專利名稱：脂質(zhì)體介導(dǎo)構(gòu)建表達(dá)hPEPT2的海拉細(xì)胞方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表達(dá)hPEPT2的海拉細(xì)胞的構(gòu)建方法，尤其是一種操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)染率高的脂質(zhì)體介導(dǎo)構(gòu)建表達(dá)hPEPT2的海拉細(xì)胞方法。
背景技術(shù)：
藥物代謝動(dòng)力學(xué)是研究藥物活性成分、組分等在體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄 (ADME)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，體內(nèi)量-時(shí)效關(guān)系，并用數(shù)學(xué)函數(shù)加以定量描述的一門科學(xué)。藥物在體內(nèi)進(jìn)吸收、分布、代謝以后，最終以原形或代謝產(chǎn)物經(jīng)由尿、糞便等途徑排出體外，因此藥物排泄尤其是以經(jīng)腎的尿排泄過程是藥物研究中重要的一環(huán)。由于轉(zhuǎn)運(yùn)體是介導(dǎo)分子或離子轉(zhuǎn)運(yùn)跨過生物膜的物質(zhì)，其作用貫穿于ADME過程的始終，為此，國(guó)內(nèi)外藥物代謝研究領(lǐng)域聚焦在CYP450代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體兩大方面。PEPT2 (peptide transporter幻是一種高親和力、低容量的人寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)體，它在人體中分布廣泛，主要表達(dá)在腎近端小管，在腎小管重吸收中起重要作用。PEPT2不僅能轉(zhuǎn)運(yùn)二、三肽，也可以識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)許多仿肽類藥物，如內(nèi)酰胺抗生素、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、貝他定等。目前，已有可表達(dá)hPEPT2的海拉(hela)細(xì)胞，為藥物的排泄過程研究提供了一個(gè)高效、完整的生物體外模型，可以為藥物的篩選、合理應(yīng)用以及毒副反應(yīng)的預(yù)測(cè)提供重要的理論依據(jù)?，F(xiàn)有的表達(dá)hPEPT2的海拉細(xì)胞的構(gòu)建方法基本上是DEAE-葡聚糖法及磷酸鈣法， DEAE-葡聚糖法雖然相對(duì)便宜，但對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用，常用于維持時(shí)間較短的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染；磷酸鈣法雖操作簡(jiǎn)便但重復(fù)性差。盡管脂質(zhì)體介導(dǎo)也是構(gòu)建轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的常用方法，具有操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)染率高等特點(diǎn)，但是迄今為止還沒有將脂質(zhì)體介導(dǎo)法應(yīng)用于構(gòu)建表達(dá) hPEPT2的海拉細(xì)胞的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問題，提供一種操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)染率高的脂質(zhì)體介導(dǎo)構(gòu)建表達(dá)hPEPT2的海拉細(xì)胞方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種脂質(zhì)體介導(dǎo)構(gòu)建表達(dá)hPEPT2的海拉細(xì)胞方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行—種脂質(zhì)體介導(dǎo)構(gòu)建表達(dá)hPEPT2的海拉細(xì)胞方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行a.將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的海拉細(xì)胞用0. 25%胰蛋白酶-0. 02% EDTA混合消化液制成單細(xì)胞懸液；b.將單細(xì)胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板上，接種密度為5*105/ml，在細(xì)胞轉(zhuǎn)染前，將培養(yǎng)液更換為無(wú)血清、無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)液；C.制備脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑ΛΡΕΡΤ2質(zhì)粒DNA復(fù)合物；d.當(dāng)海拉細(xì)胞融合度達(dá)到60 70%時(shí)，將6孔板中的海拉細(xì)胞用D-Hanks沖洗后，再加入2ml無(wú)血清、無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)液；6孔板的每個(gè)單孔中均逐滴加入500 μ 1脂質(zhì)
3體轉(zhuǎn)染試劑ΛΡΕΡΤ2質(zhì)粒DNA復(fù)合物，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻，置于37°C，5%的CO2,相對(duì)濕度90 %的細(xì)胞培養(yǎng)箱中6小時(shí)，更換含有血清、無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)液，重新置于37°C，5 % 的CO2，相對(duì)濕度90%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，完成細(xì)胞轉(zhuǎn)染；e.用濃度為lg/ml的G418配制含有血清無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)液，0. 22 μ m濾膜過濾，4°C保存；取空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的海拉細(xì)胞接種于M孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度1000個(gè)/ml， 將培養(yǎng)液同時(shí)更換為至少6個(gè)梯度含G418的有血清無(wú)雙抗DMEM培養(yǎng)液，每孔^il,置于 37°C，5%的CO2，相對(duì)濕度90%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每3天更換相應(yīng)濃度G418有血清無(wú)雙抗DMEM培養(yǎng)液，以在10 14天內(nèi)能夠殺死所有細(xì)胞的最小G418濃度為篩選濃度標(biāo)準(zhǔn)， 以緊鄰篩選濃度標(biāo)準(zhǔn)的高一梯度G418濃度作為篩選濃度；f.將d步驟所得完成細(xì)胞轉(zhuǎn)染的細(xì)胞傳代于新6孔板中，加入篩選濃度的含G418 的有血清無(wú)雙抗DMEM培養(yǎng)液，待細(xì)胞集落形成后，采用挑單克隆技術(shù)，將篩選后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至M孔板中，置于37°C，5%的CO2，相對(duì)濕度90%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所述c步驟是配制溶液I :240 μ 1無(wú)血清、無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)液加入10 μ 1脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，混勻，室溫下靜置5min ；配制溶液II 200 μ 1無(wú)血清、無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)液加入50 μ 1濃度為80 μ g/ml 的hPEPT2質(zhì)粒溶液，混勻，室溫下靜置5min ；將溶液I、溶液II混勻，得到總體積為500 μ 1的制備脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑ΛΡΕΡΤ2質(zhì)粒DNA復(fù)合物，混勻，室溫下靜置20min。所述至少6 個(gè)梯度為 G418 濃度為 300，500，700，800，900 和 1000 μ g/ml。本發(fā)明是用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將hPEPT2的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入海拉細(xì)胞中，并篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。操作簡(jiǎn)單，沒有免疫原性，對(duì)細(xì)胞沒有毒副作用，重復(fù)性好，hPEPT2基因轉(zhuǎn)染效率高達(dá)30 40%。
具體實(shí)施例方式a.將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的海拉細(xì)胞用0. 25%胰蛋白酶-0. 02% EDTA混合消化液，制成單細(xì)胞懸液；b.將單細(xì)胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板上，接種密度為5*105/ml，在細(xì)胞轉(zhuǎn)染前，將培養(yǎng)液更換為無(wú)血清、無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)液；c.制備脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑ΛΡΕΡΤ2質(zhì)粒DNA復(fù)合物；具體制備方法是配制溶液I :240 μ 1無(wú)血清、無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)液加入10 μ 1脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000，混勻，室溫下靜置 5min ；配制溶液II 200 μ 1無(wú)血清、無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)液加入50 μ 1濃度為80 μ g/ ml的hPEPT2質(zhì)粒溶液(質(zhì)粒提純后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳定量分析測(cè)得hPEPT2質(zhì)粒濃度為 80 μ g/ml)，混勻，室溫下靜置5min ；將溶液I、溶液II混勻，得到總體積為500 μ 1的制備脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑ΛΡΕΡΤ2質(zhì)粒DNA復(fù)合物；，混勻，室溫下靜置20min ；d.當(dāng)海拉細(xì)胞融合度達(dá)到60 70%時(shí)，將6孔板中的海拉細(xì)胞用D-Hanks沖洗
4兩遍后，再加入2ml無(wú)血清、無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)液；6孔板的每個(gè)單孔中均逐滴加入500 μ 1 制備脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑ΛΡΕΡΤ2質(zhì)粒DNA復(fù)合物，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻，置于37°C，5 %的 CO2,相對(duì)濕度90%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中6小時(shí)，更換含有血清、無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)液，重新置于 37°C，5%的CO2，相對(duì)濕度90%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，完成細(xì)胞轉(zhuǎn)染；e.用濃度為lg/ml的G418配制含有血清無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)液，0. 22 μ m濾膜過濾，4°C保存；取空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的海拉細(xì)胞接種于M孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度1000個(gè)/ml， 將培養(yǎng)液同時(shí)更換為6個(gè)梯度含G418的有血清無(wú)雙抗DMEM培養(yǎng)液，每孔^il,即4個(gè)孔的培養(yǎng)液為同一梯度，6個(gè)梯度是G418濃度為300，500，700，800，900和1000 μ g/ml，然后將 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37°C，5%的CO2，相對(duì)濕度90%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每3天更換相應(yīng)濃度G418有血清無(wú)雙抗DMEM培養(yǎng)液，以在10 14天內(nèi)能夠殺死所有細(xì)胞的最小G418 濃度(700 μ g/ml)為篩選濃度標(biāo)準(zhǔn)，以緊鄰篩選濃度標(biāo)準(zhǔn)的高一梯度G418濃度(800 μ g/ ml)作為篩選濃度；f.將d步驟所得完成細(xì)胞轉(zhuǎn)染的細(xì)胞傳代于新6孔板中，加入G418濃度為 800 μ g/ml的有血清無(wú)雙抗DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細(xì)胞集落形成后，采用挑單克隆技術(shù)，將篩選后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至M孔板中，置于37°C，5%的CO2，相對(duì)濕度90%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中擴(kuò)大培養(yǎng)。原料來(lái)源見下表
權(quán)利要求
1.一種脂質(zhì)體介導(dǎo)構(gòu)建表達(dá)hPEPT2的海拉細(xì)胞方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行a.將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的海拉細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-0. 02% EDTA混合消化液制成單細(xì)胞懸液；b.將單細(xì)胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板上，接種密度為5*105/ml，在細(xì)胞轉(zhuǎn)染前，將培養(yǎng)液更換為無(wú)血清、無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)液；c.制備脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑ΛΡΕΡΤ2質(zhì)粒DNA復(fù)合物；d.當(dāng)海拉細(xì)胞融合度達(dá)到60 70%時(shí)，將6孔板中的海拉細(xì)胞用D-Hanks沖洗后， 再加入2ml無(wú)血清、無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)液；6孔板的每個(gè)單孔中均逐滴加入500 μ 1脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑ΛΡΕΡΤ2質(zhì)粒DNA復(fù)合物，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻，置于37°C，5%的CO2,相對(duì)濕度 90 %的細(xì)胞培養(yǎng)箱中6小時(shí)，更換含有血清、無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)液，重新置于37°C，5 %的 CO2，相對(duì)濕度90%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，完成細(xì)胞轉(zhuǎn)染；e.用濃度為lg/ml的G418配制含有血清無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)液，0.22 μ m濾膜過濾，4°C 保存；取空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的海拉細(xì)胞接種于M孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度1000個(gè)/ml，將培養(yǎng)液同時(shí)更換為至少6個(gè)梯度含G418的有血清無(wú)雙抗DMEM培養(yǎng)液，每孔^iil，置于37°C ,5% 的CO2，相對(duì)濕度90%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每3天更換相應(yīng)濃度G418有血清無(wú)雙抗DMEM 培養(yǎng)液，以在10 14天內(nèi)能夠殺死所有細(xì)胞的最小G418濃度為篩選濃度標(biāo)準(zhǔn)，以緊鄰篩選濃度標(biāo)準(zhǔn)的高一梯度G418濃度作為篩選濃度；f.將d步驟所得完成細(xì)胞轉(zhuǎn)染的細(xì)胞傳代于新6孔板中，加入篩選濃度的含G418的有血清無(wú)雙抗DMEM培養(yǎng)液，待細(xì)胞集落形成后，采用挑單克隆技術(shù)，將篩選后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至 24孔板中，置于37°C，5%的CO2，相對(duì)濕度90%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體介導(dǎo)構(gòu)建表達(dá)hPEPT2的海拉細(xì)胞方法，其特征在于所述c步驟是配制溶液I :240 μ 1無(wú)血清、無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)液加入10 μ 1脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，混勻， 室溫下靜置5min ；配制溶液II 200 μ 1無(wú)血清、無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)液加入50 μ 1濃度為80 μ g/ml的 hPEPT2質(zhì)粒溶液，混勻，室溫下靜置5min ；將溶液I、溶液II混勻，得到總體積為500μ 1的制備脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑ΛΡΕΡΤ2質(zhì)粒DNA 復(fù)合物，混勻，室溫下靜置20min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的脂質(zhì)體介導(dǎo)構(gòu)建表達(dá)hPEPT2的海拉細(xì)胞方法，其特征在于所述至少6個(gè)梯度為G418濃度為300，500，700，800，900和ΙΟΟΟμ g/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開一種脂質(zhì)體介導(dǎo)構(gòu)建表達(dá)hPEPT2的海拉細(xì)胞方法，是用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將hPEPT2的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入海拉細(xì)胞中，并篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。操作簡(jiǎn)單，沒有免疫原性，對(duì)細(xì)胞沒有毒副作用，重復(fù)性好，hPEPT2基因轉(zhuǎn)染效率高達(dá)30～40％。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102154212SQ20101061588
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者劉克辛, 劉琦, 孟強(qiáng), 王長(zhǎng)遠(yuǎn), 郭鑫金 申請(qǐng)人:大連醫(yī)科大學(xué)