專利名稱：：流感治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及雙鏈RNA、發(fā)夾型RNA以及載體，以及含有它們的醫(yī)藥組合物、抗流感病毒劑和乙型流感病毒(influenzavirustypeB)檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
：流感是世界上最為普遍的傳染病之一，每年引起25萬(wàn)50萬(wàn)人死亡。在日本，每年有515%的人口罹患流感，當(dāng)高齡者以及免疫低下患者等罹患流感時(shí)，還出現(xiàn)過(guò)并發(fā)肺炎而死亡的病例。流感病毒因構(gòu)成病毒粒子的蛋白質(zhì)的抗原性不同而分為甲型、乙型和丙型這三類，其中，引起人類感染、每年冬季反復(fù)流行的，主要是甲型和乙型。流感的預(yù)防可以利用流感疫苗。從世界范圍看，可以使用弱毒活疫苗(使用有弱毒性的病原體)、滅活疫苗(使用經(jīng)過(guò)滅活處理而喪失感染性的病原體)以及成分疫苗(純化病原體的特定成分來(lái)使用)，在日本，在流感病毒預(yù)防方面，只有成分疫苗達(dá)到了實(shí)用化。流感疫苗是根據(jù)前季流行的流感病毒株的信息、同時(shí)期外國(guó)分離的流感病毒的基因信息、以及國(guó)民針對(duì)流感病毒株的抗體保有狀況等，預(yù)測(cè)當(dāng)年的流行株來(lái)進(jìn)行生產(chǎn)的。作為流感的治療方法，可以列舉出利用抗流感病毒劑的藥物療法，在日本，作為抗流感病毒劑，金剛烷胺和神經(jīng)氨酸酶抑制劑(奧司他韋(Oseltamivir)以及扎那米韋(zanamivir))已經(jīng)獲得批準(zhǔn)(非專利文獻(xiàn)1)。另一方面，近年來(lái)，作為抑制特定基因的表達(dá)的方法之一，發(fā)現(xiàn)了RNA干擾(RNAi；RNAinterference之略)。RNA干擾是指通過(guò)與靶標(biāo)基因的特定區(qū)域同源的雙鏈RNA，特異性地切割作為靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的mRNA的同源部分，來(lái)抑制靶標(biāo)基因表達(dá)的生命現(xiàn)象(專利文獻(xiàn)1)。已知在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，如果將長(zhǎng)鏈雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，則會(huì)誘導(dǎo)出干擾素，弓丨起細(xì)胞凋亡；但如果將2123bp的短鏈雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，則可以在不引起細(xì)胞凋亡的情況下特異性地切割靶標(biāo)基因的mRNA，抑制靶標(biāo)基因的功能(專利文獻(xiàn)2)。而且，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中引起RNA干擾的短鏈雙鏈RNA稱作siRNA(smallinterferingRNA(小干擾RNA)之略)。專利文獻(xiàn)1國(guó)際公開(kāi)1999/32619號(hào)小冊(cè)子專利文獻(xiàn)2國(guó)際公開(kāi)2001/075164號(hào)小冊(cè)子非專利文獻(xiàn)1菅谷憲夫、日本臨床、2006年、64卷、p.1840-184
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明所要解決的問(wèn)題然而，現(xiàn)狀中，準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)流感病毒的流行株是非常困難的，當(dāng)流行株的預(yù)測(cè)出現(xiàn)偏差時(shí)，流感疫苗的效果就會(huì)顯著地降低。此外，即使在流行株的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確時(shí)，流感疫苗的施用仍會(huì)引起發(fā)熱、發(fā)疹、痙攣、過(guò)敏性休克以及肝功能障礙等副作用，最壞的情況甚至有死亡的病例。而且，金剛烷胺是以甲型流感病毒的M2蛋白質(zhì)為靶標(biāo)的抗流感病毒劑，因此其對(duì)不具有M2蛋白質(zhì)的乙型流感病毒無(wú)效。此外，神經(jīng)氨酸酶抑制劑對(duì)乙型流感病毒的效果弱，而另一方面還存在嚴(yán)重副作用的問(wèn)題。即，目前的狀況是，與甲型流感病毒相比，尚沒(méi)有針對(duì)乙型流感病毒的有效治療方法。因而，本發(fā)明的目的是抑制廣范圍的乙型流感病毒株的復(fù)制，治療、預(yù)防乙型流感病毒引起的傳染病。解決問(wèn)題的方法為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種通過(guò)RNA干擾抑制乙型流感病毒的復(fù)制的雙鏈RNA，所述雙鏈RNA包含從乙型流感病毒的基因組RNA轉(zhuǎn)錄的mRNA的一部分同源的1925個(gè)堿基的RNA和該RNA的反義RNA。本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)由與從乙型流感病毒的基因組RNA轉(zhuǎn)錄的mRNA的一部分同源的1925個(gè)堿基的RNA和該RNA的反義RNA構(gòu)成的雙鏈RNA能夠抑制乙型流感病毒的復(fù)制，如果在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入該雙鏈RNA，能夠有效果地治療、預(yù)防乙型流感病毒引起的傳染病。上述mRNA優(yōu)選為NP蛋白質(zhì)基因、RNA聚合酶PA亞單位基因、RNA聚合酶PBl亞單位基因或RNA聚合酶PB2亞單位基因的mRNA。如果將包含與從NP蛋白質(zhì)基因、RNA聚合酶PA亞單位基因、RNA聚合酶PBl亞單位基因、或RNA聚合酶PB2亞單位基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的一部分同源的1925個(gè)堿基的RNA和該RNA的反義RNA的雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，則能夠通過(guò)RNA干擾特異性地切割從所述基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的mRNA，抑制乙型流感病毒的復(fù)制。上述RNA優(yōu)選選自由序列表的SEQIDNO157所示的堿基序列構(gòu)成的RNA、或者選自由在序列表的SEQIDNO:157所示的堿基序列中取代13個(gè)核苷酸而得到的堿基序列構(gòu)成的RNA；更優(yōu)選選自由序列表的SEQIDNO111所示的堿基序列構(gòu)成的RNA、或者選自由在序列表的SEQIDNO:111所示的堿基序列中取代13個(gè)核苷酸而得到的堿基序列構(gòu)成的RNA。如果將由具有序列表的SEQIDNO157所示的堿基序列的任意RNA和該RNA的反義RNA構(gòu)成的雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，則能夠通過(guò)RNA干擾更強(qiáng)地抑制乙型流感病毒的復(fù)制。此外，如果將由具有序列表的SEQIDNO:111所示的堿基序列的任意RNA和該RNA的反義RNA構(gòu)成的雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，則能夠抑制更廣范圍的乙型流感病毒株的復(fù)制。上述雙鏈RNA優(yōu)選在利用使用B/Joharmesburg/5/99株的轉(zhuǎn)染微陣列進(jìn)行的雙鏈RNA的篩選中，S/N比為3以上。S/N比為3以上的雙鏈RNA能夠更特異性地進(jìn)行基于RNA干擾的mRNA切割。上述RNA可以包含1個(gè)以上的修飾核糖核苷酸，上述修飾核糖核苷酸優(yōu)選核糖環(huán)的2’-OH基任選被氟基、甲基、甲氧基乙基或丙基取代。此外，上述RNA中的1個(gè)以上的磷酸二酯鍵任選被硫代磷酸酯(phosphorothioate)鍵取代。導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的RNA能夠被細(xì)胞中的核糖核酸酶所分解，如果對(duì)RNA鏈進(jìn)行了上述修飾，則其對(duì)核糖核酸酶具有抗性，能夠有效地發(fā)揮RNA干擾作用。上述雙鏈RNA可以形成平滑末端，優(yōu)選其有義鏈以及反義鏈的3’末端添加了14個(gè)堿基的DNA或RNA從而形成了突出端的雙鏈RNA。形成了突出端的雙鏈RNA的RNA干擾作用強(qiáng)，能夠更顯著地抑制乙型流感病毒的復(fù)制。此外，本發(fā)明提供一種發(fā)夾型RNA，該發(fā)夾型RNA能夠在細(xì)胞內(nèi)形成上述的雙鏈RNA,該發(fā)夾型RNA是與從乙型流感病毒的基因組RNA轉(zhuǎn)錄的mRNA的一部分同源的RNA和該RNA的反義RNA通過(guò)接頭序列連接而成的。上述發(fā)夾型RNA的制備中不需要使2種單鏈RNA退火來(lái)形成雙鏈RNA，而僅需采用化學(xué)合成等方式制備1種RNA即可，因而操作容易。而且，發(fā)夾型RNA在細(xì)胞內(nèi)形成雙鏈RNA，因而能夠發(fā)揮RNA干擾作用，抑制乙型流感病毒的復(fù)制。上述雙鏈RNA優(yōu)選抑制作為乙型流感病毒株的B/Joharmesburg(約翰內(nèi)斯堡)/5/99株、B/Shangdong(山東)/07/97株、B/HongKong(香港)/8/73株、B/Shanghai(上海)/361/2002株以及B/Victoria(維多利亞)/2/87株全部這些病毒株的復(fù)制。能夠抑制上述所有流感病毒株的復(fù)制的雙鏈RNA，在流感病毒株發(fā)生突變時(shí)仍然有效的可能性高。本發(fā)明提供一種載體，其是用于雙鏈RNA表達(dá)的載體，該載體包含第一DNA和與該第一DNA互補(bǔ)的第二DNA，且分別在所述第一DNA和所述第二DNA的5，側(cè)包含啟動(dòng)子，所述第一DNA與選自由序列表的SEQIDNO:157所示的堿基序列構(gòu)成的RNA中的RNA、或選自由在序列表的SEQIDNO:157所示的堿基序列中取代13個(gè)核苷酸而得到的堿基序列構(gòu)成的RNA中的RNA互補(bǔ)；其中，所述載體在導(dǎo)入了該載體的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出與所述第一DNA互補(bǔ)的第一RNA和與所述第二DNA互補(bǔ)的第二RNA，所述第一RNA與所述第二RNA相互雜交形成雙鏈RNA。此外，本發(fā)明提供一種載體，其是用于雙鏈RNA表達(dá)的載體，該載體包含第一DNA和第二DNA，且分別在所述第一DNA和所述第二DNA的5，側(cè)包含啟動(dòng)子，所述第一DNA與選自由序列表的SEQIDNO:157所示的堿基序列構(gòu)成的RNA中的RNA、或者選自由在序列表的SEQIDNO:157所示的堿基序列中取代13個(gè)核苷酸而得到的堿基序列構(gòu)成的RNA中的RNA的3’末端添加14個(gè)堿基的RNA而得到的RNA互補(bǔ)，所述第二DNA與選自由序列表的SEQIDNO:157所示的堿基序列構(gòu)成的RNA中的RNA的反義RNA、或者選自由在序列表的SEQIDNO:157所示的堿基序列中取代13個(gè)核苷酸而得到的堿基序列構(gòu)成的RNA中的RNA的反義RNA的3’末端添加14個(gè)堿基的RNA而得到的RNA互補(bǔ)；其中，所述載體在導(dǎo)入了該載體的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出與所述第一DNA互補(bǔ)的第一RNA和與所述第二DNA互補(bǔ)的第二RNA，所述第一RNA與所述第二RNA相互雜交形成雙鏈RNA。此外，本發(fā)明提供一種載體，其是用于發(fā)夾型RNA表達(dá)的載體，該載體包含DNA鏈，且在所述DNA鏈的5，側(cè)包含啟動(dòng)子，所述DNA鏈編碼發(fā)夾型RNA，所述DNA鏈?zhǔn)怯膳c下述RNA互補(bǔ)的反義DNA和與該反義DNA互補(bǔ)的DNA通過(guò)接頭序列連接而成的，所述RNA選自由序列表中SEQIDNO:157所示堿基序列構(gòu)成的RNA或選自由在序列表的SEQIDNO:157所示堿基序列中取代13個(gè)核苷酸而得到的堿基序列構(gòu)成的RNA；其中，所述載體在導(dǎo)入該載體的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出所述發(fā)夾型RNA，所述發(fā)夾型RNA在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過(guò)加工從而形成雙鏈RNA。如果將上述載體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，則能夠在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)地轉(zhuǎn)錄引起RNA干擾的雙鏈RNA，從而長(zhǎng)期抑制乙型流感病毒的復(fù)制。為了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有效地表達(dá)雙鏈RNA，上述載體優(yōu)選為質(zhì)粒載體或病毒載體。此外，如果將上述雙鏈RNA、上述發(fā)夾型RNA或上述載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物的細(xì)胞，則能夠抑制乙型流感病毒的復(fù)制，因而其可作為醫(yī)藥組合物或抗流感病毒劑加以利用。上述醫(yī)藥組合物或抗流感病毒劑也可以包含多種上述雙鏈RNA、上述發(fā)夾型RNA或上述載體。如實(shí)施例所示，因雙鏈RNA的序列而異，有些情況下對(duì)某病毒株不顯示效果，有些情況下，通過(guò)組合使用多種雙鏈RNA，對(duì)這種病毒株也能夠發(fā)揮效果。此外，如實(shí)施例所示，有些情況下，長(zhǎng)時(shí)間使用1種雙鏈RNA效果會(huì)減弱，有些情況下，通過(guò)組合使用多種雙鏈RNA，能夠更長(zhǎng)時(shí)間地保持效果。而且，由上述雙鏈RNA或上述發(fā)夾型RNA或者上述載體產(chǎn)生的雙鏈RNA具有特異性地切割乙型流感病毒來(lái)源的mRNA的活性，因此，包含上述雙鏈RNA、上述發(fā)夾型RNA或上述載體、以及轉(zhuǎn)導(dǎo)試劑的試劑盒可以作為乙型流感病毒的檢測(cè)試劑盒加以利用。上述醫(yī)藥組合物或抗流感病毒劑還可以包含通過(guò)RNA干擾抑制甲型流感病毒的復(fù)制的雙鏈RNA。不論感染病原體是甲型還是乙型流感病毒，這樣的醫(yī)藥組合物或抗流感病毒劑均能發(fā)揮治療效果，而且還可以應(yīng)對(duì)這兩個(gè)病毒株同時(shí)引起重疊感染的情況。發(fā)明效果如果將本發(fā)明的雙鏈RNA、發(fā)夾型RNA以及載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物的細(xì)胞，則能夠有效果地治療、預(yù)防乙型流感病毒引起的傳染病。此外，本發(fā)明的雙鏈RNA對(duì)于多種乙型流感病毒株具有抑制病毒復(fù)制的活性，因而，當(dāng)出現(xiàn)雙鏈RNA的靶標(biāo)序列中具有突變的乙型流感病毒時(shí)，也能夠切割病毒來(lái)源的mRNA，抑制乙型流感病毒的復(fù)制。因此，即使在乙型流感病毒的流行株不確定的情況下，也能夠發(fā)揮針對(duì)乙型流感病毒引起的傳染病的治療效果。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物和抗流感病毒劑可以同時(shí)包含兩種以上的雙鏈RNA。舉例來(lái)說(shuō)，可以同時(shí)使用至少一種甲型流感病毒靶向的雙鏈RNA和至少一種乙型流感病毒靶向的雙鏈RNA。通過(guò)這種使用方法，不論感染病原體是甲型還是乙型流感病毒，均可以使用本醫(yī)藥組合物，即使發(fā)生由兩種病毒株同時(shí)引起的重疊感染，也可以應(yīng)對(duì)。此外，再舉例來(lái)說(shuō)，可以同時(shí)使用至少兩種以上乙型流感病毒靶向的雙鏈RNA。通過(guò)這種使用方法，能夠擴(kuò)大和增強(qiáng)感染病原體為乙型流感病毒時(shí)的雙鏈RNA的效果。[圖1]示出了利用轉(zhuǎn)染微陣列進(jìn)行抑制乙型流感病毒復(fù)制的雙鏈RNA的篩選的方法的規(guī)程。[圖2](A)顯示了雙鏈RNANP-1496單獨(dú)使用、B-NP-1999-13單獨(dú)使用、以及NP-1496和B-NP-1999-13組合使用時(shí)，針對(duì)流感病毒B/Johannesburg/5/99株的抑制率。(B)顯示了雙鏈RNANP-1496單獨(dú)使用、B-NP-1999-13單獨(dú)使用、以及NP-1496禾口B-NP-1999-13組合使用時(shí)，針對(duì)流感病毒A/PR/8/34株的抑制率。[圖3](A)顯示了雙鏈RNAB-PB2-1997-7單獨(dú)使用、B-PB1-1999-1單獨(dú)使用以及B-PB2-1997-7和B-PB1-1999-1組合使用時(shí)，針對(duì)流感病毒B/Shanghai/361/2002株的抑制率。(B)顯示了雙鏈RNAB-PB2-1997-7單獨(dú)使用、B-PB1-1999-1單獨(dú)使用以及B-PB2-1997-7和B-PB1-1999-1組合使用時(shí)，針對(duì)流感病毒B/Shangdong/07/97株的抑制率。[圖4](A)顯示了培養(yǎng)18小時(shí)時(shí)，雙鏈RNAB-NP-1999-3單獨(dú)使用、B-NP-1999-13單獨(dú)使用以及B-NP-1999-3以及B-NP-1999-13組合使用針對(duì)流感病毒B/Shanghai/361/2002株的抑制率。(B)顯示了培養(yǎng)18小時(shí)時(shí)，雙鏈RNAB-NP-1999-3單獨(dú)使用、B-NP-1999-13單獨(dú)使用以及B-NP-1999-3以及B-NP-1999-13組合使用針對(duì)流感病毒B/Shangdong/07/97株的抑制率。(C)顯示了培養(yǎng)30小時(shí)時(shí)，雙鏈RNAB-NP-1999-3單獨(dú)使用、B-NP-1999-13單獨(dú)使用以及B-NP-1999-3以及B-NP-1999-13組合使用針對(duì)流感病毒B/Shanghai/^ei/^OO〗株的抑制率。(D)顯示了培養(yǎng)30小時(shí)時(shí)，雙鏈RNAB-NP-1999-3單獨(dú)使用、B-NP-1999-13單獨(dú)使用以及B-NP-1999-3以及B-NP-1999-13組合使用針對(duì)流感病毒B/Shangdong/07/97株的抑制率。符號(hào)說(shuō)明1...點(diǎn)樣位置、2...點(diǎn)樣器、3...載玻片、4...雙鏈RNA微陣列、5...細(xì)胞懸浮液、6...平皿、7...乙型流感病毒液、8...染色后的雙鏈RNA微陣列發(fā)明的具體實(shí)施例方式以下，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明。首先，對(duì)本發(fā)明的雙鏈RNA進(jìn)行說(shuō)明。本發(fā)明的雙鏈RNA是通過(guò)RNA干擾抑制乙型流感病毒的復(fù)制的雙鏈RNA，其包含與從乙型流感病毒的基因組RNA轉(zhuǎn)錄的mRNA的一部分同源的1925個(gè)堿基的RNA和該RNA的反義RNA(或由與從乙型流感病毒的基因組RNA轉(zhuǎn)錄的mRNA的一部分同源的1925個(gè)堿基的RNA和該RNA的反義RNA構(gòu)成)?！巴ㄟ^(guò)RNA干擾抑制乙型流感病毒的復(fù)制”是指并非直接抑制構(gòu)成流感病毒的蛋白質(zhì)的合成，而是通過(guò)序列特異性地切割作為靶標(biāo)的病毒基因的mRNA來(lái)進(jìn)行抑制，也包括一過(guò)性地抑制病毒的復(fù)制。這對(duì)于“通過(guò)RNA干擾抑制甲型流感病毒的復(fù)制”而言也是一樣的?！癛NA”是指一種核酸，其是由核糖、磷酸以及堿基(腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶)構(gòu)成的核糖核苷酸的聚合物。RNA能夠像DNA那樣形成互補(bǔ)氫鍵，因而可以是單鏈、雙鏈或發(fā)夾型RNA的結(jié)構(gòu)。RNA可以采用傳統(tǒng)的化學(xué)合成方法來(lái)合成，例如可以使用核酸合成儀來(lái)合成，通過(guò)在體外(invitro)使模板DNA轉(zhuǎn)錄(體外轉(zhuǎn)錄)來(lái)合成。此時(shí)，通過(guò)預(yù)先合成長(zhǎng)的雙鏈RNA，再用切丁酶進(jìn)行處理，可以得到1925bp的短雙鏈RNA的混合物?！耙倚土鞲胁《尽笔侵笇儆谡巢《究频?、感染人而引起流感的RNA病毒。在乙型流感病毒的由負(fù)鏈單鏈RNA構(gòu)成的RNA基因組上，具有編碼血凝素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、NB蛋白質(zhì)(NB),RNA聚合酶PA亞基(PA),RNA聚合酶PBl亞基(PBl),RNA聚合酶PB2亞基(PB2)、Ml蛋白質(zhì)(Ml)、BM2蛋白質(zhì)(BM2)、NP蛋白質(zhì)(核蛋白；NP)以及NS蛋白質(zhì)(非結(jié)構(gòu)蛋白；NS)的病毒基因。如果乙型流感病毒感染人，則以基因組RNA為模板、在病毒本身所具有的RNA依賴RNA聚合酶的作用下轉(zhuǎn)錄出各病毒基因的mRNA，在宿主細(xì)胞的核糖體合成各病毒蛋白質(zhì)，通過(guò)其它途徑復(fù)制出的病毒基因組與這樣的一組病毒蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)聚集，從而復(fù)制出病毒粒子。因此，上述病毒基因的翻譯產(chǎn)物對(duì)乙型流感病毒的復(fù)制而言是必需的，如果能夠抑制這些基因的表達(dá)，就能夠?qū)σ倚土鞲胁《疽鸬膫魅静∵M(jìn)行治療、預(yù)防。上述的雙鏈RNA可以這樣制備分別合成與乙型流感病毒的血凝素(HA)基因、神經(jīng)氨酸酶基因、NB蛋白質(zhì)基因、RNA聚合酶PA亞單位基因、RNA聚合酶PB1亞單位基因、RNA聚合酶PB2亞單位基因、Ml蛋白質(zhì)基因、BM2蛋白質(zhì)基因、NP蛋白質(zhì)基因或NS蛋白質(zhì)基因的mRNA的一部分同源的1925個(gè)堿基的RNA、以及該RNA的反義RNA，并使這些RNA退火。為了能夠強(qiáng)力抑制乙型流感病毒的復(fù)制，作為靶標(biāo)的mRNA優(yōu)選為乙型流感病毒的NP蛋白質(zhì)基因、RNA聚合酶PA亞單位基因、RNA聚合酶PBl亞單位基因或RNA聚合酶PB2亞單位基因的mRNA，更優(yōu)選為NP蛋白質(zhì)基因的mRNA。乙型流感病毒的各基因的堿基序列已經(jīng)在GenBank等基因數(shù)據(jù)庫(kù)中公開(kāi)，基于這些堿基序列信息能夠設(shè)計(jì)構(gòu)成雙鏈RNA的RNA。上述RNA優(yōu)選選自由序列表的SEQIDNO157所示的堿基序列構(gòu)成的RNA，或者選自由在序列表的SEQIDNO:157所示的堿基序列中取代13個(gè)核苷酸而得到的堿基序列構(gòu)成的RNA；更優(yōu)選選自由序列表的SEQIDNO111所示的堿基序列構(gòu)成的RNA，或者選自由在序列表的SEQIDNO:111所示的堿基序列中取代13個(gè)核苷酸而得到的堿基序列構(gòu)成的RNA。序列表的SEQIDNO:157所示的堿基序列是乙型流感病毒的NP蛋白質(zhì)基因、RNA聚合酶PA亞單位基因、RNA聚合酶PBl亞單位基因以及RNA聚合酶PB2亞單位基因的mRNA的部分序列，基于這些基因的堿基序列信息，能夠設(shè)計(jì)構(gòu)成雙鏈RNA的RNA。上述RNA中，為了賦予對(duì)核糖核酸酶引起的分解的抗性，可以包含1個(gè)以上的修飾核糖核苷酸，作為修飾核糖核苷酸，可以示例出核糖環(huán)的2’-OH基被氟基、甲基、甲氧基乙基或丙基取代而得到的核糖核苷酸。作為可被取代的核糖環(huán)，可以是嘧啶、嘌呤或它們的組合，嘧啶優(yōu)選例如胞嘧啶、胞嘧啶衍生物、尿嘧啶、尿嘧啶衍生物或它們的組合。為了保護(hù)RNA免受核糖核酸酶的分解，雙鏈RNA的有義鏈或反義鏈中的一種RNA鏈中可以包含上述修飾核糖核苷酸，也可以這兩種RNA鏈均包含修飾核糖核苷酸。為了使RNA具有對(duì)核糖核酸酶分解的抗性，RNA的1個(gè)以上的磷酸二酯鍵可以被硫代磷酸酯鍵所取代。將核糖環(huán)的2’-OH基用其它官能團(tuán)取代、或者將磷酸二酯鍵用硫代磷酸酯鍵取代，是本領(lǐng)域技術(shù)人員采用傳統(tǒng)方法的化學(xué)合成方法即可進(jìn)行的。乙型流感病毒的流行株根據(jù)血凝素(HA)的抗原性的不同，可以大致分為B/維多利亞/2/87和B/山形/16/88這兩類，每年流行的病毒株是屬于各組的不同病毒株。作為乙型流感病毒株，可以示例出例如B/Johannesburg/5/99株、B/Shangdong/07/97株、B/HongKong/8/73株、B/Shanghai/361/2002株以及B/Victoria/2/87株。上述雙鏈RNA優(yōu)選抑制作為乙型流感病毒株的B/Joharmesburg/5/99株、B/Shangdong/07/97株、B/HongKong/8/73株、B/Shanghai/361/2002株以及B/Victoria/2/87株中的2種以上病毒株的復(fù)制，更優(yōu)選抑制3種以上病毒株的復(fù)制，更優(yōu)選抑制所有病毒株的復(fù)制。為了避免在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)干擾素而引起細(xì)胞凋亡，上述雙鏈RNA優(yōu)選為1925bp，更優(yōu)選為1923bp，更優(yōu)選為1921bp。此外，本發(fā)明的雙鏈RNA優(yōu)選在其有義鏈以及反義鏈的3’末端添加14個(gè)堿基的DNA或RNA，從而形成突出端，該突出端更優(yōu)選由2個(gè)堿基的DNA或RNA構(gòu)成。此外，雙鏈RNA的反義鏈的突出端的堿基序列優(yōu)選與靶標(biāo)基因的mRNA互補(bǔ)，但并非必須互補(bǔ)，具有任意堿基序列的DNA或RNA均可添加在3’末端。而且，該突出端優(yōu)選由DNA構(gòu)成。此外，本發(fā)明的發(fā)夾型RNA是可在細(xì)胞內(nèi)形成上述雙鏈RNA的發(fā)夾型RNA，其中，與從乙型流感病毒的基因組RNA轉(zhuǎn)錄的mRNA的一部分同源的RNA和該RNA的反義RNA通過(guò)接頭序列連接在一起。接頭序列只要是不抑制發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成的序列即可，可以使用任意序列，接頭序列的長(zhǎng)度優(yōu)選為46個(gè)堿基，更優(yōu)選為4個(gè)堿基。抑制乙型流感病毒的復(fù)制的雙鏈RNA的篩選例如可以這樣進(jìn)行在動(dòng)物細(xì)胞(例如MDCK細(xì)胞)中導(dǎo)入雙鏈RNA，使其感染乙型流感病毒，并以是否誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為指標(biāo)來(lái)進(jìn)行。S卩，當(dāng)將切割乙型流感病毒來(lái)源的mRNA的雙鏈RNA導(dǎo)入了細(xì)胞時(shí)，即使在乙型流感病毒侵入動(dòng)物細(xì)胞的情況下，也能夠在細(xì)胞內(nèi)抑制病毒的復(fù)制，而不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，當(dāng)細(xì)胞存活時(shí)，可以判定導(dǎo)入該細(xì)胞的雙鏈RNA是抑制乙型流感病毒的復(fù)制的雙鏈RNA。另一方面，當(dāng)將不切割乙型流感病毒來(lái)源的mRNA的雙鏈RNA導(dǎo)入了細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)發(fā)生病毒的復(fù)制，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而且，誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡的細(xì)胞會(huì)死亡，而從培養(yǎng)平板上脫離，因此，根據(jù)培養(yǎng)平板上貼附生長(zhǎng)的細(xì)胞數(shù)的比例，可以對(duì)抑制乙型流感病毒的復(fù)制的雙鏈RNA的活性(以下稱為抗流感病毒活性)的強(qiáng)度進(jìn)行判定。上述篩選可以使用轉(zhuǎn)染微陣列來(lái)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染微陣列的系統(tǒng)可以使用例如CytoPathfinder公司的固相系基因?qū)爰夹g(shù)。在使用轉(zhuǎn)染微陣列進(jìn)行的篩選中，首先，將隨機(jī)合成的雙鏈RNA點(diǎn)樣在載玻片上，來(lái)制作雙鏈RNA微陣列。此時(shí)，需要對(duì)雙鏈RNA的堿基序列與點(diǎn)樣位置之間的關(guān)系進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)化，以使得能夠清楚哪個(gè)雙鏈PNA被點(diǎn)樣在載玻片上的哪個(gè)點(diǎn)樣位置上。然后，將雙鏈RNA微陣列放入平皿中進(jìn)行固定，通過(guò)向其中注入細(xì)胞與培養(yǎng)基的懸浮液來(lái)將MDCK細(xì)胞播種在雙鏈RNA微陣列上。培養(yǎng)1天，則點(diǎn)樣到雙鏈RNA微陣列上的雙鏈RNA通過(guò)細(xì)胞膜被導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)，因而，如果將乙型流感病毒溶液添加到培養(yǎng)基中并進(jìn)行培養(yǎng)，則未誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而存活下來(lái)的細(xì)胞會(huì)繼續(xù)附著在雙鏈RNA微陣列的特定點(diǎn)樣位置上，而誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡的細(xì)胞則或從雙鏈RNA微陣列上脫離，因此，以附著有細(xì)胞的點(diǎn)樣位置作為指標(biāo)，能夠篩選具有抗流感病毒活性的雙鏈RNA。即，根據(jù)附著有細(xì)胞的點(diǎn)樣位置的信息，能夠獲得具有抗流感病毒活性的雙鏈RNA的堿基序列。下面，對(duì)本發(fā)明的載體進(jìn)行說(shuō)明。本發(fā)明的載體的第一方式是用于雙鏈RNA表達(dá)的載體，該載體包含第一DNA和與該第一DNA互補(bǔ)的第二DNA，且分別在所述第一DNA和所述第二DNA的5，側(cè)包含啟動(dòng)子，所述第一DNA與選自由序列表的SEQIDNO:157所示的堿基序列構(gòu)成的RNA中的RNA、或選自由在序列表的SEQIDNO:157所示的堿基序列中取代13個(gè)核苷酸而得到的堿基序列構(gòu)成的RNA中的RNA互補(bǔ)；其中，所述載體在導(dǎo)入了該載體的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出與所述第一DNA互補(bǔ)的第一RNA和與所述第二DNA互補(bǔ)的第二RNA，所述第一RNA與所述第二RNA相互雜交形成雙鏈RNA。可以示例出例如編碼雙鏈RNA的有義鏈的DNA與第一啟動(dòng)子可調(diào)控連接、且編碼雙鏈RNA的反義鏈的DNA與第二啟動(dòng)子可調(diào)控連接的載體。這種情況下，雙鏈RNA的有義鏈以及反義鏈分別獨(dú)立地轉(zhuǎn)錄，各自的啟動(dòng)子可以相同，也可以彼此不同。上述方式還可以是一種載體，其是用于雙鏈RNA表達(dá)的載體，該載體包含第一DNA和第二DNA，且分別在所述第一DNA和所述第二DNA的5，側(cè)包含啟動(dòng)子，所述第一DNA與選自由序列表的SEQIDNO:157所示的堿基序列構(gòu)成的RNA中的RNA、或者選自由在序列表的SEQIDNO:157所示的堿基序列中取代13個(gè)核苷酸而得到的堿基序列構(gòu)成的RNA中的RNA的3’末端添加14個(gè)堿基的RNA而得到的RNA互補(bǔ)，所述第二DNA與選自由序列表的SEQIDNO:157所示的堿基序列構(gòu)成的RNA中的RNA的反義RNA、或者選自由在序列表的SEQIDNO:157所示的堿基序列中取代13個(gè)核苷酸而得到的堿基序列構(gòu)成的RNA中的RNA的反義RNA的3’末端添加14個(gè)堿基的RNA而得到的RNA互補(bǔ)；其中，所述載體在導(dǎo)入了該載體的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出與所述第一DNA互補(bǔ)的第一RNA和與所述第二DNA互補(bǔ)的第二RNA，所述第一RNA與所述第二RNA相互雜交形成雙鏈RNA。本發(fā)明的載體的第二方式是用于發(fā)夾型RNA表達(dá)的載體，該載體包含DNA鏈，且在所述DNA鏈的5’側(cè)包含啟動(dòng)子，所述DNA鏈編碼發(fā)夾型RNA，所述DNA鏈?zhǔn)怯膳c下述RNA互補(bǔ)的反義DNA和與該反義DNA互補(bǔ)的DNA通過(guò)接頭序列連接而成的，所述RNA選自由序列表中SEQIDNO:157所示堿基序列構(gòu)成的RNA或選自由在序列表的SEQIDNO:157所示堿基序列中取代13個(gè)核苷酸而得到的堿基序列構(gòu)成的RNA；其中，所述載體在導(dǎo)入該載體的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出所述發(fā)夾型RNA，所述發(fā)夾型RNA在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過(guò)加工從而形成雙鏈RNA?？梢允纠隼缇幋a發(fā)夾型RNA的DNA與單一啟動(dòng)子可調(diào)控連接的載體，所述DNA由編碼雙鏈RNA的有義鏈和反義鏈的DNA通過(guò)接頭序列連接而成。這種情況下，產(chǎn)生由雙鏈RNA的有義鏈與反義鏈通過(guò)接頭序列連接而成的單鏈RNA。該單鏈RNA通過(guò)有義鏈部分與反義鏈部分之間進(jìn)行退火，形成發(fā)夾型RNA。接頭序列只要是不抑制發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成的序列即可，可以使用任意序列，接頭序列的長(zhǎng)度優(yōu)選為46個(gè)堿基，更優(yōu)選為4個(gè)堿基。上述載體用于通過(guò)基因重組技術(shù)制作抑制乙型流感病毒的復(fù)制的雙鏈RNA，其只要能夠在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄目的RNA來(lái)制作雙鏈RNA即可。上述載體可以是質(zhì)?；虿《镜男问?，其中除了啟動(dòng)子以外，還可以包含復(fù)制起點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止序列(終止子)、選擇標(biāo)記(新霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因、氨芐西林抗性基因等)，視需要還可以包含增強(qiáng)子、多腺苷酸化信號(hào)等。作為質(zhì)粒載體，可以列舉出例如pcDNA3、pUC、pBR322、pBluescript等，作為病毒載體，可以列舉出腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、桿狀病毒、痘苗病毒等。作為RNA的模板而組合在載體上的DNA可以采用本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的方法來(lái)合成，將其插入到指示RNA的轉(zhuǎn)錄合成的合適啟動(dòng)子的調(diào)控下即可。作為啟動(dòng)子，可以示例出CMV啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTR以及金屬硫蛋白啟動(dòng)子，還可以列舉出作為RNA聚合酶III啟動(dòng)子的U6啟動(dòng)子以及Hl啟動(dòng)子。此外，啟動(dòng)子還可以是可以改變表達(dá)的“開(kāi)”或“關(guān)”的誘導(dǎo)性啟動(dòng)子。而且，載體構(gòu)建所必需的分子生物學(xué)方法記載于MolecularCloningALaboratoryManual(Sambrook等，ColdSpringHarbor>N.Y.>1989年)。此外，上述雙鏈RNA、上述發(fā)夾型RNA或上述載體可以作為以乙型流感病毒引起的傳染病的治療和預(yù)防為目的的醫(yī)藥組合物或抗流感病毒劑使用。上述的醫(yī)藥組合物以及抗流感病毒劑包含上述雙鏈RNA、上述發(fā)夾型RNA或上述載體中的至少1種以上作為有效成分，視需要還可以包含藥學(xué)可接受的添加劑。此外，從上述雙鏈RNA、或上述發(fā)夾型RNA或者上述載體產(chǎn)生的雙鏈RNA能夠特異性地切割乙型流感病毒的靶標(biāo)基因的mRNA，可以作為利用該特性的乙型流感病毒檢測(cè)試劑盒使用。上述檢測(cè)試劑盒中除了上述雙鏈RNA、上述發(fā)夾型RNA或上述載體之外，還可以包含轉(zhuǎn)導(dǎo)試劑。作為轉(zhuǎn)導(dǎo)試劑，可以列舉出例如下述試劑，該試劑是包含脂質(zhì)的試劑，該脂質(zhì)能夠與目的載體形成復(fù)合體，將載體導(dǎo)入靶標(biāo)細(xì)胞。作為適用于轉(zhuǎn)導(dǎo)試劑的脂質(zhì)，可以示例出例如多胺脂質(zhì)、陽(yáng)離子性脂質(zhì)、多陽(yáng)離子性脂質(zhì)、膽固醇、中性脂質(zhì)、陽(yáng)離子性多胺脂質(zhì)。上述醫(yī)藥組合物以及抗流感病毒劑還可以包含通過(guò)RNA干擾抑制甲型流感病毒的復(fù)制的雙鏈RNA。抑制甲型流感病毒的復(fù)制的雙鏈RNA是公知的，優(yōu)選利用例如美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)2006/0160759號(hào)說(shuō)明書(shū)、美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)2006/0275265號(hào)說(shuō)明書(shū)、國(guó)際公開(kāi)2004/028471號(hào)小冊(cè)子以及國(guó)際公開(kāi)2006/102461號(hào)小冊(cè)子等中記載的抑制甲型流感病毒的復(fù)制的雙鏈RNA。實(shí)施例以下，通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的說(shuō)明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限定。(雙鏈RNA的設(shè)計(jì)與合成)為了獲得能夠通過(guò)RNA干擾切割由乙型流感病毒的病毒基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的雙鏈RNA，基于乙型流感病毒B/Joharmesburg/5/99株的8種病毒基因的堿基序列信息(GenBank登錄號(hào)CY018613(血凝素基因)、CY018614(M1蛋白質(zhì)基因以及BM2蛋白質(zhì)基因)、CY018615(神經(jīng)氨酸酶基因以及NB蛋白質(zhì)基因)、CY018616(NP蛋白質(zhì)基因)、CY018617(NS1蛋白質(zhì)基因以及NS2蛋白質(zhì)基因)、CY018618(RNA聚合酶PA亞單位基因)、CY018619(RNA聚合酶PBl亞單位基因)、CY018620(RNA聚合酶PB2亞單位基因))，設(shè)計(jì)了包含與這些基因的部分序列互補(bǔ)的1925個(gè)堿基的RNA和該RNA的反義RNA的2，360種雙鏈RNA。這些雙鏈RNA的RNA干擾的靶標(biāo)mRNA的序列如序列表的SEQIDNO:12，360所示。雙鏈RNA的設(shè)計(jì)參考了KhvorovaA.等的文獻(xiàn)(Cell、2003年、115卷、2號(hào)、p.209-216)、SchwarzDS.等的文獻(xiàn)(Cell、2003年、115卷、2號(hào)、p.199-208),HsiehAC.等的文獻(xiàn)(Nuc1.AcidsRes.、2004年、32卷、3號(hào)、p.893-901)、ReynoldsΑ.等的文獻(xiàn)(Nat.Biotechnol.、2004年、22卷、3號(hào)、p.326-330)以及Ui-TeiK.等的文獻(xiàn)(Nucl.AcidsRes.、2004年、32卷、3號(hào)、p.936-948)，來(lái)選擇能夠引起RNA干擾的序列。從設(shè)計(jì)的2，360種雙鏈RNA中選擇出80種雙鏈RNA，分別合成了在與從乙型流感病毒的病毒基因轉(zhuǎn)錄的mRNA具有同源序列的RNA的3’末端添加2個(gè)dTTP而成的RNA，以及在其反義RNA的3’末端基于上述堿基序列信息添加與mRNA互補(bǔ)的2個(gè)堿基的DNA而成的RNA。在退火緩沖液(IOOmMKOAc、2mMMg0Ac、30mMHEPES_KOH、pH7.4)中混合所合成的RNA及其反義RNA的組合，使得兩者的摩爾數(shù)相等，90°C進(jìn)行5分鐘的變性處理后，37°C溫育1小時(shí)來(lái)進(jìn)行退火，從而得到了雙鏈RNA。(利用轉(zhuǎn)染微陣列的雙鏈RNA篩選方法)圖1示出了利用轉(zhuǎn)染微陣列進(jìn)行的抑制乙型流感病毒的復(fù)制的雙鏈RNA的篩選方法的規(guī)程。首先，按照?qǐng)DI(A)所示的規(guī)程，制備雙鏈RNA混合溶液。具體地，在微量管中加入不合血清的DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco，sModifiedEagle，sMedium)25μL，在向其中加入10(^11的雙鏈1^(1IOyL)并進(jìn)行混合，然后，加入15μL的轉(zhuǎn)導(dǎo)試劑(Lipofectamine2000；Invitrogen公司)并進(jìn)行混合，靜置20分鐘。然后，向微量管中的溶液中添加細(xì)胞粘附因子(纖連蛋白)10200μg并進(jìn)行混合，制備了用于雙鏈RNA微陣列4的制作的雙鏈RNA混合溶液。接下來(lái)，如圖I(B)所示，將雙鏈RNA混合溶液充填在點(diǎn)樣器2中，點(diǎn)樣于設(shè)置在載玻片3上的指定點(diǎn)樣位置1，制作了雙鏈RNA微陣列4。此時(shí)，對(duì)于不抑制乙型流感病毒的復(fù)制的陰性對(duì)照用雙鏈RNA(QIAGENCat.No.1022076；以下稱為對(duì)照雙鏈RNA)的雙鏈RNA混合溶液也同樣地點(diǎn)樣在載玻片3上。對(duì)于這樣制作的雙鏈RNA微陣列4，將點(diǎn)樣位置1與雙鏈RNA的序列信息之間的關(guān)系數(shù)據(jù)庫(kù)化，使得能夠事后跟蹤哪個(gè)點(diǎn)樣位置上點(diǎn)樣了具有哪個(gè)堿基序列的雙鏈RNA。然后，如圖1⑶所示，將雙鏈RNA微陣列4放入平皿6中，通過(guò)注入含有MDCK細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液5來(lái)進(jìn)行播種，使細(xì)胞附著在雙鏈RNA微陣列4上，37°C培養(yǎng)1天。其結(jié)果是，點(diǎn)樣到雙鏈RNA微陣列4上的各雙鏈RNA透過(guò)貼附在各點(diǎn)樣位置1上的MDCK細(xì)胞的細(xì)胞膜，被導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。然后，將制備成效價(jià)為1.8X107pfu/mL的5mL乙型流感病毒液7注入平皿6中，37°C培養(yǎng)2347小時(shí)。其結(jié)果是，在MDCK細(xì)胞中發(fā)生病毒的復(fù)制、誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡的細(xì)胞從雙鏈RNA微陣列4上脫離。然后，將雙鏈RNA微陣列4從平皿6中取出，用PBS清洗，將殘留在雙鏈RNA微陣列4上的存活細(xì)胞用乙醇固定，將固定的存活細(xì)胞用結(jié)晶紫進(jìn)行了染色。對(duì)于染色后的雙鏈RNA微陣列8，在風(fēng)干后用DNA微陣列掃描器(GenePiX4200)進(jìn)行掃描，獲得了用于分析殘留有存活細(xì)胞的點(diǎn)樣位置1的熒光圖像。對(duì)于這樣獲得的熒光圖像，將其用圖像解析軟件(GenePixProVer.6.0)進(jìn)行分析，計(jì)算出各點(diǎn)樣位置1內(nèi)的總像素?cái)?shù)?？傁袼?cái)?shù)是與細(xì)胞殘留面積和存活細(xì)胞數(shù)相當(dāng)?shù)闹?，因而基于該總像素?cái)?shù)，可以對(duì)抗流感病毒活性及其強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)價(jià)。利用轉(zhuǎn)染微陣列進(jìn)行的雙鏈RNA的篩選，使用各雙鏈RNA的點(diǎn)樣位置1不同的6張雙鏈RNA微陣列4反復(fù)進(jìn)行，在各雙鏈RNA的點(diǎn)樣位置1的總像素?cái)?shù)與對(duì)照雙鏈RNA的點(diǎn)樣位置1的總像素?cái)?shù)之間進(jìn)行如下所示的統(tǒng)計(jì)學(xué)假說(shuō)檢驗(yàn)，對(duì)于6張中有4張以上能夠確認(rèn)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異的雙鏈RNA，判定其為具有抗流感病毒活性的雙鏈RNA。統(tǒng)計(jì)學(xué)假說(shuō)檢驗(yàn)規(guī)程1.首先，對(duì)于使用6張雙鏈RNA微陣列獲得的對(duì)照雙鏈RNA的點(diǎn)樣位置的總像素?cái)?shù)與各雙鏈RNA的點(diǎn)樣位置的總像素?cái)?shù)的正態(tài)性進(jìn)行核對(duì)(W檢驗(yàn)、顯著性水平10%)。當(dāng)兩者遵循正態(tài)分布時(shí)，對(duì)兩組的平均值的差異進(jìn)行檢驗(yàn)(至規(guī)程2)；當(dāng)其中任何一組的總像素?cái)?shù)不遵循正態(tài)分布時(shí)，進(jìn)行非參數(shù)性的兩組的代表值的差異的檢驗(yàn)(至規(guī)程5)。2.進(jìn)行對(duì)照雙鏈RNA的點(diǎn)樣位置的總像素?cái)?shù)與各雙鏈RNA的點(diǎn)樣位置的總像素?cái)?shù)的同方差性的檢驗(yàn)(F檢驗(yàn)、顯著性水平25%、雙側(cè)檢驗(yàn))。當(dāng)為同方差時(shí)，進(jìn)行Student'st檢驗(yàn)(規(guī)程3)；當(dāng)為非同方差時(shí)，進(jìn)行Welch’st檢驗(yàn)(規(guī)程4)。3.在Student’st檢驗(yàn)中，進(jìn)行對(duì)照雙鏈RNA的點(diǎn)樣位置的總像素?cái)?shù)與各雙鏈RNA的點(diǎn)樣位置的總像素?cái)?shù)的平均值的差異的檢驗(yàn)(顯著性水平1%、單側(cè)檢驗(yàn))。4.在Welch’st檢驗(yàn)中，進(jìn)行對(duì)照雙鏈RNA的點(diǎn)樣位置的總像素?cái)?shù)與各雙鏈RNA的點(diǎn)樣位置的總像素?cái)?shù)的平均值的差異的檢驗(yàn)(顯著性水平1%、單側(cè)檢驗(yàn))。5.在Marm-Whitney’sU檢驗(yàn)中，進(jìn)行對(duì)照雙鏈RNA的點(diǎn)樣位置的總像素?cái)?shù)的代表值與各雙鏈RNA的點(diǎn)樣位置的總像素?cái)?shù)的代表值的差異的檢驗(yàn)(顯著性水平1%、單側(cè)檢驗(yàn))。而且，在判定為具有抗流感病毒活性的雙鏈RNA的雙鏈RNA中，對(duì)于S/N比(SignaltoNoiseratio，信噪比)平均為3以上的雙鏈RNA，判定為具有顯著的抗流感病毒活性的雙鏈RNA。這里，S/N比是指在利用了微陣列的篩選系統(tǒng)中，由陰性對(duì)照得到的信號(hào)的強(qiáng)度(N)與由所評(píng)價(jià)的檢測(cè)物得到的信號(hào)的強(qiáng)度(S)之比，在利用轉(zhuǎn)染微陣列進(jìn)行的雙鏈RNA的篩選中，其是用于表示RNA干擾效果的強(qiáng)度的指標(biāo)。具體地，S/N比是使用上述的根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)假說(shuō)檢驗(yàn)確定為具有抗流感病毒活性的各雙鏈RNA的點(diǎn)樣位置的總像素?cái)?shù)的平均值(μsample)、對(duì)照雙鏈RNA的點(diǎn)樣位置的總像素?cái)?shù)的平均值(μneg)和無(wú)偏標(biāo)準(zhǔn)偏差(δneg)，按下式定義的值。SZNK=PsamnpleInegT^neg本篩選方法中，各點(diǎn)樣位置的殘留細(xì)胞數(shù)表示RNA干擾效果的強(qiáng)度，因此，可以通過(guò)S/N比來(lái)評(píng)價(jià)在上述的統(tǒng)計(jì)學(xué)假說(shuō)檢驗(yàn)中確認(rèn)了顯著差異的雙鏈RNA的點(diǎn)樣位置的總像素?cái)?shù)在何種程度上多于對(duì)照雙鏈RNA的點(diǎn)樣位置的總像素?cái)?shù)。當(dāng)對(duì)照雙鏈RNA的點(diǎn)樣位置的總像素?cái)?shù)的分布符合正態(tài)分布時(shí)，無(wú)偏標(biāo)準(zhǔn)偏差(Sneg)相當(dāng)于正態(tài)分布曲線的拐點(diǎn)，在Pneg士3Sneg的范圍內(nèi)包含了99.73%的數(shù)據(jù)。這種情況下，如果可使S/N比的檢測(cè)限為3以上，則在上式中，平均值的差為3Sneg以上，從而保證了雙鏈RNA的點(diǎn)樣位置的總像素?cái)?shù)的平均值不包含在對(duì)照雙鏈RNA的點(diǎn)樣位置的總像素?cái)?shù)的分布的99.73%范圍內(nèi)。在本篩選方法中，使用6張雙鏈RNA微陣列來(lái)考察抗流感病毒活性，因而，按照以下規(guī)程預(yù)先將雙鏈RNA的點(diǎn)樣位置的總像素?cái)?shù)正態(tài)化(標(biāo)準(zhǔn)化)來(lái)求出S/N比。1.對(duì)于每一個(gè)雙鏈RNA微陣列，使用對(duì)照雙鏈RNA的點(diǎn)樣位置的總像素?cái)?shù)的平均值(μneg)和無(wú)偏標(biāo)準(zhǔn)偏差(δneg)，將各雙鏈RNA的點(diǎn)樣位置的總像素?cái)?shù)正態(tài)化。2.使用正態(tài)化的各雙鏈RNA的點(diǎn)樣位置的總像素?cái)?shù)計(jì)算S/N比。3.將S/N比的平均值為3以上的雙鏈RNA判定為具有顯著的抗流感病毒活性的雙鏈RNA。在上述篩選方法中，當(dāng)切割乙型流感病毒來(lái)源的mRNA的雙鏈RNA被導(dǎo)入MDCK細(xì)胞中時(shí)，即使MDCK細(xì)胞被乙型流感病毒侵染，也能夠抑制細(xì)胞內(nèi)病毒的復(fù)制，其結(jié)果是，不會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，當(dāng)細(xì)胞存活并附著在點(diǎn)樣位置1上時(shí)，可以將導(dǎo)入該細(xì)胞中的雙鏈RNA判定為抑制乙型流感病毒的復(fù)制的雙鏈RNA，并且，點(diǎn)樣位置1內(nèi)的總像素?cái)?shù)越多，可以將抑制乙型流感病毒的復(fù)制的作用判定為越強(qiáng)。另一方面，當(dāng)不切割乙型流感病毒來(lái)源的mRNA的雙鏈RNA被導(dǎo)入MDCK細(xì)胞中時(shí)，細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行病毒的復(fù)制，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。弓丨發(fā)了細(xì)胞凋亡的細(xì)胞從雙鏈RNA微陣列4上脫離，因此，當(dāng)點(diǎn)樣位置1上的細(xì)胞脫離時(shí)，可以將導(dǎo)入該細(xì)胞中的雙鏈RNA判定為不能抑制乙型流感病毒的復(fù)制的雙鏈RNA。因此，如果清楚有存活細(xì)胞殘留、附著的點(diǎn)樣位置1，就可以通過(guò)對(duì)預(yù)先構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，來(lái)知曉有抗流感病毒活性的雙鏈RNA的堿基序列。而且，上述的利用轉(zhuǎn)染微陣列的篩選中使用了CytoPathfinder公司的轉(zhuǎn)染微陣(TransfectionMicroArray(iiillSi豐示))。(實(shí)施例1)抑制乙型流感病毒B/Joharmesburg/5/99株的復(fù)制的雙鏈RNA的篩選按照上述的利用轉(zhuǎn)染微陣列進(jìn)行的雙鏈RNA的篩選方法，從合成的80種雙鏈RNA中篩選了抑制乙型流感病毒B/Joharmesburg/5/99株的復(fù)制的雙鏈RNA。此時(shí)，添加病毒株后的培養(yǎng)時(shí)間為34小時(shí)。表1示出了抑制乙型流感病毒B/Joharmesburg/5/99株的感染引起的病毒的復(fù)制、抑制細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)的雙鏈RNA的反義鏈以及有義鏈的堿基序列。而且，在S/N比>3一列中有白圈的雙鏈RNA表示S/N比平均為3以上、對(duì)病毒的復(fù)制具有顯著的抗流感病毒活性的雙鏈RNA。[表1]<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>其結(jié)果是，有52個(gè)雙鏈RNA確認(rèn)了與對(duì)照雙鏈RNA之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，這其中，S/N比的平均值為3以上的雙鏈RNA有26個(gè)。(實(shí)施例2)抑制乙型流感病毒B/Joharmesburg/5/99株以外的病毒株的復(fù)制的雙鏈RNA的篩選在合成的80種雙鏈RNA中，對(duì)于未對(duì)B/Johannesburg/5/99株顯示抗流感病毒活性的28個(gè)，研究了其是否對(duì)其它乙型流感病毒株具有抗流感病毒活性。作為乙型流感病毒株，使用了B/Shangdong/07/97、B/HongKong/8/73、B/Shanghai/361/2002以及B/Victoria/2/87株，向?qū)嵤├?那樣，采用上述的利用轉(zhuǎn)染微陣列進(jìn)行的雙鏈RNA的篩選方法進(jìn)行了試驗(yàn)。但，從將病毒株加入平皿內(nèi)到發(fā)生細(xì)胞脫離的培養(yǎng)時(shí)間因病毒株而異，因此，添加病毒株后的培養(yǎng)時(shí)間對(duì)B/Shangdong/07/97株而言為23小時(shí)，對(duì)B/HongKong/8/73株而言為36小時(shí)，對(duì)B/Shanghai/361/2002株而言為26小時(shí)，對(duì)于B/Victoria/2/87株而言是47小時(shí)。表2示出了抑制乙型流感病毒B/Shangdong/07/97、B/HongKong/8/73、B/Shanghai/361/2002或B/Victoria/2/87株感染引起的病毒的復(fù)制、抑制細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)的雙鏈RNA的反義鏈以及有義鏈的堿基序列。而且，在S/N比>3之列中有白圈的雙鏈RNA表示S/N比的平均值對(duì)任何病毒株而言均為3以上、對(duì)病毒的復(fù)制具有顯著的抗流感病毒活性的雙鏈RNA。[表2]<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>其結(jié)果是，有3個(gè)雙鏈RNA(B-PB2-1999-02、B-PB1-1999-17以及B-PB1-1999-26)對(duì)B/Shangdong/07/97株的感染與對(duì)照雙鏈RNA之間確認(rèn)了統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，這其中，S/N比的平均值為3以上的雙鏈RNA有1個(gè)(B-PB2-1999-2)。有2個(gè)雙鏈RNA(B-PB2-1999-2以及B-PB1-1999-24)對(duì)B/HongKong/8/73株的感染與對(duì)照雙鏈RNA之間確認(rèn)了統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，但其中沒(méi)有雙鏈RNA的S/N比的平均值為3以上。有1個(gè)雙鏈RNA(B-PB2-1999-6)對(duì)B/Shanghai/361/2002株的感染與對(duì)照雙鏈RNA之間確認(rèn)了統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，但沒(méi)有雙鏈RNA的S/N比的平均值為3以上。另一方面，沒(méi)有雙鏈RNA對(duì)B/Victoria/2/87株的感染與對(duì)照雙鏈RNA之間確認(rèn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。與實(shí)施例1的結(jié)果合起來(lái)考慮，對(duì)5株乙型流感病毒中的任何一個(gè)均顯示抗流感病毒活性的雙鏈RNA有57個(gè)。此外，這57個(gè)雙鏈RNA中有39個(gè)的S/N比的平均值對(duì)任何病毒株而言均為3以上，其具有顯著的抗流感病毒活性。因此，可以認(rèn)為即使在今后流行的乙型流感病毒株出現(xiàn)各種突變的情況下，這57個(gè)雙鏈RNA中總有一些能夠抑制病毒的復(fù)制，對(duì)乙型流感的治療顯示有效性。(實(shí)施例3)同時(shí)抑制多種乙型流感病毒株的復(fù)制的雙鏈RNA的篩選流行的乙型流感病毒株的預(yù)測(cè)是困難的，而且即使預(yù)測(cè)準(zhǔn)確也有很高的可能性產(chǎn)生突變，因而，可以認(rèn)為如果有一種雙鏈RNA能夠抑制多種乙型流感病毒株的復(fù)制，就能夠?qū)崿F(xiàn)乙型流感病毒引起的傳染病的治療、預(yù)防。因而，在實(shí)施例1中對(duì)乙型流感病毒B/Joharmesburg/5/99株顯示抗流感病毒活性的52個(gè)雙鏈RNA中，進(jìn)一步篩選了對(duì)B/Shangdong/07/97、B/HongKong/8/73、B/Shanghai/361/2002以及B/Victoria/2/87株這些病毒株均具有抗流感病毒活性的雙鏈RNA。篩選是像實(shí)施例1和2那樣，采用上述的利用轉(zhuǎn)染微陣列進(jìn)行的雙鏈RNA的篩選方法來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)。此時(shí)，使用了雙鏈RNA微陣列，所述雙鏈RNA微陣列的載片上除了實(shí)施例1中顯示抗流感病毒活性的52個(gè)雙鏈RNA之外，還點(diǎn)樣有據(jù)報(bào)告稱能抑制乙型流感病毒的復(fù)制的雙鏈RNA(PB1-P0S以及PB2-P0S)作為陽(yáng)性對(duì)照。而且，有報(bào)道稱，PBl-POS以及PB2-P0S是由與AntiviralTherapy(2006年、11卷、p.431-438)中記載的PB1-2196以及PB2-1999相同的堿基序列構(gòu)成的雙鏈RNA，它們分別通過(guò)RNA干擾切割RNA聚合酶PBl亞基(PBl)基因以及RNA聚合酶PB2亞基(PB2)基因的mRNA。表3中示出了，抑制乙型流感病毒B/Johannesburg/5/99株、B/Shangdong/07/97株、B/HongKong/8/73株、B/Shanghai/361/2002株和B/Victoria/2/87株的感染引起的病毒的復(fù)制、抑制細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)的雙鏈RNA的ID及其S/N比的值。[表3]IS/N比的值雙鍵RNA鴆號(hào)B/J0ntnnetburcZs/胩抹JB/ShwdonK/07/97抹Ig/HoniKona/a/73抹IB/Shwghw/3S1/)02^IB/Vjctwia/2/87^"PB1.P0ST2108NO3.0NOPB^POS__1Λ____ND__U__NO_B-NP-t999-02t329^OT9J"ZZBH4P-t999-0323.66813.930.416.5999-0432.182.6&S3αβB-NP-1S98-0537.017^Rt27.578JY6237.716.27Λ36.76.8IM7.5B-^P-1999-1020.861J12.731.314.5β-ΝΡ-1999-115.93M6.11&48.7B-NP~1999-129.74Z27.521Λ3.5B-NP-1B99-1332.285·2IU37J17.5B-WP-1980-14I_14.[56.g__8.0_|5.2_|__其結(jié)果是，在52個(gè)雙鏈RNA中，對(duì)于上述5株病毒株的感染均確認(rèn)與對(duì)照雙鏈RNA之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異的雙鏈RNA有11個(gè)，這11個(gè)雙鏈RNA對(duì)任何病毒株均顯示顯著的抗流感病毒活性，其中，S/N比的平均值為3以上。另一方面，陽(yáng)性對(duì)照的PBl-POS對(duì)B/Shangdong/07/97株以及B/Shanghai/361/2002株顯示出抗流感病毒活性，但對(duì)其它病毒株基本上未顯示抗流感病毒活性。此外，陽(yáng)性對(duì)照的PB2-P0S對(duì)B/Johannesburg/5/99株以及B/Shangdong/07/97株顯示抗流感病毒活性，但其活性非常弱，而且對(duì)其它病毒株不顯示抗流感病毒活性。而且，有意思的是，上述的11個(gè)雙鏈RNA的反義鏈均是具有NP蛋白質(zhì)的mRNA的互補(bǔ)序列的RNA。(實(shí)施例4)靶標(biāo)序列有突變的雙鏈RNA的抗流感病毒活性在實(shí)施例3中發(fā)現(xiàn)的、對(duì)5株乙型流感病毒具有顯著的抗流感病毒活性的雙鏈RNA中，對(duì)于B-NP-1999-13(SEQIDNO10)，比較了其與上述5株病毒株的mRNA的堿基序列的同源性。對(duì)于B/Johannesburg/5/99株以外的4個(gè)株，參照了登錄于Genbank的堿基序列(B/Shangdong/7/97株登錄號(hào)AY0441698，B/HongKong/8/73株登錄號(hào)EF456777，B/Shanghai/361/2002株登錄號(hào)AJ784078，B/Victoria/2/87株登錄號(hào)AF100359)。其結(jié)果是，B-NP-1999-13相對(duì)于B/HongKong/8/73具有3個(gè)堿基的錯(cuò)配，但卻顯示顯著的抗流感病毒活性。此外，相對(duì)于B/Victoria/2/87株在反義鏈的5，末端起的第2個(gè)堿基存在錯(cuò)配，但卻同樣地顯示出顯著的抗流感病毒活性。一般而言，雙鏈RNA的錯(cuò)配從末端起越接近中央，或者錯(cuò)配的堿基越多，RNA干擾作用越弱，但特別是在B-NP-1999-13中，盡管存在3個(gè)堿基的錯(cuò)配，但仍具有RNA干擾作用，顯示出顯著的抗流感病毒活性。該結(jié)果提示因雙鏈RNA的堿基序列而異，有些即使存在錯(cuò)配仍然具有顯著的抗流感病毒活性。這些雙鏈RNA不是對(duì)一種、而是對(duì)多種乙型流感病毒株具有抗流感病毒活性，因而這提示當(dāng)流行株是在雙鏈RNA的靶標(biāo)序列中攜帶突變的流感病毒株時(shí)，對(duì)于這種傳染病也能夠發(fā)揮充分的治療效果。(實(shí)施例5)甲型流感病毒和乙型流感病毒靶向的雙鏈RNA的組合使用對(duì)同時(shí)使用多種雙鏈RNA時(shí)對(duì)流感病毒的效果進(jìn)行了驗(yàn)證。作為針對(duì)甲型流感病毒的雙鏈RNA，化學(xué)合成了國(guó)際公開(kāi)2004/028471號(hào)小冊(cè)子中記載的siRNA——NP-14960表4顯示了NP-1496的堿基序列(5，末端一3，末端)。在NP-1496的有義鏈以及反義鏈的3’末端添加了2個(gè)脫氧胸腺嘧啶核苷酸，表4中的小字示出了這些殘基。將合成的RNA及其反義RNA的組合在退火緩沖液(IOOmM醋酸鉀、2mM醋酸鎂、30mMHEPES_K0H、pH7.4)中混合，并使得兩者摩爾數(shù)相等，90°C進(jìn)行5分鐘的變性處理后，通過(guò)37°C溫育1小時(shí)進(jìn)行退火，形成了雙鏈RNA。作為針對(duì)乙型流感病毒的雙鏈RNA，使用了上述的B-NP-1999-13。[表4]<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>將MDCK細(xì)胞懸浮于RPMI1640培養(yǎng)基中，制備成1\107細(xì)胞/11^。在其中混合NP-1496和B-NP-1999-13。將MDCK細(xì)胞和雙鏈RNA的混合液800μL轉(zhuǎn)移到電極間距離4mm寬的電穿孔杯(生產(chǎn)商島津制作所)中。使用島津基因?qū)胙b置(GTE-10)，在電壓400V、電容容量800μF的條件下施加電脈沖后，冰上靜置5分鐘。將懸浮液用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋，使其為IXIO6細(xì)胞/mL，添加終濃度10%的FCS。將其以0.ImL/孔播種于96孔板。37°C>5%CO2存在下培養(yǎng)1天。使用A/PR/8/34作為甲型流感病毒，使用B/Joharmesburg/5/99作為乙型流感病毒。將制備成IXIO4PfuAiL的各病毒以50μL/孔添加于導(dǎo)入了SiRNA的MDCK細(xì)胞，進(jìn)行了病毒感染。培養(yǎng)24小時(shí)后，將感染細(xì)胞用乙醇固定。為了采用ELISA法對(duì)感染細(xì)胞中表達(dá)的病毒蛋白進(jìn)行定量，將固定后的細(xì)胞用10%脫脂牛乳封閉后，添加作為第一抗體的抗甲型流感病毒核蛋白抗體(生產(chǎn)商SeroteC、MCA400)或抗乙型流感病毒核蛋白抗體(生產(chǎn)商Serotec、MCA403)。然后，添加作為二次抗體的HRP(horseradishperoxidase，辣根過(guò)氧化物酶)標(biāo)記兔免疫抗小鼠IgG，使其識(shí)別第一抗體，使用HRP的底物即TMB(3，3’，5，5，-tetramethyl-benzidene，3，3，，5，5，_四甲基聯(lián)苯胺)進(jìn)行生色，測(cè)定了波長(zhǎng)450nm的吸光度。根據(jù)未感染病毒的陰性對(duì)照孔與未添加siRNA而感染了病毒的陽(yáng)性對(duì)照孔的值，按照下式計(jì)算出導(dǎo)入了siRNA的孔的抑制率。抑制率=(陽(yáng)性對(duì)照孔的吸光度-樣品孔的吸光度)X100/(陽(yáng)性對(duì)照的吸光度_陰性對(duì)照孔的吸光度)結(jié)果如圖2所示。如圖2(A)所示，在單獨(dú)使用0.Inmol/mL的B_NP_1999_13時(shí)，對(duì)于B/Joharmesburg/5/99病毒，可見(jiàn)約100%的抑制活性。此外，如圖2(B)所示，在單獨(dú)使用Inmol/mL的雙鏈RNANP-1496時(shí)，相對(duì)于A/PR/8/34，可見(jiàn)約90%的抑制活性。在混合使用這些雙鏈RNA時(shí)，在感染了任何病毒時(shí)均具有抗病毒活性，觀察到了與單獨(dú)使用每種雙鏈RNA時(shí)同等程度的活性。(實(shí)施例6)乙型流感病毒靶向的雙鏈RNA的組合使用以及抗病毒譜的擴(kuò)展將雙鏈RNAB-PB2-1999-7和B-PB1-1999-1用于試驗(yàn)。作為病毒，使用了B/Shanghai/361/2002和B/Shangdong/07/97。像實(shí)施例5那樣在MDCK細(xì)胞中混合上述雙鏈RNA，通過(guò)電穿孔將其導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。培養(yǎng)1天后，用上述乙型流感病毒分別進(jìn)行感染，通過(guò)使用乙型流感病毒抗體的ELISA對(duì)18小時(shí)后的病毒蛋白進(jìn)行了定量，測(cè)定了雙鏈RNA的組合使用效果。結(jié)果如圖3所示。如圖3仏)所示，當(dāng)以0.25歷01/1^使用8^^2-1999-7時(shí)，對(duì)8/Shanghai/361/2002顯示約100%的抑制活性；而如圖3(B)所示，對(duì)B/Shangdong/07/97僅顯示約30%的弱活性。此外，如圖3A所示，當(dāng)以0.25nmol/mL使用B-PB1-1999-1時(shí)，對(duì)B/Shanghai/361/2002僅顯示約20%的抑制活性；而如圖3(B)所示，對(duì)B/Shangdong/07/97顯示約90%的抑制活性。通過(guò)混合使用這兩種雙鏈RNA，對(duì)任何病毒株均可以確認(rèn)約90%以上的強(qiáng)活性。這樣，因雙鏈RNA的序列而異，雖然有些情況下對(duì)病毒株不顯示效果，但通過(guò)組合使用多種雙鏈RNA，對(duì)這樣的病毒株也能夠顯示效果。(實(shí)施例7)乙型流感病毒靶向的雙鏈RNA的組合使用效果將雙鏈RNAB-NP-1999-3和B-NP-1999-13用于試驗(yàn)。作為病毒，使用了B/Shanghai/361/2002和B/Shangdong/07/97。像實(shí)施例5那樣在MDCK細(xì)胞中混合上述雙鏈RNA，通過(guò)電穿孔將其導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。培養(yǎng)1天后，用上述乙型流感病毒株分別進(jìn)行感染，通過(guò)使用乙型流感病毒抗體的ELISA對(duì)18-30小時(shí)后的病毒蛋白進(jìn)行了定量，測(cè)定了雙鏈RNA的組合使用效果。結(jié)果如圖4所示。如圖4㈧和圖4(B)所示，兩種雙鏈RNA在培養(yǎng)18小時(shí)的情況下，無(wú)論單獨(dú)還是組合使用對(duì)兩種病毒株均顯示80%以上的抑制活性。另一方面，如圖4(C)所示，在培養(yǎng)30小時(shí)的情況下，單獨(dú)使用0.Inmol/mL的B-NP-1999-3或0.05nmol/mL的B-NP-1999-13時(shí)，對(duì)B/Shanghai/361/2002分別僅確認(rèn)到約10%的效果。而在混合使用這兩種雙鏈RNA時(shí)，對(duì)B/Shanghai/361/2002確認(rèn)了約70%的抑制活性。此外，同樣如圖4(D)所示，當(dāng)分別單獨(dú)使用0.lhmol/mL的B-NP-1999-3或0.05nmol/mL的B-NP-1999-13時(shí)，對(duì)于B/Shangdong/07/97分別顯示50%和0%的抑制效果；但當(dāng)混合它們時(shí)，對(duì)B/Shangdong/07/97可以確認(rèn)80%的抑制活性。這樣，雖然有些情況下使用一種雙鏈RNA在病毒培養(yǎng)時(shí)間變長(zhǎng)時(shí)效果會(huì)減弱，但，即使在這種情況下，通過(guò)組合使用多種雙鏈RNA，仍可顯示持續(xù)效果。權(quán)利要求一種雙鏈RNA，其通過(guò)RNA干擾來(lái)抑制乙型流感病毒的復(fù)制，所述雙鏈RNA包含與從所述乙型流感病毒的基因組RNA轉(zhuǎn)錄的mRNA的一部分同源的19～25個(gè)堿基的RNA，以及該RNA的反義RNA。2.權(quán)利要求1所述的雙鏈RNA，其中，所述mRNA為NP蛋白質(zhì)基因、RNA聚合酶PA亞單位基因、RNA聚合酶PBl亞單位基因或RNA聚合酶PB2亞單位基因的mRNA。3.權(quán)利要求1或2所述的雙鏈RNA，其中，所述RNA選自由序列表中SEQIDNO157所示堿基序列構(gòu)成的RNA，或者選自由下述堿基序列構(gòu)成的RNA，所述堿基序列是在序列表的SEQIDNO:157所示堿基序列中取代13個(gè)核苷酸而得到的。4.權(quán)利要求1或2所述的雙鏈RNA，其中，所述RNA選自由序列表中SEQIDNO111所示堿基序列構(gòu)成的RNA，或者選自由下述堿基序列構(gòu)成的RNA，所述堿基序列是在序列表的SEQIDNO111所示的堿基序列中取代13個(gè)核苷酸而得到的。5.權(quán)利要求1或2所述的雙鏈RNA，其在利用使用B/Joharmesburg/5/99株的轉(zhuǎn)染微陣列進(jìn)行雙鏈RNA篩選時(shí)，S/N比為3以上。6.權(quán)利要求15中任一項(xiàng)所述的雙鏈RNA，其中，所述RNA任選包含1個(gè)以上的修飾核糖核苷酸。7.權(quán)利要求16中任一項(xiàng)所述的雙鏈RNA，其中，所述RNA中的1個(gè)以上磷酸二酯鍵任選被硫代磷酸酯鍵取代。8.權(quán)利要求17中任一項(xiàng)所述的雙鏈RNA，其中形成有平滑末端。9.一種雙鏈RNA，其是這樣形成的在權(quán)利要求17中任一項(xiàng)所述的雙鏈RNA的有義鏈和反義鏈的3’末端添加14個(gè)堿基的DNA或RNA來(lái)形成突出端。10.一種發(fā)夾型RNA，該發(fā)夾型RNA在細(xì)胞內(nèi)形成權(quán)利要求15中任一項(xiàng)所述的雙鏈RNA，其是這樣形成的與從所述乙型流感病毒的基因組RNA轉(zhuǎn)錄的mRNA的一部分同源的RNA和該RNA的反義RNA通過(guò)接頭序列連接在一起。11.一種用于雙鏈RNA表達(dá)的載體，該載體包含第一DNA和與該第一DNA互補(bǔ)的第二DNA,且分別在所述第一DNA和所述第二DNA的5，側(cè)包含啟動(dòng)子，所述第一DNA與下述RNA互補(bǔ)選自由序列表中SEQIDNO157所示堿基序列構(gòu)成的RNA中的RNA、或選自由在序列表的SEQIDNO:157所示堿基序列中取代13個(gè)核苷酸而得到的堿基序列構(gòu)成的RNA中的RNA；其中，所述載體在導(dǎo)入了該載體的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出與所述第一DNA互補(bǔ)的第一RNA和與所述第二DNA互補(bǔ)的第二RNA，所述第一RNA與所述第二RNA相互雜交形成雙鏈RNA。12.一種用于雙鏈RNA表達(dá)的載體，該載體包含第一DNA和第二DNA，且分別在所述第一DNA和所述第二DNA的5，側(cè)包含啟動(dòng)子，所述第一DNA與在下述RNA的3，末端添加14個(gè)堿基的RNA而得到的RNA互補(bǔ)，所述RNA選自由序列表中SEQIDNO157所示堿基序列構(gòu)成的RNA、或者選自由在序列表的SEQIDNO:157所示堿基序列中取代13個(gè)核苷酸而得到的堿基序列構(gòu)成的RNA，所述第二DNA與在下述RNA的反義RNA的3’末端添力口14個(gè)堿基的RNA而得到的RNA互補(bǔ)，所述RNA選自由序列表中SEQIDNO157所示堿基序列構(gòu)成的RNA中的RNA、或者選自由在序列表的SEQIDNO:157所示堿基序列中取代13個(gè)核苷酸而得到的堿基序列構(gòu)成的RNA中的RNA；其中，所述載體在導(dǎo)入了該載體的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出與所述第一DNA互補(bǔ)的第一RNA和與所述第二DNA互補(bǔ)的第二RNA，所述第一RNA與所述第二RNA相互雜交形成雙鏈RNA。13.一種用于發(fā)夾型RNA表達(dá)的載體，該載體包含編碼發(fā)夾型RNA的DNA鏈，且在該DNA鏈的5’側(cè)包含啟動(dòng)子，所述DNA鏈?zhǔn)怯膳c下述RNA互補(bǔ)的反義DNA和與該反義DNA互補(bǔ)的DNA通過(guò)接頭序列連接而成的，所述RNA選自由序列表中SEQIDNO157所示堿基序列構(gòu)成的RNA或選自由在序列表的SEQIDNO:157所示堿基序列中取代13個(gè)核苷酸而得到的堿基序列構(gòu)成的RNA；其中，所述載體在導(dǎo)入該載體的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出所述發(fā)夾型RNA，所述發(fā)夾型RNA在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過(guò)加工從而形成雙鏈RNA。14.一種醫(yī)藥組合物，其包含權(quán)利要求19中任一項(xiàng)所述的雙鏈RNA、權(quán)利要求10所述的發(fā)夾型RNA或權(quán)利要求1113中任一項(xiàng)所述的載體中的至少1種以上作為有效成分。15.一種抗流感病毒劑，其包含權(quán)利要求19中任一項(xiàng)所述的雙鏈RNA、權(quán)利要求10所述的發(fā)夾型RNA或權(quán)利要求1113中任一項(xiàng)所述的載體中的至少1種以上作為有效成分。16.一種乙型流感病毒檢測(cè)試劑盒，其包含權(quán)利要求19中任一項(xiàng)所述的雙鏈RNA、權(quán)利要求10所述的發(fā)夾型RNA或權(quán)利要求1113中任一項(xiàng)所述的載體，以及轉(zhuǎn)導(dǎo)試劑。17.權(quán)利要求14所述的醫(yī)藥組合物，其還包含通過(guò)RNA干擾抑制甲型流感病毒的復(fù)制的雙鏈RNA。18.權(quán)利要求15所述的抗流感病毒劑，其還包含通過(guò)RNA干擾抑制甲型流感病毒復(fù)制的雙鏈RNA。全文摘要本發(fā)明提供一種通過(guò)RNA干擾抑制乙型流感病毒的復(fù)制的雙鏈RNA，所述雙鏈RNA包含與從所述乙型流感病毒的基因組RNA轉(zhuǎn)錄的mRNA的一部分同源的19～25個(gè)堿基的RNA、以及該RNA的反義RNA。文檔編號(hào)A61K31/713GK101802191SQ20088010535公開(kāi)日2010年8月11日申請(qǐng)日期2008年7月2日優(yōu)先權(quán)日2007年7月3日發(fā)明者三宅正人,上田尚學(xué),中澤美紗子,吉川智啟,藤田芳司,門脅信悅申請(qǐng)人:杏林制藥株式會(huì)社;株式會(huì)社賽特帕斯凡德