bl——關(guān)于HCV的假定受體結(jié)合)。這些與未修飾的脂質(zhì)體制 劑和用轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)受體的單鏈Fv片段(TfRscFv)修飾的復(fù)合物進(jìn)行比較。在這些分析 中使用3種脂質(zhì)類型脂質(zhì)ΑΦ0ΤΑΡ DOPE, 1 1摩爾比)；脂質(zhì)D(D0TAP Choi, 1 1 摩爾比)；和脂質(zhì)G(D0TAP DOPE Choi, 1 1 1摩爾比)。比較了 3種樣品制備方 法。方法A 其中使DNA與配體修飾的脂質(zhì)體直接混合的預(yù)包被法。方法B:其中在配體與 脂復(fù)合物的表面綴合前，使DNA與脂質(zhì)體混合以形成陽(yáng)離子脂質(zhì)/DNA核心(脂復(fù)合物)的 后包被法。方法C:其中使DNA與脂質(zhì)體或具有組氨?；丫圪嚢彼?HoKC)肽修飾的脂質(zhì) 體混合以形成脂復(fù)合物，這之后加入攜帶特定配體的陰離子(PSchol)或中性(PCchol)脂 質(zhì)體以封裝脂復(fù)合物。A.方法1.復(fù)合物形成通過化學(xué)綴合的復(fù)合物形成用于制備包含抗體或抗體片段的陽(yáng)離子免疫脂質(zhì)體的示例性方法公開于2001年 10月1日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?9/914，046中，所述抗體或抗體片段與脂質(zhì)體的表面直 接化學(xué)綴合，所述美國(guó)專利申請(qǐng)的公開內(nèi)容通過引用整體合并入本文。例如，4-(對(duì)馬來酰 亞胺基苯基)丁酸鹽-DOPE (MPB-DOPE) (Avanti Polar Lipids)包括在上文描述的7種脂 質(zhì)體制劑中，至5-8%摩爾的總脂質(zhì)。MPB-脂質(zhì)體通過本領(lǐng)域眾所周知的方法進(jìn)行制備。 例如，從 Campbell MJ (Biotechniquesl995 Jun ； 18 (6) 1027-32)描述的那種改良的乙醇 注射法可以在本發(fā)明中使用。簡(jiǎn)言之，使所有脂質(zhì)溶解于乙醇中且混合，用Hamilton注射 器注入50-60°C的渦旋純水內(nèi)。使溶液渦旋另外10-15分鐘。終濃度是l_2mM總脂質(zhì)。加 入IM HEPES，pH 7. 5 (pH7. 0-8. 0)至10_20mM的終濃度。因?yàn)轳R來酰亞胺基團(tuán)在pH > 7的 水溶液中不穩(wěn)定，所以脂質(zhì)體應(yīng)在水(PH 5-6.5)中制備。在與scFv-SH連接前，pH可以用 1MHEPES緩沖液，pH7. 0-8. 0調(diào)整至7. 0-8. 0,以促進(jìn)后包被反應(yīng)。 以約1 1至約1 100、適當(dāng)?shù)丶s1 10至約1 50 (w W)、更適當(dāng)?shù)丶s1 20 至約1 40的蛋白質(zhì)/脂質(zhì)比，將SCFv-SH加入MPB-脂質(zhì)體中。溶液通過輕輕旋轉(zhuǎn)( 20-30RPM)在室溫下混合30分鐘，以產(chǎn)生scFv-Lip。scFv-Lip無需純化而使用，盡管它也可 以通過S印har0SeCL-4B柱層析進(jìn)行純化。將質(zhì)粒DNA稀釋于水中，并且以約0. 5 1至約 1 40(yg總核酸“8脂質(zhì))、適當(dāng)?shù)丶s1 5至約1 20&8總核酸“8脂質(zhì))，例如 約1 10 ( μ g總核酸μ g脂質(zhì))的DNA/脂質(zhì)比加入scFv-Lip中，以產(chǎn)生scFv-Lip-DNA復(fù)合物。scFv-Lip-DNA無需純化而使用，盡管它也可以通過S印haroseCL-4B柱層析進(jìn)行 純化?？梢灶A(yù)期80-100% scFv與脂質(zhì)體綴合。通過簡(jiǎn)單混合的復(fù)合物形成綴合的TfRscFv-免疫脂質(zhì)體保留其免疫活性。也已確定cys-TfRscFv可以與脂 復(fù)合物化學(xué)綴合(參見2001年10月1日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?9/914，046)，并且可以在 體外和體內(nèi)有效轉(zhuǎn)染人前列腺腫瘤細(xì)胞。使用各種化學(xué)綴合方法使單鏈抗體片段與脂質(zhì)體 附著是通常的實(shí)踐。也已確定cys-TfRscFv和陽(yáng)離子脂質(zhì)體(其不包含任何具有可還原基 團(tuán)的脂質(zhì)例如馬來酰亞胺DOPE或任何可還原基團(tuán))的簡(jiǎn)單混合，而非化學(xué)綴合，導(dǎo)致免疫 活性復(fù)合物形成，其中配體與脂質(zhì)體直接結(jié)合，無需使用接頭或化學(xué)綴合分子，所述復(fù)合物 仍與腫瘤細(xì)胞有效結(jié)合且轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞(參見例如美國(guó)公開專利申請(qǐng)?zhí)?003/0044407，其 公開內(nèi)容包括其中公開的組合物和方法通過引用合并入本文)。通過在混合的復(fù)合物中使cys-TfRscFv與脂質(zhì)體復(fù)合物A以在自始至終描述 的范圍中的單鏈蛋白質(zhì)比脂質(zhì)體和DNA比η moles(或ug)總脂質(zhì)的限定比混合，制備 cys-TfRscFv-免疫脂質(zhì)體復(fù)合物。下文描述的復(fù)合物制備依照下述一般操作。使合適量的 2mM脂質(zhì)體(上文描述的A-H)與所需的任何水(例如，DI水)混合，以給出所需體積，并且 倒轉(zhuǎn)以混合。向脂質(zhì)體-水混合物中，加入合適量的cys-TfRscFv，以給出所需比，并且通過 輕輕倒轉(zhuǎn)混合約1秒至約2分鐘。使這種混合物保持在室溫下約10分鐘至約20分鐘(在 約5分鐘后輕輕倒轉(zhuǎn)5-10秒)。同時(shí)，通過倒轉(zhuǎn)使合適量的DNA與所需的任何水混合約1 秒至約2分鐘，以給出所需體積。一般地，對(duì)于在體外測(cè)定法中的使用，希望DNA濃度在約 0. Olyg至約2 μ g/孔的范圍中；對(duì)于體內(nèi)使用，希望提供約5 μ g至約IOOyg DNA/注射。 將DNA溶液快速加入cys-TfRscFv-脂質(zhì)體溶液中，并且使混合物倒轉(zhuǎn)約1秒至約2分鐘。 使最終的混合物維持在室溫下約10分鐘至約20分鐘，在約5分鐘后輕輕倒轉(zhuǎn)5-10秒。對(duì) 于體內(nèi)使用，加入50%右旋糖或50%蔗糖至1-20% (V V)、適當(dāng)?shù)?-20% (V V)終濃 度，并且通過輕輕倒轉(zhuǎn)混合約1秒至約2分鐘。以1 30 (cys-TfRscFv 脂質(zhì)體，w w)和 1 14 ( UgDNA nmole總脂質(zhì))的合適比的具體例子如下。對(duì)于終體積800 μ 1的40 μ g DNA,使183 μ 1水與280 μ 1 2mM脂質(zhì)體溶液混合。加入34 μ 1 cys-TfRscFv (具有0. 4 μ g/ ml的濃度)。使183 μ 1水與40 μ 1 1 μ g/1 μ 1 DNA混合。加入80 μ 1 50%右旋糖作為最 后一個(gè)步驟。通過本發(fā)明的方法制備的最終復(fù)合物大小為約100至400 (nm)，具有正ζ電位，如 通過動(dòng)態(tài)光散射使用 Malvern ZETASIZER 3000 或 Malvern ZETASIZER NANO-ZS 測(cè) 定的。這個(gè)大小足夠小以有效經(jīng)過腫瘤毛細(xì)血管床并且到達(dá)腫瘤細(xì)胞，并且也足夠小以有 效經(jīng)過毛細(xì)血管床并且到達(dá)靶APC細(xì)胞。2.評(píng)估針對(duì)HCV特異性抗原的免疫應(yīng)答靶HCV抗原在疫苗研究中包括的HCV抗原是NS3直到NS5B。這些序列得自基因型laH77株 系。參見 Major Μ. Ε.，等人，！fepatitis CViruses. In =Fields Virology, Knipe D. Μ.和 Howley P.M.(編輯)，Lippincott, Williams & Wilkins，第 1127-1161 頁(yè)(2001)，其公開 內(nèi)容通過引用整體合并入本文。在恢復(fù)的動(dòng)物中單獨(dú)針對(duì)這種抗原的T細(xì)胞應(yīng)答的增強(qiáng)導(dǎo) 致短暫、臨床上不顯著的感染(參見下文)。對(duì)于在CMV啟動(dòng)子的控制下表達(dá)抗原的質(zhì)粒，已使用293-T和Huh 7. 5細(xì)胞。對(duì)于腺病毒載體，使用AD-293細(xì)胞系。通過免疫熒光染色 且通過用特異性抗體的蛋白質(zhì)印跡測(cè)定表達(dá)。腺病毒載體使用ADEASY 系統(tǒng)表達(dá)HCV基因的人腺病毒血清型5重組體適當(dāng)?shù)卦诒景l(fā)明中 使用(Stratagene，CA)。這個(gè)載體已通過El和E3基因的缺失使得復(fù)制有缺陷。通過在大 腸桿菌中重組將目的基因引入腺病毒主鏈。隨后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到AD-293細(xì)胞內(nèi)，在其中 補(bǔ)充缺失的病毒裝配基因以產(chǎn)生病毒顆粒。腺病毒也是關(guān)于HCV治療的吸引人的病毒載 體，因?yàn)檫@種病毒可以在肝中有效表達(dá)轉(zhuǎn)基因。白介素-12 (免疫增強(qiáng))白介素-12(IL_12)誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生，支持Thl超過Th2細(xì)胞的分化，并且使先天 性抗性與適應(yīng)性免疫連接。在感染過程中DCs和吞噬細(xì)胞響應(yīng)病原體產(chǎn)生IL-12。為了改 善免疫接種且刺激有效的Thl型應(yīng)答，在陽(yáng)離子免疫脂質(zhì)體制劑中包括表達(dá)IL-12的質(zhì)粒。 已制備表達(dá)小鼠和人IL-12的質(zhì)粒，以便達(dá)到小鼠和靈長(zhǎng)類動(dòng)物研究之間的一致性。小鼠接種研究涉及使用表達(dá)HCV抗原的重組載體的DNA引發(fā)/腺病毒加強(qiáng)。在第0和4周 時(shí)用在本文公開的脂質(zhì)體復(fù)合物中的20-30 μ g DNA接種小鼠，并且在10-12周時(shí)用重組腺 病毒(IO8感染單位，皮下(s. c.))加強(qiáng)。這次加強(qiáng)后4周，通過流式細(xì)胞術(shù)分析肝和脾，以 測(cè)定在肝中的T細(xì)胞特征。T細(xì)胞可以使用Ficoll梯度與肝細(xì)胞分開，并且使用標(biāo)記抗體 就特異性表面標(biāo)記進(jìn)行染色。作為對(duì)照，包括PBS處理的小鼠，肌內(nèi)(i.m.) (1至50yg/小 鼠)、腹膜內(nèi)(i.P.)、靜脈內(nèi)(i.v.)和皮內(nèi)(i.d.) (1-50 μ g/小鼠)注射的無配體脂質(zhì)體 /DNA復(fù)合物、攜帶空載體的復(fù)合物、裸露DNA，和用復(fù)合物i.m.或i. d.接種的小鼠。最佳 化劑量和時(shí)機(jī)，并且評(píng)估經(jīng)過6個(gè)月時(shí)期T細(xì)胞在肝中的持續(xù)和回憶，以基于肝內(nèi)T細(xì)胞數(shù) 目和標(biāo)記確定最佳系統(tǒng)。因?yàn)檗D(zhuǎn)鐵蛋白受體在樹突細(xì)胞上表達(dá)，并且通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞 作用攝取復(fù)合的DNA，scL-HCV或scLHK-HCV復(fù)合物的i. m.和/或i. d.接種預(yù)期導(dǎo)致比裸 露質(zhì)粒DNA更佳的全身應(yīng)答。T細(xì)胞群體可以基于⑶45RA、⑶62L、⑶27和CCR7的表達(dá)進(jìn) 行鑒定。IL-7Ra提供了可以區(qū)分短效的效應(yīng)細(xì)胞與發(fā)育成功能記憶細(xì)胞的那些的有用標(biāo) 記。這些標(biāo)記在初步小鼠研究中使用，以分析候選疫苗建立長(zhǎng)期免疫的潛力。存在關(guān)于在 黑猩猩中HCV清除后記憶CD8+T細(xì)胞在肝中的選擇性保留的證據(jù)，與在清除后6個(gè)月的血 液比較，在肝中具有高 10倍的水平。脾和肝內(nèi)T細(xì)胞的特異性通過體外免疫測(cè)定法進(jìn)行評(píng)估。最初，使用純化的HCV 抗原或重疊18肽的Elispot測(cè)定法用于分析分泌IFN- γ或IL-4的細(xì)胞。還使用從免疫 接種小鼠的脾中分離的細(xì)胞和購(gòu)自Mikroger^Germany)的全蛋白質(zhì)執(zhí)行增殖測(cè)定法。利用 HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠。這些小鼠表達(dá)HLA-A2MHC分子，并且可以呈遞HLA-A2表位。這些轉(zhuǎn)基 因小鼠可以使用與用于BALB/c小鼠的那種相同的方案進(jìn)行免疫接種，但可以在免疫學(xué)測(cè) 試中使用由HLA-A2單元型識(shí)別的肽。對(duì)于這些分析，使用對(duì)于這種單元型特異的NS5A和 NS5B鑒定的HLA-A2四聚體和表位。在FACS緩沖液(1 % BSA,在不含鈣的PBS中的0. 1 %疊 氮化鈉)中，用呈遞特異性肽的四聚體-藻紅蛋白(PE)和對(duì)于表面標(biāo)記(CD4，CD8)特異的 FITC標(biāo)記的抗體在室溫下或在冰上染色肝衍生細(xì)胞30分鐘。使用軟件Cellquest (Becton Dickenson)在 FACS-Calibur (Becton Dickenson)上獲得事件用于分析，使用 7AAD(BDPharmigen)以排除死細(xì)胞。使用得自首次用于實(shí)驗(yàn)或模擬接種小鼠的T細(xì)胞測(cè)定非特異性背景染色。對(duì)于克隆，淋巴細(xì)胞進(jìn)行抗原刺激且以有限稀釋與Y輻射的同基因APCs加上 IL-2和IL-7共培養(yǎng)，并且就HCV特異性增殖進(jìn)行測(cè)試。B.結(jié)果1.在體外使脂質(zhì)體復(fù)合物靶向人肝細(xì)胞癌0fep3B)細(xì)胞。使H印3B HCC細(xì)胞(5X IO4)種在24孔皿中，并且用如上述所述的與DNA質(zhì)粒 (0. 05ug/孔)復(fù)合的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，所述DNA質(zhì)粒在哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子的控制下表達(dá)螢光素酶 基因。用于 scL-HCV 的比是 0. 33ug 10ug(14nmol) lug(TfRscFv LipA DNA)，并 且對(duì)于 scLHK-HCV，它們是 0. 33ug Ynmol lug (TfRscFv LipA-HoKC DNA)。轉(zhuǎn)染后 24 小時(shí)，使用 Luciferase Assay System(Promega，Madison，WI)測(cè)定螢光素酶活性。結(jié) 果在圖1中作為平均值+SD(n = 3)顯示。使用與抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈抗體片段(sc)復(fù) 合的脂質(zhì)體獲得有效轉(zhuǎn)染，對(duì)于sc/LipA和sc/LipA-HoKC復(fù)合物分別具有257，815RLU和 1，120，643RLU的螢光素酶值(圖1)。使這與對(duì)于與未修飾的脂質(zhì)A (LipA)復(fù)合的螢光素 酶質(zhì)粒的538. 9RLU/μ g蛋白質(zhì)的螢光素酶值比較。當(dāng)HoKC肽摻入脂質(zhì)體復(fù)合物時(shí)，DNA進(jìn) 入這種肝細(xì)胞系內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率的這種增加與使用前列腺和胰腺細(xì)胞系的先前觀察一致。2.在體外使脂質(zhì)體復(fù)合物靶向原代黑猩猩肝細(xì)胞。正常肝細(xì)胞不具有與肝細(xì)胞癌細(xì)胞相同的受體水平，因此在原代黑猩猩肝細(xì)胞 中比較與TfRscFv (sc)、半乳糖(GAL)和L_37pA配體綴合的脂質(zhì)復(fù)合物組。將50，000個(gè) 原代黑猩猩肝細(xì)胞種在24孔板中，并且用含或不含HoKC肽的攜帶螢光素酶報(bào)道基因的 復(fù)合物轉(zhuǎn)染(0. Iyg DNA質(zhì)粒/孔)。通過上文公開的簡(jiǎn)單混合方法制備sc/Lip-HoKC/ DNA(泳道 1-3)和 sc/Lip/DNA(泳道 7-9)復(fù)合物，即，以 0. 33ug sc 7nm Lip-HoKC 和
0.33ug sc 14nmol Lip的比，使TfRscFv與合適脂質(zhì)體(含或不含HoKC)混合，通過用 手輕輕倒轉(zhuǎn)10次或在20-30PRM下旋轉(zhuǎn)15-60秒混合，并且在室溫下保持10-15分鐘。隨 后將 DNA 加入 sc/Lip-HoKC 或 sc/Lip 混合物(以 lug DNA 7nmol (對(duì)于 Lip-HoKC)禾口 lug DNA 14nmol (對(duì)于Lip)的比)，并且通過用手輕輕倒轉(zhuǎn)10次或在20-30PRM下旋轉(zhuǎn) 15-60秒混合溶液，并且在室溫下保持10-15分鐘。無配體的復(fù)合物也以相同比并且根據(jù)相 同操作制備為對(duì)照(泳道4-6和10-12)。通過使L-37pA配體與脂質(zhì)體(A，D或G)化學(xué)綴 合形成使用L-37pA配體的復(fù)合物(泳道19-21)，所述脂質(zhì)體包含6. 7%摩爾比的Lip-馬 來酰亞胺。Lip-Mal 與 L-37pA 以 14 7(nmol nmol) (Lip L_37pA)的比混合，并加入
1.5mM HEPES緩沖液(終濃度)，并且在20-30RPM下在室溫下旋轉(zhuǎn)3小時(shí)。然后，以Iug DNA 14nmol Lip的比加入DNA，如上所述混合，并且在室溫下保持15分鐘。為了比較，還 使用不同方法以形成具有GAL配體的復(fù)合物(泳道13-18)。此處，將DNA加入任何所需水 中，并且如上混合。將脂質(zhì)體A、D或G (含或不含HoKC)加入任何所需水中，并且如上混合。 使2種溶液在室溫下保持15分鐘，隨后加在一起，如上混合并且在室溫下保持15分鐘，以 形成陽(yáng)離子脂質(zhì)體/DNA核心。GAL配體先前以1 1 0. 05 (PS chol GAL)的摩爾 比與陰離子(磷脂酰絲氨酸膽固醇)脂質(zhì)體綴合。這種PScholGAL混合物隨后加入預(yù)形 成的陽(yáng)離子脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物，溶液如上混合并且在室溫下保持15分鐘，以封裝陽(yáng)離子脂 質(zhì)體/DNA核心。用于這些復(fù)合物的組分比是7nmol Ynmol lug(PScholGAL Lip-HoK C DNA)禾口 7nmol 14nmol lug(PScholGAL Lip DNA)。轉(zhuǎn)染后 48 小時(shí)，使用如上所述的螢光素酶測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定螢光素酶活性。圖2顯示在原代黑猩猩肝細(xì)胞中通過螢光素 酶RLU/ μ g蛋白質(zhì)測(cè)定的轉(zhuǎn)染效率。用所有3種方法且使用所有3種配體形成的復(fù)合物能 夠轉(zhuǎn)染這些原代黑猩猩肝細(xì)胞。使用原代黑猩猩肝細(xì)胞，與使用的脂質(zhì)無關(guān)，與sc復(fù)合的 脂質(zhì)體給出比使用不同方法與GAL (15，509RLU)或L_37pA(19，662RLU)復(fù)合的最佳脂質(zhì)體 幾乎高10倍的轉(zhuǎn)染效率( 150，000RLU)。如預(yù)期的，由于在正常肝細(xì)胞上假定的低數(shù)目 Tf受體，sc/脂質(zhì)體的總體轉(zhuǎn)染效率比相同復(fù)合物在H印3B細(xì)胞中時(shí)低直至16倍。然而， HoKC肽的包括使得使用TfRscFv的轉(zhuǎn)染效率增加10倍。如先前使用!fep3B細(xì)胞觀察到的， 當(dāng)HoKC肽與GAL配體一起包括時(shí)，觀察到用GAL和L_27pA配體的最佳轉(zhuǎn)染效率。因此，這 些研究證實(shí)scLHK-DNA復(fù)合物在將DNA遞送到正常肝細(xì)胞內(nèi)方面高度有效，并且其他配體 也可以在復(fù)合物中用于轉(zhuǎn)染正常肝臟肝細(xì)胞。
3.在體內(nèi)使脂質(zhì)體復(fù)合物靶向肝臟細(xì)胞。在體外實(shí)驗(yàn)后，使用非荷瘤BALB/c小鼠和特定脂質(zhì)體復(fù)合物在體內(nèi)執(zhí)行測(cè)試。用 在400 μ 1脂質(zhì)體復(fù)合物中的表達(dá)EGFP的20-25 μ g DNA質(zhì)粒經(jīng)由尾部靜脈i. v.接種6_9 周大的動(dòng)物，所述脂質(zhì)體復(fù)合物如上所述以上文給出的比制備，經(jīng)過24小時(shí)的時(shí)間段接種 2-3次。在最后一次接種后24-48小時(shí)時(shí)，使來自肝、脾、腎、肺和心臟的組織小片在液氮 中速凍并且貯存于-70°C。此外，使肝組織小片在福爾馬林中固定用于組織學(xué)分析。對(duì)于 蛋白質(zhì)印跡分析，使用包含蛋白酶抑制劑混合物(Sigma)的T-PER組織提取試劑(Pierce， Rockford, IL)提取肝組織，并且在離心后收集上清液以去除細(xì)胞碎片。使用BCA蛋白質(zhì) 測(cè)定試劑試劑盒(Pierce，Rockford, IL)評(píng)估蛋白質(zhì)濃度，并且使用單克隆抗GFP抗體 (BAbCo)和 ECL 蛋白質(zhì)印跡試劑盒(Yu W，等人，Nucleic Acids Research，32. e48 (2004)) 分析40 μ g總蛋白質(zhì)。用抗GAPDH抗體處理相同膜以建立相等蛋白質(zhì)裝載/孔。圖3顯 示與未處理小鼠(UT)比較，來自用與脂質(zhì)A(scLA)、脂質(zhì)A和HoKC (scLAHK)、脂質(zhì)D和 HoKC(scLDHK)、脂質(zhì)G和HoKC(ScLGHK)綴合的TfRscFv配體(sc)、與脂質(zhì)A綴合的半乳糖 (GalLA)和與脂質(zhì)A綴合的L-37pA(L-37pALA)接種的一式兩份小鼠的肝提取物的蛋白質(zhì)印 跡。左手泳道顯示關(guān)于GFP和GAPDH的陽(yáng)性對(duì)照(PC)。所有脂質(zhì)體復(fù)合物導(dǎo)致GFP在接 種的小鼠的肝中的表達(dá)。當(dāng)使用脂質(zhì)A時(shí)(比較scLA和scLAHK)，HoKC肽的包括改善DNA 至小鼠肝的遞送。用scLGHK脂質(zhì)體復(fù)合物觀察到最高水平的表達(dá)，盡管這僅在2只小鼠的 1只中出現(xiàn)，并且scLAHK復(fù)合物看起來在重復(fù)動(dòng)物中給出更一致強(qiáng)烈的GFP蛋白質(zhì)表達(dá)。 GalLA和L-37pALA修飾的脂質(zhì)體也導(dǎo)致GFP的表達(dá)，但處于更低的水平?？傊?，這個(gè)數(shù)據(jù)表明，盡管可以使用所有3種配體，但在脂質(zhì)體中包含靶向性配 體TfRscFv和HoKC肽的基因遞送媒介物對(duì)于肝臟細(xì)胞比半乳糖或L-37pA肽更佳。這 些結(jié)果是出乎意料的，因?yàn)榘肴樘峭ǔＳ糜诎邢蚋闻K細(xì)胞(Wu，J.，等人，“Targeting Hepatocytes for Drugand Gene Delivery :Emerging Novel Approaches and Applications, " Frontiers in Bioscience 7 :d717_725(2002)。4.誘導(dǎo)針對(duì)HCV的免疫應(yīng)答的DNA和病毒載體的構(gòu)建使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)克隆方法，已構(gòu)建DNA載體以在高表達(dá)啟動(dòng) 子(pAG410)的控制下表達(dá)HCV的NS3直到NS5B蛋白質(zhì)。用于表達(dá)這些HCV特異性蛋白 質(zhì)的主鏈載體已由FDA批準(zhǔn)用于臨床使用，并且目前處于使用癌癥特異性制劑的患者I期 臨床試驗(yàn)中。已在體外使用293T和Huh7.5(肝細(xì)胞)細(xì)胞測(cè)試表達(dá)，并且通過蛋白質(zhì)印跡(圖4)和免疫熒光(數(shù)據(jù)未顯示)分析顯示特異性表達(dá)HCV抗原。使用制造商的方案使用 Lipofectindnvitrogen, CA)轉(zhuǎn)染6孔皿中的細(xì)胞。48小時(shí)后，細(xì)胞就特異性基因表達(dá)進(jìn) 行分析。對(duì)于蛋白質(zhì)印跡分析，使用包含蛋白酶抑制劑混合物(Sigma)的250ylM-PER試 劑(Pierce，Rockford，IL)裂解細(xì)胞。使用 8-20% SDS-PAGE 梯度凝膠(Invitrogen)通過 蛋白質(zhì)印跡分析80微克總蛋白質(zhì)。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，并且用1 500稀釋的針對(duì) NS5B的單克隆抗體或1 500稀釋的慢性黑猩猩血清探測(cè)。使用抗人或抗小鼠IgG HRPO 綴合物和化學(xué)發(fā)光(West Pico system, Pierce, Rockford，IL)顯現(xiàn)蛋白質(zhì)。圖4顯示與 用pAGVec(空載體)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞比較，對(duì)于NS3、NS4B、NS5A和NS5B觀察到的特異性條帶。 也已使用標(biāo)準(zhǔn)克隆方法構(gòu)建腺病毒重組體，以個(gè)別表達(dá)這些相同抗原中的每一種。來自這 些病毒載體的每一個(gè)的表達(dá)也通過蛋白質(zhì)印跡分析加以驗(yàn)證(數(shù)據(jù)未顯示)。5.克隆到高表達(dá)啟動(dòng)子內(nèi)的人IL-2的增強(qiáng)效率對(duì)于充當(dāng)有效佐劑分子的ILs，它們必須以足夠高的水平表達(dá)，以有效刺激Th-IT 細(xì)胞應(yīng)答。將它們置于高表達(dá)啟動(dòng)子的控制下是實(shí)現(xiàn)這點(diǎn)的一種方法。為了證實(shí)通過這種 方法可能實(shí)現(xiàn)ILs高水平表達(dá)，將人IL-2克隆到在高表達(dá)啟動(dòng)子的控制下的pSCMV載體內(nèi) (參見公開的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?007/0065432，其公開內(nèi)容通過引用并入本文)。測(cè)試在體內(nèi) 的表達(dá)水平，并且與來自標(biāo)準(zhǔn)CMV啟動(dòng)子的那種比較。在2種情況下，通過如本文所述制備 的不含HoKC肽的靶向的脂質(zhì)體納米復(fù)合物遞送質(zhì)粒。通過皮下接種PANC-I腫瘤組織，在 4-6周大的雌性無胸腺裸鼠中誘導(dǎo)PANC-I人胰腺癌異種移植物腫瘤。約3周后，腫瘤平均 為400-700mm3，并且動(dòng)物經(jīng)過6天用納米免疫脂質(zhì)體復(fù)合物給予6次i. v.(尾部靜脈)注 射，所述復(fù)合物使用比(0. 33ug IOug lug(TfRscFv Lip DNA))并且通過如上所述 的簡(jiǎn)單混合進(jìn)行制備，攜帶在標(biāo)準(zhǔn)CMV啟動(dòng)子或高表達(dá)啟動(dòng)子的控制下的IL-2基因(40ug DNA/注射)。在最后一次注射后24小時(shí)處死小鼠。收集腫瘤和肺組織，在液氮中閃凍，并 且使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過使用針對(duì)hIL-2的商業(yè)多克隆抗體和ECL檢測(cè)的蛋白質(zhì)印跡分析就 hIL-2蛋白質(zhì)表達(dá)水平進(jìn)行分析。如圖5中所示，來自接受攜帶psCMV-hIL-2質(zhì)粒的復(fù)合物 的動(dòng)物的所有腫瘤證實(shí)在腫瘤中的高表達(dá)水平。相比之下，hIL-2表達(dá)在其中hIL-2基因 處于標(biāo)準(zhǔn)CMV啟動(dòng)子的控制下的腫瘤中不明顯。6.在經(jīng)由scL i. v.遞送后在小鼠組織中的HCV DNA序列/表達(dá)的檢測(cè)執(zhí)行實(shí)驗(yàn)以評(píng)估在scL-pAG410復(fù)合物的全身施用后，在各種非荷瘤小鼠組織中 編碼NS3直到NS5B的基因的存在。BALB/c小鼠(3只/組)用與scL(單鏈轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體 靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體)復(fù)合或作為游離質(zhì)粒DNA的質(zhì)粒pAG410DNA(25ug/小鼠/注射) i. v.注射2次(相隔8小時(shí))。通過如上所述的簡(jiǎn)單混合以(0. 33ug IOug lug (TfRscF ν Lip DNA))的比制備復(fù)合物。一組小鼠接受以相同方式和相同比制備的攜帶空pSCMV 載體的scL。注射后48小時(shí)處死動(dòng)物。收集肝、肺、脾和胸腺，并且在液N2中閃凍。部分樣 品使用DNeasyExtraction Kit (Qiagen)用于分離DNA，以用于PCR。在分開的反應(yīng)中使用 Taq Gold聚合酶執(zhí)行DNA PCR (lug DNA)，使用引物以擴(kuò)增NS3、NS5A和NS5B。PCR條件如 下在 50ul 總體積中的 6ng DNA、2mMMgCl2 ；各 0. 2mM 的 dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP ；300nM 各 種引物；和1. 25單位AmpliTaq。通過使反應(yīng)混合物在94°C下溫育10分鐘，隨后為在94°C 下15秒和60°C 30秒的40個(gè)循環(huán)，然后60°C 7分鐘來執(zhí)行擴(kuò)增。圖6顯示關(guān)于在肝中的 NS3基因的PCR數(shù)據(jù)，盡管信號(hào)差異對(duì)于NS5A和NS5B是相似的。在接受復(fù)合的對(duì)游離的PAG410的小鼠之間在所有器官中在拷貝水平上存在顯著差異。與肝相似(圖6)，在肺、脾 和胸腺中，scL-pAG410具有強(qiáng)PCR條帶，同時(shí)用游離DNA不存在檢測(cè)出的信號(hào)。如預(yù)期的， 不存在來自載體處理的小鼠的信號(hào)。因此，復(fù)合的HCV質(zhì)粒DNA的i. v.遞送導(dǎo)致在肝和其 他器官中的細(xì)胞的有效攝取。這些結(jié)果證實(shí)且支持這種方法用于將HCV抗原全身遞送給正 常肝和其他正常細(xì)胞的可行性。7.小鼠的免疫應(yīng)答小鼠無法被HCV感染。然而，為了評(píng)估誘導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答的功效，表達(dá)HCV的NS3蛋白質(zhì)的重組痘苗病毒(rVV)用作替代病毒攻擊模型。這種類型的rVV模型是本領(lǐng)域眾所 周知的，并且是評(píng)估T細(xì)胞應(yīng)答的體內(nèi)功效的公認(rèn)方法。小鼠(3只/組)在0和4周時(shí)用 HCV和IL-12質(zhì)粒DNA進(jìn)行I. V.接種，所述質(zhì)粒DNA是如上所述scL復(fù)合的或作為游離質(zhì) 粒DNA。通過如上所述的簡(jiǎn)單混合使用0. 33ug IOug lug (TfRscFv Lip DNA)的比 制備TfRscFv/Lip/DNA復(fù)合物。DNA以等摩爾量(總共50ug/小鼠/注射)混合。小鼠在8 周時(shí)用表達(dá)HCV的NS3蛋白質(zhì)的IO6噬斑形成單位(pfu)rVV進(jìn)行攻擊。在攻擊后5天時(shí)， 從小鼠中取出卵巢，在PBS中勻漿化，并且實(shí)施3輪凍/融和超聲處理。對(duì)于滴定，使卵巢 提取物(IOOul)與IOOul胰蛋白酶和IOOul PBS組合，并且在37°C下溫育30分鐘。在2% FBS/EMEM中執(zhí)行稀釋(從10—1到10_6的10倍稀釋)，并且250ul用于感染在12孔皿中的 一式兩份孔的BSC-I細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后2天時(shí)，去除培養(yǎng)基并且使細(xì)胞固定且用結(jié)晶紫(20% 乙醇、20%甲醛、0. 3%結(jié)晶紫)染色。組1接受PBSJi 2接受scL復(fù)合的pAG410和IL-12 質(zhì)粒，組3接受scL復(fù)合的空載體和IL-12質(zhì)粒，并且組4接受作為裸露DNA的pAG410和 IL-12質(zhì)粒。圖7顯示在每個(gè)組中表示為pfu/卵巢的rVV滴度。點(diǎn)表示單獨(dú)的小鼠，并且 黑色條表示平均滴度/組。與PBS組比較，用scLpAG410/IL-12復(fù)合物的免疫接種導(dǎo)致病毒 滴度的高度顯著的減少(P = 0.002)，如使用斯氏T分布評(píng)估的。Gp2中的IO4平均滴度對(duì) Gpl中的106。有趣的是，用scL復(fù)合的IL-12載體連同空主鏈載體一起接種小鼠也導(dǎo)致病 毒滴度的顯著減少(2X IO5Pfu/卵巢的平均滴度)，盡管不如與PAG410質(zhì)粒組合時(shí)可見的 那種減少那么多。對(duì)病毒復(fù)制的這種作用是使用scL遞送的結(jié)果，因?yàn)橛米鳛槁懵禗NA的 PAG410和IL-12的免疫接種(Gp 4)不導(dǎo)致病毒滴度的顯著減少。這個(gè)數(shù)據(jù)表明，用scL復(fù) 合的DNA免疫接種導(dǎo)致T細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)，這種T細(xì)胞應(yīng)答可以保護(hù)免受病毒攻擊，并且這 些免疫應(yīng)答優(yōu)于使用裸露DNA誘導(dǎo)的那些。這個(gè)數(shù)據(jù)表明表達(dá)細(xì)胞因子的質(zhì)粒單獨(dú)的scL 遞送也可以誘導(dǎo)抑制病毒復(fù)制的免疫應(yīng)答。8.在用scL復(fù)合的DNA免疫接種后的肝內(nèi)T細(xì)胞浸潤(rùn)為了評(píng)估用scL復(fù)合的DNA的免疫接種是否導(dǎo)致在用嗜肝病毒感染后更佳的肝內(nèi) T細(xì)胞浸潤(rùn)，在免疫接種后8周用3 X IO8感染顆粒的表達(dá)NS3、NS5A和NS5B HCV蛋白質(zhì)的 非復(fù)制腺病毒重組體I. V.攻擊上文描述的相同4組(在0和4周時(shí)用如上等同的復(fù)合物 進(jìn)行免疫接種)。攻擊后10天，收獲肝組織，進(jìn)行福爾馬林固定，并且使用本領(lǐng)域眾所周知 的標(biāo)準(zhǔn)方案包埋在石蠟塊中。切片進(jìn)行H&E染色并且就T細(xì)胞浸潤(rùn)進(jìn)行分析。在不同小鼠 組中評(píng)估肝浸潤(rùn)T細(xì)胞的數(shù)目。對(duì)于3只小鼠/組的每一只計(jì)數(shù)3個(gè)視野。使關(guān)于每個(gè)組 的計(jì)數(shù)組合且求平均值以給出T細(xì)胞數(shù)目/視野(fov)。數(shù)據(jù)通過斯氏T檢驗(yàn)進(jìn)行分析。 在接受scL pAG410/IL-12的小鼠中的平均T細(xì)胞浸潤(rùn)顯著高于在接受PBS的小鼠中的那 種，118. 8個(gè)T細(xì)胞/fov對(duì)70. 2個(gè)T細(xì)胞/fov (ρ = 0.000007)。這與關(guān)于接受scL-載體/IL-12的小鼠的71. 5個(gè)T細(xì)胞/fov比較。在接受裸露pAG410/IL_12的小鼠中也存在顯 著更高水平的T細(xì)胞浸潤(rùn)，108. 75個(gè)T細(xì)胞/fov(p = 0. 001)，但以比用scL-pAG410/IL_12 少的程度。這些觀察證實(shí)用表達(dá)HCV抗原的scL復(fù)合的質(zhì)粒的免疫接種導(dǎo)致在用重組嗜肝 病毒感染后在肝中更佳的T細(xì)胞應(yīng)答。9.關(guān)于HCV特異性RNA、抗原和免疫應(yīng)答的表達(dá)和測(cè)試的工具的開發(fā)。使用Sindbis表達(dá)系統(tǒng)，已改造表達(dá)重組病毒以表達(dá)HCV的核心、E1E2和NS3蛋 白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)隨后進(jìn)行組氨酸標(biāo)記，以促進(jìn)使用鎳柱的純化。執(zhí)行有效純化并且通過 蛋白質(zhì)印跡分析測(cè)定特異性(使用小鼠單克隆或兔多克隆抗體)。已從具有針對(duì)HCV的 E1E2、NS3和NS5A蛋白質(zhì)的高滴度抗體的受感染黑猩猩鑒定慢性期血清。這種滅活血清已 在數(shù)種蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光測(cè)定法中用于成功檢測(cè)來自重組DNA和病毒載體的HCV抗原 表達(dá)。從Mikrogen(Germany)商購(gòu)可得的NS3、NS5A和NS5B蛋白質(zhì)也已用于檢測(cè)在黑猩 猩中針對(duì)HCV的T細(xì)胞應(yīng)答(使用ELISpot、增殖測(cè)定法和流式細(xì)胞術(shù)分析)。已也從NIH AIDSResearch and Reference Reagent Program 獲得與 la H77 基因型序列對(duì)應(yīng)的一組重 疊18肽，所述la H77基因型序列也已在使用黑猩猩外周血單核細(xì)胞(PBMCs)的Elispot 測(cè)定法中成功使用。已開發(fā)ELISA s用于測(cè)試針對(duì)大多數(shù)HCV抗原，核心、E1E2、NS2、NS3、 NS5A和NS5B的抗體。近期研究已顯示使用ELISA獲得的抗E1E2滴度已證明是在受感染黑 猩猩中的中和抗體滴度的良好指示物。已也開發(fā)巢式和實(shí)時(shí)PCR測(cè)定法，以檢測(cè)且定量在 血清中的HCV RNA。已評(píng)估了這些測(cè)定法的靈敏度和特異性，并且使用巢式PCR可以檢測(cè)出 少至40個(gè)RNA拷貝/mL，并且使用實(shí)時(shí)PCR可以檢測(cè)出少至200個(gè)RNA拷貝/mL(74WH0IU/ mL)。所有這些試劑和檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)于來源于在黑猩猩中在感染的早期急性期過程中收集的 血漿的單克隆病毒特異，所述黑猩猩用由HCV基因型Ia(HCV-H)感染性克隆轉(zhuǎn)錄的RNA接 種。10.在HCV攻擊前首次用于實(shí)驗(yàn)和恢復(fù)的黑猩猩的預(yù)防疫苗接種已檢查了疫苗引發(fā)糖蛋白特異性或非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)特異性免疫應(yīng)答以改變HCV感 染病程的能力。這些研究顯示中和抗體(nAb)和疫苗誘導(dǎo)的T細(xì)胞可以改變?cè)诤谛尚赡Ｐ?中的HCV感染。a)基于包膜的疫苗改變HCV感染。已開發(fā)了產(chǎn)生用于在疫苗實(shí)驗(yàn)中使用的HCV E1E2蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化系統(tǒng)。使用 Sindbis表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)組氨酸標(biāo)記的E1E2蛋白質(zhì)，并且使用GNL凝集素和鎳柱——本領(lǐng)域 良好建立的方法純化至>80%純度。通過使用針對(duì)El和E2的單克隆抗體的蛋白質(zhì)印跡和 SDS PAGE凝膠的銀染色評(píng)估特異性和純度。2只黑猩猩，一只首次用于實(shí)驗(yàn)(Chl601)和一 只從急性HCV感染恢復(fù)(Chl587)，用肌內(nèi)遞送的25 μ grElE2蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫接種，并且用 100黑猩猩感染劑量(CID5tl)的克隆HCV進(jìn)行攻擊(圖8A和8B)。攻擊結(jié)果與未接種疫苗 的對(duì)照動(dòng)物中的感染進(jìn)行比較。除強(qiáng)和特異性T細(xì)胞增殖應(yīng)答外，2只動(dòng)物的免疫接種產(chǎn)生 針對(duì)E1E2的高抗體滴度，包括針對(duì)E2的高變區(qū)(HVRl)的抗體。這個(gè)區(qū)域已顯示在天然分 離株中是最可變的，并且也認(rèn)為代表nAb表位。使用完整蛋白質(zhì)E1E2和HVRl肽ELISA測(cè) 定法測(cè)量抗體，所述ELISA測(cè)定法利用由BSC-I細(xì)胞純化的生物素化HVRl肽或E1E2蛋白 質(zhì)開發(fā)，所述BSC-I細(xì)胞用表達(dá)E1E2的重組痘苗病毒感染。在2只接種疫苗的動(dòng)物中病毒 血癥延遲3周。在Chl601中，HCV RNA滴度維持在5 X IO4拷貝/ml以下，并且ALT水平被最低限度升高。肝內(nèi)細(xì)胞因子mRNA水平的增加與HCV RNA下降至無法定量水平一致。不 管這個(gè)對(duì)照，隨著抗體滴度減弱病毒血癥再現(xiàn)，并且動(dòng)物被慢性感染，這個(gè)再現(xiàn)與免疫逃逸 無關(guān)。從急性HCV感染恢復(fù)的黑猩猩不發(fā)展nAbs。將nAb加入原發(fā)感染中誘導(dǎo)的已存在 的記憶T細(xì)胞應(yīng)答，產(chǎn)生能夠保護(hù)動(dòng)物不受再感染的免疫應(yīng)答。在Chl587中，病毒血癥在 3周時(shí)在唯一一份樣品中可檢測(cè)(< IO4拷貝/ml)，無肝炎的證據(jù)。b) T細(xì)胞疫苗改變HCV感染構(gòu)建不使用本發(fā)明的方法的疫苗，其僅包含HCV NS抗原NS3、NS5A和NS5B?；謴?fù) 的黑猩猩(Chl588)用DNA引發(fā)/rVV(重組痘苗病毒)加強(qiáng)方案針對(duì)NS3進(jìn)行免疫接種。 第二只恢復(fù)的黑猩猩(Chl606)用包括NS3、NS5A和NS5B的疫苗進(jìn)行免疫接種。黑猩猩用 IOOCID5ci的克隆HCV進(jìn)行攻擊。在2只動(dòng)物中，在疫苗接種后加強(qiáng)T細(xì)胞應(yīng)答。2只動(dòng)物的 攻擊導(dǎo)致亞臨床感染(在注射(p. i.)后6周時(shí)僅持續(xù)1 (Chl606)或2(Chl588)周的低水 平病毒血癥(圖9A-9C))。相比之下，未接種疫苗的恢復(fù)的黑猩猩在p. i. 1周時(shí)發(fā)展病毒血 癥，這在至少直到14周時(shí)可檢測(cè)。首次用于實(shí)驗(yàn)的黑猩猩(Ch6394)隨后用NS3-NS5疫苗進(jìn)行疫苗接種，并且用 IOOCID50的單克隆H77進(jìn)行攻擊。使用采用完整抗原和重疊肽的增殖和Elispot測(cè)定法測(cè) 試T細(xì)胞應(yīng)答。Ch6394在疫苗接種后發(fā)展針對(duì)所有疫苗抗原的特異性T細(xì)胞應(yīng)答。在攻擊 后，這只動(dòng)物在P. i. 1周時(shí)變得病毒血癥，但具有< IO5拷貝/ml的最大限度滴度和病毒復(fù) 制的立即控制(圖9A-9C)。在首次用于實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物中，滴度每7天增加 2倍，而在Ch6394 中，滴度在相同時(shí)期內(nèi)減少30倍。然而，在第10周時(shí)，喪失病毒控制，并且動(dòng)物發(fā)展慢性感 染。這種喪失伴隨NS3特異性免疫應(yīng)答(IFN-Y產(chǎn)生T細(xì)胞頻率和增殖)的喪失，并且與2 個(gè)氨基酸突變的出現(xiàn)相關(guān)，2個(gè)突變一個(gè)在NS3區(qū)中并且一個(gè)在NS5A區(qū)中。Elispot測(cè)定 法已顯示與野生型肽比較，攜帶這些突變的肽不再由來自Ch6394的PBMCs識(shí)別，表明這些 改變代表免疫逃逸突變。從⑶4T細(xì)胞逃逸可能已導(dǎo)致輔助功能的喪失，這可以解釋NS3特 異性應(yīng)答在這個(gè)動(dòng)物中的喪失。這些結(jié)果暗示基于T細(xì)胞的針對(duì)HCV的疫苗具有控制感染 的潛力。11.在HCV攻擊前首次用于實(shí)驗(yàn)的黑猩猩的預(yù)防疫苗接種a)使用i. v.配體-脂質(zhì)體納米復(fù)合物(scL-HCV)疫苗策略在首次用于實(shí)驗(yàn)的黑 猩猩中引發(fā)特異性T細(xì)胞應(yīng)答，并且其在攻擊后增強(qiáng)。已執(zhí)行在首次用于實(shí)驗(yàn)的黑猩猩中使用如自始至終描述的scL-HCV納 米復(fù)合物的疫苗研究。使用scL-HCV復(fù)合物在0、4和8周時(shí)進(jìn)行注射以引發(fā)免 疫應(yīng)答，隨后為重組腺病毒(rAd)加強(qiáng)(16周)。用于給動(dòng)物接種疫苗的復(fù)合物 0. 33ug IOug lug(TfRscFv Lip DNA)的比制備，用5%右旋糖作為賦形劑，以約 0. 164mgDNA/Kg/注射使用(基于黑猩猩的重量)。將制備的復(fù)合物注入250ml5%右旋糖的 袋內(nèi)用于i. v.輸注，并且施用于動(dòng)物。動(dòng)物在32周(加強(qiáng)后16周)時(shí)進(jìn)行攻擊。用納米 復(fù)合物的輸注和腺病毒加強(qiáng)是良好耐受的，在任何動(dòng)物中無不良反應(yīng)。疫苗接種后=Elispot研究在2只接種疫苗的動(dòng)物(Chl611、Ch6407)中在疫苗接種后16周時(shí)顯示強(qiáng)烈、廣泛反應(yīng)的HCV特異性IFN-Y應(yīng)答(圖10A-10C)，在接受空載 體納米復(fù)合物和非-rAd的對(duì)照動(dòng)物(Ch0257)中具有最低限度或無法檢測(cè)的應(yīng)答。在用 scIHK-HCV接種后在Chl611和Ch6407中可見低水平IFN- γ特異性T細(xì)胞應(yīng)答，指示針對(duì)疫苗的這種引發(fā)組分的免疫應(yīng)答。在免疫接種后在2只接種疫苗的動(dòng)物中還觀察到肝內(nèi) IFN- γ和⑶3mRNA水平的增加(圖12A-12C，第12、16和32周)。數(shù)據(jù)表示為相對(duì)于第O周 (接種疫苗前)時(shí)的mRNA水平，并且對(duì)內(nèi)源對(duì)照(GAPDH)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。在第16和32周時(shí) CD3mRNA的增加也指示肝中的T細(xì)胞浸潤(rùn)。對(duì)于對(duì)照動(dòng)物(Ch0257)，在免疫接種后的任何時(shí) 間和在攻擊前(第32周)未見細(xì)胞因子的增加(圖12A-12C)。這個(gè)數(shù)據(jù)表明在使用本文 公開的復(fù)合物和方法接種疫苗后，在肝以及外周血中誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答，并且這個(gè)數(shù)據(jù)通過 在Ch6407和對(duì)照Ch0257中的血清細(xì)胞因子分析(使用TransSignal Cytokine Antibody Array試劑盒(Panomics))得到支持。第一次scL_HCV DNA納米復(fù)合物處理后2周，僅在 接種疫苗的黑猩猩中，而不是在對(duì)照動(dòng)物中觀察到細(xì)胞因子的上調(diào)，包括ICAM-1、各種白介 素、TGF-α 禾口 IFN-γ 0攻擊后使用本領(lǐng)域眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)方法在第32周時(shí)用100感染劑量的HCV攻擊 免疫接種的黑猩猩。在攻擊后，2只接種疫苗的動(dòng)物都顯示病毒復(fù)制的立即控制，這與如通 過Elispot測(cè)定法測(cè)量的增加的HCV特異性T細(xì)胞應(yīng)答(圖11A-11C)和增加的肝內(nèi)細(xì)胞 因子應(yīng)答(圖12A-12C) —致。在攻擊后，2只動(dòng)物仍具有對(duì)疫苗抗原(NS3-NS5B)特異的 可檢測(cè)的T細(xì)胞應(yīng)答。在攻擊后并且響應(yīng)病毒復(fù)制，這些應(yīng)答增加。使用來自對(duì)照黑猩猩 的PBMCs的Elispot測(cè)定法顯示無HCV特異性應(yīng)答(圖11A-11C)。在首次用于實(shí)驗(yàn)的受 感染動(dòng)物的急性期中可檢測(cè)免疫應(yīng)答的這種不存在與其他公開的觀察一致。在2只免疫接 種的動(dòng)物中緊在攻擊后肝內(nèi)IFN-γ mRNA水平增加(圖12A-12C)，如由在第34周(攻擊后 2周)時(shí)，對(duì)于Ch6407和Chieil分別超過基線8和10倍的增加證明的。這些增加指示在 肝中對(duì)病毒復(fù)制的立即免疫應(yīng)答。肝內(nèi)細(xì)胞因子水平在對(duì)照動(dòng)物中僅在攻擊后數(shù)周開始增 力口，并且直至第41周時(shí)才達(dá)到與免疫接種動(dòng)物中的那些可比較的水平。從第O到8周時(shí)使用實(shí)時(shí)PCR測(cè)定法測(cè)量病毒滴度，并且從第O到6周時(shí)測(cè)量血清ALT水平。圖13顯示2只接種疫苗的動(dòng)物在攻擊后都顯示比在對(duì)照黑猩猩中觀察到的 那些明顯更低的病毒滴度。此外，滴度在前5周過程中并不指數(shù)增加(如在對(duì)照黑猩猩中 可見的以及如在所有首次用于實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物中可見的)。事實(shí)上，在2只接種疫苗的動(dòng)物中， 到第5周時(shí)病毒滴度比對(duì)照動(dòng)物低超過41og1(l。2只接種疫苗的動(dòng)物但不是對(duì)照黑猩猩，也 證實(shí)在感染后2周的ALT升高，證實(shí)指示在肝中早期的免疫應(yīng)答的肝內(nèi)細(xì)胞因子數(shù)據(jù)(圖 14)。如預(yù)期的，在對(duì)照動(dòng)物中的ALT水平直至感染晚期時(shí)才增加。在攻擊后預(yù)期所有動(dòng)物 的感染，因?yàn)檫@是T細(xì)胞疫苗，并且不設(shè)計(jì)為誘導(dǎo)中和抗體和消除性免疫。病毒的最初復(fù)制 是刺激先前誘導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答所需的。這個(gè)數(shù)據(jù)表明這種I. V. scLHK-HCV疫苗策略誘導(dǎo)記 憶T細(xì)胞，所述記憶T細(xì)胞在用病毒感染后被回憶，并且這種回憶應(yīng)答在立即控制病毒復(fù)制 方面是有效的。12.在慢性感染的黑猩猩中測(cè)試免疫治療策略構(gòu)建包括HCV NS3、NS5A和NS5B的疫苗，以測(cè)定T細(xì)胞免疫治療疫苗是否可以證 明在慢性HCV感染的黑猩猩中是有效的。裸露DNA引發(fā)(非scL-HK)(i.m.)/重組痘苗病 毒(rVV)加強(qiáng)方案用于處理慢性感染的黑猩猩，所述黑猩猩用NS3、NS5A和NS5B疫苗進(jìn)行 i. m.免疫接種，隨后為rVV加強(qiáng)，所述疫苗遞送與作為佐劑的CpGs組合的3劑量裸露DNA。 接種rVV后，在外周血中針對(duì)NS3、NS5A和NS5B的T細(xì)胞應(yīng)答增加12-20倍(圖15)。然 而，HCV RNA和肝酶水平不受影響；RNA滴度保持在 IO4RNA拷貝/ml，類似于處理前水平。在分析肝內(nèi)IFN-Y和TNF-mRNA后，未注意到這些細(xì)胞因子中任一種的增加，暗示在血液中 增加的T細(xì)胞活性不導(dǎo)致在HCV復(fù)制位點(diǎn)處的增加。無法控制病毒可能已起因于T細(xì)胞無 法在肝中起作用。4只不同的慢性感染的黑猩猩用本發(fā)明的scL-HCV復(fù)合物進(jìn)行i. v.注 射，所述復(fù)合物通過如本文描述的簡(jiǎn)單混合制備，封裝攜帶編碼NS3、NS4B、NS5A和 NS5B的基因，攜帶編碼IL-2的基因的pSCMV質(zhì)粒DNA或空載體。通過簡(jiǎn)單混合以 0. 33ug IOug lug (TfRscFv Lip DNA)的比以 0. 2mg/Kg/注射(基于體重)制備復(fù) 合物。加入5%右旋糖作為賦形劑。在復(fù)合物制備前，對(duì)于HCV IL-2以1 1摩爾比或 對(duì)于空載體IL-2以2. 5 1混合DNAs。3只動(dòng)物用scL/HCV-IL-2進(jìn)行疫苗接種，并且 1只接受攜帶空載體-IL-2的復(fù)合物。每只動(dòng)物接受相隔4-6周的3次注射。在最后一次 疫苗接種后4周用重組腺病毒載體加強(qiáng)。研究涉及使用等摩爾量的表達(dá)HCV抗原和IL-2的重組載體i. v.遞送scL_DNA或 scLHK-DNA接種物。因?yàn)樗斜磉_(dá)的基因在相同主鏈載體中，所以使DNA比基于摩爾量確 保所有表達(dá)的插入片段相等遞送。分開的HC V和IL DNAs以等摩爾比的載體插入片段混 合，并且封裝到scL或scLHK內(nèi)。DNA作為不含內(nèi)毒素的制劑(< 5EU/mg DNA)在GLP條件 下(Aldevr0n，ND)產(chǎn)生。DNA ( 7mg/動(dòng)物/注射)在復(fù)合物中基于黑猩猩重量進(jìn)行施用 (0. 17mg/kg)。這個(gè)劑量大致等價(jià)于施用于60kg人的那種，并且是先前用于疫苗接種首次 用于實(shí)驗(yàn)的黑猩猩的劑量。制備復(fù)合物，凍干且送至動(dòng)物場(chǎng)所用于重構(gòu)和注射。scL-HCV/ IL-2或scLHK-HCV/IL-2在0、4、8和12周時(shí)在3只動(dòng)物中i. v.遞送。使用這個(gè)時(shí)間表，以 便給予免疫系統(tǒng)響應(yīng)接種的時(shí)間。如果在4周后未見對(duì)T細(xì)胞應(yīng)答或RNA滴度的影響，那 么在無另外的接種的情況下將不預(yù)期看見任何新作用。第4只(對(duì)照動(dòng)物)在相同時(shí)間點(diǎn) 時(shí)接受scL或scLHK復(fù)合的空載體和IL-2質(zhì)粒。這區(qū)分這種細(xì)胞因子單獨(dú)對(duì)HCV感染的 作用。如果在4次劑量后未觀察到病毒應(yīng)答，那么如在預(yù)防疫苗研究中使用的，給予用表達(dá) HCV抗原NS3-NS5B的rAcKlO11感染單位)的加強(qiáng)，并且繼續(xù)監(jiān)控免疫應(yīng)答和病毒滴度。嗜 肝病毒載體的使用還達(dá)到靶向肝區(qū)室的目的。C.取樣研究動(dòng)物直至24周。樣品收集在第一次接種前4周開始；這些樣品用作基線和 陰性對(duì)照。取樣持續(xù)直至最后一次接種后8周時(shí)，允許其中測(cè)定處理是否產(chǎn)生陽(yáng)性應(yīng)答的 時(shí)間。研究自始至終，如通過NIRCSOPs限定的，通過Menghini技術(shù)每2周執(zhí)行肝活組織檢 查，并且每周經(jīng)由股靜脈抽血用于在下文詳述的研究中使用。在偶數(shù)周(第-4、-2、0、2周 等)時(shí)獲得40mL全血，并且在奇數(shù)周(-3、-1、1等)時(shí)獲得5mL血漿。為了測(cè)定質(zhì)粒的穩(wěn) 定性，在劑量前以及在第一次接種后15分鐘、1、3、8、24、48和72小時(shí)時(shí)收集ImL血液。抽 取所有其他血液，并且在接種前獲得肝活組織檢查。這個(gè)抽血時(shí)間表基于由NIRC產(chǎn)生的用 于在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中的血液收集的指導(dǎo)。收集90mL/月，完全在可允許的限制內(nèi)。用肝 素作為抗凝劑收集血液。血漿通過在2700rpm下離心10分鐘得自5mL和ImL體積。將血 漿樣品分成500ul等分試樣并且貯存于-80°C。一半肝活組織檢查在福爾馬林中固定，一半 分成2mm切片且在液N2中速凍。D.測(cè)定scL-HCV或scLHK-HCV復(fù)合物在肝中的存在和在血液中的穩(wěn)定性在小鼠中的初步研究表明封裝顯著增加在肝中發(fā)現(xiàn)的核酸量，并且延長(zhǎng)其中它可以在血液中檢測(cè)出的時(shí)間。在黑猩猩中用封裝的HCVNS3-NS5B質(zhì)粒證實(shí)這些發(fā)現(xiàn)。為了測(cè) 定在注射后HCV DNA在循環(huán)中存在多久，在劑量前和第一次注射后15分鐘、1、3、8、24、48和 72小時(shí)收集ImL血液。將血漿分成2個(gè)等分試樣并且在-80°C下冷凍。一個(gè)等分試樣用于 分離質(zhì)粒(High Pure PCR Template Pr印aration試劑盒(Roche))。從一片2mm速凍肝組 織分離DNA (DNeasy ExtractionKit (Qiagen)) 0陰性對(duì)照樣品是來自相同動(dòng)物的在接種前 獲取的血漿和肝組織。通過PCR評(píng)估外源HCV質(zhì)粒。在不存在逆轉(zhuǎn)錄酶的情況下使用PCR 使質(zhì)粒與由于慢性感染存在的任何病毒RNA區(qū)分。此外，使用位于pSCMV主鏈中的一個(gè)引 物和在HCV插入片段中的一個(gè)引物。因此，僅擴(kuò)增外源DNA。這種方法已成功地用于pSCMV 載體中的其他插入片段(IND生物分布研究的p53)。為了定量，通過將已知量的NS3-NS5B 質(zhì)粒加入來自未感染黑猩猩的血漿或肝組織中隨后提取來制備信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)。FDA具有來自 使用的動(dòng)物的大量存檔樣品。掃描的凝膠使用IMAGEQUANT 圖像分析軟件(Molecular Dynamics)進(jìn)行定量，并且通過與標(biāo)準(zhǔn)比較計(jì)算質(zhì)粒的量。從血漿的第二個(gè)等分試樣和第 二片速凍肝組織中分離DNA用于DNA分析，使用Stratagene DNAExtraction試劑盒。在 接種前獲取的血漿和肝組織作為陰性對(duì)照。使用Gene Image Alkaline Phosphatase DNA Labeling and DetectionSystem(Amersham)執(zhí)行雜交。如上，用于通過DNA分析檢測(cè)外源 DNA的探針跨越在載體和插入片段之間的連接處。這種探針由IDT，Inc. (Coralville, ΙΑ) 合成。這種方法也已用于分析在組織中的外源DNA。如上制備標(biāo)準(zhǔn)。隨后通過瓊脂糖凝膠、 印跡和雜交分析樣品。10至50倍過量的探針用于確保所有條帶的飽和。掃描的放射自顯 影照片使用IMAGEQUANT 軟件(Molecular Dynamics)進(jìn)行定量，并且通過與標(biāo)準(zhǔn)比較
計(jì)算質(zhì)粒DNA的量。如果這種非放射性方法的靈敏度水平太低，那么可以使用由Y32P-ATP 標(biāo)記的'5末端或可以如先前所述(Fernandez J.，等人，J. Virol，78，9782-9789 (2004)) 執(zhí)行巢式PCR。使用2種方法評(píng)估在血液和肝中的DNA幫助確保即使一種方法不成功也能 獲得結(jié)果。測(cè)試一式三份地執(zhí)行，并且使用t檢驗(yàn)使來自每只動(dòng)物的順次血漿樣品與在15 分鐘時(shí)觀察到的那種進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較，以評(píng)估隨著時(shí)間過去DNA濃度的顯著減少。未對(duì)肝進(jìn) 行統(tǒng)計(jì)比較，因?yàn)殛P(guān)于這種組織的研究是為了證實(shí)DNA在這種器官中的存在而不是隨著時(shí) 間的穩(wěn)定性。E.在慢性感染的黑猩猩I. V.接種后測(cè)試對(duì)scLHK-HCV復(fù)合物的應(yīng)答1.評(píng)估在外周血中的免疫應(yīng)答在接受治療疫苗的慢性HCV感染的黑猩猩的外周血中增加的特異性T細(xì)胞活性不一定導(dǎo)致在肝中更高的T細(xì)胞活性和減少的病毒滴度。因此，分析在這些動(dòng)物的肝中的T 細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞因子應(yīng)答是關(guān)鍵的。然而，外周血可以用作評(píng)估誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的程度和 特異性的第一個(gè)來源。肝活組織檢查是昂貴且有限的，并且更多T細(xì)胞得自外周血。肝的 研究用于確定在外周血中增加的免疫應(yīng)答是否與在肝中更大的T細(xì)胞活性相關(guān)。如本領(lǐng)域 先前描述的(Puig M.，等人，Vaccine，22，991-1000 (2004))，使用Ficoll梯度離心從每2 周獲得的全血中分離PBMCs。從梯度的頂端取出血漿，并且以ImL和200uL等分試樣貯存 于-80°C。約IO8PBMCs和15mL血漿得自40mL全血。解凍冷凍細(xì)胞(IO7AiL)的單個(gè)等分 試樣，并且在AIM-V培養(yǎng)基(Invitrogen)加上2%人AB血清(Biowhittaker)中洗滌。評(píng) 估活細(xì)胞數(shù)目，并且通過Elispot (Shoukry N. H.，等人 J. Exp. Med.，197，1645-1655 (2003)) 測(cè)試細(xì)胞。用于每種分析的細(xì)胞總數(shù)目依賴于在一次測(cè)定中測(cè)試的抗原數(shù)目。使用整組重疊肽(重疊Ilaa的18聚體，NIHReagent Program)，其覆蓋Ia基因組且與Ia基因組對(duì)應(yīng)。 這些肽與用于感染黑猩猩的病毒以及在scL-HCV或scLHK-HCV中的HCV質(zhì)粒中使用的序列 對(duì)應(yīng)。使用包含30-45個(gè)重疊肽的10個(gè)肽庫(kù)以篩選樣品。在每種測(cè)定法中包括陰性卵白 蛋白肽對(duì)照、陽(yáng)性植物血凝素對(duì)照和培養(yǎng)基對(duì)照。使用IO5細(xì)胞/孔一式三份地測(cè)試樣品。 樣品針對(duì)覆蓋整個(gè)病毒基因組的肽進(jìn)行測(cè)試。盡管預(yù)期疫苗刺激針對(duì)抗原NS3-NS5B的應(yīng) 答，但這種刺激可能導(dǎo)致改善的T輔助應(yīng)答或增加的IL-2生產(chǎn)，這導(dǎo)致針對(duì)在疫苗中不包 括的病毒抗原的增強(qiáng)的應(yīng)答。在96孔板中以1 μ g/ml每種單獨(dú)的肽和人Elispot測(cè)試試 劑盒(U-Cytech, Netherlands) (Shoukry N. H.，等人 J. Exp. Med.，197，1645-1655(2003)) 執(zhí)行PBMCs的預(yù)刺激以及產(chǎn)生IFN y、IL4、IL2和ILlO的細(xì)胞的Elispot分析。通過從一 式三份測(cè)試孔的平均值中扣除一式三份對(duì)照(無抗原)的平均值計(jì)算特異性點(diǎn)形成單位 (SFU)數(shù)目。如本領(lǐng)域先前所述的(Puig M.，等人，Vaccine，22，991-1000 (2004))，使用96 孔板(IO5細(xì)胞/孔，一式三份)對(duì)PBMCs執(zhí)行T細(xì)胞增殖測(cè)定法。用lug/mL蛋白質(zhì)(NS3、 NS5A或NS5B) (Mikrogen, Germany)或肽刺激細(xì)胞。對(duì)于后期研究，使用抗人CD4+或CD8+ 免疫磁珠(Dynal) (Puig M.，等人，Hepatology, 44, 736-745 (2006))從總?cè)后w中耗盡 CD4+ 和CD8+T細(xì)胞，且進(jìn)行測(cè)試以測(cè)定識(shí)別特異性抗原的特定細(xì)胞類型。由這些研究產(chǎn)生的數(shù) 據(jù)給出增強(qiáng)的HCV特異性T細(xì)胞應(yīng)答的最佳指示。對(duì)于每只動(dòng)物在疫苗前和后樣品之間比 較結(jié)果。t檢驗(yàn)用于評(píng)估在疫苗接種后SFU的顯著增加。對(duì)外周血的研究結(jié)果與肝內(nèi)T細(xì) 胞浸潤(rùn)分析、細(xì)胞因子應(yīng)答和病毒RNA水平的改變結(jié)合，以測(cè)定這種治療策略的功效。2.血漿細(xì)胞因子水平的改變的檢測(cè)。在用scL-HCV接種首次用于實(shí)驗(yàn)的黑猩猩后血清細(xì)胞因子的分析顯示在接種疫 苗的動(dòng)物而不是對(duì)照中的大量細(xì)胞因子(ICAM-l、TGF-i3和IFN-β)的改變。在治療疫苗接 種后檢查一組血清細(xì)胞因子的改變，并且與處理前樣品和對(duì)照動(dòng)物比較。使用TransSignal HumanCytokine Antibody Array試劑盒，用在疫苗接種前和后獲取的l_2mL血漿分析細(xì)胞 因子。來自未感染黑猩猩的正常血漿作為陰性對(duì)照。在血清細(xì)胞因子(類型和水平)中可 見的改變與在肝中在mRNA水平下發(fā)現(xiàn)的那些比較。除mRNA的肝內(nèi)分析外，對(duì)血清細(xì)胞因 子執(zhí)行這些研究。定量mRNA分析，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并且提供在肝中的細(xì)胞因子水平的指示。 重要的是使這些分析偶聯(lián)以測(cè)定外周血中的應(yīng)答是否反映在肝中觀察到的那些。細(xì)胞因子 模式中的任何改變與記憶T細(xì)胞的持續(xù)關(guān)聯(lián)。正相關(guān)是關(guān)于發(fā)展測(cè)定與清除相關(guān)的特異性 T細(xì)胞的存在的更簡(jiǎn)化方法的第一個(gè)步驟。3.通過組織學(xué)和細(xì)胞因子分析評(píng)估在肝中的HCV特異性應(yīng)答a)關(guān)于肝浸潤(rùn)T細(xì)胞的存在的測(cè)試。通過組織學(xué)分析和細(xì)胞因子應(yīng)答測(cè)試關(guān)于肝中浸潤(rùn)T細(xì)胞的存在。在接受治療疫 苗的慢性感染黑猩猩的外周血中增加的HCV特異性T細(xì)胞活性不一定導(dǎo)致在肝中更高的T 細(xì)胞活性和減少的病毒滴度。因此，分析在這些動(dòng)物的肝中的T細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞因子應(yīng)答 是關(guān)鍵的。
b)福爾馬林固定的肝組織的分析使福爾馬林固定的石蠟包埋組織切片，就特定蛋白質(zhì)和細(xì)胞標(biāo)記進(jìn)行染色⑶4 ； CD8 ；穿孔素；IFN-γ ；IL-2 ；CD45RA/R0 禾口 CCR-7?；?CD45RA 和 CCR7 的表達(dá)可以鑒定 T 細(xì)胞群體(Campbell J. J.，等人，Journal of Immunology, 166,877-884(2001) ；SallustoF.,等人 Nature，401，708-712 (1999) ；Seder R. Α.禾口 Ahmed R. , Naturelmmunology,4, 835-842(2003))。執(zhí)行肝切片的免疫組織學(xué)分析，以對(duì)于每個(gè)活組織檢查區(qū)分肝中存在的 淋巴細(xì)胞的數(shù)目、類型和定位。使切片在二甲苯中脫蠟，在乙醇中水合，隨后在PBS中洗滌。 對(duì)于抗原檢測(cè)，用IOmM檸檬酸緩沖液pH 6. 0在100°C下處理組織10分鐘。在與特異性抗 體溫育前，在組織切片上的非特異性位點(diǎn)用5%牛奶封閉。在感染前(歷史貯存樣品)和 在處理前得自相同動(dòng)物的肝活組織檢查用于比較。用標(biāo)記的鏈霉親和素_生物素技術(shù)和使 用DAB開發(fā)的產(chǎn)品執(zhí)行這些研究。對(duì)于處理前和后的切片分析6個(gè)視野，并且計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì) 胞類型。用這種染色方法，評(píng)估細(xì)胞在肝內(nèi)相對(duì)于門靜脈的定位或特定肝細(xì)胞類型。使用 t檢驗(yàn)就T細(xì)胞浸潤(rùn)執(zhí)行統(tǒng)計(jì)分析。c)速凍肝組織的分析使用RNeasy Mini Kit (Qiagen，CA)從部分速凍組織中分離總RNA。使用First Strand cDNA Synthesis Kit(Pharmacia)逆轉(zhuǎn)錄 RNA，并且通過實(shí)時(shí) PCR 就細(xì)胞因子 mRNA 水平進(jìn)行測(cè)試，使用針對(duì)IFN- y、IL2、⑶3、⑶8和⑶4的特異性引物探針組，如本領(lǐng)域先前 所述的(Major M.E.，等人H印atology，39，1709-1720 (2004))。這些細(xì)胞因子的水平對(duì)內(nèi) 源對(duì)照(GAPDH)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并且與每只動(dòng)物的處理前活組織檢查中的水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較 (Thimme R.，等人Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 99,15661-15668 (2002))。同時(shí)，小部分冷凍 肝組織用于同時(shí)分析一組36種細(xì)胞因子的蛋白質(zhì)水平，使用TransSignal Human Cytokine Antibody Array kit (Panomics)。F.評(píng)估毒性。研究在慢性感染個(gè)體中的肝相關(guān)治療疫苗的作用是特別重要的。盡管疫苗可以導(dǎo) 致減少的病毒滴度，但由于在肝中增強(qiáng)的免疫應(yīng)答，它可能加重肝炎且導(dǎo)致肝病。來自黑猩 猩的血清和肝組織就肝特異性酶和指示毒性的組織病理學(xué)改變進(jìn)行分析。通過商業(yè)實(shí)驗(yàn) 室(ANTECHDiagnostics)就對(duì)肝功能特異的一組標(biāo)記每周測(cè)試等分試樣(2mL)的血漿總 膽紅素、ALT、堿性磷酸酶(ALP)、血清白蛋白、Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn) 移酶(GST)。在任何接種后這些標(biāo)記水平超過正常范圍的增加持續(xù)<2周視為可接受的。 超過正常范圍的持續(xù)水平指示毒性。因?yàn)檫@是對(duì)肝病特異的少數(shù)測(cè)試之一(Mclntyre， N.禾口 Rosalki, S.Biochemical investigations in the managementof liver disease. In :0xford Textbook of Clinical HepatologyMcIntyre,Benhamou,Bircher,Rizzetto禾口 Rodes (編輯).OxfordUniversity Press, 293-309. (1991))，所以對(duì)于每只動(dòng)物比較處理前 和后的ALT水平以統(tǒng)計(jì)評(píng)估毒性。為了評(píng)估細(xì)胞凋亡，用改良的熒光TUNEL測(cè)定法使組織染色，使用原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒TMR Red(Roche)。這種信號(hào)在遠(yuǎn)紅外范圍中發(fā)出，并且優(yōu)于FITC，因?yàn)樵?肝切片中關(guān)于細(xì)胞凋亡的信號(hào)在氬激光器下為紅細(xì)胞自體熒光。使用Laser Scanning Cytometer(LSC)評(píng)估熒光強(qiáng)度和分布。這是基于載玻片的儀器，其以類似于流式細(xì)胞儀的 方式執(zhí)行，并且檢測(cè)FITC、PE、PI、Cy5和DAPI。最佳化掃描設(shè)置并且應(yīng)用于所有樣品，用相 同方案測(cè)量背景、陰性和陽(yáng)性信號(hào)。作為直方圖顯示的數(shù)據(jù)允許信號(hào)通過Compucyte程序 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和定量評(píng)估組織中陽(yáng)性細(xì)胞凋亡信號(hào)的百分比區(qū)域以及信號(hào)強(qiáng)度。H&E染色的肝切片通過委員會(huì)證明合格的獸醫(yī)病理學(xué)家就組織病理學(xué)改變進(jìn)行評(píng) 估。處理前和后的切片使用用于評(píng)估慢性肝炎的Ishak評(píng)分系統(tǒng)(0-4級(jí))(Ishak K.，等人，Journal of H印atology，22，696-699 (1995))進(jìn)行分級(jí)。這是建立的用于分級(jí)肝活組 織檢查的方法并且在臨床背景中廣泛使用。分級(jí)包括門靜脈、門靜脈周圍和腺泡內(nèi)的炎癥 細(xì)胞浸潤(rùn)以及肝細(xì)胞損傷和壞死的評(píng)估。使用這3種方法分析肝毒性，提供了這種治療疫 苗對(duì)這種器官的作用的完全描述，以評(píng)估未來臨床使用的安全性。G.監(jiān)控病毒滴度的改變。免疫應(yīng)答的初次測(cè)試和scL-HCV或scLHK-HCV治療方法的成功是血液中HCV RNA滴度的改變。這些使用內(nèi)部的、實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定法(Major Μ. Ε.，等人，J. Virol, 73, 3317-3325(1999) ；Major Μ· Ε·，等人，J. Virol, 73, 3317-3325 (1999))進(jìn)行測(cè)定。使用 TriZol(Invitrogen)從來自處理前和后采血的200uL血清分離總RNA，并且如本領(lǐng)域先前 所述(Major Μ. Ε.，等人，J. Virol，73，3317-3325 (1999) ；Fernandez J.，等人，J. Virol，78， 9782-9789(2004))執(zhí)行RT PCR0使RNA分成重復(fù)孔(η = 4)，使用一組HCV RNA標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算 RNA濃度并且表示為RNA拷貝/mL血漿。我們具有在干凈、受控條件下擴(kuò)增HCV序列的廣泛 經(jīng)驗(yàn)(Major Μ. Ε.，等人，J. Virol，73，3317-3325 (1999) ；Fernandez J.，等人，J. Virol，78， 9782-9789(2004))。在分開的房間執(zhí)行操作以避免污染，并且在所有情況下使用指定的移 液管和試劑。在所有提取中，包括來自未感染黑猩猩的陰性對(duì)照血漿，并且在RT-PCR測(cè)定 法中使用提取的RNA。比較處理前和后的RNA滴度，以測(cè)定滴度的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著改變。血漿而 不是肝就病毒RNA滴度進(jìn)行分析。肝活組織檢查是有限的，并且血漿中的滴度直接指示肝 中的水平。僅當(dāng)動(dòng)物顯示病毒的清除時(shí)，通過更靈敏的巢式PCR就病毒RNA測(cè)試肝，所述巢 式PCR檢測(cè)出少至 40 個(gè) RNA拷貝 /mL (Major Μ. Ε.，等人!fepatology，39，1709-1720(2004)， Puig Μ.，等人 J. Virol Methods，105，253-263 (2002))。如果靶向的治療疫苗導(dǎo)致RNA滴度的減少，肝內(nèi)T細(xì)胞、肝內(nèi)細(xì)胞因子和外周HCVT細(xì)胞應(yīng)答的增加，那么這是HCV特異性應(yīng)答在肝中起作用的強(qiáng)烈指示，特別是當(dāng)與對(duì)照動(dòng) 物比較時(shí)。如果肝內(nèi)T細(xì)胞和細(xì)胞因子水平增加但病毒RNA滴度不下降，那么這暗示由于 逃逸突變或T細(xì)胞功能障礙，誘導(dǎo)的T細(xì)胞不識(shí)別病毒表位。RNA滴度暫時(shí)下降隨后復(fù)發(fā)至 處理前水平指示在病毒中的突變發(fā)展，以逃逸新近誘導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答。這通過在復(fù)發(fā)前和 后的病毒序列分析進(jìn)行研究。如果觀察到突變，那么T細(xì)胞逃逸可以在體外使用PBMCs和 肽進(jìn)行測(cè)試，所述肽代表跨越發(fā)現(xiàn)包含突變的區(qū)域的新和舊氨基酸序列。在慢性HCV感染的黑猩猩中的這些研究對(duì)于評(píng)估可以在慢性感染的患者中使用 的任何HCV特異性治療疫苗是關(guān)鍵的。重要的是顯示HCV特異性T細(xì)胞應(yīng)答的增強(qiáng)不使肝 炎癥增加至臨床治療無法耐受的水平。實(shí)施例2免疫脂質(zhì)體的鼻內(nèi)(IN)施用經(jīng)由IN途徑的疫苗施用對(duì)于特定類型的病毒例如具有頭與頸組織(這包括鼻和 咽喉)傾向的那些特別有用。例子包括誘導(dǎo)呼吸疾病的病毒，所述疾病不僅包括流感還包 括SARS和禽流感。然而，這個(gè)途徑也可以用于遞送其他類型的疫苗。為了比較scL復(fù)合物 當(dāng)IN給予時(shí)靶向且轉(zhuǎn)染局部組織的能力，給予非荷瘤BALB/c小鼠封裝表達(dá)螢光素酶基因 的質(zhì)粒DNA的scL納米免疫脂質(zhì)體復(fù)合物(scLLUC)，或等量的游離、未復(fù)合(裸露)質(zhì)粒 DNA(LUC)(對(duì)于2種處理IOug/小鼠/劑量)，或不處理(CTL)。scLLUC復(fù)合物如實(shí)施例1 中通過簡(jiǎn)單混合以0. 33ug IOug lug(TfRscFv Lip DNA)的比制備，用5%右旋糖作為賦形劑。在24小時(shí)內(nèi)施用2個(gè)劑量。最后一次劑量后48小時(shí)，用螢光素底物(ip施用)以 3mg/小鼠注射動(dòng)物，并且使用IVIS 100光學(xué)成像系統(tǒng)(Kenogen，Alameda CA.) 在麻醉下顯現(xiàn)整個(gè)動(dòng)物(圖16A-16C)。表達(dá)的信號(hào)強(qiáng)度在實(shí)際測(cè)量中通過顏色指示。紅 色/黃色具有對(duì)應(yīng)于轉(zhuǎn)染的螢光素酶基因的最高表達(dá)水平的最高強(qiáng)度，同時(shí)藍(lán)色表示最低 限度表達(dá)，而綠色是中等表達(dá)。這些表達(dá)水平(高/中/低)已在圖16A-16C和17A-17C 上指出(代替顏色表示)。在圖16A-16C中顯而易見的是，與游離的裸露DNA(LUC)(小圖 B)比較，scL復(fù)合物(scLLUC)(小圖C)的IN施用導(dǎo)致在鼻區(qū)域中高得多的轉(zhuǎn)染/表達(dá)水 平。小圖A表示未處理對(duì)照。令人驚訝和出乎意料的是，當(dāng)兩者直接施用于待轉(zhuǎn)染的組織 時(shí)(局部遞送)，scL納米免疫脂質(zhì)體復(fù)合物將產(chǎn)生比裸露DNA(這將是目前使用的)好得 多的結(jié)果。A.在IV施用后，與裸露DNA比較，質(zhì)粒DNA有效負(fù)荷的增強(qiáng)的分布和定位的證實(shí)還使用IVIS 100光學(xué)成像系統(tǒng)(Xenogen，Alameda CA)，使非荷瘤BALB/c小鼠成 像，所述小鼠經(jīng)由IV尾部靜脈注射接受封裝表達(dá)螢光素酶基因的質(zhì)粒DNA的SCL納米免疫 脂質(zhì)體復(fù)合物(scLLUC)(如上)，或等量的游離、未復(fù)合(裸露)質(zhì)粒DNA (LUC)(對(duì)于2種 處理25ug/小鼠/劑量)，或未處理(CTL)。在24小時(shí)內(nèi)施用2個(gè)劑量。最后一次劑量后 48小時(shí)，用螢光素底物(ip施用)以 3mg/小鼠注射動(dòng)物，并且在處于麻醉時(shí)顯現(xiàn)整個(gè)動(dòng) 物。如圖17A-17C中所示，在接受裸露DNA的小鼠中(小圖B)任何地方都不存在明顯的信 號(hào)，除在尾部中的注射部位外(LUC)。(在嘴上的小量可能是由于在注射部位處舔而導(dǎo)致)。 相比之下，在攜帶相同量的質(zhì)粒DNA的scL復(fù)合物的iv施用后(scLLUC)(小圖C)，動(dòng)物幾 乎各處都存在中至高水平的信號(hào)。小圖A表示未處理對(duì)照。其中淋巴結(jié)和肝定位的位置更 強(qiáng)烈。這可能是由于樹突細(xì)胞和枯否細(xì)胞的確表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體并且因此可以攝取復(fù)合物 的事實(shí)。然而，在正常非腫瘤組織中的這種高水平攝取和表達(dá)是出乎意料且令人驚訝的。實(shí)施例3使用小鼠模型最佳化scL-HCV或scLHK-HCV對(duì)肝細(xì)胞的體內(nèi)遞送。在小鼠研究中使用由脂質(zhì)A配制的scL或scLHK。20至30微克DNA經(jīng)由脂質(zhì)體復(fù) 合物在脂質(zhì)體復(fù)合物中經(jīng)由尾部靜脈遞送給重復(fù)小鼠，經(jīng)過24小時(shí)時(shí)期使用2-3次接種。 為了跟蹤內(nèi)吞到特定細(xì)胞類型內(nèi)的脂質(zhì)體，用羅丹明-DOPE標(biāo)記的磷脂以總脂質(zhì)的0. 05摩 爾百分比使用(Avanti Polar Lipids，AL)。通過蛋白質(zhì)印跡分析組織樣品，在注射后24-48 小時(shí)通過流式細(xì)胞術(shù)就HCV特異性蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行細(xì)胞的組織學(xué)染色和高分辨率成像。 對(duì)于組織學(xué)分析，組織在Tissue-Tek培養(yǎng)基中進(jìn)行速凍或進(jìn)行福爾馬林固定。使用低溫恒 溫器或切片機(jī)使組織切片，并且就特定蛋白質(zhì)或細(xì)胞標(biāo)記進(jìn)行染色。對(duì)于石蠟包埋的福爾 馬林固定的組織，使切片在二甲苯中脫蠟，并且在用PBS洗滌前在乙醇中水合。對(duì)于抗原檢 測(cè)，用IOmM檸檬酸緩沖液pH 6. 0在微波中在100°C下處理組織10分鐘。在冷卻和洗滌后， 使用0. 3% H2O2達(dá)到內(nèi)源過氧化物酶活性的猝滅。在與特異性抗體溫育前，在組織切片上 的非特異性位點(diǎn)用5%牛奶或正常血清封閉。對(duì)于通過流式細(xì)胞術(shù)的肝細(xì)胞分析，已開發(fā)灌注技術(shù)用于從小鼠中分離總肝臟細(xì) 胞和居住T細(xì)胞，以用于流式細(xì)胞術(shù)分析。操作自始至終小鼠維持在麻醉下，從而使得血壓 最初得以維持。這防止靜脈萎陷并且因此增加后續(xù)套管插入術(shù)的成功。小鼠用異氟烷進(jìn) 行麻醉，并且操作自始至終經(jīng)由鼻錐附著維持麻醉。切開腹腔以暴露肝，并且將腸移位到小鼠的左側(cè)以暴露門靜脈。將24G IV輸注組插入門靜脈內(nèi)。用預(yù)熱的Liver Perfusion Medium(Gibco ；配制用于清洗肝的血液、預(yù)防凝血且起始細(xì)胞與細(xì)胞接觸的松弛的緩沖平 衡鹽溶液)以3ml/分鐘輸注肝5分鐘。隨后灌注預(yù)熱的Liver Digest Medium (Gibco ；用于解離活肝細(xì)胞的合格Collagenase-Dispase培養(yǎng)基)，以3ml/分鐘通過肝，共10-12分 鐘。隨后從小鼠中取出肝，并且置于冰上。通過經(jīng)過100 μ m篩隨后為低速離心來從細(xì)胞碎 片中取出和純化肝細(xì)胞。使用羅丹明標(biāo)記的脂質(zhì)體，細(xì)胞可以通過流式細(xì)胞術(shù)直接進(jìn)行分 析，以測(cè)定脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率或細(xì)胞定位。使用流式細(xì)胞術(shù)使復(fù)合物到肝細(xì)胞 內(nèi)的攝取與經(jīng)由脾細(xì)胞的攝取或非靶向的脂復(fù)合物的攝取比較。通過低速離心使細(xì)胞與脾 細(xì)胞碎片分離。用ACK裂解緩沖液(BiowhittakenMD)使紅細(xì)胞裂解，洗滌后，使細(xì)胞經(jīng)過 IOOym細(xì)胞濾網(wǎng)(Falcon，BD，NJ)。取出另外的組織以分析DNA到其他器官內(nèi)的攝取。具 體地，取出腎、心臟和肺組織，并且通過蛋白質(zhì)印跡分析蛋白質(zhì)提取物。A. scL-HCV或scLHK_HCV針對(duì)體內(nèi)功效的劑量最佳化BALB/c小鼠用于測(cè)定最佳生物劑量(OBD)，以在不存在持續(xù)肝酶升高的情況下達(dá) 到良好免疫應(yīng)答。作為對(duì)照，使用游離(未復(fù)合)質(zhì)粒、攜帶空載體的修飾脂質(zhì)體和缺乏 HCV基因的非重組腺病毒。使用5只動(dòng)物/組。施用的最高劑量是約50 μ g。小鼠組通過 i.v.注射接受包含1、5、10、20和50yg/注射的脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物(如實(shí)施例1中所述制 備)。它們接受在0和4周時(shí)的接種隨后為在10周時(shí)的腺病毒加強(qiáng)。這次加強(qiáng)后4周，通 過流式細(xì)胞術(shù)和體外測(cè)試分析肝和脾，以測(cè)定通過如上所述的免疫接種誘導(dǎo)的T細(xì)胞的特 征和特異性。為了簡(jiǎn)化這個(gè)實(shí)驗(yàn)，對(duì)照動(dòng)物僅接受最高劑量的DNA和腺病毒。動(dòng)物就肝酶 和肝中的組織學(xué)改變進(jìn)行監(jiān)控。一旦已確定OBD后，這個(gè)劑量用于每次注射，同時(shí)注射次數(shù) 以4周間隔從1次到5次變化，隨后為在最后一次注射后6周的腺病毒加強(qiáng)。4周后，如上 分析肝和脾，以測(cè)定導(dǎo)致最佳應(yīng)答的注射次數(shù)。B.誘導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答的交叉反應(yīng)性。盡管在美國(guó)占優(yōu)勢(shì)的HCV基因型是la，但在疫苗開發(fā)中需要解決來自超過1個(gè) HCV基因型的病毒表位識(shí)別。在小鼠中評(píng)估誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的交叉反應(yīng)性，使用與來自基因 型Ib和2a的共有序列對(duì)應(yīng)的重疊肽。與la H77基因組序列對(duì)應(yīng)的整組重疊18肽已由NIH AIDSResearch and Reference Reagent Program 提供。這個(gè) Program 具有可用的與 lb J4 基因型對(duì)應(yīng)的相似重疊肽組。2型肽組購(gòu)自Mimotopes (Washington，NC)。為了更好地評(píng)估 在患者群體中可能發(fā)生的交叉反應(yīng)性，使用上文描述的HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠執(zhí)行這些分析。 這些小鼠表達(dá)HLA-A2MHC分子，并且可以呈遞HLA-A2表位。使用Elispot測(cè)定法評(píng)估針對(duì) 代表不同基因型的肽庫(kù)的應(yīng)答，并且用對(duì)應(yīng)于用于免疫接種的la H77序列的肽平行執(zhí)行。 如果未觀察到交叉反應(yīng)性，那么使用包含與所有3種基因型對(duì)應(yīng)的DNA質(zhì)粒的納米脂復(fù)合 物，隨后為使用各自與3種不同基因型對(duì)應(yīng)的3種rAd的加強(qiáng)測(cè)試三價(jià)疫苗。評(píng)估針對(duì)每 種單獨(dú)的基因型的免疫應(yīng)答，并且與當(dāng)使用單獨(dú)的個(gè)別基因型序列時(shí)獲得的應(yīng)答比較。C.體內(nèi)安全性研究scL-HCV或scLHK_HCV的小鼠LDltl基于如上所述測(cè)定的0BD。由OBD開始，逐漸增 加劑量的質(zhì)粒DNA(直至IOOyg) —周注射一次，共5周。由于復(fù)合物中的組分比已被設(shè)定， 增加質(zhì)粒DNA的量也增加復(fù)合物(如實(shí)施例1中制備)中的TfRscFv和Lip或Lip-HK的 量。scL-HCV 或 scLHK-HCV i. v.、i. p.、i. m.或 i. d.注射到雄性和雌性 4-6 周大的 BALB/C小鼠內(nèi)，10只小鼠/組。動(dòng)物的重量每周評(píng)估2次，并且它們每天就毒性癥狀(例如，消瘦)進(jìn)行監(jiān)控。接受游離質(zhì)粒DNA或無配體脂質(zhì)體-DNA的動(dòng)物用作對(duì)照。為了評(píng)估短期 毒性，一半小鼠在最后一次注射后2天處死。其余在最后一次劑量后2周處死，以評(píng)估長(zhǎng)期 毒性。組織學(xué)檢查各種器官和組織，包括肝、生殖腺、肺、胰腺、腎、心臟、皮膚、脾、腦、腸和骨 髓。肝酶水平也在每周基礎(chǔ)上進(jìn)行監(jiān)控(Antech Diagnostics)。來自器官的組織樣品進(jìn)行 速凍并且貯存于-70°C用于提取DNA。對(duì)所有組織樣品執(zhí)行PCR分析，以在接種后在所有組 織中評(píng)估scLHK-HCV的生物分布和DNA的持續(xù)。對(duì)HCV基因特異的引物是可獲得的。一旦已確定DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物的LDltl，該劑量就與漸增劑量的重組腺病毒組合用 于處理雄性和雌性BALB/c小鼠。每組10只小鼠接受scL-HCV或scLHK-HCV (如實(shí)施例1中 制備)的1或3次i.v.、i.p.、i.m.或i.d.注射/周，共5周，隨后為每周2次皮下(s. c.) 施用漸增劑量的重組腺病毒(IO8至IO9感染單位)，共3周。如上，一半小鼠在最后一次劑 量后2天處死，以評(píng)估短期應(yīng)答，一半在2周后處死，以評(píng)估長(zhǎng)期應(yīng)答。組織學(xué)分析各種器官 和組織，包括生殖腺、肺、胰腺、腎、心臟、皮膚、脾、腦、腸和骨髓，并且特別重點(diǎn)關(guān)注肝組織 學(xué)。在這個(gè)研究過程中每周獲取血液并且評(píng)估肝酶。取出脾并且就T細(xì)胞應(yīng)答進(jìn)行分析， 以評(píng)估任何耐受誘導(dǎo)是否已在這些動(dòng)物中出現(xiàn)。在雄性和雌性裸鼠中執(zhí)行血漿藥代動(dòng)力學(xué)分析和生物分布研究。動(dòng)物以O(shè)BD接受 scL-HCV或scLHK-HCV復(fù)合物(如實(shí)施例1中制備)的一次i. v.、i. p.、i. m.或i. d.注射。 在劑量前以及在復(fù)合物施用后5分鐘、15分鐘、30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、24小 時(shí)、48和72小時(shí)時(shí)，經(jīng)由心臟穿刺在麻醉下在包含肝素鈉作為抗凝劑的管中獲得血樣。對(duì) 小鼠實(shí)施安樂死，并且快速切割肝、胰腺、生殖腺、脾、腎、肺、心臟、淋巴結(jié)和腦，在冰冷的生 理鹽水中漂洗，并且在干冰上速凍。血樣在3000rpm下于4°C離心10分鐘，以使血漿與細(xì)胞 分離。血漿和組織樣品都貯存于-80°C。測(cè)定在血漿和組織樣品中的HCV質(zhì)粒濃度。簡(jiǎn)言之，使用苯酚_氯仿提取法從血漿 樣品中，并且使用DNA提取試劑盒(Stratagene，La Jolla, CA)從組織樣品中分離質(zhì)粒DNA。 通過將已知量的質(zhì)粒加入空白血漿或空白組織樣品中隨后進(jìn)行提取來制備HCV濃度標(biāo)準(zhǔn)。 隨后通過瓊脂糖凝膠、印跡和雜交分析提取物。使用Gene ImageAlkaline Phosphatase DNA Labeling and Detection System(Amersham)執(zhí)行雜交,使用 HCV 序列作為探針。10 至 50
倍過量的探針用于確保所有條帶的飽和。掃描放射自顯影照片并且使用IMAGEQUANT 軟件(Molecular Dynamics)進(jìn)行定量，并且通過與標(biāo)準(zhǔn)比較計(jì)算各種樣品中的質(zhì)粒DNA的 量。備選地，探針用Y32P-ATP進(jìn)行5'末端標(biāo)記或執(zhí)行對(duì)HCV特異的巢式PCR。通過標(biāo)準(zhǔn) 方法(參見例如，Gokhale，P. C，等人，Gene Therapy 4 1289-1299 (1997))評(píng)估血漿藥代動(dòng) 力學(xué)參數(shù)。在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中評(píng)估肝靶向的安全性和功效。在恒河猴中用scL-HCV或scLHK-HCV (如實(shí)施例1中制備)和腺病毒重組體執(zhí)行 劑量應(yīng)答研究。誘導(dǎo)攜帶特異性記憶標(biāo)記的最佳HCV特異性T細(xì)胞的免疫接種系統(tǒng)和劑量 用作猴模型中的起始劑量。用scL-HCV或scLHK-HCV接種恒河猴，并且用s. c.遞送的直至 IO12感染單位的重組腺病毒加強(qiáng)。提議的疫苗接種方案由在0和3個(gè)月時(shí)的DNA引發(fā)和加 強(qiáng)，隨后為在6個(gè)月時(shí)的腺病毒組成。對(duì)照組用與空載體、游離質(zhì)粒DNA復(fù)合的scL-HCV或 scLHK和非重組腺病毒接種。
第一個(gè)研究使用4個(gè)組(3個(gè)疫苗和1個(gè)對(duì)照)，2只動(dòng)物/組。組1-3接受漸增 劑量的納米復(fù)合物scL-HCV或scLHK-HCV，同時(shí)維持由在上文描述的小鼠中的劑量最佳化 研究測(cè)定的水平下的rAd接種。組4是對(duì)照組，接受scL或scLHK-空載體，隨后為用非重 組腺病毒的加強(qiáng)。如果觀察到應(yīng)答中的穩(wěn)定期，那么使用其余4只動(dòng)物以在穩(wěn)定期中間的 scL-HCV或scLHK-HCV劑量執(zhí)行免疫接種研究，并且使rAd劑量增加0. 51og1(1。(2組動(dòng)物， 2只動(dòng)物/組，2個(gè)增加劑量的rAd)。在研究1中來自對(duì)照組的數(shù)據(jù)提供用于這些動(dòng)物的對(duì) 照數(shù)據(jù)。如果未觀察到穩(wěn)定期，并且相對(duì)于劑量擴(kuò)大免疫應(yīng)答增加并且具有最低限度ALT 升高，那么使用增加劑量的scLHK-HCV，在其余4只動(dòng)物中執(zhí)行第二個(gè)研究。在疫苗接種的獼猴中，在外周血和肝中評(píng)估特異性免疫和記憶T細(xì)胞的存在，使 用Elispot、流式細(xì)胞術(shù)和組織學(xué)分析。透皮肝活組織檢查每月執(zhí)行2次；一半組織樣品置 于培養(yǎng)基中，四分之一在液氮中速凍，并且四分之一在甲醛中固定。執(zhí)行肝切片的免疫組織 學(xué)分析，以在每次接種后以2-4周間隔區(qū)分在肝中存在的淋巴細(xì)胞數(shù)目、類型和定位。評(píng)估 ⑶95、⑶45RA/⑶45R0、⑶62L和⑶28的表達(dá)，特別地，這看起來是這個(gè)物種中記憶T細(xì)胞亞 群的鑒定中的有用標(biāo)記。測(cè)定恒河猴的單元型，并且在外周血中使用鑒定的T細(xì)胞表位。制備四聚體，并且 如上所述通過用于小鼠T細(xì)胞分析的流式細(xì)胞術(shù)分析用于顯示記憶T細(xì)胞的特異性。用已 知T細(xì)胞表位和多色流式細(xì)胞術(shù)表型，可以使用極小數(shù)目的細(xì)胞評(píng)估與T細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞 因子和細(xì)胞裂解分子。就ALT升高分析血液，并且針對(duì)凋亡標(biāo)記使組織染色，以測(cè)定肝中的 細(xì)胞是否由于在引發(fā)過程中誘導(dǎo)的對(duì)HCV抗原特異的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的作用而 經(jīng)歷凋亡。E.用脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物處理慢性黑猩猩scL-HCV或scLHK-HCV/腺病毒疫苗在慢性黑猩猩中用作治療疫苗。4只慢性感染 的黑猩猩最初都被與基因型la(H77株系)對(duì)應(yīng)的單個(gè)序列單克隆病毒感染。這些動(dòng)物已 慢性感染3. 5-5年。HCV是RNA病毒，并且因此基因組在復(fù)制過程中經(jīng)歷突變。來自在用 這種相同單克隆儲(chǔ)備物接種后持續(xù)感染的動(dòng)物的病毒在感染約6個(gè)月后積累突變(可能由 于免疫壓力)。已制備了在感染后38周時(shí)從Ch6412分離的病毒的序列數(shù)據(jù)。整個(gè)編碼區(qū) 的分析揭示9個(gè)氨基酸改變，其中6個(gè)位于NS3、NS5A和NS5B區(qū)中。盡管在循環(huán)病毒基因 組中的這些突變，在這些動(dòng)物中在治療疫苗中還是使用野生型序列。使用與許多良好保守 的表位對(duì)應(yīng)的野生型序列在減少病毒滴度方面是有效的。作為第一終末點(diǎn)，在每只動(dòng)物的 血清中評(píng)估病毒RNA滴度的減少，相對(duì)于處理前水平(作為第二終末點(diǎn))。在肝中測(cè)量增 加的T細(xì)胞活性，并且肝內(nèi)的細(xì)胞因子mRNA水平增加。與處理前水平比較，RNA滴度超過
0.51og10的減少和T細(xì)胞數(shù)目或細(xì)胞因子mRNA水平超過2倍的增加視為顯著的。2只動(dòng)物 用治療疫苗接種，并且2只動(dòng)物用載體對(duì)照接種。對(duì)于治療疫苗，scL-HCV或scLHK-HCV(如實(shí)施例1中制備)以O(shè)BD以3周間隔
1.v.遞送3次，或空DNA載體用于對(duì)照動(dòng)物。最后一次DNA接種后4周(第13周)，施用 表達(dá)相同HCV抗原的重組腺病毒(1012感染單位i. v.)或非重組病毒。動(dòng)物將跟蹤直至6 個(gè)月。研究自始至終，每2周獲得活組織檢查，并且每周獲得血液(20-50mL)，就血清ALT升 高、HCV RNA滴度和肝內(nèi)T細(xì)胞浸潤(rùn)監(jiān)控動(dòng)物。使用實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定法測(cè)定HCV RNA滴度， 使用靶向HCV的5' UTR和核心區(qū)的引物和探針。在外周血和肝中檢查增強(qiáng)的特異性免疫和記憶T細(xì)胞的存在，使用Elispot、流式細(xì)胞術(shù)和組織學(xué)分析。通過Klatskin技術(shù)執(zhí)行透 皮肝活組織檢查；一半組織樣品置于培養(yǎng)基中，四分之一在液氮中速凍，并且四分之一在甲 醛中固定。F.新鮮肝組織的分析通過機(jī)械勻漿從肝活組織檢查中分離淋巴細(xì)胞，隨后為洗滌和計(jì)數(shù)。細(xì)胞用 針對(duì) CD4、CD8、CD45RA/CD45R0、CD95、CD62L 和 CD28 的抗體(BD Pharmingen)進(jìn)行染 色，并且通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定數(shù)目。使用FACS-Calibur(Becton Dickenson)使用軟件 Cellquest (BectonDickenson)獲得事件用于分析，使用7AAD (BD Pharmigen)以排除死細(xì) 胞。如對(duì)于小鼠和獼猴研究描述的，四聚物用于研究來自處理的黑猩猩的特異性T細(xì)胞的 功能。在黑猩猩中，MHC單元型稱為Patr (黑猩猩屬(Pan Troglodytes))型。已針對(duì)黑 猩猩并且針對(duì)慢性動(dòng)物鑒定這些Patr等位基因中的數(shù)種，已鑒定了由來自這些動(dòng)物的各 自的T細(xì)胞識(shí)別的Patr等位基因和HCV表位序列。這些動(dòng)物中的循環(huán)病毒在持續(xù)感染過 程中可能在先前鑒定的表位中已摻入突變。在T細(xì)胞表位的詳細(xì)分析后，用T細(xì)胞表位合 成新四聚體用于在流式細(xì)胞術(shù)分析中使用。T細(xì)胞克隆還已在體外開發(fā)用于長(zhǎng)期分析。用 100，000 γ 輻射的 PBMCs、0. 01g/ml 抗 CD3 和 100U/ml IL-2 克隆淋巴細(xì)胞。G.速凍肝組織的分析使用RNeasy Mini Kit (Qiagen，CA)從速凍組織中分離總RNA。使用First Strand cDNA Synthesis Kit(Pharmacia)逆轉(zhuǎn)錄 RNA，并且通過實(shí)時(shí) PCR 就細(xì)胞因子 mRNA 水平進(jìn)行測(cè)試，使用針對(duì)IFN-γ、⑶3、⑶8和⑶4的特異性引物探針組(Perkin-Elmer AppliedBiosystems,CA) 0這些細(xì)胞因子的水平對(duì)內(nèi)源對(duì)照(GAPDH)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并且與每 只動(dòng)物處理前活組織檢查中的水平進(jìn)行比較。細(xì)胞因子mRNA水平超過2倍的增加或減少 視為顯著的。H.福爾馬林固定的組織的分析使用切片機(jī)使福爾馬林固定的組織切片，并且就特定蛋白質(zhì)、細(xì)胞標(biāo)記或凋亡標(biāo) 記進(jìn)行染色，以測(cè)定肝中的細(xì)胞是否由于在疫苗接種過程中誘導(dǎo)的對(duì)HCV抗原特異的CTLs 的作用而經(jīng)歷凋亡。對(duì)肝切片執(zhí)行免疫組織學(xué)分析，以區(qū)分對(duì)于每個(gè)活組織檢查在肝中存 在的淋巴細(xì)胞數(shù)目、類型和定位。使切片在二甲苯中脫蠟，并且在用PBS洗滌前在乙醇中水 合。對(duì)于抗原檢測(cè)，用IOmM檸檬酸緩沖液pH 6. O在微波中在100°C下處理組織10分鐘。 在與特異性抗體溫育前，在組織切片上的非特異性位點(diǎn)用5%牛奶或正常血清封閉。在感染 前(歷史貯存樣品)和在處理前得自相同動(dòng)物的肝活組織檢查用于比較。I.在I期臨床試驗(yàn)的準(zhǔn)備中的正式藥代動(dòng)力學(xué)和毒理學(xué)研究用1個(gè)對(duì)照組(30只小鼠)和2個(gè)處理組(各30只小鼠，一半雄性和一半雌性) 用低(比OBD或LD10低IOx)和高(比OBD或LD10高10倍)劑量的如實(shí)施例1中所述制備 的scL-DNA或scL-HK-DNA復(fù)合物執(zhí)行毒理學(xué)研究。以上文確定的給藥時(shí)間表在第1天時(shí) 開始注射復(fù)合物。在最后一次注射后2天、3周和6周處死來自每個(gè)組的10只小鼠。每天 監(jiān)控體重和食物攝取。評(píng)估關(guān)于對(duì)照和處理組的臨床病理學(xué)(尿血液學(xué)、臨床化學(xué)、特別是 肝酶)和組織病理學(xué)。包括下述器官注射部位、腦、胰腺、腹股溝淋巴結(jié)、骨髓(組織和涂 片)、肝、腎、睪丸/卵巢、脾、肺、心臟。
生物分布研究這個(gè)研究包括在復(fù)合物的單次注射后的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)(2天、2周、4 周和6周)以最高劑量的1個(gè)對(duì)照(10只小鼠)和4個(gè)處理組(各10只小鼠)。在所有組 中對(duì)下述器官執(zhí)行如上通過DNAPCR的分析肝、骨髓、胰腺、腎、脾、注射部位、睪丸/卵巢、 腹股溝淋巴結(jié)、肺、心臟、腦。實(shí)施例4通過經(jīng)由化學(xué)綴合制備的納米免疫脂質(zhì)體在人中誘導(dǎo)針對(duì)病毒抗原的免疫應(yīng)答本發(fā)明還提供了用于在人(以及其他哺乳動(dòng)物和動(dòng)物)中誘導(dǎo)針對(duì)病毒抗原的免 疫應(yīng)答的方法，其包括給個(gè)體施用配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，所述復(fù)合物包含編碼 病毒蛋白質(zhì)和白介素的核酸分子，例如一種或多種質(zhì)粒包含編碼充當(dāng)抗原的病毒蛋白質(zhì)的 基因、編碼一種或多種白介素的基因。包含各種靶向配體的復(fù)合物可以與脂質(zhì)體的表面直 接化學(xué)綴合，并且基本上如上文實(shí)施例1中所述如下制備MPB-脂質(zhì)體通過由 Campbell MJ (Biotechniques 1995 Jun ； 18 (6) 1027-32)描 述的那種改良的乙醇注射法制備。4-(對(duì)馬來酰亞胺基苯基)丁酸鹽-DOPE(MPB-DOPE) (Avanti Polar Lipids)包括在脂質(zhì)體制劑中[脂質(zhì)A(D0TAP DOPE, 1 1摩爾比)； 脂質(zhì)B(DDAB DOPE, 1 1摩爾比)；脂質(zhì)D(D0TAP Choi, 1 1摩爾比)；和脂質(zhì) G(D0TAP DOPE Choi, 1 1 1摩爾比)]，至5-8%摩爾的總脂質(zhì)。簡(jiǎn)言之，使所有脂 質(zhì)溶解于乙醇中并且混合，用Hamilton注射器注50-60°C的渦旋純水內(nèi)。使溶液渦旋另外 10-15分鐘。終濃度是l_2mM總脂質(zhì)。加入IM HEPES, pH7. 5 (pH7. 0-8. 0)至10_20mM的終濃 度。因?yàn)轳R來酰亞胺基團(tuán)在PH>7的水溶液中不穩(wěn)定，所以脂質(zhì)體適當(dāng)?shù)卦谒?pH 5-6. 5) 中制備。在與scFv-SH連接前，pH可以用1MHEPES緩沖液，ρΗ7· 0-8. 0調(diào)整至7. 0-8. 0，以 促進(jìn)后包被反應(yīng)。以約1 1至約1 100、適當(dāng)?shù)丶s1 10至約1 50 (w W)、更適當(dāng)?shù)丶s 1 20至約1 40例如1 30的蛋白質(zhì)/脂質(zhì)比，將ScFv-SH或具有-SH基團(tuán)的任何抗 體或抗體片段(包括Fab ‘或Mab)加入MPB-脂質(zhì)體中。溶液通過輕輕旋轉(zhuǎn)( 20-30RPM) 在室溫下混合30分鐘，以產(chǎn)生scFv-Lip。scFv-Lip無需純化而使用，盡管它也可以通過 SepharoseCL-4B柱層析進(jìn)行純化。為了產(chǎn)生scFv-Lip-DNA復(fù)合物，必要時(shí)將質(zhì)粒DNA稀 釋于水中，并且以約0.5 1至約1 40(yg總核酸yg脂質(zhì))、適當(dāng)?shù)丶s1 5至約 1 20 ( μ g總核酸μ g脂質(zhì))，例如1 10 ( μ g總核酸Pg脂質(zhì))的DNA/脂質(zhì)比加 入scFv-Lip中，并且使混合物倒轉(zhuǎn)5-10秒，或?qū)τ诟篌w積在20-30RPM下旋轉(zhuǎn)1_2分鐘。 最終的混合物在室溫下保持10-15分鐘，在約5分鐘后再次輕輕倒轉(zhuǎn)5-10秒。對(duì)于在體內(nèi) 的使用，加入50%右旋糖或50%蔗糖至5-20% (V V)的終濃度，并且通過輕輕倒轉(zhuǎn)5-10 秒混合，或?qū)τ诟篌w積在20-30RPM下旋轉(zhuǎn)1-2分鐘。scFv-Lip-DNA無需純化而使用，盡 管它也可以通過S印harose CL-4B柱層析進(jìn)行純化。預(yù)期80-100%的scFv(或具有-SH基 團(tuán)的任何抗體)與脂質(zhì)體綴合。在與復(fù)合物結(jié)合/封裝前，使編碼病毒抗原和白介素的質(zhì)?；旌显谝黄?，以0. 1摩 爾編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子比10摩爾編碼一種或多種白介素的 一種或多種核酸分子；至10摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子比0. 1 摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子的插入片段比插入片段摩爾比。例如， 使用1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子的插入片段比1摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子的插入片段的比。如果待針對(duì)其接種疫苗的疾病是HIV，那么使用的質(zhì)粒DNA適當(dāng)?shù)厥前幋a包膜蛋白質(zhì)(Vanniasinkam, Τ.禾口 Ertl, H. C. (2005) :Adenoviral gene delivery for HIV-I vaccination. Current GeneTherapy, 5 :203_212. ；Ferrantelli, F.禾口 Ruprecht, R.Μ. (2002) !Neutralizing antibodies against HIV-back in the majorleagues ？ Current Opinion in Immunology, 14 495-502.)禾口/ 或 Nef 蛋白質(zhì)(Vanniasinkam, Τ.禾口 Ertl, H.C. (2005) :Adenoviral genedelivery for HIV-I vaccination. Current Gene Therapy, 5 203-212. ；Lichterfeld, Μ.，Yu, X. G.，Cohen, D.，Addo, Μ. Μ.，Malenfant, J.， Perkins, B. , Pae, Ε. , Johnston, Μ. N. , Strick, D. , Allen, Τ. Μ. , Rosenberg, Ε. S. , Korber, B. ,Walker,B. D.和Altfeld，M. (2004) =HIV-I Nef is preferentially recognized byCD8 T cells in primary HIV-I infection despite a relatively highdegree of genetic diversity. AIDS, 18 1383-1392.)；禾Π / 或 gpl40(Smith，S. Μ. (2002) :HIV vaccine development in the nonhumanprimate model of AIDS. Journal of Biomedical Science, 9:100-111.)中的一種或多種的一種或多種基因的那種。由這種DNA編碼的一種或多種蛋 白質(zhì)充當(dāng)抗原以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。此外，相同復(fù)合物適當(dāng)?shù)匕|(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含編碼任何 白介素、適當(dāng)?shù)匕捉樗?和/或白介素12和/或白介素15的基因。如果待針對(duì)其接種疫苗的疾病是流感，那么使用的質(zhì)粒DNA適當(dāng)?shù)厥前?石馬血凝素(HA) (Tamura, S.，Tanimoto，T.禾口 Kurata，Τ. (2005) :Mechanisms of broad cross-protection provided byinfluenza virus infection and their application to vaccines. Japanese Journal of Infectious Diseases，58 :195_207· ；Cox, Μ. M. (2005) Cell-based protein vaccines for influenza. CurrentOpinion in Molecular Therapeutics，7 24~29. ；Ze, C，Kurata, T.禾口 Tamura，S. (2000) !identification of effective constituentsof influenza vaccine by immunization with plasmid DNAs encodingviral proteins.Japanese Journal of Infectious Diseases，53 219-228.)、和 / 或神經(jīng)氨酸酶(NA) (Tamura, S.，Tanimoto，Τ.和 Kurata, Τ. (2005) Mechanisms of broad cross-protectionprovided by influenza virus infection and their application tovaccines.Japanese Journal of Infectious Diseases, 58 195-207. ；Cox, Μ. M. (2005) :Cell_based protein vaccines for influenza. Current Opinion in Molecular Therapeutics，7 24~29. ；Ze, C，Kurata, T.禾口 Tamura， S. (2000) !identification of effectiveconstituents of influenza vaccine by immunization with plasmidDNAs encoding viral proteins. Japanese Journal of InfectiousDiseases，53 :219_228.)、和 / 或核衣殼(Cox,Μ. Μ. (2005) :Cell-basedprotein vaccines for influenza. Current Opinion in MolecularTherapeutics，7 :24_29·)禾口 / 或基質(zhì)蛋白 M2 (Cox，M. Μ. (2005) Cell-based protein vaccines for influenza. Current Opinion inMolecular Therapeutics，7 :24_29.)的一種或多種基因的那種。由這種 DNA編 碼的一種或多種蛋白質(zhì)充當(dāng)抗原以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。此外，相同復(fù)合物適當(dāng)?shù)匕|(zhì)粒，所述 質(zhì)粒包含編碼任何白介素、適當(dāng)?shù)匕捉樗?和/或白介素12和/或白介素15的基因。如果待針對(duì)其接種疫苗的疾病是SARS，那么使用的質(zhì)粒DNA適當(dāng)?shù)厥前幋a 剌突糖蛋白、和/或核衣殼和/或結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)Si、和/或結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)M、和/或結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)N(Weiss,S. R.禾口Navas-Martin,S. (2005) Coronavirus pathogenesis and the emerging pathogensevere acute respiratory syndrome coronavirus. Microbiology Molecular Biology Reviews，69 :635-664.)的一種或多種基因的那種。由這種DNA編碼的一種或多 種蛋白質(zhì)充當(dāng)抗原以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。此外，相同復(fù)合物適當(dāng)?shù)匕|(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含編碼 任何白介素、適當(dāng)?shù)匕捉樗?和/或白介素12和/或白介素15的基因。
如果待針對(duì)其接種疫苗的疾病是禽流感(也稱為H5N1)，那么使用的質(zhì)粒DNA 適當(dāng)?shù)厥前幋a血凝素(Wong，S. S.和 Yuen，K. Y. (2006) =Avian influenza virus infections in humans. Chest, 129 156-168. ；Stephenson, I. , Bugarini, R. , Nicholson, K. G. , Podda, A. , Wood, J. Μ. , Zambon, M. C 禾口 Katz, J. M. (2005) :Cross_reactivity to highly pathogenic avian influenza H5Nlviruses after vaccination with nonadjuvanted andMF59_adjuvanted influenza A/Duck/Singapore/97(H5N3)vaccine a potential priming strategy. Journal of Infectious Diseases,191 1210-1215.； Treanor, J. J. , Wilkinson, B. Ε. , Masseoud, F. , Hu-Primmer, J. , Battaglia, R., 0' Brien, D. ，Wolff, M. ，Rabinovich, G. ，Blackwelder, W.禾口 Katz，J. M. (2001) =Safety andimmunogenicity of a recombinant hemagglutinin vaccine for H5influenza in humans. Vaccine, 19 :1732-1737.)的一種或多種基因的那種。由這種DNA編碼的一種或多 種蛋白質(zhì)充當(dāng)抗原以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。此外，相同復(fù)合物適當(dāng)?shù)匕|(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含編碼 任何白介素、適當(dāng)?shù)匕捉樗?和/或白介素12和/或白介素15的基因。如果待針對(duì)其接種疫苗的疾病是埃博拉、馬爾堡、或絲狀病毒科(filoviridae) 中的任何一種，那么使用的質(zhì)粒DNA適當(dāng)?shù)厥前幋aVP24、和/或VP30、和/或VP35、和/ 或 VP40、和 / 或 sGP、和 / 或糖蛋白和 / 或核蛋白質(zhì)(Hart，M. K. (2003) =Vaccine research effortsfor filoviruses. International Journal for Parasitology,33 583-595.； Wilson, J. A. , Bosio, CM.禾口 Hart, M. K. (2001) :Ebola virus :the search for vaccines and treatments. Cellular& Molecular Life Sciences, 58 :1826-1841.)的一種或多種基 因的那種。由這種DNA編碼的一種或多種蛋白質(zhì)充當(dāng)抗原以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。此外，相同復(fù) 合物適當(dāng)?shù)匕|(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含編碼白介素2和/或白介素12和/或白介素15的基 因。如果待針對(duì)其接種疫苗的疾病是乙型肝炎，那么使用的質(zhì)粒DNA適當(dāng)?shù)厥前?編碼乙型肝炎表面抗原(HBsAg) (Hanke，T. (2006) :0n DNA vaccines and prolonged expression of immunogens. European Journal of Immunology, 36 806-809. ；Zuckerman, J. N. (2006) :Vaccination against hepatitis A and B !developments, deployment and delusions. Current Opinion in InfectiousDiseases, 19 456-459.)、禾口 / 或核 衣殼(HBc)(Michel, Μ. L.禾口 Mancini-Bourgine, Μ. (2005) Therapeutic vaccination againstchronic hepatitis B virus infection. Journal of ClinicalVirology,34 Suppl 1 :S108-S114.)的一種或多種基因的那種。由這種DNA編碼的一種或多種蛋白質(zhì)充 當(dāng)抗原以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。此外，相同復(fù)合物適當(dāng)?shù)匕|(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含編碼任何白介 素、適當(dāng)?shù)匕捉樗?和/或白介素12和/或白介素15的基因。如果待針對(duì)其接種疫苗的疾病是西尼羅病毒、登革熱、黃熱病、或黃病毒科 (flaviviridae)中的任何一種，那么使用的質(zhì)粒DNA適當(dāng)?shù)厥前幋aE糖蛋白的一種或多種基因的那種，所述蛋白質(zhì)引發(fā)大多數(shù)病毒中和抗體(參見Sampathkumar，P.，“ West Nile Virus :Epidemiology，Clinical Presentation，Diagnosis and Prevention，" Mayo Clinic Processings 78 1137-1144 (2003) ；King, N.J.C, “ Immunopathology of Flavivirus Infections， Immunology, “ Immunology and Cell Biology 85 33-42(2007))。由這種DNA編碼的一種或多種蛋白質(zhì)充當(dāng)抗原以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。此外，相 同復(fù)合物適當(dāng)?shù)匕|(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含編碼任何白介素、適當(dāng)?shù)匕捉樗?和/或白介素12 和/或白介素15的基因。如上制備的最終復(fù)合物的大小適當(dāng)?shù)卦诩s50-500 (nm)之間，具有正ζ電位，如通過動(dòng)態(tài)光散射使用 Malvern ZETASIZER NANO-ZS 或 Malvern ZETASIZER 3000 測(cè)定 的。這個(gè)大小足夠小以有效經(jīng)過毛細(xì)血管床并且到達(dá)靶APC細(xì)胞。如上制備的復(fù)合物作為預(yù)防或治療疫苗使用。對(duì)于預(yù)防，將如上制備的配體靶向 的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物納米脂復(fù)合物疫苗靜脈內(nèi)注射到哺乳動(dòng)物內(nèi)，例如先前未暴露于病 毒疾病的人。使用復(fù)合物在0、4和8周時(shí)進(jìn)行注射。用于給受試者接種疫苗的復(fù)合物適當(dāng)?shù)?以0. 33ug IOug lug(TfRscFv Lip DNA)的比制備，用5%右旋糖作為賦形劑。復(fù)合 物中的DNA總量為0. 01至10mg/kg/注射。合適量是0. 164mg/kg/注射，這是7_12mg DNA/ 注射(基于受試者的重量)。將制備的復(fù)合物注入250ml 5%右旋糖的袋內(nèi)用于i. v.輸注， 或作為推注注射，通過靜脈內(nèi)(IV)、瘤內(nèi)(IT)、損傷內(nèi)(IL)、氣溶膠、透皮、經(jīng)口、內(nèi)窺鏡、局 部、肌內(nèi)(IM)、皮內(nèi)(ID)、眼內(nèi)(10)、腹膜內(nèi)(IP)、經(jīng)皮(TD)、鼻內(nèi)(IN)、大腦內(nèi)(IC)、器官 內(nèi)(例如，肝內(nèi))、緩慢釋放埋植劑或皮下施用，或經(jīng)由使用滲透或機(jī)械泵的施用。對(duì)于治療用途，將如上制備的配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物納米脂復(fù)合物疫苗 靜脈內(nèi)注射到哺乳動(dòng)物內(nèi)，例如慢性感染病毒疾病(例如，乙型肝炎)的人，或急性暴露于 病毒疾病(例如，埃博拉、SARS、H5N1、天花、西尼羅病毒)的人。包含在與用于預(yù)防用途相 同的范圍中的量的DNA的復(fù)合物在250ml 5%右旋糖溶液中i. v.遞送，或作為推注遞送，在 第0、4和8周時(shí)3次，通過靜脈內(nèi)(IV)、瘤內(nèi)(IT)、損傷內(nèi)(IL)、氣溶膠、透皮、經(jīng)口、內(nèi)窺 鏡、局部、肌內(nèi)(IM)、皮內(nèi)(ID)、眼內(nèi)(10)、腹膜內(nèi)(IP)、經(jīng)皮(TD)、鼻內(nèi)(IN)、大腦內(nèi)(IC)、 器官內(nèi)(例如，肝內(nèi))、緩慢釋放埋植劑或皮下施用，或經(jīng)由使用滲透或機(jī)械泵的施用。實(shí)施例5通過經(jīng)由簡(jiǎn)單混合制備的納米免疫脂質(zhì)體復(fù)合物在人中誘導(dǎo)針對(duì)病毒抗原的免 疫應(yīng)答本發(fā)明還提供了用于在人(以及其他哺乳動(dòng)物和動(dòng)物)中誘導(dǎo)針對(duì)病毒抗原的免 疫應(yīng)答的方法，其包括給個(gè)體施用配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，所述復(fù)合物包含編碼 病毒蛋白質(zhì)和白介素的核酸分子，例如一種或多種質(zhì)粒包含編碼充當(dāng)抗原的病毒蛋白質(zhì)的 基因、編碼一種或多種白介素的基因。包含與脂質(zhì)體的表面直接復(fù)合/結(jié)合但不化學(xué)綴合 的各種靶向性配體的復(fù)合物基本上如上文實(shí)施例1中所述如下制備通過由Campbell MJ (Biotechniques 1995 Jun ;18 (6) :1027_32)描述的那種改 良的乙醇注射法制備脂質(zhì)體[脂質(zhì)A(D0TAP DOPE, 1 1摩爾比)；脂質(zhì)B(DDAB DOPE, 1 1 摩爾比)；月旨質(zhì) D(D0TAP Choi, 1 1 摩爾比)；和月旨質(zhì) G(D0TAP DOPE Chol, 1:1: 1摩爾比)]。簡(jiǎn)言之，使所有脂質(zhì)溶解于乙醇中并且混合，用Hamilton注射器注 入50-60°C的渦旋純水內(nèi)。使溶液進(jìn)一步渦旋10-15分鐘。終濃度是l_2mM總脂質(zhì)。
通過在混合的復(fù)合物中使TfRscFv與脂質(zhì)體組合物A (或任何上文給出的脂質(zhì)體 組合物)以單鏈蛋白質(zhì)比脂質(zhì)體和DNA的限定比混合，制備TfRscFv或任何抗體或抗體片 段(包括任何scFv、Fab'或Mab)_免疫脂質(zhì)體復(fù)合物。復(fù)合物的制備依照下述一般操作 使合適量的2mM脂質(zhì)體(上文描述的A-H)與所需的任何水(例如，DI水)混合，以給出所 需體積，并且輕輕倒轉(zhuǎn)10次以混合，或?qū)τ诟篌w積在20-30RPM下旋轉(zhuǎn)1-2分鐘。向脂質(zhì) 體-水混合物中，加入合適量的TfRscFv，以給出所需比，并且通過輕輕倒轉(zhuǎn)約5-10秒混合 或?qū)τ诟篌w積在20-30RPM下旋轉(zhuǎn)1分鐘。使這種混合物保持在室溫下約10-15分鐘(在 約5分鐘后再次輕輕倒轉(zhuǎn)5-10秒)。同時(shí)，合適量的DNA通過倒轉(zhuǎn)5-10秒或?qū)τ诟篌w積 在20-30RPM下旋轉(zhuǎn)1-2分鐘，與所需的任何水混合以給出所需體積。一般地，對(duì)于體內(nèi)使 用，希望提供約5 ii g至約lOOmg DNA/注射。將DNA溶液快速加入TfRscFv-脂質(zhì)體溶液中， 并且使混合物倒轉(zhuǎn)5-10秒或?qū)τ诟篌w積在20-30RPM下旋轉(zhuǎn)1-2分鐘。使最終的混合物 維持在室溫下10-15分鐘，在約5分鐘后再次輕輕倒轉(zhuǎn)5-10秒。對(duì)于體內(nèi)使用，加入50% 右旋糖或50%蔗糖至5-20% (V V)終濃度，并且通過輕輕倒轉(zhuǎn)5-10秒混合，或?qū)τ诟?體積在20-30RPM下旋轉(zhuǎn)1-2分鐘。使用1 30 (TfRscFv 脂質(zhì)體，w w)和1 14(u g DNA nmole總脂質(zhì))的合適比的具體例子如下。對(duì)于終體積800 yl中的40 y g DNA,使 183 u 1水與280 u 1 2mM脂質(zhì)體溶液混合。加入34 u 1 TfRscFv (具有0. 4 y g/ml的濃度)。 使183 u 1水與40 ill 1 u g/1 u 1 DNA混合。加入80 u 1 50%右旋糖作為最后一個(gè)步驟。根據(jù)先前描述的體內(nèi)配制法來制備Tf-Lip-DNA復(fù)合物。Xu等人，Human Gene Therapy, 10 (18) :2941_52 (1999)。與輻射組合的轉(zhuǎn)鐵蛋白-脂質(zhì)體介導(dǎo)的全身性p53基因 療法導(dǎo)致人頭與頸癌異種移植物的消退。對(duì)于最佳體內(nèi)制劑的一般制備，使25ml Tf(5mg/ ml，鐵飽和的全-轉(zhuǎn)鐵蛋白；Sigma, St. Louis, M0)和50ml Lip(2mM總脂質(zhì))加上75ml 水在聚丙烯管中混合，并且在室溫下保持5-15分鐘，伴隨頻繁搖動(dòng)，或?qū)τ诟篌w積在 20-30RPM下旋轉(zhuǎn)1-2分鐘。將在120ml 20mM HEPES緩沖液，pH 7. 4中的10微克質(zhì)粒DNA 加入管中，通過輕輕倒轉(zhuǎn)10次立即且充分混合，或?qū)τ诟篌w積在20-30RPM下旋轉(zhuǎn)1-2 分鐘，并且在室溫下保持10-20分鐘，伴隨頻繁搖動(dòng)。隨后將30微升50%右旋糖溶液加入 管中，通過輕輕倒轉(zhuǎn)10次立即且充分混合，或?qū)τ诟篌w積在20-30RPM下旋轉(zhuǎn)1-2分鐘， 并且在室溫下保持10-15分鐘。最終DNA 脂質(zhì)Tf 比為1 10 12. 5(mg/nmol/mg)0 HEPES緩沖液可以由水替換。A. Lip-HoKC 的制備當(dāng)在復(fù)合物中包括(K[K(H)KKK]5_K(H)KKC}肽(HoKC)時(shí)，使用如上文所描述的 乙醇注射法制備陽(yáng)離子脂質(zhì)體制劑A(以1 1摩爾比的D0TAP D0PE)、B(以1 1 的 DDAB DOPE)、G (以 1 1 1 的 D0TAP DOPE 膽固醇)禾口 H (以 1 1 1 的 DDAB DOPE 膽固醇)(或上文給出的任何脂質(zhì)體制劑)。每種脂質(zhì)體制劑還包括總脂質(zhì) 5摩爾百分比的MPB-D0PE。因?yàn)镠oKC肽攜帶末端半胱氨酸，所以MPB-D0PE包括在所有脂 質(zhì)體組合物中，以允許肽與脂質(zhì)體綴合。Lip-HoKC脂質(zhì)體如下使用攜帶馬來酰亞胺基團(tuán)的 陽(yáng)離子脂質(zhì)體(Lip-MPB)和肽之間的偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行制備。將在半胱氨酸上具有游離巰基的 0. lmmol肽等分試樣加入溶于10mM HEPES, pH 7. 4溶液中的2mmol Lip-MPB，并且在室溫下 旋轉(zhuǎn)(20-30r. p. m.) 2小時(shí)。所得到的Lip-HoKC具有1. 4mM的脂質(zhì)濃度。當(dāng)脂質(zhì)體包含HoKC時(shí)，完全復(fù)合物以與用于產(chǎn)生不含HoKC的TfRscFv-Lip-DNACN 101801344 A
說明書
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復(fù)合物的那種等同的方式形成。此處，同樣以特定比使TfRscFv或任何抗體或抗體片段 (包括Fab ‘或Mab)與Lip-HoKC混合(通過輕輕倒轉(zhuǎn)10次或?qū)τ诟篌w積在20-30RPM 下旋轉(zhuǎn)1-2分鐘)，并且在室溫下溫育10-15分鐘。隨后將DNA加入TfRscFv-Lip-HoKC溶 液中，通過輕輕倒轉(zhuǎn)10次混合或?qū)τ诟篌w積在20-30RPM下旋轉(zhuǎn)1-2分鐘，并且再次在室 溫下溫育10-15分鐘，這之后加入右旋糖或蔗糖至5-20%的終濃度，通過輕輕倒轉(zhuǎn)10次混 合或?qū)τ诟篌w積在20-30RPM下旋轉(zhuǎn)1分鐘，并且在室溫下溫育10-15分鐘。在復(fù)合物中 TfRscFv LipA-HoKC DNA 的比為 0.3mg 7nmol lmg。在復(fù)合物中封裝之前，使編碼病毒抗原和白介素的質(zhì)?；旌显谝黄?，以0. 1摩爾 編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子比10摩爾編碼一種或多種白介素的一 種或多種核酸分子；至10摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子比0. 1摩 爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子的插入片段比插入片段摩爾比。例如，使 用1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子的插入片段比1摩爾編碼一種 或多種白介素的一種或多種核酸分子的插入片段的比。如果待針對(duì)其接種疫苗的疾病是HIV，那么使用的質(zhì)粒DNA適當(dāng)?shù)厥前幋a 包膜蛋白質(zhì)(Vanniasinkam, T.禾口 Ertl, H. C. (2005) :Adenoviral gene delivery for HIV-1 vaccination. Current GeneTherapy, 5 :203_212. ；Ferrantelli, F.禾口 Ruprecht, R.M. (2002) :Neutralizing antibodies against HIV-back in the majorleagues ？ Current Opinion in Immunology, 14 495-502.)禾口 / 或 Nef 蛋白質(zhì)(Vanniasinkam, T.禾口 Ertl, H. C. (2005) :Adenoviral genedelivery for HIV-1 vaccination. Current Gene Therapy, 5 203-212. ；Lichterfeld, M.，Yu, X. G.，Cohen, D.，Addo, M. M.，Mai enfant, J.， Perkins, B. , Pae, E. , Johnston, M. N. , Strick, D. , Allen, T. M. , Rosenberg, E. S. , Korber, B. ,Walker,B. D.和Altfeld，M. (2004) :HIV_1 Nef is preferentially recognized byCD8 T cells in primary HIV-1 infection despite a relatively highdegree of genetic diversity. AIDS，18 :1383-1392.)；和 / 或 gpl40(Smith, S. M. (2002) :HIV vaccine development in the nonhumanprimate model of AIDS. Journal of Biomedical Science, 9:100-111.)中的一種或多種的一種或多種基因的那種。由這種DNA編碼的一種或多種蛋 白質(zhì)充當(dāng)抗原以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。此外，相同復(fù)合物適當(dāng)?shù)匕|(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含編碼任何 白介素、適當(dāng)?shù)匕捉樗?和/或白介素12和/或白介素15的基因。如果待針對(duì)其接種疫苗的疾病是流感，那么使用的質(zhì)粒DNA適當(dāng)?shù)厥前幨R血凝素(HA) (Tamura，S.，Tanimoto，T.禾口 Kurata，T. (2005) :Mechanisms of broad cross-protection provided byinfluenza virus infection and their application to vaccines. Japanese Journal of Infectious Diseases，58 :195-207. ；Cox, M. M. (2005) Cell-based protein vaccines for influenza. CurrentOpinion in Molecular Therapeutics，7 24~29. ；Ze，C，Kurata, T.禾口 Tamura，S. (2000) Identification of effective constituentsof influenza vaccine by immunization with plasmid DNAs encodingviral proteins. Japanese Journal of Infectious Diseases，53 219-228.)、和 / 或神經(jīng)氨酸酶(NA) (Tamura, S.，Tanimoto，T.和 Kurata, T. (2005) Mechanisms of broad cross-protectionprovided by influenza virus infection and their application tovaccines. Japanese Journal of Infectious Diseases,
5858 195-207. ；Cox, M. M. (2005) :Cell_based protein vaccines for influenza. Current Opinion in Molecular Therapeutics, 7 24~29. ；Ze, C, Kurata, T.禾口 Tamura, S. (2000) -Identification of effectiveconstituents of influenza vaccine by immunization with plasmidDNAs encoding viral proteins.Japanese Journal of InfectiousDiseases,53 :219_228.)、和 / 或核衣殼(Cox，M.M. (2005) :Cell_basedprotein vaccines for influenza. Current Opinion in MolecularTherapeutics, 7 24~29.)禾口 / 或基質(zhì)蛋白 M2 (Cox,M. M. (2005) :Cell_based protein vaccines for influenza. Current Opinion inMolecular Therapeutics, 7 24~29.)白勺—禾中$$禾中白勺iP禾中。fig禾中 DNAH 碼的一種或多種蛋白質(zhì)充當(dāng)抗原以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。此外，相同復(fù)合物適當(dāng)?shù)匕|(zhì)粒，所述 質(zhì)粒包含編碼任何白介素、適當(dāng)?shù)匕捉樗?和/或白介素12和/或白介素15的基因。如果待針對(duì)其接種疫苗的疾病是SARS，那么使用的質(zhì)粒DNA適當(dāng)?shù)厥前幋a 刺突糖蛋白、和/或核衣殼和/或結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)S1、和/或結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)M、和/或結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì) N(Weiss,S. R.禾口Navas-Martin,S. (2005) :Coronavirus pathogenesis and the emerging pathogensevere acute respiratory syndrome coronavirus. Microbiology Molecular Biology Reviews，69 :635-664.)的一種或多種基因的那種。由這種DNA編碼的一種或多 種蛋白質(zhì)充當(dāng)抗原以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。此外，相同復(fù)合物適當(dāng)?shù)匕|(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含編碼 任何白介素、適當(dāng)?shù)匕捉樗?和/或白介素12和/或白介素15的基因。如果待針對(duì)其接種疫苗的疾病是禽流感(也稱為H5N1)，那么使用的質(zhì)粒DNA 適當(dāng)?shù)厥前幋a血凝素(Wong，S.S.和 Yuen，K. Y. (2006) :Avian influenza virus infections in humans. Chest, 129 :156_168. ；Stephenson, I. , Bugarini, R. , Nicholson, K. G. , Podda, A. , Wood, J. M. , Zambon, M. C 禾口 Katz, J. M. (2005) :Cross_reactivity to highly pathogenic avian influenza H5Nlviruses after vaccination with nonadjuvanted andMF59_adjuvanted influenza A/Duck/Singapore/97(H5N3)vaccine a potential priming strategy. Journal of Infectious Diseases,191 1210-1215.； Treanor, J. J. , Wilkinson, B. E. , Masseoud, F. , Hu—Primmer, J. , Battaglia, R., 0' Brien, D. ，Wolff, M. ，Rabinovich, G. ，Blackwelder, ff.禾口 Katz，J. M. (2001) Safety andimmunogenicity of arecombinant hemagglutinin vaccine for H5influenza in humans. Vaccine, 19 :1732_1737.)的一種或多種基因的那種。由這種DNA編碼的一種或多 種蛋白質(zhì)充當(dāng)抗原以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。此外，相同復(fù)合物適當(dāng)?shù)匕|(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含編碼 任何白介素、適當(dāng)?shù)匕捉樗?和/或白介素12和/或白介素15的基因。如果待針對(duì)其接種疫苗的疾病是埃博拉、馬爾堡、或絲狀病毒科中的任何一種，那 么使用的質(zhì)粒DNA適當(dāng)?shù)厥前幋aVP24、和/或VP30、和/或VP35、和/或VP40、和/或 sGP、和 / 或糖蛋白和 / 或核蛋白質(zhì)(Hart, M. K. (2003) :Vaccine research efforts for filoviruses. International Journal for Parasitology,33 583-595. ；Wilson, J. A., Bosio,CM.禾口Hart,M.K. (2001) :Ebola virus :the searchfor vaccines and treatments. Cellular & Molecular LifeSciences，58 :1826-1841.)的一種或多種基因的那種。由這 種DNA編碼的一種或多種蛋白質(zhì)充當(dāng)抗原以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。此外，相同復(fù)合物適當(dāng)?shù)匕?質(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含編碼任何白介素、適當(dāng)?shù)匕捉樗?和/或白介素12和/或白介素15的 基因。
如果待針對(duì)其接種疫苗的疾病是乙型肝炎，那么使用的質(zhì)粒DNA適當(dāng)?shù)厥前?編碼乙型肝炎表面抗原(HBsAg) (Hanke，T. (2006) :0n DNA vaccines and prolonged expression of immunogens. European Journal of Immunology, 36 806-809. ；Zuckerman, J. N. (2006) Vaccination against hepatitis A and B !developments, deployment and delusions. Current Opinion in InfectiousDiseases, 19 456-459.)、禾口 / 或核 衣殼(HBc)(Michel, Μ. L.禾口 Mancini-Bourgine, Μ. (2005) :Therapeutic vaccination againstchronic hepatitis Bvirus infection. Journal of Cl inicalVirology,34 Suppll :S108-S114.)的一種或多種基因的那種。由這種DNA編碼的一種或多種蛋白質(zhì)充當(dāng) 抗原以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。此外，相同復(fù)合物適當(dāng)?shù)匕|(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含編碼任何白介素、 適當(dāng)?shù)匕捉樗?和/或白介素12和/或白介素15的基因。如果待針對(duì)其接種疫苗的疾病是西尼羅病毒、登革熱、黃熱病、或黃病毒科中 的任何一種，那么使用的質(zhì)粒DNA適當(dāng)?shù)厥前幋aE糖蛋白的一種或多種基因的 那種，所述蛋白質(zhì)引發(fā)大多數(shù)病毒中和抗體(參見Sampathkumar，P.，“ West Nile Virus :Epidemiology, Clinical Presentation, Diagnosis and Prevention, " Mayo ClinicProcessin gs 78 1137-1144(2003) ；King, N. J. C, “ Immunopa thologyof Flavivirus Infections, Immunology, " Immunology and CellBiology 85 33-42(2007))。由這種DNA編碼的一種或多種蛋白質(zhì)充當(dāng)抗原以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。此外，相 同復(fù)合物適當(dāng)?shù)匕|(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含編碼任何白介素、適當(dāng)?shù)匕捉樗?和/或白介素12 和/或白介素15的基因。通過這些方法制備的最終復(fù)合物的大小在約50-400 (nm)之間，具有正ζ電位，如 通過動(dòng)態(tài)光散射使用 Malvern ZETASIZER 3000 或 Malvern ZETASIZER NANO-ZS 測(cè) 定的。這個(gè)大小足夠小以有效經(jīng)過毛細(xì)血管床并且到達(dá)靶APC細(xì)胞。如上制備的復(fù)合物適當(dāng)?shù)刈鳛轭A(yù)防或治療疫苗使用。對(duì)于預(yù)防，將如上制備的配 體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物納米脂復(fù)合物疫苗靜脈內(nèi)注射到哺乳動(dòng)物內(nèi)，例如先前未暴 露于病毒疾病的人。使用復(fù)合物在0、4和8周時(shí)進(jìn)行靜脈內(nèi)注射。用于給受試者接種疫苗 的復(fù)合物適當(dāng)?shù)匾? 10 12. 5(mg/nmol/mg) (DNA 脂質(zhì)Tf)的比制備，用5-210%右 旋糖或蔗糖作為賦形劑；當(dāng)HoKC不是復(fù)合物的組分時(shí)，0.33ug IOug lug(TfRscFv LipDNA)，用5-20%右旋糖或蔗糖作為賦形劑；并且當(dāng)復(fù)合物包含HoKC時(shí)，以0.3mg 7nmol Img(TfRscFv Lip-HoKC DNA)的比，用5%右旋糖或蔗糖。復(fù)合物中的DNA總量為0. 01 至10mg/kg/注射。合適量是0. 164mg/kg/注射，這是7_12mgDNA/注射(基于受試者的重 量)。將制備的復(fù)合物注入250ml 5%右旋糖的袋內(nèi)用于i. v.輸注，或作為推注i. v.注射， 通過靜脈內(nèi)(IV)、瘤內(nèi)(IT)、損傷內(nèi)(IL)、氣溶膠、透皮、經(jīng)口、內(nèi)窺鏡、局部、肌內(nèi)(IM)、皮 內(nèi)(ID)、眼內(nèi)(10)、腹膜內(nèi)(IP)、經(jīng)皮(TD)、鼻內(nèi)(IN)、大腦內(nèi)(IC)、器官內(nèi)(例如，肝內(nèi)) 注射、緩慢釋放埋植劑或皮下施用，或經(jīng)由使用滲透或機(jī)械泵的施用。對(duì)于治療用途，將如上制備的配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物納米脂復(fù)合物疫苗 注射到哺乳動(dòng)物內(nèi)，例如慢性感染病毒疾病(例如，乙型肝炎)的人，或急性暴露于病毒疾 病(例如，埃博拉、SARS、H5N1、天花、西尼羅病毒)的人。包含在與用于預(yù)防用途相同的范 圍中的量的DNA的復(fù)合物在250ml 5%右旋糖溶液中i. v.遞送，或作為推注遞送，在第0、 4和8周時(shí)3次，通過靜脈內(nèi)(IV)、瘤內(nèi)(IT)、損傷內(nèi)(IL)、氣溶膠、透皮、經(jīng)口、內(nèi)窺鏡、局部、肌內(nèi)(IM)、皮內(nèi)(ID)、眼內(nèi)(10)、腹膜內(nèi)(IP)、經(jīng)皮(TD)、鼻內(nèi)(IN)、大腦內(nèi)(IC)、器官 內(nèi)(例如，肝內(nèi))、緩慢釋放埋植劑或皮下施用，或經(jīng)由使用滲透或機(jī)械泵的施用。實(shí)施例6通過經(jīng)由化學(xué)綴合制備的2種納米免疫脂質(zhì)體復(fù)合物的共注射在人中誘導(dǎo)針對(duì) 病毒抗原的免疫應(yīng)答本發(fā)明還提供了用于在人(以及其他哺乳動(dòng)物和動(dòng)物)中誘導(dǎo)針對(duì)病毒抗原的免 疫應(yīng)答的方法，其包括給個(gè)體施用配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，所述復(fù)合物包含編碼 病毒蛋白質(zhì)和白介素的核酸分子，例如一種或多種質(zhì)粒包含編碼充當(dāng)抗原的病毒蛋白質(zhì)的 基因、編碼一種或多種白介素的基因。包含與脂質(zhì)體的表面直接化學(xué)綴合的各種靶向性配 體的復(fù)合物如上文實(shí)施例4中所述制備。攜帶編碼充當(dāng)抗原的病毒蛋白質(zhì)的一種或多種基因的一種或多種質(zhì)粒DNA與實(shí) 施例4中描述的那種等同。使用與對(duì)于攜帶編碼病毒蛋白質(zhì)的一種或多種基因的一種或多 種質(zhì)粒DNA使用的等同的操作和比，制備含有包含編碼例如白介素2、白介素12和/或白介 素15的基因的質(zhì)粒DNA的分開的配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物。如上制備的最終復(fù)合物的大小在約50-500 (nm)之間，具有正ζ電位，如通過動(dòng)態(tài) 光散射使用 Malvern ZETASIZER 3000 或 Malvern ZETASIZER NANO-ZS 測(cè)定的。這 個(gè)大小足夠小以有效經(jīng)過毛細(xì)血管床并且到達(dá)靶APC細(xì)胞。如上制備的復(fù)合物作為預(yù)防或治療疫苗使用。對(duì)于作為疫苗的用途，以反映每種 復(fù)合物中的質(zhì)粒DNA插入片段摩爾比的復(fù)合物復(fù)合物比，使2種復(fù)合物混合在一起。因 此，2種復(fù)合物的比是包含0. 1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子的 復(fù)合物量比包含10摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子的復(fù)合物量；至包 含10摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子的復(fù)合物量比包含0. 1摩爾 編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子的復(fù)合物量。例如，使用包含1摩爾編碼一 種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子的復(fù)合物量比包含1摩爾編碼一種或多種白 介素的一種或多種核酸分子的復(fù)合物量的比。將包含編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種 或多種質(zhì)粒DNA的復(fù)合物加入包含編碼一種或多種白介素的一種或多種質(zhì)粒DNA的復(fù)合物 中，并且使溶液輕輕倒轉(zhuǎn)10次或在20-30RPM下旋轉(zhuǎn)1分鐘，以形成用于在人受試者中使用 的最終疫苗。對(duì)于預(yù)防，將如上制備的配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物納米脂復(fù)合物疫苗靜脈 內(nèi)注射到哺乳動(dòng)物內(nèi)，例如先前未暴露于病毒疾病的人。使用復(fù)合物在0、4和8周時(shí)進(jìn)行 注射。用于形成給受試者施用的疫苗的每種復(fù)合物(包含一種或多種病毒基因的那種和包 含一種或多種白介素基因的那種)適當(dāng)?shù)匾?. 33ug IOug lug(TfRscFv Lip DNA) 的比制備，用5%右旋糖作為賦形劑。疫苗中的DNA總量為0.01至10mg/kg/注射。合適量 是0. 164mg/kg/注射，這是7-12mg DNA/注射(基于受試者的重量)。將制備的復(fù)合物注 入250ml 5%右旋糖的袋內(nèi)用于i. v.輸注，或作為推注i. v.注射，通過靜脈內(nèi)(IV)、瘤內(nèi) (IT)、損傷內(nèi)(IL)、氣溶膠、透皮、經(jīng)口、內(nèi)窺鏡、局部、肌內(nèi)(IM)、皮內(nèi)(ID)、眼內(nèi)(10)、腹膜 內(nèi)(IP)、經(jīng)皮(TD)、鼻內(nèi)(IN)、大腦內(nèi)(IC)、器官內(nèi)(例如，肝內(nèi))、緩慢釋放埋植劑或皮下 施用，或經(jīng)由使用滲透或機(jī)械泵的施用。對(duì)于治療用途，將如上制備的配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物納米脂復(fù)合物疫苗注射到哺乳動(dòng)物內(nèi)，例如慢性感染病毒疾病(例如，乙型肝炎)的人，或急性暴露于病毒疾 病(例如，埃博拉、SARS、H5N1、天花、西尼羅病毒)的人。制備的包含在與用于預(yù)防用途相 同的范圍中的量的DNA的復(fù)合物在250ml 5%右旋糖溶液中i. v.遞送，或作為推注遞送，在 第0、4和8周時(shí)3次，通過靜脈內(nèi)(IV)、瘤內(nèi)(IT)、損傷內(nèi)(IL)、氣溶膠、透皮 、經(jīng)口、內(nèi)窺 鏡、局部、肌內(nèi)(IM)、皮內(nèi)(ID)、眼內(nèi)(10)、腹膜內(nèi)(IP)、經(jīng)皮(TD)、鼻內(nèi)(IN)、大腦內(nèi)(IC)、 器官內(nèi)(例如，肝內(nèi))、緩慢釋放埋植劑或皮下施用，或經(jīng)由使用滲透或機(jī)械泵的施用。實(shí)施例7通過經(jīng)由簡(jiǎn)單混合制備的2種納米免疫脂質(zhì)體復(fù)合物的共注射在人中誘導(dǎo)針對(duì) 病毒抗原的免疫應(yīng)答本發(fā)明還提供了用于在人中誘導(dǎo)針對(duì)病毒抗原的免疫應(yīng)答的方法，其包括給個(gè)體 同時(shí)施用配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，所述復(fù)合物包含編碼病毒蛋白質(zhì)和白介素的核 酸分子，例如一種或多種質(zhì)粒包含編碼充當(dāng)抗原的病毒蛋白質(zhì)的基因、編碼一種或多種白 介素的基因。包含與脂質(zhì)體的表面直接復(fù)合但不化學(xué)綴合的各種配體的復(fù)合物(含或不含 HoKC肽)如上文實(shí)施例5中所述制備。攜帶編碼充當(dāng)抗原的病毒蛋白質(zhì)的一種或多種基因 的一種或多種質(zhì)粒DNA與實(shí)施例5中描述的那種等同。使用與對(duì)于攜帶編碼病毒蛋白質(zhì)的 一種或多種基因的一種或多種質(zhì)粒DNA使用的等同的操作和比，制備包含含有編碼任何白 介素例如白介素2、白介素12和/或白介素15的基因的質(zhì)粒DNA的分開的配體靶向的陽(yáng)離 子脂質(zhì)體復(fù)合物。如上制備的最終復(fù)合物的大小在約50-400 (nm)之間，具有正ζ電位，如通過動(dòng)態(tài) 光散射使用 Malvern ZETASIZER 3000 或 Malvern ZETASIZER NANO-ZS 測(cè)定的。這 個(gè)大小足夠小以有效經(jīng)過毛細(xì)血管床并且到達(dá)靶APC細(xì)胞。對(duì)于作為疫苗的用途，以反映每種復(fù)合物中的質(zhì)粒DNA插入片段摩爾比的復(fù)合 物復(fù)合物比，使2種復(fù)合物混合在一起。因此，2種復(fù)合物的比是包含0. 1摩爾編碼一種 或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子的復(fù)合物量比包含10摩爾編碼一種或多種白介 素的一種或多種核酸分子的復(fù)合物量；至包含10摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種 或多種核酸分子的復(fù)合物量比包含0. 1摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分 子的復(fù)合物量。例如，使用包含1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子 的復(fù)合物量比包含1摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子的復(fù)合物量的比。 將包含編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種質(zhì)粒DNA的復(fù)合物加入包含編碼一種或 多種白介素的一種或多種質(zhì)粒DNA的復(fù)合物中，并且使溶液輕輕倒轉(zhuǎn)10次或在20-30RPM 下旋轉(zhuǎn)1分鐘，以形成用于在人受試者中使用的最終疫苗。如上制備的復(fù)合物作為預(yù)防或治療疫苗使用。對(duì)于預(yù)防，將如上制備的配體靶向 的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物納米脂復(fù)合物疫苗注射到哺乳動(dòng)物內(nèi)，例如先前未暴露于病毒疾病 的人。使用復(fù)合物在0、4和8周時(shí)進(jìn)行靜脈內(nèi)注射。用于給受試者接種疫苗的復(fù)合物適當(dāng) 地以1 10 12. 5(mg/nmol/mg) (DNA 脂質(zhì)Tf)的比制備，用5-20%右旋糖或蔗糖作 為賦形劑；當(dāng)HoKC不是復(fù)合物的組分時(shí)，0. 33ug IOug lug (TfRscFv Lip DNA)，用 5-20%右旋糖或蔗糖作為賦形劑；和當(dāng)復(fù)合物包含HoKC時(shí)，以0.3mg 7nmol Img(TfRscF ν Lip-HoKC DNA)的比，用5%右旋糖或蔗糖。復(fù)合物中的DNA總量為0. 01至10mg/kg/ 注射。合適量是0. 164mg/kg/注射，這是7-12mg DNA/注射(基于受試者的重量)。將制備的復(fù)合物注入250ml 5%右旋糖的袋內(nèi)用于i. v.輸注，或作為推注i. v.注射，通過靜脈內(nèi) (IV)、瘤內(nèi)(IT)、損傷內(nèi)(IL)、氣溶膠、透皮、經(jīng)口、內(nèi)窺鏡、局部、肌內(nèi)(IM)、皮內(nèi)(ID)、眼內(nèi) (10)、腹膜內(nèi)(IP)、經(jīng)皮(TD)、鼻內(nèi)(IN)、大腦內(nèi)(IC)、器官內(nèi)(例如，肝內(nèi))、緩慢釋放埋植 劑或皮下施用，或經(jīng)由使用滲透或機(jī)械泵的施用。對(duì)于治療用途，將如上制備的配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物納米脂復(fù)合物疫苗注射到哺乳動(dòng)物內(nèi)，例如慢性感染病毒疾病(例如，乙型肝炎)的人，或急性暴露于病毒疾 病(例如，埃博拉、SARS、H5N1、天花、西尼羅病毒)的人。包含在與用于預(yù)防用途相同的范 圍中的量的DNA的復(fù)合物在250ml 5%右旋糖溶液中i. v.遞送，或作為推注遞送，在第0、 4和8周時(shí)3次，通過靜脈內(nèi)(IV)、瘤內(nèi)(IT)、損傷內(nèi)(IL)、氣溶膠、透皮、經(jīng)口、內(nèi)窺鏡、局 部、肌內(nèi)(IM)、皮內(nèi)(ID)、眼內(nèi)(10)、腹膜內(nèi)(IP)、經(jīng)皮(TD)、鼻內(nèi)(IN)、大腦內(nèi)(IC)、器官 內(nèi)(例如，肝內(nèi))、緩慢釋放埋植劑或皮下施用，或經(jīng)由使用滲透或機(jī)械泵的施用。本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)通過引用合并入本文，其程度與明確且單獨(dú)地指出每個(gè)單獨(dú)的出版物、專利和專利申請(qǐng)通過引用合并入本文一樣。
權(quán)利要求
在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)針對(duì)病毒抗原的免疫應(yīng)答的方法，其包括給所述哺乳動(dòng)物施用配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，其中所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物包括(a)陽(yáng)離子脂質(zhì)體；(b)與所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體直接復(fù)合，但不與所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體化學(xué)綴合的配體；(c)與所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體結(jié)合的編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子；和(d)與所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體結(jié)合的編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述病毒抗原來自選自流感病毒、HIV病毒、SARS病毒、禽 流感病毒、埃博拉病毒、乙型肝炎病毒和天花病毒的病毒。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種病毒蛋白質(zhì)選自HIV病毒蛋白質(zhì)、埃博拉 病毒蛋白質(zhì)、流感病毒蛋白質(zhì)、SARS病毒蛋白質(zhì)、禽流感病毒蛋白質(zhì)、乙型肝炎病毒蛋白質(zhì) 和天花病毒蛋白質(zhì)。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種白介素選自IL-l、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、 IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18 和 IL-23。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述復(fù)合物作為推注或作為輸注經(jīng)由選自下述的途徑施 用靜脈內(nèi)施用、經(jīng)口施用、肌內(nèi)施用、損傷內(nèi)施用、皮內(nèi)施用、經(jīng)皮施用、眼內(nèi)施用、腹膜內(nèi) 施用、透皮施用、氣溶膠施用、鼻內(nèi)施用、器官內(nèi)施用、大腦內(nèi)施用、局部施用、皮下施用、內(nèi) 窺鏡施用、緩慢釋放埋植劑和經(jīng)由滲透或機(jī)械泵的施用。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述配體選自轉(zhuǎn)鐵蛋白、半乳糖、L-37pA、抗體和抗體片段。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述配體是單鏈Fv抗體片段。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述單鏈Fv抗體片段是抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈 Fv(TfRscFv)。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體進(jìn)一步包括這樣的肽，所述 肽包括與所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體結(jié)合的K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC) (SEQ ID NO 1)肽。
10.在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)針對(duì)病毒抗原的免疫應(yīng)答的方法，其包括給所述哺乳動(dòng)物施用 配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，其中所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物包括(a)陽(yáng)離子脂質(zhì)體；(b)與所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體化學(xué)綴合的配體；(c)與所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體結(jié)合的編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子；禾口(d)與所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體結(jié)合的編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述病毒抗原來自選自流感病毒、HIV病毒、SARS病毒、 禽流感病毒、埃博拉病毒、乙型肝炎病毒和天花病毒的病毒。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述一種或多種病毒蛋白質(zhì)選自HIV病毒蛋白質(zhì)、埃博拉 病毒蛋白質(zhì)、流感病毒蛋白質(zhì)、SARS病毒蛋白質(zhì)、禽流感病毒蛋白質(zhì)、乙型肝炎病毒蛋白質(zhì) 和天花病毒蛋白質(zhì)。
13.權(quán)利要求10的方法，其中所述一種或多種白介素選自IL-1、IL-2、IL_3、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18 和 IL-23。
14.權(quán)利要求10的方法，其中所述復(fù)合物作為推注或作為輸注經(jīng)由選自下述的途徑施用靜脈內(nèi)施用、經(jīng)口施用、肌內(nèi)施用、損傷內(nèi)施用、皮內(nèi)施用、經(jīng)皮施用、眼內(nèi)施用、腹膜 內(nèi)施用、透皮施用、氣溶膠施用、鼻內(nèi)施用、器官內(nèi)施用、疑為大腦內(nèi)施用、局部施用、皮下施 用、內(nèi)窺鏡施用、緩慢釋放埋植劑和經(jīng)由滲透或機(jī)械泵的施用。
15.權(quán)利要求10的方法，其中所述配體選自轉(zhuǎn)鐵蛋白、半乳糖、L-37pA、抗體和抗體片段。
16.權(quán)利要求10的方法，其中所述配體是單鏈Fv抗體片段。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述單鏈Fv抗體片段是抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈 Fv(TfRscFv)。
18.權(quán)利要求10的方法，其中所述配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體進(jìn)一步包括這樣的肽，所 述肽包括與所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體結(jié)合的K[K(H)KKIC5-K(H)KKC(HoKC) (SEQ ID NO=D肽。
19.治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中的病毒疾病的方法，其包括給所述哺乳動(dòng)物施用陽(yáng)離子脂 質(zhì)體復(fù)合物，其中所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物包括(a)陽(yáng)離子脂質(zhì)體；(b)與所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體直接復(fù)合，但不與所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體化學(xué)綴合的配體；(c)與所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體結(jié)合的編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子；禾口(d)與所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體結(jié)合的編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述病毒疾病選自流感、HIV、SARS、禽流感、埃博拉、乙型 肝炎和天花。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述一種或多種病毒蛋白質(zhì)選自HIV病毒蛋白質(zhì)、埃博拉 病毒蛋白質(zhì)、流感病毒蛋白質(zhì)、SARS病毒蛋白質(zhì)、禽流感病毒蛋白質(zhì)、乙型肝炎病毒蛋白質(zhì) 和天花病毒蛋白質(zhì)。
22.權(quán)利要求19的方法，其中所述一種或多種白介素選自IL-1、IL-2、IL_3、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18 和 IL-23。
23.權(quán)利要求19的方法，其中所述復(fù)合物作為推注或作為輸注經(jīng)由選自下述的途徑施 用靜脈內(nèi)施用、經(jīng)口施用、肌內(nèi)施用、損傷內(nèi)施用、皮內(nèi)施用、經(jīng)皮施用、眼內(nèi)施用、腹膜內(nèi) 施用、透皮施用、氣溶膠施用、鼻內(nèi)施用、器官內(nèi)施用、大腦內(nèi)施用、局部施用、皮下施用、內(nèi) 窺鏡施用、緩慢釋放埋植劑和經(jīng)由滲透或機(jī)械泵的施用。
24.權(quán)利要求19的方法，其中所述配體選自轉(zhuǎn)鐵蛋白、半乳糖、L-37pA、抗體和抗體片段。
25.權(quán)利要求19的方法，其中所述配體是單鏈Fv抗體片段。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述單鏈Fv抗體片段是抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈 Fv(TfRscFv)。
27.權(quán)利要求19的方法，其中所述配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體進(jìn)一步包括這樣的肽，所 述肽包括與所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體結(jié)合的K[K(H)KKIC5-K(H)KKC(HoKC) (SEQ ID NO=D肽。
28.治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中的病毒疾病的方法，其包括給所述哺乳動(dòng)物施用陽(yáng)離子脂 質(zhì)體復(fù)合物，其中所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物包括(a)陽(yáng)離子脂質(zhì)體；(b)與所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體化學(xué)綴合的配體；(C)與所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體結(jié)合的編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子；禾口(d)與所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體結(jié)合的編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述病毒疾病選自流感、HIV、SARS、禽流感、埃博拉、乙型 肝炎和天花。
30.權(quán)利要求28的方法，其中所述一種或多種病毒蛋白質(zhì)選自HIV病毒蛋白質(zhì)、埃博拉 病毒蛋白質(zhì)、流感病毒蛋白質(zhì)、SARS病毒蛋白質(zhì)、禽流感病毒蛋白質(zhì)、乙型肝炎病毒蛋白質(zhì) 和天花病毒蛋白質(zhì)。
31.權(quán)利要求28的方法，其中所述一種或多種白介素選自IL-1、IL-2、IL_3、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18 和 IL-23。
32.權(quán)利要求28的方法，其中所述復(fù)合物作為推注或作為輸注經(jīng)由選自下述的途徑施 用靜脈內(nèi)施用、經(jīng)口施用、肌內(nèi)施用、損傷內(nèi)施用、皮內(nèi)施用、經(jīng)皮施用、眼內(nèi)施用、腹膜內(nèi) 施用、透皮施用、氣溶膠施用、鼻內(nèi)施用、器官內(nèi)施用、大腦內(nèi)施用、局部施用、皮下施用、內(nèi) 窺鏡施用、緩慢釋放埋植劑和經(jīng)由滲透或機(jī)械泵的施用。
33.權(quán)利要求28的方法，其中所述配體選自轉(zhuǎn)鐵蛋白、半乳糖、L-37pA、抗體和抗體片段。
34.權(quán)利要求28的方法，其中所述配體是單鏈Fv抗體片段。
35.權(quán)利要求35的方法，其中所述單鏈Fv抗體片段是抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈 Fv(TfRscFv)。
36.權(quán)利要求28的方法，其中所述配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體進(jìn)一步包括這樣的肽，所 述肽包括與所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體結(jié)合的K[K(H)KKIC5-K(H)KKC(HoKC) (SEQ ID NO=D肽。
37.將一種或多種活性劑遞送給哺乳動(dòng)物的抗原呈遞細(xì)胞(APCs)的方法，其包括給所 述哺乳動(dòng)物施用抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈Fv(TfRscFv)靶向的陽(yáng)離子免疫脂質(zhì)體復(fù)合物，所述 復(fù)合物包括陽(yáng)離子脂質(zhì)體、TfRscFv和一種或多種活性劑，其中所述TfRscFv與所述陽(yáng)離子 脂質(zhì)體直接復(fù)合，但不化學(xué)綴合。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述APCs是專業(yè)APCs。
39.權(quán)利要求37的方法，其中所述APCs是非專業(yè)APCs。
40.權(quán)利要求37的方法，其中所述活性劑包含一種或多種核酸分子。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述核酸分子編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)。
42.權(quán)利要求40的方法，其中所述核酸分子編碼一種或多種白介素。
43.權(quán)利要求40的方法，其中所述核酸分子編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)和一種或多種 白介素。
44.權(quán)利要求41或權(quán)利要求43的方法，其中所述一種或多種病毒蛋白質(zhì)選自HIV病毒 蛋白質(zhì)、埃博拉病毒蛋白質(zhì)、流感病毒蛋白質(zhì)、SARS病毒蛋白質(zhì)、禽流感病毒蛋白質(zhì)、乙型肝 炎病毒蛋白質(zhì)和天花病毒蛋白質(zhì)。
45.權(quán)利要求42或權(quán)利要求43的方法，其中所述一種或多種白介素選自IL-1、IL-2、 IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18 和 IL-23。
46.權(quán)利要求37的方法，其中所述復(fù)合物作為推注或作為輸注經(jīng)由選自下述的途徑施用靜脈內(nèi)施用、經(jīng)口施用、肌內(nèi)施用、損傷內(nèi)施用、皮內(nèi)施用、經(jīng)皮施用、眼內(nèi)施用、腹膜內(nèi) 施用、透皮施用、氣溶膠施用、鼻內(nèi)施用、器官內(nèi)施用、大腦內(nèi)施用、局部施用、皮下施用、內(nèi) 窺鏡施用、緩慢釋放埋植劑和經(jīng)由滲透或機(jī)械泵的施用。
47.權(quán)利要求37的方法，其中所述APCs位于肝、脾、淋巴結(jié)、腸和/或呼吸道中。
48.將一種或多種活性劑遞送給哺乳動(dòng)物的抗原呈遞細(xì)胞(APCs)的方法，其包括給所 述哺乳動(dòng)物施用抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈Fv(TfRscFv)靶向的陽(yáng)離子免疫脂質(zhì)體復(fù)合物，所述 復(fù)合物包括陽(yáng)離子脂質(zhì)體、TfRscFv和一種或多種活性劑，其中所述TfRscFv與所述陽(yáng)離子 脂質(zhì)體化學(xué)綴合。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述APCs是專業(yè)APCs。
50.權(quán)利要求48的方法，其中所述APCs是非專業(yè)APCs。
51.權(quán)利要求48的方法，其中所述活性劑包含一種或多種核酸分子。
52.權(quán)利要求51的方法，其中所述核酸分子編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)。
53.權(quán)利要求51的方法，其中所述核酸分子編碼一種或多種白介素。
54.權(quán)利要求51的方法，其中所述核酸分子編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)和一種或多種 白介素。
55.權(quán)利要求52或權(quán)利要求54的方法，其中所述一種或多種病毒蛋白質(zhì)選自HIV病毒 蛋白質(zhì)、埃博拉病毒蛋白質(zhì)、流感病毒蛋白質(zhì)、SARS病毒蛋白質(zhì)、禽流感病毒蛋白質(zhì)、乙型肝 炎病毒蛋白質(zhì)和天花病毒蛋白質(zhì)。
56.權(quán)利要求53或權(quán)利要求54的方法，其中所述一種或多種白介素選自IL-l、IL-2、 IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18 和 IL-23。
57.權(quán)利要求48的方法，其中所述復(fù)合物作為推注或作為輸注經(jīng)由選自下述的途徑施 用靜脈內(nèi)施用、經(jīng)口施用、肌內(nèi)施用、損傷內(nèi)施用、皮內(nèi)施用、經(jīng)皮施用、眼內(nèi)施用、腹膜內(nèi) 施用、透皮施用、氣溶膠施用、鼻內(nèi)施用、器官內(nèi)施用、大腦內(nèi)施用、局部施用、皮下施用、內(nèi) 窺鏡施用、緩慢釋放埋植劑和經(jīng)由滲透或機(jī)械泵的施用。
58.權(quán)利要求48的方法，其中所述APCs位于肝、脾、淋巴結(jié)、腸和/或呼吸道中。
59.在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)針對(duì)病毒抗原的免疫應(yīng)答的方法，其包括給所述哺乳動(dòng)物施用 配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，所述復(fù)合物通過下述過程制備(a)制備配體；(b)使所述配體與陽(yáng)離子脂質(zhì)體混合，以形成配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體，其中所述配體 與所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體直接復(fù)合，但不化學(xué)綴合；和(c)使所述配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體與下述混合編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子；和編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子，以形成所述配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體 復(fù)合物。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所述配體選自轉(zhuǎn)鐵蛋白、半乳糖、L-37pA、抗體和抗體片段。
61.權(quán)利要求60的方法，其中所述配體是單鏈Fv片段。
62.權(quán)利要求61的方法，其中所述單鏈Fv抗體片段是抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈Fv(TfRscFv)。
63.權(quán)利要求60的方法，其中所述抗體片段在羧基末端處包括半胱氨酸部分。
64.權(quán)利要求59的方法，其中所述配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體進(jìn)一步包括這樣的肽，所 述肽包括與所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體結(jié)合的K[K(H)KKIC5-K(H)KKC(HoKC) (SEQ ID NO=D肽。
65.權(quán)利要求59的方法，其中所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體包括一種或多種陽(yáng)離子脂質(zhì)和一種或 多種中性或輔助脂質(zhì)的混合物。
66.權(quán)利要求59的方法，其中所述配體和所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約1 1至約 1 100 (w w)范圍中的比混合。
67.權(quán)利要求66的方法，其中所述配體和所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約1 10至約 1 50(w w)范圍中的比混合。
68.權(quán)利要求67的方法，其中所述配體和所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約1 20至約 1 40(w w)范圍中的比混合。
69.權(quán)利要求59的方法，其中所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體包括二油?；谆姿徜@與二油酰 基磷脂酰乙醇胺和/或膽固醇的混合物；或雙十八烷基二甲基溴化銨與二油?；字Ｒ?醇胺和/或膽固醇的混合物。
70.權(quán)利要求59的方法，其中所述核酸分子以約0.1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì) 的一種或多種核酸分子比10摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子；至10摩 爾編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子比約0.1摩爾編碼一種或多種白介 素的一種或多種核酸分子的摩爾比存在。
71.權(quán)利要求60的方法，其中所述核酸以約1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種 或多種核酸分子比約1摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子的摩爾比存在。
72.權(quán)利要求59的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分 子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約0.5 1 至約1 40(yg總核酸yg脂質(zhì)體)的重量比存在。
73.權(quán)利要求72的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分 子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約1 5至 約1 20(yg總核酸yg脂質(zhì)體)的重量比存在。
74.權(quán)利要求73的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸 分子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約 1 10(yg總核酸yg脂質(zhì)體)的重量比存在。
75.權(quán)利要求59的方法，其中所述一種或多種病毒蛋白質(zhì)選自HIV病毒蛋白質(zhì)、埃博拉 病毒蛋白質(zhì)、流感病毒蛋白質(zhì)、SARS病毒蛋白質(zhì)、禽流感病毒蛋白質(zhì)、乙型肝炎病毒蛋白質(zhì) 和天花病毒蛋白質(zhì)。
76.權(quán)利要求59的方法，其中所述一種或多種白介素選自IL-1、IL-2、IL_3、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18 和 IL-23。
77.治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中的病毒疾病的方法，其包括給所述哺乳動(dòng)物施用配體靶向 的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，所述復(fù)合物通過下述過程制備(a)制備配體；(b)使所述配體與陽(yáng)離子脂質(zhì)體混合，以形成配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體，其中所述配體與所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體直接復(fù)合，但不化學(xué)綴合；和(c)使所述配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體與下述混合編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子；和編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子，以形成所述配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體 復(fù)合物。
78.權(quán)利要求77的方法，其中所述配體選自轉(zhuǎn)鐵蛋白、半乳糖、L-37pA、抗體和抗體片段。
79.權(quán)利要求77的方法，其中所述配體是單鏈Fv片段。
80.權(quán)利要求79的方法，其中所述單鏈Fv片段是抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈Fv(TfRSCFv)。
81.權(quán)利要求78的方法，其中所述抗體片段在羧基末端處包括半胱氨酸部分。
82.權(quán)利要求77的方法，其中所述配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體進(jìn)一步包括這樣的肽，所 述肽包括與所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體結(jié)合的K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC) (SEQ ID N0:1)肽。
83.權(quán)利要求77的方法，其中所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體包括一種或多種陽(yáng)離子脂質(zhì)和一種或 多種中性或輔助脂質(zhì)的混合物。
84.權(quán)利要求77的方法，其中所述配體和所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約1 1至約 1 100 (w w)范圍中的比存在。
85.權(quán)利要求84的方法，其中所述配體和所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約1 10至約 1 50(w w)范圍中的比存在。
86.權(quán)利要求85的方法，其中所述配體和所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約1 20至約 1 40(w w)范圍中的比存在。
87.權(quán)利要求77的方法，其中所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體包括二油酰基三甲基磷酸銨與二油酰 基磷脂酰乙醇胺和/或膽固醇的混合物；或雙十八烷基二甲基溴化銨與二油酰基磷脂酰乙 醇胺和/或膽固醇的混合物。
88.權(quán)利要求77的方法，其中所述核酸分子以約0.1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì) 的一種或多種核酸分子比10摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子；至10摩 爾編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子比約0. 1摩爾編碼一種或多種白介 素的一種或多種核酸分子的摩爾比存在。
89.權(quán)利要求88的方法，其中所述核酸以約1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種 或多種核酸分子比約1摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子的摩爾比存在。
90.權(quán)利要求77的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分 子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約0.5 1 至約1 40(iig總核酸Pg脂質(zhì)體)的重量比存在。
91.權(quán)利要求90的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分 子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約1 5至 約1 20(iig總核酸Pg脂質(zhì)體)的重量比存在。
92.權(quán)利要求77的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸 分子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約 1 10(yg總核酸Pg脂質(zhì)體)的重量比存在。
93.權(quán)利要求77的方法，其中所述一種或多種病毒蛋白質(zhì)選自HIV病毒蛋白質(zhì)、埃博拉病毒蛋白質(zhì)、流感病毒蛋白質(zhì)、SARS病毒蛋白質(zhì)、禽流感病毒蛋白質(zhì)、乙型肝炎病毒蛋白質(zhì) 和天花病毒蛋白質(zhì)。
94.權(quán)利要求77的方法，其中所述一種或多種白介素選自IL-1、IL-2、IL_3、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18 和 IL-23。
95.在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)針對(duì)病毒抗原的免疫應(yīng)答的方法，其包括給所述哺乳動(dòng)物施用 配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，所述復(fù)合物通過下述過程制備(a)制備配體；(b)使所述配體與陽(yáng)離子脂質(zhì)體化學(xué)綴合，以形成配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體；和(c)使所述配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體與下述混合編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子；和編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子，以形成所述配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體 復(fù)合物。
96.權(quán)利要求95的方法，其中所述配體選自轉(zhuǎn)鐵蛋白、半乳糖、L-37pA、抗體和抗體片段。
97.權(quán)利要求95的方法，其中所述配體是單鏈Fv片段。
98.權(quán)利要求97的方法，其中所述單鏈Fv片段是抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈Fv(TfRSCFv)。
99.權(quán)利要求96的方法，其中所述抗體片段在羧基末端處包括半胱氨酸部分。
100.權(quán)利要求95的方法，其中所述配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體進(jìn)一步包括這樣的肽，所 述肽包括與所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體結(jié)合的K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC) (SEQ ID N0:1)肽。
101.權(quán)利要求95的方法，其中所述配體經(jīng)由硫原子與所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體化學(xué)綴合，所 述硫原子是在所述化學(xué)綴合前在所述配體上的羧基末端處的巰基的部分。
102.權(quán)利要求95的方法，其中所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體包括一種或多種陽(yáng)離子脂質(zhì)和一種 或多種中性或輔助脂質(zhì)的混合物。
103.權(quán)利要求95的方法，其中所述配體和所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約1 1至約 1 100(w w)范圍中的比存在。
104.權(quán)利要求103的方法，其中所述配體和所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約1 10至約 1 50(w w)范圍中的比存在。
105.權(quán)利要求104的方法，其中所述配體和所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約1 20至約 1 40(w w)范圍中的比存在。
106.權(quán)利要求95的方法，其中所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體包括二油?；谆姿徜@與二油 酰基磷脂酰乙醇胺和/或膽固醇的混合物；或雙十八烷基二甲基溴化銨與二油?；字?乙醇胺和/或膽固醇的混合物。
107.權(quán)利要求95的方法，其中所述核酸分子以約0.1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì) 的一種或多種核酸分子比10摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子；至10摩 爾編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子比約0. 1摩爾編碼一種或多種白介 素的一種或多種核酸分子的摩爾比存在。
108.權(quán)利要求107的方法，其中所述核酸以約1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一 種或多種核酸分子比約1摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子的摩爾比存 在。
109.權(quán)利要求108的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分 子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體 以約0.5 1至約1 40(iig總核酸Pg脂質(zhì)體)的重量比存在。
110.權(quán)利要求109的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分 子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體 以約1 5至約1 20(iig總核酸Pg脂質(zhì)體)的重量比存在。
111.權(quán)利要求110的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分 子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體 以約1 10(iig總核酸Pg脂質(zhì)體)的重量比存在。
112.權(quán)利要求95的方法，其中所述一種或多種病毒蛋白質(zhì)選自HIV病毒蛋白質(zhì)、埃博 拉病毒蛋白質(zhì)、流感病毒蛋白質(zhì)、SARS病毒蛋白質(zhì)、禽流感病毒蛋白質(zhì)、乙型肝炎病毒蛋白 質(zhì)和天花病毒蛋白質(zhì)。
113.權(quán)利要求95的方法，其中所述一種或多種白介素選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18 和 IL-23。
114.治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中的病毒疾病的方法，其包括給所述哺乳動(dòng)物施用配體靶向 的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，所述復(fù)合物通過下述過程制備(a)制備配體；(b)使所述配體與陽(yáng)離子脂質(zhì)體化學(xué)綴合，以形成配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體；和(c)使所述配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體與下述混合編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子；和編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子，以形成所述配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體 復(fù)合物。
115.權(quán)利要求114的方法，其中所述配體選自轉(zhuǎn)鐵蛋白、半乳糖、L-37pA、抗體和抗體 片段。
116.權(quán)利要求114的方法，其中所述配體是單鏈Fv片段。
117.權(quán)利要求114的方法，其中所述單鏈Fv片段是抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈 Fv(TfRscFv)。
118.權(quán)利要求115的方法，其中所述抗體片段在羧基末端處包括半胱氨酸部分。
119.權(quán)利要求114的方法，其中所述配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體進(jìn)一步包括這樣的肽， 所述肽包括與所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體結(jié)合的K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC) (SEQ ID N0:1)肽。
120.權(quán)利要求114的方法，其中所述配體經(jīng)由硫原子與所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體化學(xué)綴合， 所述硫原子是在所述化學(xué)綴合前在所述配體上的羧基末端處的巰基的部分。
121.權(quán)利要求114的方法，其中所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體包括一種或多種陽(yáng)離子脂質(zhì)和一種 或多種中性或輔助脂質(zhì)的混合物。
122.權(quán)利要求114的方法，其中所述配體和所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約1 1至約 1 100 (w w)范圍中的比存在。
123.權(quán)利要求122的方法，其中所述配體和所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約1 10至約 1 50(w w)范圍中的比存在。
124.權(quán)利要求123的方法，其中所述配體和所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約1 20至約140(w w)范圍中的比存在。
125.權(quán)利要求114的方法，其中所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體包括二油?；谆姿徜@與二油 酰基磷脂酰乙醇胺和/或膽固醇的混合物；或雙十八烷基二甲基溴化銨與二油?；字?乙醇胺和/或膽固醇的混合物。
126.權(quán)利要求114的方法，其中所述核酸分子以約0.1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白 質(zhì)的一種或多種核酸分子比約10摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子；至 10摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子比約0. 1摩爾編碼一種或多種 白介素的一種或多種核酸分子的摩爾比存在。
127.權(quán)利要求126的方法，其中所述核酸以約1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一 種或多種核酸分子比約1摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子的摩爾比存 在。
128.權(quán)利要求114的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分 子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體 以約0.5 1至約1 40(iig總核酸Pg脂質(zhì)體)的重量比存在。
129.權(quán)利要求128的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分 子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體 以約1 5至約1 20(1!8總核酸Pg脂質(zhì)體)的重量比存在。
130.權(quán)利要求129的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分 子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體 以約1 10(i!g總核酸Pg脂質(zhì)體)的重量比存在。
131.權(quán)利要求114的方法，其中所述一種或多種病毒蛋白質(zhì)選自HI V病毒蛋白質(zhì)、埃 博拉病毒蛋白質(zhì)、流感病毒蛋白質(zhì)、SARS病毒蛋白質(zhì)、禽流感病毒蛋白質(zhì)、乙型肝炎病毒蛋 白質(zhì)和天花病毒蛋白質(zhì)。
132.權(quán)利要求114的方法，其中所述一種或多種白介素選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18 和 IL-23。
133.制備配體靶向的陽(yáng)離子免疫脂質(zhì)體復(fù)合物的方法，其包括(a)制備配體；(b)使所述配體與陽(yáng)離子脂質(zhì)體混合，以形成配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體，其中所述配體 與所述陽(yáng)離子免疫脂質(zhì)體直接復(fù)合，但不化學(xué)綴合；和(c)使所述配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體與下述混合編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子；和編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子，以形成所述配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物。
134.權(quán)利要求133的方法，其中所述配體選自轉(zhuǎn)鐵蛋白、半乳糖、L-37pA、抗體和抗體 片段。
135.權(quán)利要求134的方法，其中所述配體是單鏈Fv片段。
136.權(quán)利要求135的方法，其中所述單鏈Fv片段是抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈 Fv(TfRscFv)。
137.權(quán)利要求134的方法，其中所述抗體片段在羧基末端處包括半胱氨酸部分。
138.權(quán)利要求133的方法，其進(jìn)一步包括混合這樣的肽，所述肽包括與所述陽(yáng)離子脂 質(zhì)體結(jié)合的 K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC) (SEQID NO 1)肽。
139.權(quán)利要求133的方法，其中所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體包括一種或多種陽(yáng)離子脂質(zhì)和一種 或多種中性或輔助脂質(zhì)的混合物。
140.權(quán)利要求133的方法，其中所述配體和所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約1 1至約 1 100 (w w)范圍中的比存在。
141.權(quán)利要求140的方法，其中所述配體和所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約1 10至約 1 50(w w)范圍中的比存在。
142.權(quán)利要求141的方法，其中所述配體和所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約1 20至約 1 40(w w)范圍中的比存在。
143.權(quán)利要求133的方法，其中所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體包括二油?；谆姿徜@與二油 ?；字Ｒ掖及泛?或膽固醇的混合物；或雙十八烷基二甲基溴化銨與二油?；字?乙醇胺和/或膽固醇的混合物。
144.權(quán)利要求133的方法，其中所述核酸分子以約0.1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白 質(zhì)的一種或多種核酸分子比約10摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子；至 10摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子比約0. 1摩爾編碼一種或多種 白介素的一種或多種核酸分子的摩爾比存在。
145.權(quán)利要求144的方法，其中所述核酸以約1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一 種或多種核酸分子比約1摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子的摩爾比存 在。
146.權(quán)利要求133的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分 子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體 以約0.5 1至約1 40(iig總核酸Pg脂質(zhì)體)的重量比存在。
147.權(quán)利要求146的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分 子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所配體靶向的述陽(yáng)離子脂質(zhì)體 以約1 5至約1 20(iig總核酸Pg脂質(zhì)體)的重量比存在。
148.權(quán)利要求147的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分 子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體 以約1 10(iig總核酸Pg脂質(zhì)體)的重量比存在。
149.權(quán)利要求133的方法，其中所述一種或多種病毒蛋白質(zhì)選自HIV病毒蛋白質(zhì)、埃博 拉病毒蛋白質(zhì)、流感病毒蛋白質(zhì)、SARS病毒蛋白質(zhì)、禽流感病毒蛋白質(zhì)、乙型肝炎病毒蛋白 質(zhì)和天花病毒蛋白質(zhì)。
150.權(quán)利要求133的方法，其中所述一種或多種白介素選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18 和 IL-23。
151.制備配體靶向的陽(yáng)離子免疫脂質(zhì)體復(fù)合物的方法，其包括(a)制備配體；(b)使所述配體與陽(yáng)離子脂質(zhì)體化學(xué)綴合，以形成配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體；和(c)使所述配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體與下述混合編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子；和編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子，以形成所述配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物。
152.權(quán)利要求151的方法，其中所述配體選自轉(zhuǎn)鐵蛋白、半乳糖、L-37pA、抗體和抗體 片段。
153.權(quán)利要求151的方法，其中所述配體是單鏈Fv片段。
154.權(quán)利要求153的方法，其中所述單鏈Fv片段是抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈 Fv(TfRscFv)。
155.權(quán)利要求152的方法，其中所述抗體片段在羧基末端處包括半胱氨酸部分。
156.權(quán)利要求151的方法，其進(jìn)一步包括混合這樣的肽，所述肽包括與所述陽(yáng)離子脂 質(zhì)體結(jié)合的 K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC) (SEQID NO 1)肽。
157.權(quán)利要求151的方法，其中所述配體經(jīng)由硫原子與所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體化學(xué)綴合， 所述硫原子是在所述直接綴合前在所述配體上的羧基末端處的巰基的部分。
158.權(quán)利要求151的方法，其中所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體包括一種或多種陽(yáng)離子脂質(zhì)和一種 或多種中性或輔助脂質(zhì)的混合物。
159.權(quán)利要求151的方法，其中所述配體和所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約1 1至約 1 100 (w w)范圍中的比存在。
160.權(quán)利要求159的方法，其中所述配體和所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約1 10至約 1 50(w w)范圍中的比存在。
161.權(quán)利要求160的方法，其中所述配體和所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約1 20至約 1 40(w w)范圍中的比存在。
162.權(quán)利要求151的方法，其中所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體包括二油?；谆姿徜@與二油 ?；字Ｒ掖及泛?或膽固醇的混合物；或雙十八烷基二甲基溴化銨與二油?；字?乙醇胺和/或膽固醇的混合物。
163.權(quán)利要求151的方法，其中所述核酸分子以約0.1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白 質(zhì)的一種或多種核酸分子比約10摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子；至 10摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子比約0. 1摩爾編碼一種或多種 白介素的一種或多種核酸分子的摩爾比存在。
164.權(quán)利要求163的方法，其中所述核酸以約1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一 種或多種核酸分子比約1摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子的摩爾比存 在。
165.權(quán)利要求151的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分 子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約0.5 1 至約1 40(iig總核酸Pg脂質(zhì)體)的重量比存在。
166.權(quán)利要求165的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分 子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約1 5至 約1 20(iig總核酸Pg脂質(zhì)體)的重量比存在。
167.權(quán)利要求166的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核 酸分子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約 1 10(yg總核酸Pg脂質(zhì)體)的重量比存在。
168.權(quán)利要求151的方法，其中所述一種或多種病毒蛋白質(zhì)選自HIV病毒蛋白質(zhì)、埃博 拉病毒蛋白質(zhì)、流感病毒蛋白質(zhì)、SARS病毒蛋白質(zhì)、禽流感病毒蛋白質(zhì)、乙型肝炎病毒蛋白 質(zhì)和天花病毒蛋白質(zhì)。
169.權(quán)利要求151的方法，其中所述一種或多種白介素選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18 和 IL-23。
170.配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，其通過權(quán)利要求129或權(quán)利要求151的方法制備。
171.配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，其包括陽(yáng)離子脂質(zhì)體、配體、編碼一種或多種病 毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子、和編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子，其中 所述配體與所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體直接復(fù)合，但不化學(xué)綴合。
172.配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，其包括陽(yáng)離子脂質(zhì)體、配體、編碼一種或多種病 毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子、和編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子，其中 所述配體與所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體化學(xué)綴合。
173.權(quán)利要求171或權(quán)利要求172的配體靶向的配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，其 中所述配體選自轉(zhuǎn)鐵蛋白、半乳糖、L-37pA、抗體和抗體片段。
174.權(quán)利要求171或權(quán)利要求172的配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，其中所述核酸 分子封裝在所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體內(nèi)。
175.權(quán)利要求171或權(quán)利要求172的配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，其中所述核酸 分子與所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體的內(nèi)部或外部單層結(jié)合。
176.權(quán)利要求171或權(quán)利要求172的配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，其中所述配體 是單鏈Fv片段。
177.權(quán)利要求176的配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，其中所述抗體片段是抗轉(zhuǎn)鐵蛋 白受體單鏈Fv (TfRscFv)。
178.權(quán)利要求171或權(quán)利要求172的配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，其中所述陽(yáng)離 子脂質(zhì)體包括一種或多種陽(yáng)離子脂質(zhì)和一種或多種中性或輔助脂質(zhì)的混合物。
179.權(quán)利要求171或權(quán)利要求172的配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，其中所述抗體 或抗體片段和所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約1 1至約1 100(w w)范圍中的比存在。
180.權(quán)利要求179的配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，其中所述抗體或抗體片段和所 述陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約1 10至約1 50(w w)范圍中的比存在。
181.權(quán)利要求180的配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，其中所述抗體或抗體片段和所 述陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約1 20至約1 40(w w)范圍中的比存在。
182.權(quán)利要求171或權(quán)利要求172的配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，其中所述陽(yáng)離 子脂質(zhì)體包括二油?；谆姿徜@與二油酰基磷脂酰乙醇胺和/或膽固醇的混合物；或 雙十八烷基二甲基溴化銨與二油?；字Ｒ掖及泛?或膽固醇的混合物。
183.權(quán)利要求171或權(quán)利要求172的配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，其中所述核酸 分子以約0. 1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子比約10摩爾編碼一 種或多種白介素的一種或多種核酸分子；至10摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或 多種核酸分子比約0. 1摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子的摩爾比存在。
184.權(quán)利要求183的配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，其中所述核酸以約1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子比約1摩爾編碼一種或多種白介素的一種 或多種核酸分子的摩爾比存在。
185.權(quán)利要求171或權(quán)利要求172的配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，其中所述編碼 一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種 核酸分子、和所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約0.5 1至約1 40(iig總核酸Pg脂質(zhì)體)的重 量比存在。
186.權(quán)利要求185的配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，其中所述編碼一種或多種病毒 蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所 述陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約1 5至約1 20(iig總核酸Pg脂質(zhì)體)的重量比存在。
187.權(quán)利要求186的配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，其中所述編碼一種或多種病毒 蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所 述陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約1 10(yg總核酸Pg脂質(zhì)體)的重量比存在。
188.權(quán)利要求171或權(quán)利要求172的配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，其中所述一種 或多種病毒蛋白質(zhì)選自HIV病毒蛋白質(zhì)、流感病毒蛋白質(zhì)、SARS病毒蛋白質(zhì)、禽流感病毒蛋 白質(zhì)、埃博拉病毒蛋白質(zhì)、乙型肝炎病毒蛋白質(zhì)和天花病毒蛋白質(zhì)。
189.權(quán)利要求171或權(quán)利要求172的配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，其中所述一種 或多種白介素選自 IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、 IL-13、IL-15、IL-17、IL-18 和 IL-23。
190.權(quán)利要求171或權(quán)利要求172的配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，其進(jìn)一步包 括這樣的肽，所述肽包括與所述復(fù)合物結(jié)合的K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC) (SEQ ID NO 1) 肽。
191.藥物組合物，其包括權(quán)利要求171或權(quán)利要求172的配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù) 合物。
192.權(quán)利要求191的藥物組合物，其進(jìn)一步包括選自一種或多種抗菌劑、一種或多種 防腐劑、一種或多種緩沖劑和一種或多種表面活性劑的一種或多種賦形劑。
193.藥物組合物，其包括第一配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，其包括陽(yáng)離子脂質(zhì)體、配體和編碼一種或多種 病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子，其中所述配體與所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體直接復(fù)合但不化學(xué) 綴合；和第二配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，其包括陽(yáng)離子脂質(zhì)體、配體和編碼一種或多種 白介素的一種或多種核酸分子，其中所述配體與所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體直接復(fù)合但不化學(xué)綴1=1 o
194.藥物組合物，其包括第一配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，其包括陽(yáng)離子脂質(zhì)體、配體和編碼一種或多種 病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子，其中所述配體與所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體化學(xué)綴合；和第二配體靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，其包括陽(yáng)離子脂質(zhì)體、配體和編碼一種或多種 白介素的一種或多種核酸分子，其中所述配體與所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體化學(xué)綴合。
195.權(quán)利要求194或權(quán)利要求195的藥物組合物，其中所述核酸分子封裝在所述陽(yáng)離 子脂質(zhì)體內(nèi)。
196.權(quán)利要求194或權(quán)利要求195的藥物組合物，其中所述核酸分子與所述陽(yáng)離子脂 質(zhì)體的內(nèi)部或外部單層結(jié)合。
197.權(quán)利要求194或權(quán)利要求195的藥物組合物，其中所述配體選自轉(zhuǎn)鐵蛋白、半乳 糖、L-37pA、抗體和抗體片段。
198.權(quán)利要求194或權(quán)利要求195的藥物組合物，其中所述配體是單鏈Fv片段。
199.權(quán)利要求198的藥物組合物，其中所述抗體片段是抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈 Fv(TfRscFv)。
200.權(quán)利要求194或權(quán)利要求195的藥物組合物，其中所述第一和第二陽(yáng)離子脂質(zhì)體 包括一種或多種陽(yáng)離子脂質(zhì)和一種或多種中性或輔助脂質(zhì)的混合物。
201.權(quán)利要求194或權(quán)利要求195的藥物組合物，其中每一所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體的所述 抗體或抗體片段以約1 1至約1 100(w w)范圍中的比存在。
202.權(quán)利要求201的藥物組合物，其中每一所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體的所述抗體或抗體片段 以約1 10至約1 50(w w)范圍中的比存在。
203.權(quán)利要求202的藥物組合物，其中每一所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體的所述抗體或抗體片段 以約1 20至約1 40(w w)范圍中的比存在。
204.權(quán)利要求194或權(quán)利要求195的藥物組合物，其中所述第一和第二陽(yáng)離子脂質(zhì)體 包括二油?；谆姿徜@與二油酰基磷脂酰乙醇胺和/或膽固醇的混合物；或雙十八烷 基二甲基溴化銨與二油?；字Ｒ掖及泛?或膽固醇的混合物。
205.權(quán)利要求194或權(quán)利要求195的藥物組合物，其中所述核酸分子以約0.1摩爾編 碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子比約10摩爾編碼一種或多種白介素的一 種或多種核酸分子；至10摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子比約0. 1 摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子的摩爾比存在。
206.權(quán)利要求205的藥物組合物，其中所述核酸以約1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白 質(zhì)的一種或多種核酸分子比約1摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子的摩 爾比存在。
207.權(quán)利要求194或權(quán)利要求195的藥物組合物，其中，在所述第一和第二陽(yáng)離子脂 質(zhì)體中，所述編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子、所述編碼一種或多種白 介素的一種或多種核酸分子、和所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體分別以約0.5 1至約1 40(iig總核 酸Pg脂質(zhì)體)的重量比存在。
208.權(quán)利要求207的藥物組合物，其中，在所述第一和第二陽(yáng)離子脂質(zhì)體中，所述編碼 一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種 核酸分子、和所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體分別以約1 5至約1 20(iig總核酸Pg脂質(zhì)體)的 重量比存在。
209.權(quán)利要求208的藥物組合物，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質(zhì)的一種或多種 核酸分子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體以約 1 10(yg總核酸Pg脂質(zhì)體)的重量比存在。
210.權(quán)利要求194或權(quán)利要求195的藥物組合物，其中所述一種或多種病毒蛋白質(zhì)選 自HIV病毒蛋白質(zhì)、流感病毒蛋白質(zhì)、SARS病毒蛋白質(zhì)、禽流感病毒蛋白質(zhì)、乙型肝炎病毒 蛋白質(zhì)和天花病毒蛋白質(zhì)。
211.權(quán)利要求194或權(quán)利要求195的藥物組合物，其中所述一種或多種白介素選自 IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、 IL-18 和 IL-23。
212.權(quán)利要求194或權(quán)利要求195的藥物組合物，其進(jìn)一步包括這樣的肽，所述肽包括 與每一所述復(fù)合物結(jié)合的 K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HOKC) (SEQ ID NO 1)肽。
213.權(quán)利要求194或權(quán)利要求195的藥物組合物，其進(jìn)一步包括選自一種或多種抗菌 劑、一種或多種防腐劑、一種或多種緩沖劑和一種或多種表面活性劑的一種或多種賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明在藥物遞送且特別地基于陽(yáng)離子脂質(zhì)體的疫苗領(lǐng)域中。在實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備用于遞送分子以誘導(dǎo)針對(duì)病毒抗原的免疫應(yīng)答或者治療或預(yù)防病毒疾病的配體靶向的(例如，抗體或抗體片段靶向的)脂質(zhì)體的方法。遞送系統(tǒng)的特異性得自靶向性配體。
文檔編號(hào)A61K39/12GK101801344SQ200880105375
公開日2010年8月11日 申請(qǐng)日期2008年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月9日
發(fā)明者E·H·常, K·F·皮若羅 申請(qǐng)人:喬治敦大學(xué)