專(zhuān)利名稱(chēng)：：腦膜炎疫苗制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于免疫接種抵御腦膜炎的組合疫苗配制領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：?jiǎn)蝿┝恐泻幸环N以上病原生物的抗原的疫苗被稱(chēng)為"多價(jià)"或"組合"疫苗，例如白喉、破傷風(fēng)和百日咳("DTP")疫苗以及麻疹、腮腺炎和風(fēng)疹("MMR")疫苗。組合疫苗對(duì)患者的益處在于能減少注射次數(shù)，從而帶來(lái)順應(yīng)性提高的臨床優(yōu)勢(shì)(例如參見(jiàn)參考文獻(xiàn)1的第29章)，兒科接種時(shí)尤其如此。然而同時(shí)，由于以下因素其制造較為困難抗原和其他組分之間的物理和生化屬性不相容；免疫干擾；以及穩(wěn)定性。這些困難中的一些可通過(guò)適當(dāng)配制疫苗而解決。例如，偶聯(lián)的B型流感嗜血桿菌(/Zaewo;/n7w/^/7we"zae)("Hib")的PRP莢膜糖在水性條件下可能不穩(wěn)定，因此INFANRIX頂系列中含Hib的疫苗(包括PEDIARIXtm)包含凍干的Hib組分，使用時(shí)用剩余的抗原水性制劑進(jìn)行重建。參考文獻(xiàn)2也描述了含Hib的疫苗制劑，Hib偶聯(lián)物與腦膜炎球菌偶聯(lián)物組合凍干，臨用時(shí)重建。相反，參考文獻(xiàn)3描述了腦膜炎球菌偶聯(lián)物的全液體制劑，其他組分(例如Hib或肺炎球菌偶聯(lián)物)可凍干并重建。參考文獻(xiàn)22描述了腦膜炎球菌偶聯(lián)物的組合，其中血清群A("MenA")偶聯(lián)物凍干后用其他血清群偶聯(lián)物的液體制劑重建。Hib和腦膜炎球菌是細(xì)菌性腦膜炎的兩大原因，本發(fā)明的目的的提供另外且改良的Hib和腦膜炎球菌偶聯(lián)物的疫苗制劑。
發(fā)明內(nèi)容根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，用液體Hib組分重建凍干的腦膜炎球菌組分，從而制備腦膜炎組合疫苗。因此，本發(fā)明提供了一種試劑盒，其包括(i)水性組分，包含B型流感嗜血桿菌莢膜糖的偶聯(lián)物；和(ii)凍干組分，包含腦膜炎萘瑟菌(A^'Mer^wem:"g/^fc)莢膜糖的偶聯(lián)物。為給予患者，水性和凍干組分組合形成適合注射的組合液體疫苗。本發(fā)明還提供了制備組合疫苗的方法，該方法包括將(i)水性組分，包含B型流感嗜血桿菌莢膜糖的偶聯(lián)物，和(ii)凍干組分，包含腦膜炎萘瑟菌莢膜糖的偶聯(lián)物進(jìn)行組合的步驟。本發(fā)明還提供了一種組合疫苗，其包含(i)B型流感嗜血桿菌莢膜糖的偶聯(lián)物；和(ii)腦膜炎萘瑟菌莢膜糖的偶聯(lián)物，通過(guò)將水性流感嗜血桿菌偶聯(lián)物與凍干的腦膜炎萘瑟菌偶聯(lián)物組合來(lái)制備。疫苗可包含凍干穩(wěn)定劑(如下所述)。液體組分本發(fā)明的試劑盒和方法涉及使用包括Hib糖偶聯(lián)物的水性抗原組分。給予Hib偶聯(lián)物優(yōu)選能使患者抗-PRP抗體濃度大于0.15微克/毫升，更優(yōu)選大于l微克/毫升。這些是標(biāo)準(zhǔn)可接受的效應(yīng)閾值。Hib糖抗原是眾所周知的[例如，參考文獻(xiàn)1的第14章]，其制備方法也己詳細(xì)記載[例如，參考文獻(xiàn)4-13]。Hib糖與載體蛋白偶聯(lián)以提高其免疫原性，尤其是兒童中的免疫原性。本發(fā)明可使用任何合適的Hib偶聯(lián)物。Hib偶聯(lián)物的糖部分可以是多糖(例如，全長(zhǎng)磷酸多核糖基核糖醇(PRP))，但也可以使用寡糖(例如，分子量為約1到約5kDa)。純化PRP的片段化(例如水解)可方便地形成寡糖，然后通常純化具有所需大小的片段。如果本發(fā)明的組合物包含偶聯(lián)的寡糖，應(yīng)先制備寡糖再偶聯(lián)。水性組分中Hib偶聯(lián)物的濃度通常在0.5微克/毫升到50微克/毫升的范圍內(nèi)，例如l-20微克/毫升，12-16微克/毫升等。濃度可約為15微克/毫升。水性Hib組分可以不含佐劑或者可包含佐劑。如果包含佐劑，佐劑通常是鋁鹽，例如磷酸鋁或氫氧化鋁。如果包含佐劑，Hib組分可吸附于鋁鹽或者未吸附。已報(bào)道在一些情況下吸附于磷酸鋁佐劑是有益的[14]，而在另一些情況下未吸附是有益的[2]。已知各種不同的Hib偶聯(lián)物。例如，參考文獻(xiàn)1的表14-7給出了四種不同Hib偶聯(lián)物的特征。它們由各種參數(shù)相區(qū)別，例如載體蛋白。本發(fā)明可使用任何合適的載體蛋白(如下所述)，如CRM197(在"HbOC"中)，破傷風(fēng)類(lèi)毒素(在"PRP-T"中)以及腦膜炎萘瑟菌的外膜復(fù)合物(在"PRP-OMP"中)。各種水性Hib偶聯(lián)物市售可得并且可用于本發(fā)明。例如，惠氏(Wyeth)的HIBTITERTM產(chǎn)品有液體制劑可用。HIBTITERtm采用CRM197載體，每0.5毫升劑量(以小瓶供應(yīng))包含0.9%氯化鈉配制的IO微克糖，不含佐劑。默克(Merck)的PEDVAXHIBTM產(chǎn)品也有液體制劑可用。PEDVAXHIBtm使用OMPC載體，每0.5毫升劑量包含0.9%氯化鈉配制的7.5微克糖和225微克羥基磷酸硫酸鋁佐劑。該制劑不含乳糖和硫柳汞。ACTHIBTM產(chǎn)品目前沒(méi)有液體形式可用。另一種有用的Hib偶聯(lián)物包含通過(guò)己二酸接頭共價(jià)連接于CRM197的Hib寡糖[15,16]。Hib偶聯(lián)物可以是水性組分中唯一的抗原成分，或者可以存在一種或多種其他抗原。例如，水性組分可包含以下一種或多種白喉類(lèi)毒素，破傷風(fēng)類(lèi)毒素，無(wú)細(xì)胞百日咳抗原，滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原，乙型肝炎病毒表面抗原和/或肺炎球菌糖。如果水性組分包含佐劑并包括Hib偶聯(lián)物、白喉類(lèi)毒素、破傷風(fēng)類(lèi)毒素、無(wú)細(xì)胞百日咳抗原、滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原和乙型肝炎病毒表面抗原，可使用HEXAVACTM產(chǎn)品。如果水性組分包含佐劑并包括Hib偶聯(lián)物、白喉類(lèi)毒素、破傷風(fēng)類(lèi)毒素、全細(xì)胞百日咳抗原、乙型肝炎病毒表面抗原，可使用QUINVAXEMTM產(chǎn)品。如果水性組分包含佐劑并包括Hib偶聯(lián)物、白喉類(lèi)毒素、破傷風(fēng)類(lèi)毒素、無(wú)細(xì)胞百日咳抗原和脊髓灰質(zhì)炎病毒，可使用PEDIACELTM產(chǎn)品。本發(fā)明優(yōu)選使用市售液體單價(jià)Hib偶聯(lián)物作為水性組分，如不含佐劑的HIBTITERtm疫苗。組合Hib和腦膜炎球菌偶聯(lián)物時(shí)避免使用佐劑的明顯優(yōu)點(diǎn)在參考文獻(xiàn)2中提及。7凍干組分本發(fā)明的試劑盒和方法涉及使用包括腦膜炎球菌莢膜糖偶聯(lián)物的凍干抗原組分。給予腦膜炎球菌偶聯(lián)物優(yōu)選導(dǎo)致血清群(serogroup)殺菌抗體應(yīng)答，用人補(bǔ)體測(cè)量時(shí)，相關(guān)血清群的血清殺菌試驗(yàn)(SBA)效價(jià)增加至少4倍，優(yōu)選至少8倍。如果用兔補(bǔ)體測(cè)定SBA效價(jià)，那么效價(jià)優(yōu)選提高至少128倍。針對(duì)血清群C的偶聯(lián)單價(jià)疫苗已被批準(zhǔn)用于人，其包含MENJUGATEtm[18]、MENINGITECtm和NEISVAC-CTM。已知血清群A+C的偶聯(lián)物的混合物[19，20]，已報(bào)道了血清群A+C+W135+Y的偶聯(lián)物的混合物[21-24]，并于2005被批準(zhǔn)作為水性MENACTRATM產(chǎn)品上市。本發(fā)明所用凍干組分可包括一種或多種腦膜炎球菌偶聯(lián)物。包括血清群A、C、W135和Y中的2、3或4種時(shí)，通常(例如)是A+C，A+W135，A+Y，C+W135，C+Y，W135+Y，A+C+W135，A+C+Y，A+W135+Y，A+C+W135+Y，等等。包含所有四種血清群A、C、W135和Y中的糖的組分是優(yōu)選的。如果包括來(lái)自一種以上血清群的偶聯(lián)物，它們可以基本上相等質(zhì)量存在，例如各血清群糖的質(zhì)量彼此在±10%內(nèi)。凍干組分中每種血清群的典型含量在1微克到20微克之間，例如每個(gè)血清群2-10微克，或者約4微克。作為基本相等比例的替代形式，可試驗(yàn)雙倍質(zhì)量的血清群A的糖。血清群A腦膜炎球菌的莢膜糖是(a1—6)-連接的N-乙?；?D-甘露糖胺-l-磷酸酯的均聚物，具有部分C3和C4位的O-乙酰基化。C-3位的乙?；梢允?0-95%。用于純化糖的條件可導(dǎo)致脫-O-乙酰化(例如在堿性條件下)，但在C-3位保留OAc也是有用的。在一些實(shí)施方式中，血清群A糖中至少50%(例如，至少60%、70%、80%、90%、95%或更多)的甘露糖胺殘基的C-3位被O-乙酰基化。乙?；杀环忾]基團(tuán)取代以避免水解[25]，這種改性的糖仍然是本發(fā)明涵義內(nèi)的血清群A糖。血清群C莢膜糖是(a2—9)-連接的唾液酸(N-乙?；窠?jīng)氨酸，或"NeuNAc")的均聚物。糖結(jié)構(gòu)為—9)-Neu;NAc7/8OAc-(a2—。大多數(shù)血清群C株在唾液酸殘基的C-7和/或C-8位具有O-乙?；鶊F(tuán)，但約15%的臨床分離物缺乏這些0-乙酰基[26，27]。OAc基團(tuán)的存在與否產(chǎn)生獨(dú)特表位，抗體與糖結(jié)合的特異性可影響其對(duì)0-乙?；?OAc-)和脫-0-乙?；?OAc+)菌株的殺菌活性[28-30]。本發(fā)明中使用的血清群C糖可以從OAc+或OAc-菌株獲得。獲得許可的MenC偶聯(lián)物疫苗包含OAc-(NEISVAC-C頂)和OAc+(MENJUGATEtm和MENINGITECtm)糖。在一些實(shí)施方式中，用于制備血清群C偶聯(lián)物的菌株是OAc+菌株，例如血清型16，血清亞型P1.7a,1等。因此，可使用C:16:P1.7a,1OAc+菌株。也可使用血清亞型Pl.l的OAc+菌株，例如Cll菌株。血清群W135糖是唾液酸-半乳糖二糖單元的聚合物。類(lèi)似于血清群C糖，其具有可變的O-乙?；?，但在唾液酸7和9位[31]。結(jié)構(gòu)如下44)-D-Neu/5Ac(7/90Ac)-a-(2—6)-D-Gal-a-("。血清群Y糖類(lèi)似于血清群W135糖，只是二糖重復(fù)單元包括葡萄糖而非半乳糖。類(lèi)似于血清群W135，在唾液酸7和9位具有可變的0-乙?；痆31]。血清群Y的結(jié)構(gòu)如下—4)-D-Neu;5Ac(7/90Ac)-a-(2—6)-D-Glc-a-(1—。本發(fā)明中使用的糖可以如上所述O-乙?；?例如，在天然莢膜糖中所見(jiàn)相同的o乙?；Ｊ?，或者可以在糖環(huán)的一個(gè)或多個(gè)位置部分或完全脫-o-乙?；蛘吲c天然莢膜糖相比，它們可以超-o-乙?；?。偶聯(lián)物中的糖部分可包括由腦膜炎球菌制備的全長(zhǎng)糖，和/或可包括全長(zhǎng)糖的片段，即比細(xì)菌中存在的天然莢膜糖短的糖。因此，糖可以解聚，解聚發(fā)生在糖純化期間或者之后、但在偶聯(lián)之前。解聚可降低糖鏈長(zhǎng)度。一種解聚方法涉及使用過(guò)氧化氫[21]。將過(guò)氧化氫加入糖中(例如，11202終濃度為1%)，然后孵育混合物(例如在約55'C)直到實(shí)現(xiàn)所需的鏈長(zhǎng)降低。另一種解聚方法涉及酸水解[22]。其他解聚方法是本領(lǐng)域已知的。用于制備本發(fā)明中使用的偶聯(lián)物的糖可以通過(guò)任何這些解聚方法獲得。可利用解聚獲得對(duì)于免疫原性最佳的鏈長(zhǎng)和/或出于糖的物理可操作性而降低鏈長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，糖具有以下平均聚合度(Dp):A=10-20;C=12-22;W135=15-25;Y=15-25。在分子量方面，而非Dp，對(duì)于所有血清群，有用的范圍是<100kDa;5kDa-75kDa;7kDa-50kDa;8kDa陽(yáng)35kDa;12kDa-25kDa;915kDa-22kDa。在一些實(shí)施方式中，腦膜炎球菌血清群A、C、W135和Y的糖的平均分子量各自超過(guò)50kDa，例如^75kDa，^100kDa，^110kDa，^120kDa，2130kDa，等等[32]，甚至最高達(dá)1500kDa，具體通過(guò)MALLS測(cè)定。例如MenA糖可以是50-500kDa，如60-80kDa;MenC糖可以是100-210kDa;MenW135糖可以是60-190kDa，如120-140kDa;和/或MenY糖可以是60-190kDa，如150-160kDa。有用的載體蛋白(如下所述)包括CRM197、白喉類(lèi)毒素和/或破傷風(fēng)類(lèi)毒素.如果凍干組分包括來(lái)自一種以上腦膜炎球菌血清群的偶聯(lián)物，則各偶聯(lián)物可使用不同的載體蛋白(例如，一種血清群在CRM197上，另一種在破傷風(fēng)類(lèi)毒素上)或者它們可使用相同的載體蛋白(例如，來(lái)自?xún)煞N血清群的糖分別偶聯(lián)于CRM197，然后組合)。出于穩(wěn)定性原因，凍干組分可包含穩(wěn)定劑，例如乳糖、蔗糖和甘露醇、以及它們的混合物，例如乳糖/蔗糖混合物、蔗糖/甘露醇混合物等。因此，最終疫苗可包含乳糖和/或蔗糖。使用蔗糖/甘露醇混合物可加速干燥過(guò)程。凍干組分也可包含氯化鈉。重建后凍干材料中的可溶性組分可保留在組合物中。凍干組分可包含或不含佐劑，例如鋁鹽。凍干組分優(yōu)選不包含Hib糖。包裝本發(fā)明的組合物本發(fā)明中使用的濕潤(rùn)和干燥組分必須在使用前保持相互分離。因此，它們以試劑盒形式分別包裝。試劑盒可采取各種形式。在一些實(shí)施方式中，兩種組分各自包裝在獨(dú)立的容器中。在其它實(shí)施方式中，兩種組分包裝在單一容器的不同腔室內(nèi)，例如包裝到多室注射器的不同室內(nèi)。雙室注射器能使兩種單獨(dú)的組合物在儲(chǔ)存期間保持隔離，但在啟動(dòng)注射器栓塞時(shí)發(fā)生混合。凍干材料通常保存在密封小瓶中。該小瓶可具有開(kāi)口(例如橡膠密封，可裂頸部等)，保持無(wú)菌的同時(shí)允許取出內(nèi)容物和/或引入水性材料進(jìn)行重建。小瓶可由各種材料制成，例如玻璃、塑料等。水性材料也可以保存在小瓶中，但作為可選形式也可以保存在(例如)注射器中。同樣，容器能夠在保持無(wú)菌的同時(shí)允許取出其內(nèi)容物。注射器可施加有或未施加與其附連的針頭，在沒(méi)有針頭的情況下，可將獨(dú)立的針頭與注射器一起包裝以供組裝和使用，注射器通常具有針尖帽以在附連針頭之前封閉針尖。優(yōu)選安全性針頭。一般是l-英寸23-號(hào)、l-英寸25-號(hào)和5/8-英寸25-號(hào)針頭。注射器的活塞可帶有抑止裝置，以防止活塞在吸出時(shí)偶然脫出。注射器可由各種材料，如玻璃、塑料等制成。藥瓶可以有適合的帽(如Luer鎖)，以便將預(yù)填裝注射器插入該帽，可以將注射器的內(nèi)容物推入藥瓶(在其中重建凍干物質(zhì))，可以將藥瓶的內(nèi)容物吸回注射器中。從藥瓶中拔出注射器后，可連上針頭，將該組合物給予患者。該帽可以位于封口或蓋子內(nèi)側(cè)，以便在封口或蓋子打開(kāi)后才能接觸到該帽。如果將材料包裝到容器內(nèi)，通常在材料加入容器之前對(duì)容器進(jìn)行滅菌。采用玻璃容器(如注射器或藥瓶)時(shí)，可采用由硼硅酸鹽玻璃，而非鈉鈣玻璃制成的容器。重建在給予患者之前，本發(fā)明涉及用水性組分(含有Hib偶聯(lián)物)重建凍干的抗原組分(含有至少一種腦膜炎球菌偶聯(lián)物)。重建可涉及各種步驟。如果組分保存在多室注射器中，則驅(qū)動(dòng)注射器將導(dǎo)致水性和干燥材料的混合。如果組分保存在單獨(dú)容器中，可使用不同的混合過(guò)程。在一些實(shí)施方式中，小瓶中的水性材料可以抽取到注射器內(nèi)(例如通過(guò)針頭)，或者已經(jīng)位于注射器內(nèi)。然后，將水性材料由注射器轉(zhuǎn)移到含凍干材料的小瓶中(例如通過(guò)針頭，可以是與先前從小瓶抽取水性材料所用針頭相同或不同的針頭)。因而重建凍干材料，將其抽取(例如，通過(guò)針頭，同樣可以與先前使用的針頭相同或不同)到注射器內(nèi)(例如，與先前使用的注射器相同或不同)，由該注射器注入患者(例如，通過(guò)針頭，同樣可以與先前使用的針頭相同或不同)。一旦凍干材料和水性材料發(fā)生組合并位于遞送裝置內(nèi)(通常是注射器)，可將該組合物給予患者。重建通常剛好在給予患者之前進(jìn)行，例如注射前不超過(guò)30分鐘。重建之后，給予患者的組合物將包含Hib和腦膜炎球菌偶聯(lián)物。Hib偶聯(lián)物源自最初的水性材料，而腦膜炎球菌偶聯(lián)物源自最初的凍干材料。最初的水性材料也可包括腦膜炎球菌偶聯(lián)物，例如凍干材料可包含來(lái)自血清群A和W135的偶聯(lián)物，水性材料包含來(lái)自血清群C的偶聯(lián)物(除了Hib偶聯(lián)物之外)。本發(fā)明重建疫苗中Hib糖的質(zhì)量通常為0.5-50微克，例如l-20微克，10-15微克，12-16微克。該量可以約為12.5微克。小于5微克的質(zhì)量也是合適的[33]，例如l-5微克，2-4微克，或約2.5微克。重建疫苗中每種血清群的腦膜炎球菌糖的質(zhì)量通常在1微克到20微克之間，例如每種血清群2-10微克，或約5-10微克。如果包括來(lái)自一種以上血清群的偶聯(lián)物，它們可以基本上相等質(zhì)量存在，例如各血清群糖的質(zhì)量彼此在±10%內(nèi)。作為相等比例的替代形式，可利用雙倍質(zhì)量的血清群A的糖。因此，疫苗可包含10微克MenA糖以及各5微克的MenC、W135和Y她鵬。在一些實(shí)施方式中，Hib糖的質(zhì)量與特定腦膜炎球菌血清群糖的質(zhì)量基本相同。在一些實(shí)施方式中，Hib糖的質(zhì)量大于特定腦膜炎球菌血清群糖的質(zhì)量(例如1.5倍)。在一些實(shí)施方式中，Hib糖的質(zhì)量小于特定腦膜炎球菌血清群糖的質(zhì)量(例如1.5倍)。如果組合物包含來(lái)自一種以上腦膜炎球菌血清群的糖，則每種血清群有平均糖質(zhì)量。如果使用基本相等質(zhì)量的各血清群，則平均質(zhì)量與各個(gè)血清群的質(zhì)量相同；如果使用非等量的血清群，則平均質(zhì)量不同，對(duì)于10:5:5:5微克的MenACWY來(lái)說(shuō)，平均質(zhì)量為每血清群6.25微克。在一些實(shí)施方式中，Hib糖的質(zhì)量與每血清群的腦膜炎球菌糖平均質(zhì)量基本相同。在一些實(shí)施方式中，Hib糖的質(zhì)量大于每血清群的腦膜炎球菌糖平均質(zhì)量(例如，至少1.5倍)。在一些實(shí)施方式中，Hib糖的質(zhì)量小于每血清群的腦膜炎球菌糖平均質(zhì)量(例如，至少1.5倍)[34]。治療方法和疫苗的給藥本發(fā)明涉及并行給予組合疫苗形式的Hib和腦膜炎球菌偶聯(lián)物。重建的組合物適合給予人類(lèi)患者，且本發(fā)明提供了提升患者免疫應(yīng)答的方法，該方法包括將本發(fā)明組合物給予患者的步驟。本發(fā)明也提供了用于藥物中的本發(fā)明組合物。本發(fā)明還提供了(i)水性組分，包含B型流感嗜血桿菌莢膜糖的偶聯(lián)物，和(ii)凍干組分，包含腦膜炎萘瑟氏菌莢膜糖的偶聯(lián)物在制造用于給予患者的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了用于免疫接種的的組合，其包含(i)水性組分，包含B型流感嗜血桿菌莢膜糖的偶聯(lián)物；和(ii)凍干組分，包含腦膜炎萘瑟氏菌莢膜糖的偶聯(lián)物。本發(fā)明的重建組合物優(yōu)選疫苗，用于減輕或防止細(xì)菌性腦膜炎，包括腦膜炎球菌性腦膜炎和Hib腦膜炎。接受本發(fā)明組合物的患者可以小于2歲，例如0-12個(gè)月。一類(lèi)特定的患者為1到3個(gè)月大，過(guò)去未曾接受過(guò)腦膜炎球菌偶聯(lián)物疫苗。為發(fā)揮充分功效，典型的兒童初次免疫方案可包括給予一次以上的劑量。例如，可在以下時(shí)間給予劑量第0，2和4個(gè)月(0時(shí)為首劑量)；第0，l禾口2個(gè)月；第0和2個(gè)月；第0，2和8個(gè)月；等等。首劑量(O時(shí))可以在約2個(gè)月大時(shí)給予，或者有時(shí)(例如，在0-2-8個(gè)月方案中)在約3個(gè)月大時(shí)給予。組合物還可用作加強(qiáng)劑量，例如對(duì)兒童而言在其兩歲時(shí)使用?？赏ㄟ^(guò)肌肉內(nèi)注射到(例如)手臂、腿或臀部中給予本發(fā)明組合物。如果本發(fā)明組合物包含鋁基佐劑，儲(chǔ)藏過(guò)程中組分可能會(huì)沉淀。因此，在重建前后要震搖該混合物再給予患者。偶聯(lián)本發(fā)明釆用Hib和腦膜炎球菌偶聯(lián)物，其中莢膜糖偶聯(lián)于載體蛋白。用于共價(jià)偶聯(lián)的有用載體蛋白是細(xì)菌毒素或類(lèi)毒素，如白喉類(lèi)毒素或破傷風(fēng)類(lèi)毒素，或其衍生物如CRM197白喉毒素突變體[35-37]。其他合適的載體蛋白包括，腦膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[38]、合成肽[39、40]、熱激蛋白[41，42]、百日咳蛋白[43,44]、細(xì)胞因子[45]、淋巴因子[45]、激素[45]、生長(zhǎng)因子[45]、含有各種病原體衍生抗原的多種人CD4+T細(xì)胞表位的人造蛋白[46]如N19[47]、流感嗜血桿菌的D蛋白[48-50]、肺炎球菌溶血素[51]、肺炎球菌表面蛋白PspA[52]、鐵攝取蛋白[53]、艱難梭菌(C.^^"7e)的毒素A或B[54]等等。白喉類(lèi)毒素(Dt)、破傷風(fēng)類(lèi)毒素(Tt)和CRM197是目前兒科疫苗中使用的主要載體，例如來(lái)自GSK的Hib偶聯(lián)物使用Tt作為載體，HIBTITERTM產(chǎn)品使用CRM197，PREVENARTM中的肺炎球菌偶聯(lián)物使用CRM197，MENJUGATEtm和MENINGITECTM產(chǎn)品使用CRM197，NEISVAC-Ctm使用Tt。可使用糖:蛋白質(zhì)比例(w/w)在1:5(即蛋白質(zhì)過(guò)量)和5:1(即糖過(guò)量)之間的偶聯(lián)物，例如比例在l:2到5:1之間，比例在1:1.25至l」1:2.5之間。如參考文獻(xiàn)55所述，混合物中不同的腦膜炎球菌血清群偶聯(lián)物具有不同的糖:蛋白質(zhì)比例，例如一種的比例為l:2到l:5之間，而另一種的比例在5:1到1:1.99之間。偶聯(lián)物可與游離載體蛋白聯(lián)用[56]。當(dāng)本發(fā)明組合物中給定載體蛋白存在游離和偶聯(lián)形式時(shí)，未偶聯(lián)形式可不多于組合物中載體蛋白總量的5%，更常見(jiàn)少于2重量％。可采用任何合適的偶聯(lián)反應(yīng)，必要時(shí)采用任何合適的接頭。一般在偶聯(lián)前活化或官能化糖。活化可包括例如用氰化試劑如CDAP(如1-氰基-4-二甲基氨基四氟硼酸吡啶[57，58等])。其它合適技術(shù)采用活性酯、碳二亞胺、酰肼、降冰片烷、對(duì)硝基苯甲酸、N-羥基琥珀酰亞胺、S-NHS、EDC、TSTU(也參見(jiàn)參考文獻(xiàn)11的引言)?？捎萌魏渭褐椒?，如參考文獻(xiàn)59和60所述的方法通過(guò)接頭基團(tuán)進(jìn)行連接。一種連接類(lèi)型包括多糖的還原性胺化，將得到的氨基與己二酸接頭基團(tuán)的一端偶聯(lián)，然后將蛋白質(zhì)偶聯(lián)于該己二酸接頭基團(tuán)的另一端[61，62]。其它接頭包括P-丙酰胺基[63]、硝基苯基-乙基胺[64]、鹵代酰基鹵化14物[65]、糖苷鍵[66]、6-氨基己酸[67]、ADH[68]、C4-C12部分[69]等。也可使用碳二亞胺縮合反應(yīng)[70]。作為采用接頭的替代方法，可以采用直接連接。直接連接蛋白質(zhì)可包括氧化多糖，然后與蛋白質(zhì)迸行還原性胺化，如參考文獻(xiàn)71和72所述?？梢允褂冒ㄒ韵虏襟E的方法將氨基引入糖(如用-NH2取代末端-0基團(tuán))，然后用己二酸二酯(如己二酸N-羥基琥珀酰亞胺基二酯)衍生后，與載體蛋白反應(yīng)。在另一個(gè)有用的反應(yīng)中，用氰化試劑衍生化糖，然后與蛋白質(zhì)偶聯(lián)(直接，或者在載體中引入巰基或酰肼親核基團(tuán)之后)，無(wú)需使用接頭。合適的氰化試劑包括l-氰基-4-(二甲基氨基)-吡啶鎗四氟硼酸鹽("CDAP")，對(duì)硝基苯基氰酸酯和N-氰基三乙基銨四氟硼酸鹽("CTEA")。如參考文獻(xiàn)73所述，混合物可包含一種糖/蛋白直接連接的偶聯(lián)物和另一種通過(guò)接頭連接的偶聯(lián)物。當(dāng)使用來(lái)自不同腦膜炎球菌血清群的糖偶聯(lián)物時(shí)這種設(shè)置尤其有用，例如MenA和MenC糖可通過(guò)接頭偶聯(lián)；而MenW135和MenY糖則直接偶聯(lián)于載體蛋白。偶聯(lián)后，可分離游離和偶聯(lián)的糖。許多合適的方法可實(shí)現(xiàn)這種分離，包括疏水色譜、切向超濾、透析等。(例如，也可參見(jiàn)74和75等)。如果疫苗包含游離和偶聯(lián)形式的給定糖，未偶聯(lián)形式不超過(guò)組合物中全部糖總量的20重量。/。(例如，S15%，S10%，S5%，S2%，Si%)。各偶聯(lián)物的載體量(偶聯(lián)和未偶聯(lián))可以不超過(guò)100微克/毫升，例如各偶聯(lián)物的載體蛋白<30微克/毫升。一些組合物中載體的總濃度小于500微克/毫升，例如<400微克/毫升，<300微克/毫升，<200微克/毫升，<100微克/毫升，<50微克/毫升，等等。本發(fā)明組合物的特征除了上述抗原組分，本發(fā)明組合物(混合前和混合后)通常還包含非抗原組分。非抗原組分可包括載體、佐劑、賦形劑、緩沖劑等，如下文更詳細(xì)所述。本發(fā)明組合物通常包含一種或多種藥物載體和/或賦形劑。無(wú)菌、無(wú)熱原的磷酸鹽緩沖生理鹽水是一種典型載體。藥學(xué)上可接受的賦形劑的全面討論參見(jiàn)參考文獻(xiàn)76。為了控制張力，包含生理性鹽如鈉鹽是有用的。氯化鈉(NaCl)是一種這樣的鹽，其濃度可以是l-20毫克/毫升。通常，水性組合物(凍干材料重建之前和/或之后)的重量克分子滲透濃度在200mOsm/kg至U400mOsm/kg之間，例如240-360mOsm/kg，或者290-320mOsm/kg。本發(fā)明組合物可包含一種或多種緩沖劑。緩沖劑一般包括磷酸鹽緩沖劑；Tris緩沖劑；硼酸鹽緩沖劑；琥珀酸鹽緩沖劑；組氨酸緩沖劑；或檸檬酸緩沖劑。包含的緩沖劑的濃度一般是5-20mM。緩沖劑可包含在水性和/或凍干組分中。水性組合物的pH通常為5.0-7.5，更一般為5.0-6.0(最佳穩(wěn)定性)，或者為6.0-7.0。本發(fā)明組合物優(yōu)選為無(wú)菌組合物。本發(fā)明組合物優(yōu)選無(wú)熱原，如每劑量含有〈1EU(內(nèi)毒素單位，標(biāo)準(zhǔn)量度)，優(yōu)選每劑量〈0.1EU。本發(fā)明組合物可以不含谷蛋白。一些本發(fā)明的疫苗不含佐劑。其他本發(fā)明的疫苗包含佐劑。不含佐劑的疫苗可通過(guò)混合不含佐劑的組分進(jìn)行制備。含佐劑的疫苗可通過(guò)組合多種含佐劑組分，通過(guò)組合含佐劑和不含佐劑組分，或者通過(guò)組合不含佐劑組分與佐劑而進(jìn)行制備。如果抗原是吸附性的，組合物可以是具有混濁外觀(guān)的懸浮液。這種外觀(guān)意味著微生物污染不容易發(fā)現(xiàn)，因此疫苗可包含防腐劑。當(dāng)疫苗包裝在多劑量容器中時(shí)這點(diǎn)尤其重要。所包含的有用的防腐劑是2-苯氧基乙醇和硫柳汞。然而，如果可能的話(huà)，建議不用汞防腐劑(如硫柳汞)。本發(fā)明組合物優(yōu)選包含小于約25ng/ml的汞。這種防腐劑可包含在水性和/或凍干組分中。以八13+表示的組合物中鋁鹽的濃度優(yōu)選小于5毫克/毫升，例如S4毫克/毫升、S3毫克/毫升、S2毫克/毫升、Sl毫克/毫升、S0.85毫克/毫升等。本發(fā)明組合物可以0.5ml的劑量給予患者。應(yīng)理解，0.5ml的劑量包括正常差異，如0.5ml土0.05ml。佐劑本發(fā)明組合物可包含佐劑，佐劑可包括一種或多種鋁鹽，具體是磷酸鋁佐劑和/或氫氧化鋁佐劑。用于制備本發(fā)明組合物的抗原組分可以在使用前包含鋁佐劑，S卩"預(yù)先混合"或者"預(yù)先吸附"于佐劑。目前使用的鋁佐劑通常稱(chēng)為"氫氧化鋁"或"磷酸鋁"佐劑。這些名稱(chēng)是為方便起見(jiàn)，但它們都不是所代表的實(shí)際化合物的準(zhǔn)確描述[例如參見(jiàn)參考文獻(xiàn)77的第9章]。本發(fā)明可采用通常用作佐劑的任何"氫氧化物"或"磷酸"鹽。稱(chēng)為"氫氧化鋁"的佐劑一般是羥基氧化鋁鹽(通常至少部分為晶體)。羥基氧化鋁以分子式A10(0H)表示，其與其它鋁化合物，例如氫氧化鋁A1(0H)3的區(qū)別在于紅外(IR)光譜，特別是在1070cm"處存在吸收帶和在3090-3100cm"處存在強(qiáng)烈的肩峰[參考文獻(xiàn)77的第9章]。稱(chēng)為"磷酸鋁"的佐劑一般是羥基磷酸鋁，這些佐劑也常含有少量硫酸根?？赏ㄟ^(guò)沉淀獲得這些佐劑，沉淀期間的反應(yīng)條件和濃度影響磷酸根取代該鹽中羥基的程度。羥基磷酸鹽中PCVA1摩爾比通常在0.3-0.99之間。羥基磷酸鹽因存在羥基而有別于嚴(yán)格的A1P04。例如，3164cm"的IR光譜帶(例如，當(dāng)加熱至20(TC時(shí))表明存在結(jié)構(gòu)性羥基[參考文獻(xiàn)77的第9章]。磷酸鋁佐劑的P04/A產(chǎn)摩爾比通常為0.3-1.2，優(yōu)選為0.8-1.2，更優(yōu)選為0.95±1。磷酸鋁通常是無(wú)定形的，尤其是羥基磷酸鹽。典型的佐劑是PCVA1摩爾比為0.84-0.92的無(wú)定形的羥基磷酸鋁，包含0.6mgA產(chǎn)/ml。磷酸鋁通常是顆粒?？乖胶箢w粒直徑一般是0.5-20jLim(如約5-10pm)。磷酸鋁的PZC與磷酸對(duì)羥基的取代程度逆相關(guān)，這種取代程度可能取決于用于通過(guò)沉淀制備鹽的反應(yīng)條件和反應(yīng)物濃度。也通過(guò)改變?nèi)芤褐杏坞x磷酸根離子的濃度(更多磷酸根-更多酸性PZC)或加入緩沖劑如組氨酸緩沖劑(使PZC堿性更強(qiáng))改變PZC。本發(fā)明所用的磷酸鋁的PZC通常為4.0-7.0，更優(yōu)選為5.0-6.5，例如約為5.7。用于制備本發(fā)明組合物的磷酸鋁溶液可以，但不一定含有緩沖液(如磷17酸鹽或組氨酸或Tris緩沖液)。磷酸鋁溶液優(yōu)選為無(wú)菌和無(wú)熱原。磷酸鋁溶液可含有游離的水性磷酸根離子，如濃度為1.0-20mM，優(yōu)選5-15mM，更優(yōu)選約lOmM的磷酸根離子。磷酸鋁溶液也可含有氯化鈉。氯化鈉的濃度優(yōu)選為0.1-100毫克/毫升(例如0.5-50毫克/毫升，l-20毫克/毫升，2-10毫克/毫升)，更優(yōu)選約3±1毫克/毫升。NaCl的存在有助于在抗原吸附前正確測(cè)定pH?？砂钠渌乖税悸?lián)的腦膜炎奈瑟球菌和Hib糖，組合物還可包含一種或多種其他抗原。例如，組合物可包含來(lái)自其他病原體(具體是細(xì)菌和/或病毒)的抗原。合適的其他抗原可選自白喉類(lèi)毒素("D")破傷風(fēng)類(lèi)毒素("T")百日咳抗原("P")，通常是無(wú)細(xì)胞("aP")乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原("HBsAg")滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗(IPV)甲型肝炎病毒(HAV)抗原來(lái)自肺炎鏈球菌的莢膜糖這些抗原通常源自本發(fā)明的水性組分。白喉類(lèi)毒素白喉棒狀桿菌導(dǎo)致白喉?？商幚?例如用福爾馬林或甲醛)白喉毒素使其脫毒，同時(shí)保留其在注射后誘導(dǎo)特異性抗毒素抗體的能力。參考文獻(xiàn)1的第13章更詳細(xì)地公開(kāi)了白喉疫苗中使用的白喉類(lèi)毒素。優(yōu)選的白喉類(lèi)毒素是經(jīng)過(guò)甲醛處理的毒素。用可以補(bǔ)充牛提取物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(如Fenton培養(yǎng)基，或Linggoud和Fenton培養(yǎng)基)培養(yǎng)白喉棒狀桿菌，接著進(jìn)行甲醛處理、超濾和沉淀，從而獲得白喉類(lèi)毒素。通過(guò)包括無(wú)菌過(guò)濾和/或透析的方法處理此類(lèi)毒素化物質(zhì)。白喉類(lèi)毒素的量可表達(dá)為國(guó)際單位(IU)。例如，NIBSC提供的'吸附的白喉類(lèi)毒素的第三國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)1999'(DiphtheriaToxoidAdsorbedThirdInternationa!Standard1999)[78,79]含有160RJ/安瓿。除了IU系統(tǒng)，'Lf單位("絮凝化單位"或"臨界絮凝化劑量")被定義為與1國(guó)際單位抗毒素混合產(chǎn)生最佳絮凝化混合物的類(lèi)毒素的量[80]。例如，NIBSC提供的'簡(jiǎn)易白喉類(lèi)毒素'(DiphtheriaToxoid,Plain)[81]，其含有300LF/安瓿，并還提供了'用于絮凝試驗(yàn)的白喉類(lèi)毒素的第一國(guó)際參考試劑，(The1stInternationalReferenceReagentForDiphtheriaToxoidForFlocculationTest)[102〗，其含有900LF/安瓿。組合物通常包含20-80Lf的白喉類(lèi)毒素，典型地約50Lf。通過(guò)IU測(cè)定，組合物通常包含至少30IU/劑量。白喉類(lèi)毒素有用地吸附在氫氧化鋁佐劑上。破傷風(fēng)類(lèi)毒素破傷風(fēng)梭菌(C7oW〃W/"w/etom')導(dǎo)致破傷風(fēng)。破傷風(fēng)毒素經(jīng)過(guò)處理得到保護(hù)性類(lèi)毒素。參考文獻(xiàn)1的第27章更詳細(xì)地公開(kāi)了破傷風(fēng)疫苗中使用的類(lèi)毒素。優(yōu)選的破傷風(fēng)類(lèi)毒素是經(jīng)過(guò)甲醛處理的毒素。用生長(zhǎng)培養(yǎng)基(如衍生自牛酪蛋白的Latham培養(yǎng)基)培養(yǎng)破傷風(fēng)梭菌(C化Mm')，然后進(jìn)行甲醛處理、超濾和沉淀，從而獲得破傷風(fēng)類(lèi)毒素。然后通過(guò)包括無(wú)菌過(guò)濾和/或透析的方法處理此物質(zhì)?？捎脟?guó)際單位(IU)表示破傷風(fēng)類(lèi)毒素的量。例如，NIBSC提供了'吸附的破傷風(fēng)類(lèi)毒素的第三國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)2000'[83,84]，其含有469IU/安瓿。作為IU系統(tǒng)的替代形式，'Lf單位("絮凝單位"或"邊界絮凝劑量")定義為與一個(gè)國(guó)際單位的抗毒素混合時(shí)，產(chǎn)生最優(yōu)絮凝混合物的類(lèi)毒素量[80]。例如，NIBSC提供了'用于絮凝試驗(yàn)的破傷風(fēng)類(lèi)毒素的第一國(guó)際參比試劑'[85]，其含有1000Lf/安瓿。組合物通常包含5-50Lf的破傷風(fēng)類(lèi)毒素，典型地約20Lf。通過(guò)IU測(cè)定，組合物通常包含至少40IU/劑量。破傷風(fēng)類(lèi)毒素可以(但不一定)吸附于氫氧化鋁佐劑(例如，吸附占破傷風(fēng)類(lèi)毒素總量0-10%)。百日咳抗原百日咳博德特菌可導(dǎo)致百日咳。疫苗中的百日咳抗原是細(xì)胞(全細(xì)胞，滅活的B.百日咳桿菌細(xì)胞)或無(wú)細(xì)胞形式。已經(jīng)詳盡記錄了細(xì)胞百日咳抗原的制備(參見(jiàn)例如參考文獻(xiàn)1的第21章)，例如，可通過(guò)加熱滅活百日咳博德特菌的I期培養(yǎng)物獲得該抗原。然而，作為替代形式，可采用無(wú)細(xì)胞抗原。如果使用無(wú)細(xì)胞抗原，優(yōu)選使用一種、兩種或(優(yōu)選)三種以下抗原(1)解毒的百日咳毒素(百日咳類(lèi)毒素或"PT");(2)絲狀血細(xì)胞凝集素("FHA");(3)百日咳桿菌粘附素(也稱(chēng)為"69千道爾頓外膜蛋白")。優(yōu)選從改良的Stainer-Scholte液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的百日咳博德特菌培養(yǎng)物中分離制備這三種抗原?？蓮陌l(fā)酵肉湯中(如通過(guò)吸附于羥基磷灰石凝膠)分離PT和FHA，但可通過(guò)加熱處理和絮凝(如采用氯化鋇)從細(xì)胞中提取百日咳桿菌粘附素?？捎眠B續(xù)的色譜和/或沉淀步驟純化抗原?？赏ㄟ^(guò)疏水性層析、親和層析和大小排阻層析純化PT和FHA?？赏ㄟ^(guò)離子交換層析、疏水性層析和大小排阻層析純化百日咳桿菌粘附素。在用于本發(fā)明之前，可用甲醛處理FHA和百日咳桿菌粘附素?？梢酝ㄟ^(guò)甲醛和/或戊二醛處理使PT脫毒。作為這種化學(xué)脫毒方法的替代形式，PT可以是通過(guò)誘變降低了酶活性的突變PT[86]，但化學(xué)處理脫毒更加常見(jiàn)。無(wú)細(xì)胞百日咳抗原可吸附到一種或多種鋁鹽佐劑上。作為替代形式，它們也可以非吸附狀態(tài)添加。如果加入百日咳桿菌粘附素，優(yōu)選其已經(jīng)吸附在氫氧化鋁佐劑上。PT和FHA可吸附到氫氧化鋁佐劑或者磷酸鋁上。所有PT、FHA和百日咳桿菌粘附素都吸附于氫氧化鋁是有用的。組合物通常包含l-50貼/劑量的PT;1-50pg/劑量的FHA;禾卩1-50嗎百日咳桿菌粘附素。除了PT、FHA和百日咳桿菌粘附素之外，無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗中還可包含噬菌體傘毛(fimbriae)(例如凝集原2和3)。乙型肝炎病毒表面抗原乙型肝炎病毒(HBV)是一種已知的可導(dǎo)致病毒性肝炎的物質(zhì)。HBV病20毒顆粒由被外部蛋白質(zhì)外殼或衣殼包裹的內(nèi)部核心構(gòu)成，病毒核心含有病毒DNA基因組。衣殼的主要成份是一種稱(chēng)為HBV表面抗原，或者更通常稱(chēng)為'HBsAg'的蛋白質(zhì)，這通常是一種分子量約為24kDa的由226個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。所有現(xiàn)有乙肝疫苗均含HBsAg，當(dāng)這種抗原被給予接種者時(shí)它能刺激產(chǎn)生抗-HbsAg抗體從而抵抗HBV感染。為制造疫苗，可用兩種方法制備HBsAg。第一種方法涉及從慢性乙肝攜帶者的血槳中純化顆粒形式的抗原，這是因?yàn)槁砸腋螖y帶者的肝臟中會(huì)合成大量HBsAg并在HBV感染期間釋放到血流中。第二種方法涉及通過(guò)重組DNA法表達(dá)蛋白質(zhì)。本發(fā)明方法中使用的HBsAg優(yōu)選是在酵母細(xì)胞中重組表達(dá)的。合適的酵母包括例如酵母屬(如釀酒酵母CS.ceWs&e))或漢森酵母屬(如多形漢森酵母(/f.;w/y/na7^a))宿主。HBsAg通常是非糖基化的。不同于天然HBsAg(即質(zhì)粒純化產(chǎn)品中的HBsAg)，酵母表達(dá)的HBsAg通常是非糖基化的，且這是可用于本發(fā)明的最優(yōu)選HBsAg形式，因?yàn)樗歉叨让庖咴缘?，且制造時(shí)沒(méi)有血液產(chǎn)品污染風(fēng)險(xiǎn)。HBsAg通常是基本呈球形的顆粒形式(平均直徑約為20nm)，包括含有磷脂的脂質(zhì)基質(zhì)。酵母表達(dá)的HBsAg顆?？珊性谔烊籋BV病毒顆粒中未發(fā)現(xiàn)的磷脂酰肌醇。該顆粒也可含有非毒性量的LPS以刺激免疫系統(tǒng)[87]。HBsAg可以是包括含有磷脂、磷脂酰肌醇和聚山梨酯20的脂質(zhì)基質(zhì)的顆粒形式。所有已知的HBV亞型都含有共同的決定簇'a'。與其它決定簇和亞決定簇聯(lián)合，鑒定到九種亞型aywl，ayw2，ayw3，ayw4，ayr，adw2，adw4,adrq-和adrq+。除了這些亞型，已經(jīng)出現(xiàn)其它變體，如在免疫個(gè)體中檢測(cè)到的HBV突變體("逃逸突變體")。本發(fā)明常用的HBV亞型是亞型adw2。除'S'序列以外，表面抗原可包含所有或部分前-S序列，如所有或部分前-Sl和/或前-S2序列。HBsAg的量通常以微克表示，每個(gè)疫苗劑量中HbsAg的一般含量在5到5pg之間，例如10昭/劑量。雖然最終疫苗中HBsAg可吸附于氫氧化鋁佐齊U(例如公知的ENGERIX-BTM產(chǎn)品)，或者可保持未吸附，但通常吸附于磷酸鋁佐劑[88〗。滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗脊髓灰質(zhì)炎病毒可導(dǎo)致脊髓灰質(zhì)炎。除了使用口服脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗，本發(fā)明可使用IPV，如參考文獻(xiàn)l第24章詳細(xì)披露的。脊髓灰質(zhì)炎病毒可在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長(zhǎng)，優(yōu)選的培養(yǎng)物采用衍生自猴腎的Vero細(xì)胞系。Vero細(xì)胞宜作為培養(yǎng)的微載體。培養(yǎng)后，可用諸如超濾、滲濾和層析等技術(shù)純化病毒顆粒。施用于患者之前，脊髓灰質(zhì)炎病毒必需被滅活，這可通過(guò)甲醛處理來(lái)實(shí)現(xiàn)。脊髓灰質(zhì)炎可能由三種類(lèi)型的脊髓灰質(zhì)炎病毒之一引起。這三種類(lèi)型相似，并且引起相同的癥狀，但它們的抗原性差異很大，被一種類(lèi)型感染后并不能保護(hù)其免受其它類(lèi)型的感染。因此本發(fā)明優(yōu)選采用三種脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原1型脊髓灰質(zhì)炎病毒(例如Mahoney毒株)、2型脊髓灰質(zhì)炎病毒(例如MEF-1毒株)，和3型脊髓灰質(zhì)炎病毒(例如Saukett毒株)。優(yōu)選將病毒單獨(dú)培養(yǎng)、純化和滅活，然后合并以得到用于本發(fā)明的散裝三價(jià)混合物。IPV的量通常用'DlT單位("D-抗原單位"[89])表示。通常，每劑量每種病毒類(lèi)型包含1-100DU，例如80DU的1型脊髓灰質(zhì)炎病毒，約16DU的2型脊髓灰質(zhì)炎病毒，約64DU的3型脊髓灰質(zhì)炎病毒。在用于制備本發(fā)明組合物之前，脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原優(yōu)選不吸附于任何鋁鹽佐劑，但它們可以在儲(chǔ)存期間吸附到疫苗組合物中的鋁鹽佐劑上。甲型肝炎病毒抗原甲型肝炎病毒(HAV)是一種已知的可導(dǎo)致病毒性肝炎的物質(zhì)。參考文獻(xiàn)1的第15章公開(kāi)了HAV疫苗。有用的HAV組分基于滅活病毒，可通過(guò)甲醛處理實(shí)現(xiàn)滅活?？梢栽谌伺叻坞p倍體成纖維細(xì)胞，如MRC-5細(xì)胞上培養(yǎng)病毒。有用的HAV毒株是HM175，雖然也可使用CR326F?？梢栽谠试S病毒生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。裂解細(xì)胞，可通過(guò)超濾和凝膠滲透層析純化得到的懸液。以EU(Elisa單位)計(jì)，HAV抗原的含量一般為至少約500EU/ml。肺炎球菌糖偶聯(lián)的肺炎球菌抗原包含偶聯(lián)于載體蛋白的肺炎鏈球菌p"ewwom'ae)的莢膜糖抗原[例如，參考文獻(xiàn)90-92]。通常包含來(lái)自肺炎鏈球菌一種以上血清型的糖廣泛采用23種不同血清型的多糖的混合物，如同采用5-11中不同血清型的多糖的偶聯(lián)疫苗[93]。例如，PREVNARtm[94]含有來(lái)自7種血清型(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)的抗原，其中各糖通過(guò)還原胺化單獨(dú)偶聯(lián)于CRM197，每0.5ml劑量含有2嗎各糖(4嗎血清型6B)。本發(fā)明組合物至少包含血清型6B、14、19F和23F的糖抗原。其它血清型可選自1，3，4，5，7F，9V和18C。7-價(jià)(如PREVNARtm所述)，9-價(jià)(例如PREVNAR中的7種血清型加上1和5)，10-價(jià)(例如PREVNAR中的7種血清型加上1、5和7F)和ll-價(jià)(例如，PREVNAR中的7種血清型加上l、3、5和7F)覆蓋度的肺炎球菌血清型尤其有用。通常，每劑量中組合物包含的各存在的血清型為l-20.ug(以糖計(jì))。凍干偶聯(lián)物與水包油乳液佐劑本發(fā)明其他方面的目的是提供包含腦膜炎球菌偶聯(lián)物的改良疫苗制劑，使用水包油乳液重建包含來(lái)自多種腦膜炎球菌血清群的莢膜糖的凍干日^r日苗^T龍苗々RXV/jq/J乂人乂\^*J、I^LM^LX乂J0因此，本發(fā)明提供了一種試劑盒，其包括(i)水包油乳液組分；和(ii)凍干組分，包含來(lái)自一種以上腦膜炎萘瑟氏菌血清群的莢膜糖的偶聯(lián)物。為給予患者，乳液和凍干組分組合形成適合注射的液體疫苗。本發(fā)明還提供了制備疫苗的方法，該方法包括組合以下組分的步驟(i)水包油乳液組分；和(ii)凍千組分，包含來(lái)自一種以上腦膜炎萘瑟氏菌血清群的莢膜糖的偶聯(lián)物。本發(fā)明還提供了一種疫苗，其包含在水包油乳液中的腦膜炎萘瑟菌莢膜糖的偶聯(lián)物，通過(guò)將水包油乳液組分與來(lái)自一種以上腦膜炎萘瑟菌血清23群的凍干的莢膜糖偶聯(lián)物組合進(jìn)行制備。疫苗可包含凍干穩(wěn)定劑(如下所述)。本發(fā)明還提供以下組分在制備用于給予患者的藥物中的應(yīng)用(i)水包油乳液組分；和(ii)凍干組分，包含來(lái)自一種以上腦膜炎萘瑟氏菌血清群的莢膜糖偶聯(lián)物。本發(fā)明還提供了用于免疫接種的組合其包含(i)水包油乳液組分；和(ii)凍干組分，包含來(lái)自一種以上腦膜炎萘瑟氏菌血清群的莢膜糖偶聯(lián)物。本發(fā)明該方面的凍干組分的特征如上所述，只是總是包含一種以上血清群的偶聯(lián)物。此外，如果使用水包油乳液，凍干組分通常不含佐劑。上文也描述了包裝(例如試劑盒形式、獨(dú)立容器、多室注射器、小瓶等)、重建、給予(例如患者、方案、注射等)、偶聯(lián)(例如載體蛋白、糖:蛋白質(zhì)比例、連接鍵等)以及最終組成((例如載體、重量克分子滲透濃度、緩沖劑、phl寺,|H'、」符仳?？准晨凇挂耘c丄處爪'l王Hlt)祖or相問(wèn)(、忭必安修止.)U'、J力工"叉用。牟反明該力囬tr、j組甘柳p」^包s-非胭腺災(zāi)壞囷饑尿，卯上尸/r還，例卯D、T、P、HBV、IPV、HAV和/或肺炎球菌抗原。如上所述，它們可以在水性組分中，例如在乳液佐劑中。除了腦膜炎球菌偶聯(lián)物和乳液之外，本發(fā)明該方面的疫苗優(yōu)選還包含Hib偶聯(lián)物。Hib偶聯(lián)物最初是凍干形式，例如與凍干的腦膜炎球菌偶聯(lián)物組合，或者是水性形式。在一些實(shí)施方式中，Hib偶聯(lián)物可與乳液混合，使用Hib/乳液混合物來(lái)重建凍干的腦膜炎球菌偶聯(lián)物。本發(fā)明提供了一種疫苗，其在水包油乳液中包含來(lái)自?xún)煞N或更多種(例如，2、3或4種)腦膜炎萘瑟菌血清群的莢膜糖的偶聯(lián)物和B型流感嗜血桿菌莢膜糖。本發(fā)明該方面使用的Hib偶聯(lián)物的特征在上文中詳細(xì)揭示，例如關(guān)于(i)偶聯(lián)，(ii)糖部分的長(zhǎng)度，(iii)載體蛋白以及(iv)相對(duì)于腦膜炎球菌偶聯(lián)物的劑量比。本發(fā)明所用的具體的水包油乳液包括但不限于*鯊烯、吐溫80和司盤(pán)85的亞微米乳液。該乳液的體積組成可以是約5%鯊烯、約0.5%聚山梨酯80和約0.5%司盤(pán)85(或者對(duì)于2X濃縮物是雙倍劑量)。以重量計(jì)，這些含量變?yōu)?.3%鯊烯、0.5%聚山梨酯80和0.48%司盤(pán)85。這種佐劑稱(chēng)為'MF59'。MF59乳液宜包含檸檬酸根離子，如10mM檸檬酸鈉緩沖液。，鯊烯、生育酚和吐溫80的乳液。該乳液可包含磷酸鹽緩沖鹽水。它也可含有司盤(pán)85(如1%)和/或卵磷脂。這些乳液可含有2-10%鯊烯、2-10%生育酚和0.3-3%吐溫80，鯊烯:生育酚的重量比優(yōu)選S1(例如0.90)，因?yàn)檫@能提供更穩(wěn)定的乳液。角鯊烯和吐溫80的體積比可以約為5:2，或者重量比約為11:5?？赏ㄟ^(guò)下述方法制備一種這樣的乳液將吐溫80溶解于PBS得到2%溶液，然后將卯ml該溶液與5gDL-a-生育酚和5ml鯊烯的混合物混合，然后使該混合物微流體化。得到的乳液可含有(如)平均直徑為100-250nm，優(yōu)選約180nm的亞微米油滴。該乳液也可包含3d-MPL禾卩/或皂苷(如QS21)。鯊烯、生育酚和曲通去污劑(如曲通X-100)的乳液。該乳液也可含有3-0-脫?；瘑瘟柞Ｖ琈A(:'3d-MPL')。該乳液可含有磷酸鹽緩沖液。，含有鯊烯、普朗尼克F-68嵌段共聚物、卵磷脂酰膽堿、甘油和生育酚的乳液[95]。，含有鯊烯、聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污劑(如曲通X100)和生育酚(如琥珀酸a-生育酚)的乳液。該乳液可包含這三種組分，其質(zhì)量比約為75:11:10(如750微克/毫升聚山梨酯80、110微克/毫升曲通X-100和100微克/毫升琥珀酸a-生育酚)，這些濃度應(yīng)包括抗原中這些組分的貢獻(xiàn)。該乳液也可包含3d-MPL。該乳液也可包含皂苷，如QS21。水相可含有磷酸鹽緩沖液。.含有鯊烯、水性溶劑、聚氧乙烯烷基醚親水性非離子型表面活性劑(如聚氧乙烯(12)十六十八醚)和疏水性非離子型表面活性劑(如脫水山梨糖醇酯或二縮甘露醇酯，如失水山梨糖醇單油酸酯或'司盤(pán)80')的乳液。該乳劑優(yōu)選為熱可逆的和/或其中至少90。/。油滴(以體積計(jì))的尺寸小于200nm[96]。該乳劑也可含有以下一種或多種物質(zhì)糖醇；低溫保護(hù)劑(例如，糖，如十二烷基麥芽苷和/或蔗糖)；禾B/或垸基聚糖苷(alkylpolyglycoside)。也可包含TLR4激動(dòng)劑，如化學(xué)結(jié)構(gòu)不含糖環(huán)的TLR4激動(dòng)劑[97]。這類(lèi)乳液可以被凍干。，角鯊烯、泊洛沙姆-105和Abil-Care的乳液[98]。含佐劑疫苗中這些組分的終濃度(重量)是5%鯊烯、4%泊洛沙姆-105(普流羅尼多元醇)和2%Abil-Care85(雙-PEG/PPG-16/16PEG/PPG-16/16二甲硅油；辛酸/癸酸甘油三酯)。*鯊烯、聚山梨酯80和泊洛沙姆401("普流羅尼克TML121")的乳液。可以用磷酸鹽緩沖鹽水，pH7.4配制該乳液。該乳液是一種有用的胞壁酰二肽遞送載體，已在"SAF-I"佐劑(0.05-l。/。Thr-MDP、5%鯊烯、2.5%普朗尼克L121和0.2%聚山梨酸酯80)中與蘇氨?；?MDP—起使用[99]。也可不與Thr-MDP—起使用，例如用"AF"佐劑(5。/。鯊烯、1.25。/。普朗尼克L121和0.2%聚山梨酸酯80)[100]。優(yōu)選微流體化。含有0.5-50%油、0.1-10%磷脂和0.05-5%非離子型表面活性劑的乳液。如參考文獻(xiàn)101所述，優(yōu)選的磷脂組分是磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。優(yōu)選亞微米液滴尺寸。不可代謝油(如輕質(zhì)礦物油)和至少一種表面活性齊U(如卵磷脂、吐溫80或司盤(pán)80)的亞微米水包油乳液?？砂砑觿?，例如QuilA皂苷、膽固醇、皂苷-親脂體偶聯(lián)物(如通過(guò)葡糖醛酸的羧基將脂族胺加到脫?；碥丈隙a(chǎn)生的GPI-0100,參見(jiàn)參考文獻(xiàn)102)、二甲基二-十八垸基溴化銨和/或N,N-二-十八烷基-N,N-雙(2-羥乙基)丙二胺。*皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如膽固醇)結(jié)合成螺旋膠束的乳液[103]。包含礦物油、非離子親脂性乙氧基化脂肪醇和非離子親水性表面活性劑(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液網(wǎng)。包含礦物油、非離子親水性乙氧基化脂肪醇和非離子親脂性表面活性劑(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液網(wǎng)。優(yōu)選包含角鯊烯的乳液。26概述術(shù)語(yǔ)"含有"包括"包含"以及"由...組成"，例如"含有"x的組合物可僅由X組成或可包含其它物質(zhì)，例如X+Y。術(shù)語(yǔ)"基本上"不排除"完全"，如"基本上不含"Y的組合物可能完全不含Y。必要時(shí)，可從本發(fā)明定義中省去術(shù)語(yǔ)"基本上"。與數(shù)值x相關(guān)的術(shù)語(yǔ)"約，，表示，例如X士100/0。除非另有說(shuō)明，包括混合兩種或更多種組分的步驟的方法不需要任何特定的混合順序。因此，可以任何順序混合這些組分。有三種組分時(shí)，兩種組分可以彼此混合，然后將該組合再與第三種組分混合，等等。偶聯(lián)物的濃度在這里定義為糖的質(zhì)量，以避免由于載體選擇而導(dǎo)致的差異。將抗原抗原描述為"吸附"于佐劑時(shí)，優(yōu)選至少吸附了50重量％的該抗原，例如50。/。、60。/。、70°/。、80。/。、90°/。、95%、98%或更多。優(yōu)選的是，白喉類(lèi)毒素和破傷風(fēng)類(lèi)毒素均完全吸附，即上清液中檢測(cè)不到。也優(yōu)選HBsAg完全吸附。將動(dòng)物(特別是牛)材料用于培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，它們應(yīng)獲自未患傳染性海綿狀腦病(TSE)，特別是未患牛海綿狀腦病(BSE)的來(lái)源。本發(fā)明實(shí)施方式根據(jù)參考文獻(xiàn)22所述制備腦膜炎球菌糖偶聯(lián)物。在不含佐劑情況下組合各血清群A、C、W135和Y的偶聯(lián)物，形成四價(jià)腦膜炎球菌偶聯(lián)物的混合物。該混合物在穩(wěn)定劑，例如蔗糖/甘露醇混合物的存在下凍干，形成以后在需要時(shí)可以重建的凍干腦膜炎球菌組分。凍干材料填充到小瓶?jī)?nèi)，劑量為重建后各5嗎糖(血清群A是IO貼)。購(gòu)得HIBTITER疫苗(惠氏(Wyeth))和液體PEDVAXHIBTM。HIBTITER疫苗不含佐劑，而液體PEDVAXHIBTM包含鋁鹽佐劑。兩種疫苗均以玻璃瓶形式提供。通過(guò)針頭將玻璃瓶?jī)?nèi)容物抽取到注射器中，并注入含凍干材料的小瓶中。輕柔混合后，通過(guò)針頭將內(nèi)容物抽取到新的注射器中。用注射針頭更換注射器的針頭，將重建的疫苗注入測(cè)試對(duì)象。在最初的動(dòng)物研究中，使用8組CD1小鼠(每組10只)。組1接受將凍千的MenA偶聯(lián)物與液體MenCWY混合物混合制備的MenACWY偶聯(lián)物疫苗，如參考文獻(xiàn)22所述。組2接受水性重建凍干的MenACWY而制備的MenACWY疫苗。組3-5接受與組2相同的疫苗，但用以下試劑重建(3)含羥基硫酸硫酸鋁佐劑的Hib-OMPC偶聯(lián)物，例如PEDVAXHIB;(4)吸附于磷酸鋁的CRM197-Hib偶聯(lián)物；或(5)未吸附的CRM197-Hib偶聯(lián)物，例如HIBTITERtm。組6-8給予這三種液體Hib疫苗但不給予腦膜炎球菌偶聯(lián)物，分別與組3-5配對(duì)。在第0、14和28天皮下給予200pl體積的疫苗。劑量是lpgMenCWY糖，2叫MenA糖和2.5pgHib糖。第0、28和42天取血清，測(cè)定對(duì)腦膜炎球菌菌株的殺菌活性以及抗-PRP應(yīng)答。在這些實(shí)驗(yàn)的變型中，組4接受含佐劑但非吸附于磷酸鋁的CRM197-Hib偶聯(lián)物。在研究SS-07-02中，三次劑量后的免疫原性結(jié)果如下，對(duì)于5種偶聯(lián)物，以應(yīng)答對(duì)象％表示，對(duì)于腦膜炎球菌偶聯(lián)物，以幾何平均效價(jià)(GMT)表示MenAMenCMenW]MenYHibGMTGMT%GMT%GMT%%1272100154100146100111100-2656100239100106100233訓(xùn)-18821001533100138010053010037.5411687.52051002311009187.587.51111007087.566753875756-------507-------62.58-------50因此，液體Hib與凍干MenACWY的組合可提供保留針對(duì)所有五種細(xì)菌效力的組合物。組3(用液體Hib偶聯(lián)物與羥基磷酸硫酸鋁佐劑重建)和組4(用液體Hib偶聯(lián)物與磷酸鋁佐劑重建)可見(jiàn)優(yōu)良結(jié)果。組3抗-腦膜炎球菌效價(jià)最高，對(duì)所有血清群100%應(yīng)答，但對(duì)Hib抗原的應(yīng)答對(duì)象數(shù)量中等。組4可見(jiàn)最佳抗-Hib應(yīng)答，抗-腦膜炎球菌應(yīng)答也合理，尤其是針對(duì)血清群W135[3]。兩次劑量后組3和4也顯示優(yōu)良的免疫應(yīng)答(數(shù)據(jù)未顯示)，與組1、2或5相比，這兩組中抗-MenY應(yīng)答尤其高(GMT和應(yīng)答對(duì)象。/。都是這樣)。2次劑量后，組4顯示最高的抗-腦膜炎球菌效價(jià)，對(duì)所有血清群100%應(yīng)答。在組4和5中，腦膜炎球菌偶聯(lián)物的存在可提高對(duì)Hib糖的免疫應(yīng)答(比較組8與組5，組7與組4)。在組3和4中，如果液體Hib抗原含佐劑，Hib偶聯(lián)物的存在可提高抗-W135效價(jià)(與組2相比)，但在使用不含佐劑的Hib的組5中未見(jiàn)這種提高。在平行實(shí)驗(yàn)中，用水包角鯊烯乳液(MF59)重建偶聯(lián)物。三組(9-ll)接受以下試劑(9)凍干的MenACWY偶聯(lián)物，(10)CRM197-Hib偶聯(lián)物或(ll)兩者的混合物。3次劑量后的免疫原性結(jié)果如下所示<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>因此，水包角鯊烯乳液能改善腦膜炎球菌和Hib偶聯(lián)物的效力，MenACWY+Hib+乳液組合可提供優(yōu)異的免疫原性。室溫下，采用NMR研究組合產(chǎn)品4和5中MenA和Hib糖偶聯(lián)物在24小時(shí)期間的穩(wěn)定性。這些糖均包含磷酸二酯鍵，因此，以水性形式儲(chǔ)存期間易水解斷裂。然而，用液體Hib重建凍干的MenACWY混合物之后，不論是否存在磷酸鋁佐劑，MenA和Hib糖保持完全穩(wěn)定，沒(méi)有可檢測(cè)的解聚。應(yīng)理解，僅以舉例的方式描述了本發(fā)明，可在本發(fā)明的范圍和構(gòu)思內(nèi)進(jìn)行修改。參考文獻(xiàn)(將其內(nèi)容納入本文作參考)[1](f資度J)(Tacc/"esXPlotkin和Orenstein編)。第四版，2004，ISBN:0-7216-9688-0。[2]WO02腿49。[3]WO2005/032583。[4]Ramsay等(2001)Lancet357(9251):195-196。[5]Undberg(1999)Vaccine17Suppl2:S28-36。6〗Buttery&Moxon(2000)JRCollPhysiciansLond34:163-168。7〗Ahmad&Chapnick(1999)InfectDisClinNorthAm13:113-133,vii。8]Goldblatt(1998)J.Med.Microbiol.47:563-567。9]歐洲專(zhuān)利0477508。10]美國(guó)專(zhuān)利5,306,492。11]W098/42721。12](f腐薪疫度iVCw/"ga"Facc!'"e^(Cruse等編)ISBN3805549326,具體是第10巻:48-114。[13]Hermanson(1996)!f全嫁:傳凝;^,術(shù)》,f2/oco","ga化7fec/w"々Me5;;ISBN:0123423368或012342335X。14]WO97/00697。15]Karura等(1999)TheTurkishJournalofPaediatrics42:421-427。16]Ravenscroft等(2000)DevBiol(Basel)103:35-47。17]W.H.O.Tech.Rep.Ser.594:51,1976。18]Jones(2001)CurrOpinI講stigDrugs2:47-49。19]Costantino1992)Vaccine10:691-8。20]Lieberman等(1996)JAMA275:1499-503。21]WO02/058737。22]WO03/007985。23]Rennels等(2002)PediatrInfectDisJ21:978-979。24]Campbell等(2002)JInfectDis186:1848-1851。25]WO03/080678。[26Glode等(1979)〗InfectDis139:52-56。27]WO94/05325;美國(guó)專(zhuān)利5,425,946。28]Arakere&Frasch(1991)Infect.Immun.59:4349-4356。29]Michon等(2000)Dev.Biol.103:151-160。.30]Rubinstein&Stein(1998)J.Immunol.141:4357-4362。[31]WO2005Z033148。32'3334353637383940414243444546474849505152WO2007細(xì)314。WO2007細(xì)327。WO2007細(xì)322。Anonymous(Jan2002)ResearchDisclosure,453077'Anderson(1983)InfectImmun39(l):233-238。Anderson等(1985)JClinInvest76(l):52-59。EP-A-0372501。EP-A-0378881。EP-A-0427347。W093/17712WO94/03208。W098/58668。EP-A-0471177。WO91/01146Falugi等(20(H)EurJImmunol31:3816-3824。Baraldo4(2004)InfectImmun72(8):4884-7。EP-A-0594610。Ruan等(1990)JImmunol145:3379-3384。WO00/56360。Kuo等(1995)InfectImmun63:2706-13。WO02/091998。30[53]WO01/72337[54〗WO00/61761。[55]WO2007/000341。[56〗WO96/40242[57]Lees等(1996)Vaccine14:湧-198。[58]WO95/08348。[59]美國(guó)專(zhuān)利4,882,317[60]美國(guó)專(zhuān)利4,695,624[61]Porro等(1985)MolImmunol22:907-919。[62]EP-A-0208375[63〗WO00/10599[64]Gever等Med.Microbiol.Immunol,165:171-288(1979)。[65〗美國(guó)專(zhuān)利4,057,685。[66]美國(guó)專(zhuān)利4,673,574;4，761,283;4,808,700。[67]美國(guó)專(zhuān)利4,459,286。[68]美國(guó)專(zhuān)利4,965,338[69]美國(guó)專(zhuān)利4,663,160.[71]美國(guó)專(zhuān)利4,761,283[72]美國(guó)專(zhuān)利4,356,170[73]WO2007細(xì)342。[74]Lei等(2000)DevBiol(Basel)103:259-264。[75]WO00/38711;美國(guó)專(zhuān)殺U6,146,902。[76]Gennaro(2000)《雷明登藥物科學(xué)與實(shí)踐》(Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy),第20版，ISBN:0683306472。[77](f資浙皮仏'f卓位^7乾淑遂展》(Tacc/"eZ)e5/g"..7TeS"6畫(huà)Yo""々'謂""/7p簡(jiǎn)c/,(Powell和Newman編)普萊美出版社(PlenumPress)1995(ISBN0-306-44867-X)。[78]Sesardic等(2001)Biologicals29:107-22。[79]NIBSC編碼98/560。[80]世界衛(wèi)生組織的《免疫的免疫學(xué)基礎(chǔ)系列叢書(shū)》(T7e/附ww"o/og/co//or/m歸m'za〃'o"sw'"J的第1輯(Galazka)。[81]NDBSC編碼69/017。[82]NIBSC編碼DEFT。[83]Sesardic等(2002)Biologicals30:49-68。[84]NIBSC編碼98/552。[85]NDBSC編碼TEFT。[86]Rappuoli等(1991)TIBTECH9:232-23%。[87〗Vanlandschoot等(2005)JGenVirol86:323-31。[88]W093/24148。[89〗世界衛(wèi)生組織(WHO)的(fj^疫游免瘦學(xué)基鄉(xiāng),;^i(齊》(T7ef'附w""o/ogfca/6aw's/or/附廳m'za"owsm'ey」的第6輯(Robertson)[卯]Watson(2000)PediatrInfectDisJ19:331-332。[91〗Rubin(2000)PediatrClinNorthAm47:269-285，v。[92]Jedrzejas(2001)MicrobiolMolBiolRev65:187-207。[93]Zielen等，(2000)InfectImmun.68:1435-1440。[94]Darkes&Plosker(2002)PaediatrDrugs4:609-630。[95〗W09簡(jiǎn)6776。[96]US-2007/0014805。[97〗WO2007/08030S。[98]Suli等(2004)Vaccine22(25-26):3464-9。Allison&Byars(1992)ResImmunol143:519-25。Hariharan等(1995)CancerRes55:3486-9。WO95/11700。美國(guó)專(zhuān)利6,080,725。WO2005/097181。WO2006/113373。權(quán)利要求1.一種試劑盒，其包括(i)水性組分，所述水性組分包含B型流感嗜血桿菌莢膜糖的偶聯(lián)物；和(ii)凍干組分，所述凍干組分包含腦膜炎萘瑟菌莢膜糖的偶聯(lián)物。2.—種制備組合疫苗的方法，該方法包括組合以下組分的步驟(i)水性組分，所述水性組分包含B型流感嗜血桿菌莢膜糖的偶聯(lián)物，和(ii)凍干組分，所述凍干組分包含腦膜炎萘瑟菌莢膜糖的偶聯(lián)物。3.—種組合疫苗，其包含(i)B型流感嗜血桿菌莢膜糖的偶聯(lián)物；和(ii)腦膜炎萘瑟菌莢膜糖的偶聯(lián)物，通過(guò)將水性B型流感嗜血桿菌偶聯(lián)物與凍干的腦膜炎萘瑟氏菌偶聯(lián)物組合進(jìn)行制備。4.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的試劑盒、方法或疫苗，其特征在于，所述水性組分包含佐劑。5.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的試劑盒、方法或疫苗，其特征在于，所述流感嗜血桿菌偶聯(lián)物吸附于磷酸鋁。6.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的試劑盒、方法或疫苗，其特征在于，所述水性組分不含佐劑。7.—種疫苗，其在水包油乳液中包含來(lái)自?xún)煞N或更多種腦膜炎萘瑟菌血清群以及來(lái)自B型流感嗜血桿菌的莢膜糖的偶聯(lián)物。8.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的試劑盒、方法或疫苗，其特征在于，給予所述流感嗜血桿菌偶聯(lián)物在患者中產(chǎn)生濃度大于0.15微克/毫升的抗-PRP抗體。9.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的試劑盒、方法或疫苗，其特征在于，所述水性組分中流感嗜血桿菌偶聯(lián)物的濃度為0.5-50微克/毫升。10.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的試劑盒、方法或疫苗，其特征在于，所述流感嗜血桿菌糖偶聯(lián)于選自下組的載體蛋白CRM197、破傷風(fēng)類(lèi)毒素和腦膜炎萘瑟菌的外膜復(fù)合物。11.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的試劑盒或方法，其特征在于，所述水性組分包含以下一種或多種物質(zhì)白喉類(lèi)毒素、破傷風(fēng)類(lèi)毒素、無(wú)細(xì)胞百曰咳j/l原、滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒t亢原、乙型肝炎病毒表面，亢原和/或肺炎球菌糖。12.—種用于制備疫苗的試劑盒，該試劑盒包括(i)水包油乳液組分；和(ii)凍干組分，所述凍干組分包含來(lái)自一種以上腦膜炎萘瑟菌血清群的莢膜糖的偶聯(lián)物。13.—種制備疫苗的方法，所述方法包括組合以下組分的步驟(i)水包油乳液組分；和(ii)凍干組分，所述凍干組分包含來(lái)自一種以上腦膜炎萘瑟菌血清群的莢膜糖的偶聯(lián)物。14.一種疫苗，其在水包油乳液中包含腦膜炎萘瑟菌莢膜糖的偶聯(lián)物，所述疫苗通過(guò)將水包油乳液組分與來(lái)自一種以上腦膜炎萘瑟菌血清群的凍干的莢膜糖偶聯(lián)物組合進(jìn)行制備。15.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求中所述的試劑盒、方法或疫苗，其特征在于，給予腦膜炎萘瑟菌偶聯(lián)物可引起殺菌性抗體應(yīng)答。16.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求中所述的試劑盒、方法或疫苗，其特征在于，所述凍干組分包含腦膜炎球菌血清群A、C、W135和Y中的2、3或4種。17.如權(quán)利要求16所述的試劑盒、方法或疫苗，其特征在于，所述凍干組分包含來(lái)自各個(gè)腦膜炎球菌血清群A、C、W135和Y的莢膜糖。18.如權(quán)利要求17所述的試劑盒、方法或疫苗，其特征在于，每個(gè)血清群的腦膜炎球菌莢膜糖的量在1微克到20微克之間。19.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的試劑盒、方法或疫苗，其特征在于，所述腦膜炎萘瑟菌糖偶聯(lián)于選自下組的載體蛋白CRM197、白喉類(lèi)毒素和破傷風(fēng)類(lèi)毒素。20.如權(quán)利要求16所述的試劑盒、方法或疫苗，其特征在于，所述凍干組分包含含穩(wěn)定劑的莢膜糖。21.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的試劑盒、方法或疫苗，其特征在于，所述凍干組分包含佐劑。22.如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)所述的試劑盒、方法或疫苗，其特征在于，所述凍干組分不含佐劑。23.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的試劑盒、方法或疫苗，其特征在于，所述凍干組分不含Hib糖。24.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的疫苗，所述疫苗包含一種或多種緩沖劑。25.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含以下一種或多種物質(zhì)白喉類(lèi)毒素，破傷風(fēng)類(lèi)毒素，無(wú)細(xì)胞百日咳抗原，滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原，乙型肝炎病毒表面抗原和/或肺炎球菌糖。26.—種在患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括將前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的疫苗給予患者的步驟。全文摘要用液體Hib組分重建凍干的腦膜炎球菌組分，從而制備腦膜炎組合疫苗。凍干的腦膜炎組分也可用水包油乳液重建。文檔編號(hào)A61K9/19GK101678094SQ200880018507公開(kāi)日2010年3月24日申請(qǐng)日期2008年6月4日優(yōu)先權(quán)日2007年6月4日發(fā)明者M(jìn)·肯托尼,P·科斯坦蒂諾申請(qǐng)人:諾華有限公司