專利名稱：：胰島素經(jīng)鼻吸入粉霧劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種胰島素經(jīng)鼻制劑，具體涉及胰島素經(jīng)鼻吸入粉霧劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
：胰島素是一個由51個氨基酸組成的多肽激素，其分子量約為5800，在正常個體(非糖尿病的)胰島的(3細(xì)胞內(nèi)生成。胰島素主要起到調(diào)節(jié)糖代謝，降低血糖水平；胰島素的缺乏將導(dǎo)致糖尿病。眾多的糖尿病人需要長期頻繁的施用胰島素來維持可接受的血糖水平。胰島素最常用的給藥方法是皮下注射，一般注入腹部或大腿上部。為了維持可接受的血糖水平，通常需要每天注射胰島素，至少一次或兩次，并在必要時補充注射速效胰島素。胰島素的注射給藥方式給患者帶來眾多不便。首先，患者會發(fā)現(xiàn)每天頻繁的注射既困難又麻煩，還伴隨著疼痛，因此可能會導(dǎo)致不情愿而不遵醫(yī)囑，從而一些較嚴(yán)重的患者會危及生命。此外，皮下注射胰島素的吸收也相對較慢，通常需要4590分鐘，且釋放緩慢，增加低血糖的風(fēng)險。因此，醫(yī)藥工作者一直在尋求可以避免自我注射，同時胰島素又可以迅速吸收入體內(nèi)的給藥途徑及相應(yīng)的胰島素制劑?，F(xiàn)在國內(nèi)外已經(jīng)提出了各種可能的替代性胰島素給藥方式，包括腸溶口服、直腸內(nèi)、透皮、肺部等給藥方法。盡管這些技術(shù)避免了皮下注射的不適，但它們也都受到了自身限制。直腸內(nèi)給藥不方便不舒適，不易為患者接受。將胰島素制備成腸溶口服制劑最能為患者接受，但是胰島素為多肽藥物，對胃腸道各種蛋白酶非常敏感，并且胃腸道的粘膜緊密程度高，胰島素難于透過，且腸溶口服制劑胰島素的釋放時間難以確定，藥物可能會在不適當(dāng)?shù)臅r間釋放入血。透皮給藥同樣需要克服皮膚的障礙，因此生物利用度很低，成本較高。肺部給藥業(yè)已取得進(jìn)展，2006年輝瑞公司的exubera肺部干粉吸入劑成功上市，盡管胰島素的吸收較迅速且避免了疼痛，但由于使用其裝置需要較高的技巧，并且還需要患者定期檢查肺生理情況，最終并未取得預(yù)期的市場效果。在90年代初期，INS鼻用制劑的研究最為活躍，而粉霧劑更是由于其給藥劑量準(zhǔn)確，且有利于增加多肽類藥物的穩(wěn)定性和便于存貯等優(yōu)點倍受關(guān)注。在前期的研究中多采用吸收促進(jìn)劑包括膽鹽、脂肪酸、皂角苷、辛酸鈉、月桂酸鈉和聚丙烯酸等。但長期應(yīng)用可損害鼻粘膜和纖毛，致使該給藥途徑未能成功。如何減輕或消除藥物及其添加劑的纖毛毒性，提高胰島素透膜吸收，是使胰島素經(jīng)鼻給藥成功進(jìn)入臨床應(yīng)用的先決條件。日本株式會社DDS研究所2001年在中國申請的專利，其申請?zhí)枮?1801146.2，胰島素的經(jīng)鼻吸入制劑，公開了以多孔球狀碳酸鈣作為載體的含胰島素制劑，其中多孔球狀碳酸鈣是柱狀或針狀微晶或者它們的平行連生結(jié)晶的集合體，碳酸鈣微粒在18-115pm，其比表面積不低于1.5m々g,胰島素以單層或多層的形式附載在其上。該專利存在的一個明顯缺陷是使用大量的碳酸鈣載體，容易對鼻粘膜產(chǎn)生刺激性。日本產(chǎn)業(yè)化研究株式會社2002年在中國申請專利，其申請?zhí)枮?2804546.7，胰島素的經(jīng)鼻藥用組合物，該發(fā)明提供一種以具有特定粒子分布的結(jié)晶纖維素聚集體作為胰島素載體的經(jīng)鼻用粒狀組合物，其中胰島素為未實施可溶化處理的粉末，且該結(jié)晶纖維素聚集體有90%以上的粒子分布在10350)_im的粒徑范圍內(nèi)；胰島素粉末與結(jié)晶纖維素聚集體的重量配比為1:1500,優(yōu)選1:2~100，通過將藥物粉末和固體載體均勻混合進(jìn)行制備而得。該專利存在的一個明顯缺陷是使用了大量的結(jié)晶纖維素，不溶性異物的加入容易對鼻粘膜產(chǎn)生刺激性。美國本特利藥品公司2004年在中國申請專利，其申請?zhí)枮?00480041300.9，用于胰島素治療的藥用組合物及方法，公開了用胰島素治療患者的組合物和方法，其組合了胰島素、滲透增強劑以及保持酸性pH的液體載體，其pH不超過4.5，通過鼻噴霧形式釋放。其中的滲透增強劑為CPE-215(環(huán)十五酸內(nèi)酯)，該滲透增強劑在低溫時容易產(chǎn)生結(jié)晶，而為了保持胰島素的穩(wěn)定性，該制劑需要低溫保存，因此還需要加入結(jié)晶抑制劑；此外，該滲透增強劑在包含胰島素的水相中乳化，因此選擇了HLB值714的表面活性劑，所得的油滴粒徑在0.1~20^im。因此，該專利存在的一個明顯缺陷是滲透增強劑對鼻黏膜可能有刺激性及毒性，且容易吸收進(jìn)入體內(nèi)可能導(dǎo)致不可預(yù)知的副作用。本發(fā)明人先前申請了相關(guān)技術(shù)的中國專利。分別為申請?zhí)枮?00510028990.0，發(fā)明名稱為"一種胰島素鼻用粉霧劑及制備方法"以及申請?zhí)枮?00510028991.5，發(fā)明名稱為"一種胰島素經(jīng)鼻給藥液體制劑"。在這兩份專利中，都是使用微乳體系，以增加胰島素分子的親脂性。同時使用具有生物粘附性的材料，延長含有胰島素的自微乳化粉末在鼻腔的滯留時間。而在200510028990.0專利中，則是選擇將含藥微乳凍干，再與適當(dāng)?shù)妮d體結(jié)合，以制備一種胰島素的粉霧劑。在上述兩個專利，所制備的含藥微乳粒徑大多在lOOnm以上，而得到lOOnm以下的微乳則必須使用大量的表面活性劑，非磷脂的表面活性劑(泊洛沙姆)與磷脂的比例高達(dá)3:15:1?，F(xiàn)經(jīng)實驗考察，發(fā)現(xiàn)以卵磷脂和泊洛沙姆作為乳化劑，由于兩者的HLB值相差較大(卵磷脂HLB為5-6,而泊洛沙姆HLB為25)，所得體系物理穩(wěn)定性較差，盡管兩者具有良好的安全性，并廣泛地應(yīng)用于脂肪乳劑的制備中，但所得乳劑的粒徑常大于100nm。因此，如何選擇合適的表面活性劑和其它助劑；優(yōu)化胰島素經(jīng)鼻給藥制劑中的胰島素與表面活性劑和其他助劑的配比；在提高胰島素的吸收速度與程度的同時，避免低血糖反應(yīng)并降低對鼻黏膜的刺激及毒性，一直是本領(lǐng)域十分關(guān)注的課題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種胰島素經(jīng)鼻吸入粉霧劑，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，滿足臨床治療的需要。本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是這樣的本發(fā)明采用經(jīng)鼻給藥制劑，這樣從給藥途徑上避免了經(jīng)肺給藥后可能出現(xiàn)的對肺生理功能的影響，也可以避免注射給藥的不良反應(yīng)。同時從鼻腔的生理結(jié)構(gòu)來看，其粘膜的表面積相對較大(150180cm2)，且附著大量的絨毛，可大大增加藥物吸收的有效面積；鼻腔粘膜較薄(24mm)，且在其上皮細(xì)胞下有豐富的毛細(xì)血管和毛細(xì)淋巴管，藥物能被迅速吸收。另外，相對于胃腸道而言，鼻腔的分解酶比較少，對多肽藥物破壞小。所以經(jīng)鼻給藥具有劑量小、生物利用度高及起效迅速等特點。而與胰島素的液體制劑相比，粉霧劑具有眾多優(yōu)點避免了防腐劑的加入，降低產(chǎn)生鼻腔刺激性的風(fēng)險；延長藥物在鼻腔的滯留時間；粉末在主動吸入給藥后可分布于近纖毛豐富的嗅覺區(qū)，更利于胰島素的透膜吸收。發(fā)明人從胰島素同時具有疏水鏈和親水鏈的這一分子結(jié)構(gòu)特點出發(fā)，首先制備一種含有活性成分胰島素、水為連續(xù)相、油脂為分散相的乳劑，俗稱水包油的乳劑(0/W)。通過大量的試驗表明，胰島素作為一兩性蛋白，溶解于水相，其二聚體的疏水內(nèi)核與乳劑的油相之間存在吸附作用。對于一個水包油的乳劑，其中的油相以近似圓球的油滴形態(tài)懸浮在水相中，胰島素的二聚體的疏水內(nèi)核則吸附在油滴表面，如圖14所示。對于所制備的含藥微乳，發(fā)明人認(rèn)為，應(yīng)當(dāng)充分考慮其活性成分胰島素的用量與油滴表面積之間的配合關(guān)系，片面的增加胰島素的用量，并不能提高治療效果，反而增加成本。結(jié)合上述幾點，申請人提出如下的技術(shù)方案本發(fā)明胰的島素經(jīng)鼻吸入粉霧劑，其組分和重量百分比含量為具有自微乳化功能的胰島素凍干粉1100%載體099%所述載體為藥學(xué)上可接受的載體，選自甘露醇、乳糖、微晶纖維素或殼聚糖中的一種或者幾種的混合物。所說的具有自微乳化功能的胰島素凍干粉，其組分包括胰島素、油脂、乳化劑、抗氧劑、甘露醇、生物凝膠粘附劑和pH調(diào)節(jié)劑；基于lg胰島素抗氧劑0.01~0.045g甘露醇L02.0g生物凝膠粘附劑0.02~lgpH調(diào)節(jié)劑0.05g0.5g油脂的用量根據(jù)如下關(guān)系確定胰島素的疏水核的表面積油滴的表面積=1:ii.5，凍千前油滴的平均粒徑為10200納米；油脂與乳化劑的體積重量比為lml:0.61.2g;所說的乳化劑為卵磷脂和吐溫80的混合物，卵磷脂和吐溫80的重量份數(shù)比例為卵磷脂l份，吐溫80(U00.35份。所述的具有自微乳化功能的胰島素凍干粉，其粒徑為10~15(^m，由胰島素納米乳劑經(jīng)過真空冷凍干燥或噴霧干燥制備而得。所說的胰島素納米乳劑中，基于lg胰島素-抗氧劑0.01~0.045g甘露醇L02.0g生物凝膠粘附劑0.02~lgpH調(diào)節(jié)劑0.05g0.5gtK696ml;油脂的用量根據(jù)如下關(guān)系確定-胰島素的疏水核的表面積油滴的表面積=1:ii.5，油滴的平均粒徑為io200納米；油脂與乳化劑的體積重量比為lml:0.61.2g;所說的乳化劑為卵磷脂和吐溫80的混合物，卵磷脂和吐溫80的重量份數(shù)比例為卵磷脂l份，吐溫800.100.35份。所說的胰島素的疏水核的表面積為一個確定的值，根據(jù)文獻(xiàn)[ThePeotidesAnalysis,sythesis,Biology,1981,4:63]的記載，胰島素的疏水核表面積計為1.5nm2，lg胰島素分子所含的分子數(shù)為1.03xl0，則其二聚體的個數(shù)為5.15xl(T，總疏水核表面積為7.7xl019nm2，即，lg胰島素與油滴發(fā)生吸附作用的胰島素的疏水核的表面積為7.7><1019nm;油滴的粒徑可采用文獻(xiàn)(鄭少輝，鄧意輝，動態(tài)光散射技術(shù)在靜脈注射亞微乳劑粒徑評價中的應(yīng)用，中國藥劑學(xué)雜志，2005，3(3):126)報道的方法，采用Nicomp-380激光粒度測定儀進(jìn)行測定；體系中，單個油滴的表面積可根據(jù)球體的面積計算公式計算，計算公式如下單個油滴的表面積S=47n;2=;r"2;43單個油滴的體積36;因此，當(dāng)體系中，總體積為V的油脂被分散為粒徑為d油滴時，其總的油滴的數(shù)量n=V/Vi;而油滴總的表面積為nXS1;單位體積的油脂分散后其比表面積K"。所說的油脂選自合成油脂如辛癸酸甘油酯或天然植物油脂如豆油、椰子油、茶油或花生油，動物油脂如魚油；其中優(yōu)選辛癸酸甘油酯；所說的生物凝膠粘附劑選自殼聚糖、海藻酸鹽、阿拉伯膠、羥丙基甲基纖維素、羥丙基纖維素或羧甲基纖維素鈉中的一種或者多種的混合物；其中優(yōu)選殼聚糖；所說的pH調(diào)節(jié)劑包括HCl、NaOH、有機酸、有機堿如醋酸、檸檬酸、氨基丁三醇、乙醇胺或氨基酸如甘氨酸、精氨酸等；優(yōu)選的，所說的具有自微乳化功能的胰島素凍干粉包括如下配比的組分胰島素lg，油脂0.42.5ml，乳化劑0.243.0g，生物凝膠粘附劑0.02lg，甘露醇05g，甘油02.5g，抗氧劑0.01~0.045g，pH調(diào)節(jié)劑0.05~0.5g;優(yōu)選的油滴的平均粒徑為40100納米；優(yōu)選的，所說的具有自微乳化功能的胰島素凍干粉還包括0.010.045g抗氧劑，抗氧劑為維生素E。需要著重說明的是，本發(fā)明中，油脂的用量是根據(jù)油滴的表面積和油滴的粒徑確定的，大量的動物試驗證明，在上述的條件和配比下，能夠獲得最佳的藥物治療效果。本發(fā)明胰島素經(jīng)鼻給藥制劑的制備方法包括下列步驟-胰島素納米乳劑的制備(1)將生物凝膠粘附劑與水或鹽酸混合溶解，獲得生物凝膠粘附劑與水或鹽酸的混合物；(2)將油脂、表面活性劑和抗氧劑混合溶解，獲得油相，然后與水混合，攪拌，得初乳，將初乳在乳勻機中，400-800bar壓力下均質(zhì)210個循環(huán)，得到半透明至透明的微乳液，其中，油滴的粒徑為10200納米,優(yōu)選40-100納米；(3)將處方量的胰島素，加入步驟(2)中微乳液與步驟(1)的水凝膠，加入濃度為l-6mol/L的鹽酸或其他酸使胰島素溶解；(4)加入甘露醇，并用pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)體系pH為3.58.5，獲得胰島素納米乳劑；具有自微乳化功能的胰島素凍干粉的制備將上述所得胰島素納米乳劑經(jīng)冷凍干燥或噴霧干燥后，篩取粒徑為10150nm的粉末，獲得具有自微乳化功能的胰島素凍干粉。所說的冷凍干燥包括如下步驟將所說的胰島素納米乳劑置于一40一3(TC下34h，然后置于一15一l(TC下1015h，然后置于一5(TC下24h，然后置于510。C下24h，最后置于2025t:下l2h，獲得具有自微乳化功能的胰島素凍干粉；所說的噴霧干燥的進(jìn)氣溫度為80100°C，出氣溫度為508(TC;胰島素經(jīng)鼻吸入粉霧劑的制備將上述獲得的具有自微乳化功能的胰島素凍干粉按照所需劑量與載體混合后灌裝于膠囊、泡囊或其他適宜的鼻用吸入裝置中，每個獨立包裝中含胰島素0.55mg，即獲得胰島素經(jīng)鼻吸入粉霧劑。本發(fā)明的胰島素經(jīng)鼻給藥制劑，通過主動吸入方式給藥，可用于胰島素依賴型糖尿病患者的治療。劑量一般為25100IU，具體可根據(jù)病人的病情等因素，由醫(yī)師決定。本發(fā)明的動物試驗證明，胰島素降血糖作用與乳劑的含油量及油滴粒徑有關(guān)，而油滴的粒徑與乳化劑的選擇和用量有關(guān)，在一般情況下，乳化劑的用量越多，則形成的油滴粒徑越小，但是，制劑的不安全性也相應(yīng)的增加，因此，應(yīng)當(dāng)綜合考慮上述的各個方面的因素，選擇合適的乳化劑及其用量。發(fā)明人通過蟾蜍上顎纖毛毒性試驗和溶血試驗對乳化劑用量進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)2%為吐溫的安全濃度，在此濃度下吐溫與磷脂聯(lián)合應(yīng)用能制備出粒徑小于100nm的乳劑，更有利于促進(jìn)胰島素的透粘膜吸收。經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)，此微乳體系具有良好的物理穩(wěn)定性和粘膜安全性。大量的實驗數(shù)據(jù)顯示油脂和胰島素的量存在一定的比例關(guān)系；當(dāng)體系中胰島素二聚體疏水核的表面積與油滴的表面積之比達(dá)1:11.5,胰島素經(jīng)鼻腔吸收的降血糖效果最好，油相超過此比例，降糖效果并未增加，相反粘膜刺激性和纖毛毒性均增加。另外通過試驗后發(fā)現(xiàn)，選用冷凍干燥或者噴霧干燥方法，通過一定的工藝研究，選用合適的工藝參數(shù)，可以將含藥微乳固化，進(jìn)而獲得一種具有自微乳化能力的固體粉末，且制劑的藥效并未下降。而通過干燥工藝，可以提高胰島素的穩(wěn)定性。本發(fā)明的技術(shù)效果在于本發(fā)明確立了胰島素的用量與油滴之間的關(guān)系，并選擇了合適的乳化劑，將胰島素制備成納米乳劑。通過冷凍干燥或噴霧干燥制得具有自微乳化作用的固體粉末，藥物穩(wěn)定性較液體狀態(tài)明顯增加；該干粉遇水后可自動復(fù)溶成納米大小的乳劑；含藥組合物進(jìn)入鼻腔后，納米大小的乳劑易于透過鼻黏膜的屏障，經(jīng)鼻黏膜內(nèi)豐富的毛細(xì)血管和淋巴管進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮療效，從而可顯著提高藥物的生物利用度，吸收迅速，而對鼻黏膜無刺激性；另外生物粘附劑的使用，增加了含藥粉末在鼻粘膜上的滯留時間，使得藥物吸收和利用更為完全。圖1體外胰島素透黏膜試驗結(jié)果。圖2溶血試驗結(jié)果。圖3家兔經(jīng)鼻給藥胰島素粉末、胰島素粉霧劑及其復(fù)溶液平均血糖曲線。圖4家兔經(jīng)鼻給藥不同實施例胰島素粉霧劑后平均血糖曲線。圖5血糖曲線上面積與ins—油脂比關(guān)系。圖6Beagle犬經(jīng)鼻給藥胰島素后平均血糖曲線。圖7藥動學(xué)試驗Beagle犬平均血糖曲線圖8胰島素皮下及經(jīng)鼻給藥平均藥時曲線圖9家兔鼻黏膜病理切片圖10空白微乳(實施例9)的粒徑測定電位測定結(jié)果(平均粒徑61.4nm)。圖ll胰島素納米乳劑(1:0.8)粒徑測定結(jié)果(平均粒徑66.3nm)。圖12空白微乳(實施例9)的zeta電位測定結(jié)果(一17.20mv)。圖13胰島素納米乳劑(1:0.8)的zeta電位測定結(jié)果(一7.54mv)。圖14胰島素的二聚體的疏水內(nèi)核則吸附在油滴表面時的示意圖。具體實施例方式實施例1取殼聚糖75mg用lmlO.lmol/1鹽酸溶解備用；取卵磷脂1.6g、辛癸酸甘油酯2.0ml、tween800.4g和維生素E40mg，60。C溶解得到油相；將油相在6(TC下，倒入同溫的蒸餾水，攪拌，制得初乳，將初乳于高壓乳勻機下以800bar壓力循環(huán)6次，得到空白微乳60ml，油滴的平均粒徑約45nm;取胰島素3.0g和上述微乳混合，加入殼聚糖溶液，滴加0.3ml3mol/lHC1溶解胰島素；加入3.0g甘露醇，用O.lmol/1NaOH調(diào)節(jié)pH至4.0，冷凍干燥制得胰島素納米乳的干粉，凍干程序-一40。C4h、一15。C12h、一5。C4h、5'C4h、20°C2h，測定其最低共熔點為一9.4。C;將干粉過篩后與甘露醇和微晶纖維素的混合物混合，甘露醇和微晶纖維素的重量比例為甘露醇微晶纖維素二i:i;凍干粉載體=1:i，重量比，然后灌裝于膠囊，每個獨立包裝的泡囊含胰島素1.5mg，即獲得本發(fā)明的胰島素經(jīng)鼻給藥制劑。實施例2取殼聚糖75mg用lmlO.lmol/1鹽酸溶解備用；取卵磷脂1.6g、辛癸酸甘油酯2.0ml、tween800.4g和維生素E40mg，6(TC溶解得到油相；將油相在6(TC下，倒入同溫的蒸熘水，攪拌，制得初乳，將初乳于高壓乳勻機下以600bar壓力循環(huán)6次，得到空白微乳60ml，油滴的平均粒徑約60nm;取胰島素3.0g和上述微乳混合，加入殼聚糖溶液，滴加0.3ml3mol/lHC1溶解胰島素；加入3.0g甘露醇，用O.lmol/1NaOH調(diào)節(jié)pH至4.0，冷凍干燥制得胰島素納米乳的干粉，凍干程序一40。C4h、一15。C12h、一5。C4h、5°C4h、20°C2h，測定其最低共熔點為一9.6'C;將干粉過篩后與甘露醇和微晶纖維素混合，甘露醇微晶纖維素=1:l，重量比；凍干粉載體=1:i，重量比；然后灌裝于膠囊，每個獨立包裝的泡囊含胰島素1.5mg，即獲得本發(fā)明的胰島素經(jīng)鼻給藥制劑。實施例3取殼聚糖75mg用lml0.1moI/I鹽酸溶解備用；取卵磷脂1.6g、辛癸酸甘油酯2.0ml、tween800.4g和維生素E40mg，6(TC溶解得到油相；將油相在6(TC下，倒入同溫的蒸餾水，攪拌，制得初乳，將初乳于高壓乳勻機下以400bar壓力循環(huán)6次，得到空白微乳60ml，油滴的平均粒徑約95nm;取胰島素3.0g和上述微乳混合，加入殼聚糖溶液，滴加0.3ml3mol/lHC1溶解胰島素；加入3.0g甘露醇，用0.1mol/lNaOH調(diào)節(jié)pH至4.0，冷凍干燥制得胰島素納米乳的干粉，凍干程序一40。C4h、一15。C12h、_5°C4h、5°C4h、20°C2h，測定其最低共熔點為一9.8°C;將干粉過篩后與甘露醇和微晶纖維素混合，甘露醇微晶纖維素二i:l，重量比；凍干粉載體二i:i，重量比；然后灌裝于膠囊，每個獨立包裝的泡囊含胰島素1.5mg，即獲得本發(fā)明的胰島素經(jīng)鼻給藥制劑。實施例4取海藻酸鈉2g用20ml水溶解備用；取卵磷脂1.2g、精制豆油1.8ml、tween800.32g和維生素E30mg，60。C溶解得到油相；將油相在6(TC下，倒入同溫的蒸餾水，攪拌，制得初乳，將初乳于高壓乳勻機下以800bar壓力循環(huán)2次，得到空白微乳40ml，油滴的平均粒徑約60nm;取胰島素2.0g和上述微乳混合，加入海藻酸鈉溶液，滴加lmol/lHCl溶解胰島素；加入4g甘露醇，用0.1mol/lNaOH調(diào)節(jié)pH至7.4，冷凍干燥制得胰島素納米乳的干粉，凍干程序一3(TC3h、一15。C10h、一5。C2h、10°C2h、25。Clh，測定其最低共熔點為一io.2i:;將干粉過篩后與甘露醇和微晶纖維素混合，甘露醇微晶纖維素=1:5，重量比；凍干粉載體=99:1，重量比；然后灌裝于膠囊，每個獨立包裝的泡囊含胰島素5mg,即獲得本發(fā)明的胰島素經(jīng)鼻給藥制劑。實施例5取殼聚糖O.lg用5mlO.lmol/1鹽酸溶解備用；取卵磷脂2.7g、魚油2.5ml、tween800.3g和維生素E70mg,6(TC溶解得到油相；將油相在6(TC下，倒入同溫的蒸餾水，攪拌，制得初乳，將初乳于高壓乳勻機下以400bar壓力循環(huán)10次，得到空白微乳50ml，油滴的平均粒徑約200nm;取胰島素2.0g和上述微乳混合，加入殼聚糖溶液，滴加0.4mllmo1/1檸檬酸溶解胰島素；加入3g甘露醇，用甘氨酸調(diào)節(jié)pH至3.5，噴霧干燥得干粉，噴霧干燥時控制進(jìn)風(fēng)溫度為8(TC，出風(fēng)溫度50'C。將干粉過篩后與微晶纖維素混合，凍干粉載體=80:20，重量比；然后灌裝于膠囊，每個獨立包裝的泡囊含胰島素2.5mg，即獲得本發(fā)明的胰島素經(jīng)鼻給藥制劑。實施例6取羥丙基纖維素lg用10ml水溶脹備用；取卵磷脂2.5g、辛癸酸甘油酯5.1ml、tween800.5g和維生素E60mg,60。C溶解得到油相；將油相在6(TC下，倒入同溫的蒸餾水，攪拌，制得初乳，將初乳于高壓乳勻機下以800bar壓力循環(huán)IO次，得到空白微乳120ml，油滴的平均粒徑約40nm;取胰島素10.0g和上述微乳混合，加入羥丙基纖維素溶液，滴加0.4ml6mol/lHC1溶解胰島素；加入20g甘露醇，用氨基丁三醇調(diào)節(jié)pH至6.0，冷凍干燥制得胰島素納米乳的干粉，凍干程序一40。C4h、_10°C12h、0°C4h、5°C2h、20°C2h，測定其最低共熔點為一8.8。C;將干粉過篩后灌裝，每個獨立包裝的泡囊含胰島素3mg，即獲得本發(fā)明的胰島素經(jīng)鼻給藥制劑。實施例7取羧甲基纖維素鈉0.5g用10ml水溶解備用；取卵磷脂1.8g、辛癸酸甘油酯2.0ml、tween800.6g和維生素E60mg以及，60'C溶解得到油相；將油相在60'C下，倒入同溫的蒸餾水，攪拌，制得初乳，將初乳于高壓乳勻機下以600bar壓力循環(huán)4次，得到空白微乳40ml，油滴的平均粒徑約50nm;取胰島素2.0g和上述微乳混合，加入羧甲基纖維素鈉溶液，滴加0.4mllmol/1HC1溶解胰島素；加入4g甘露醇，用O.lmol/1NaOH調(diào)節(jié)pH至8.5，冷凍干燥制得胰島素納米乳的干粉，凍干程序一40。C4h、—15°C15h、一5。C2h、5°C2h、20°C2h，測定其最低共熔點為一9.2t:;將干粉過篩后與甘露醇、乳糖、微晶纖維素混合，甘露醇乳糖微晶纖維素=1:1:1，凍干粉載體=1:99，重量比；然后灌裝于膠囊，每個獨立包裝的泡囊含胰島素0.5mg，即獲得本發(fā)明的胰島素經(jīng)鼻給藥制劑。實施例8取殼聚糖200mg用10ml0.1mol/l鹽酸溶解備用；取卵磷脂13.5g、茶油19.2ml、tween801.5g和維生素E450mg，60。C溶解得到油相；將油相在6(TC下，倒入同溫的蒸餾水，攪拌，制得初乳，將初乳于高壓乳勻機下以600bar壓力循環(huán)6次，得到空白微乳75ml，油滴的平均粒徑約100nm;取胰島素10.0g和上述微乳混合，加入殼聚糖溶液，滴加0.4ml6mol/lHC1溶解胰島素；加入10g甘露醇，用0.1mol/lNaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，噴霧干燥時控制進(jìn)風(fēng)溫度為120°C，出氣溫度為8(TC。將干粉過篩后與甘露醇混合，凍干粉載體=40:60，重量比；然后灌裝于膠囊，每個獨立包裝的泡囊含胰島素2mg，即獲得本發(fā)明的胰島素經(jīng)鼻給藥制劑。實施例9取殼聚糖200mg用10ml0.1mol/l鹽酸溶解備用；取卵磷脂5g、辛癸酸甘油酯10.0ml、tween80lg和維生素E150mg，6(TC溶解得到油相；將油相在6(TC下，倒入同溫的蒸餾水，攪拌，制得初乳，將初乳于高壓乳勻機下以600bar壓力循環(huán)10次，得到空白微乳60ml，油滴的平均粒徑約60nm;取胰島素10.0g和上述微乳混合，加入殼聚糖溶液，滴加0.4ml6mol/lHC1溶解胰島素；加入10g甘露醇，用乙醇胺調(diào)節(jié)pH至4.5，冷凍干燥制得胰島素納米乳的干粉，凍干程序一40。C4h、一15。C14h、一5°C2h、5°C2h、2(TC2h，測定其最低共熔點為—9.(TC;將干粉過篩后與甘露醇、微晶纖維素和殼聚糖混合，甘露醇微晶纖維素殼聚糖二i:i:o.oi，重量比；凍干粉載體二i:i，重量比；然后灌裝于膠囊，每個獨立包裝的泡囊含胰島素1mg，即獲得本發(fā)明的胰島素經(jīng)鼻給藥制劑。實施例10取羥丙基纖維素5g用50ml水溶脹備用；取卵磷脂2g、辛癸酸甘油酯4ml、tween800.4g和維生素E50mg，6(TC溶解得到油相；將油相在6(TC下，倒入同溫的蒸餾水，攪拌，制得初乳，將初乳于高壓乳勻機下以800bar壓力循環(huán)10次，得到空白微乳100ml，油滴的平均粒徑約20nm;取胰島素10.0g和上述微乳混合，加入羥丙基纖維素溶液，滴加0.6ml3mol/lHC1溶解胰島素；加入25g甘露醇，用甘氨酸調(diào)節(jié)pH至4.5，冷凍干燥30h制得胰島素納米乳的干粉，凍干程序一40。C4h、一15°C10h、一5°C4h、5°C2h、20°C2h，測定其最低共熔點為一9.3'C;將干粉過篩后與甘露醇混合，凍干粉載體-60:40，重量比；然后灌裝于膠囊，每個獨立包裝的泡囊含胰島素lmg，即獲得本發(fā)明的胰島素經(jīng)鼻給藥制劑。實施例11透膜實驗1、試驗方法取新鮮牛鼻黏膜，生理鹽水洗凈，剝離脂肪等組織，取牛鼻黏膜剪成適宜大小，固定在改裝Franz擴(kuò)散池的供給室與接收室之間，黏膜外表面朝向供給室，在接收室中注入pH4.0的生理鹽水至滿，記錄加入液的體積。開啟磁力攪拌器和恒溫水浴，保持恒速攪拌，37'C恒溫，將給藥粉末均勻撒于擴(kuò)散室黏膜，噴灑適量生理鹽水潤濕，于各個時間點取樣0.3ml，并在接收室中補充新鮮pH4.0的生理鹽水0.3ml。將所取得樣品離心后用HPLC法測定胰島素透膜量。2、測定采用高效液相法測定。儀器型號SHIMADZUSCL-10AVP,SPD-10AVP，LC-10ADVP,SIL-10ADVP,CTO-10AS;色譜柱色譜柱C18250mm><4.6mm(5(am)(Dikma,Diamonsil);流動相0.2mol/L硫酸鹽緩沖溶液(取無水硫酸鈉28.4g，加水溶解后，加磷酸2.7ml、水800ml，用乙醇胺調(diào)節(jié)pH至2.3，加水至1000ml)-乙腈(74:26);流速1.0mL/min;紫外檢測波長214nm，柱溫40°C，進(jìn)樣體積20pL。3、試驗樣品配置樣品1:實施例2樣品2:申請?zhí)?005100289卯.0，一種胰島素經(jīng)鼻干粉吸入劑，實施例l,處方胰島素11.65%、粘附劑4.85%、表面活性劑48.54%、助表面活性劑9.71%、油脂8.74%、稀釋劑11.65%、酸堿4.85%(凍干前平均粒徑l卯nm)。樣品3:胰島素粉末加甘露醇和微晶纖維素制備的載體混合物(重量比同樣品l);給藥量胰島素2mg。4、透膜試驗結(jié)果透膜試驗結(jié)果見圖l。由測定結(jié)果可見，對于同一種生物膜而言，本發(fā)明胰島素經(jīng)鼻粉霧劑透黏膜能力明顯大于其他的胰島素干粉。由上述試驗結(jié)果提示本發(fā)明經(jīng)過乳化劑優(yōu)選以及粒徑控制后，所制得胰島素經(jīng)鼻粉霧劑透黏膜能力最強；與樣品2的胰島素干粉相比，認(rèn)為胰島素與油滴表面積比例、納米乳的粒徑大小對胰島素的透膜能力具有顯著影響。實施例12鼻黏膜刺激性試驗(在體法)鼻黏膜纖毛毒性評價分組,每組各3只，組l:本發(fā)明胰島素經(jīng)鼻粉霧劑(實施例5，生理鹽水復(fù)溶稀釋成lmg/ml)，組2:生理鹽水，組3:1%普萘洛爾。將蟾蜍仰臥固定于蛙板上，用止血鉗使口腔張開，分別滴加0.2ml上述溶液于黏膜處，放置0.5h后用手術(shù)剪分離上腭黏膜，取約3mmx3mm的黏膜，生理鹽水洗凈血塊及雜物，將其平鋪于載玻片上，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察黏膜纖毛的擺動情況，之后將載玻片置于加有少量蒸餾水飽和的層析缸中，密閉，置于室溫環(huán)境(25°C)中，此后每隔一定時間取出標(biāo)本，置于顯微鏡下觀察，如纖毛繼續(xù)擺動則放回層析缸中，直至纖毛停止運動為止，記錄纖毛持續(xù)運動時間，見表l。實驗結(jié)果顯示生理鹽水組纖毛清晰完整，纖毛運動活躍，擺動的纖毛數(shù)量多，持續(xù)擺動時間為678士26min;給予1%普萘洛爾溶液后，觀察可見少量黏膜上皮脫落且纖毛運動停止；給予本發(fā)明胰島素經(jīng)鼻粉霧劑后，纖毛較清晰，持續(xù)擺動時間為670±21min。結(jié)果可見，本發(fā)明的胰島素經(jīng)鼻粉霧劑對鼻腔纖毛具有良好的相容性，不會對纖毛擺動造成損傷。表1纖毛持續(xù)擺動時間<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實施例13鼻黏膜刺激性試驗(離體法):鼻黏膜纖毛毒性評價分組,每組各3只，組l:本發(fā)明胰島素經(jīng)鼻粉霧劑(實施例IO,生理鹽水復(fù)溶稀釋成lmg/ml)，組2:生理鹽水，組3:1%普萘洛爾。將蟾蜍仰臥固定于蛙板上，用止血鉗使口腔張開，生理鹽水清洗粘膜后手術(shù)剪分離上腭黏膜，取約3mmx3mm的黏膜，生理鹽水洗凈血塊及雜物，將其平鋪于載玻片上，滴加上述試液，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察黏膜纖毛的擺動情況，之后將載玻片置于加有少量蒸餾水飽和的層析缸中，密閉，置于室溫環(huán)境(25°C)中，此后每隔一定時間取出標(biāo)本，置于顯微鏡下觀察，如纖毛繼續(xù)擺動則放回層析缸中，直至纖毛停止運動為止，記錄纖毛持續(xù)運動時間，見表2。實驗結(jié)果顯示生理鹽水組纖毛清晰完整，纖毛運動活躍，擺動的纖毛數(shù)量多，持續(xù)擺動時間為657±23min;給予1%普萘洛爾溶液后，觀察可見少量黏膜上皮脫落且纖毛運動停止。給予本發(fā)明胰島素經(jīng)鼻粉霧劑后，纖毛較清晰，持續(xù)擺動時間為666士18min。結(jié)果可見，本發(fā)明的胰島素經(jīng)鼻粉霧劑對鼻腔纖毛具有良好的相容性，不會對纖毛擺動造成損傷。表2纖毛持續(xù)擺動時間<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>實施例14溶血性試驗鼻粘膜組織受損的原因之一是藥物或輔料對細(xì)胞膜有破壞作用，因此通過考察藥物或輔料對生物膜的作用可間接評價鼻粘膜毒性。常用的天然生物膜是紅細(xì)胞膜,通過溶血實驗來考察。血細(xì)胞懸液的配制取兔血數(shù)毫升(約20ml)，放入含玻璃珠的三角燒瓶中振搖10分鐘，或用玻璃棒攪動血液，除去纖維蛋白原，使成脫纖血液。加入0.9%氯化鈉溶液約10倍量，搖勻，1200r/min離心15分鐘，除去上清液，沉淀的紅細(xì)胞再用0.9%氯化鈉溶液按上述方法洗滌3次，至上清液不顯紅色為止。將所得紅細(xì)胞用0.9%氯化鈉溶液配成2%的混懸液，供試驗用。受試物的制備-本發(fā)明胰島素經(jīng)鼻粉霧劑(實施例6)，用水溶解成等滲液后，離心取上清夜，用0.9%氯化鈉溶液調(diào)節(jié)胰島素濃度為lmg/ml后作為供試品溶液。試驗方法取潔凈試管7只，進(jìn)行編號，1-5號管為供試品管，6號陰性對照管，7號陽性對照管。按下表所示依次加入2%紅細(xì)胞懸液、0.9%氯化鈉溶液混勻后，立即置37'C士0.5'C的恒溫箱中進(jìn)行溫育，開始每隔15分鐘觀察l次，1小時后，每隔l小時觀察l次，一般觀察3小時。按下列順序加入各種溶液<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>結(jié)果觀察3h后取出各試管，于3000r/m下離心5min，觀察結(jié)果見圖2，試驗中的陽性對照溶液呈澄明紅色，管底無細(xì)胞殘留，表明有溶血發(fā)生；陰性對照紅細(xì)胞全部下沉，上清液體無色澄明，表明無溶血發(fā)生。l-5號樣品管與陰性管相比未見明顯血紅色，無溶血發(fā)生。結(jié)果判斷陰性對照管無溶血，陽性對照管有溶血發(fā)生，受試物管中的溶液在3小時內(nèi)不發(fā)生溶血?？梢钥闯?，本發(fā)明的胰島素經(jīng)鼻粉霧劑具有良好的生物膜相容性。實施例15動物藥效學(xué)試驗實驗動物和給藥方式家兔12只，雌雄各半，隨機分為兩組，體重2.5士0.2kg，分為組l:胰島素粉末；組2:本發(fā)明實施例8制備的胰島素經(jīng)鼻粉霧劑；組3:本發(fā)明實施例8制備的胰島素經(jīng)鼻粉霧劑復(fù)溶液。飼養(yǎng)7天后，開始實驗。實驗前夜禁食，只飲凈水。給藥劑量25IU/只分別于給藥前30、IO分鐘及給藥后O、5、15、30、45、60、75、90、120、180、240、300、360分鐘兔耳靜脈，用葡萄糖氧化酶測定法測定血清葡萄糖含量；測定結(jié)果見圖3。從圖3可以看出本發(fā)明的胰島素經(jīng)鼻粉霧劑經(jīng)鼻給藥后，能夠有效促進(jìn)胰島素透過鼻黏膜進(jìn)入血液循環(huán)，發(fā)揮降血糖作用，同時，胰島素干粉經(jīng)過加水復(fù)溶后降糖效果與干粉給藥無明顯差異，說明胰島素粉霧劑經(jīng)鼻給藥后能夠迅速溶解吸收起效；而胰島素粉末，未見其降血糖作用，說明僅僅胰島素粉末是不能經(jīng)鼻有效吸收的。實施例16動物藥效學(xué)試驗實驗動物和給藥方式家兔18只，體重2.5i0.2kg，雌雄各半，隨機分為3組。詞養(yǎng)7天后，開始實驗。實驗前夜禁食，只飲凈水。組1給予實施例1所制得胰島素經(jīng)鼻粉霧劑、組2給予實施例2所制得胰島素經(jīng)鼻粉霧劑、組3給予實施例3所制得胰島素經(jīng)鼻粉霧劑。給藥劑量25IU/只分別于給藥前及給藥后5、15、30、45、60、75、90、120、180、240、360分鐘兔耳靜脈，用葡萄糖氧化酶測定法測定血清葡萄糖含量，計算平均血糖，結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，在處方相同的條件下，凍干前胰島素微乳粒徑的粒徑小，所具有的油滴表面積大，胰島素與油脂表面積比在1~1.5:1范圍下具有良好的降糖效果，而低于此比值后降糖效果減弱，說明根據(jù)胰島素與油脂表面積比例與降糖效果相關(guān)的假設(shè)得到驗證。實施例17動物藥效學(xué)試驗藥液配置制備實施例4所制備的空白微乳，以胰島素與空白乳1:10、1:15、1:18、1:25、l:30(g/ml)的比例制備胰島素納米乳，其余各組分均相同制得胰島素粉霧劑。實驗動物和給藥方式-家兔15只，體重2.5土0.2kg，雌7雄8，隨機分為5組。飼養(yǎng)7天后，開始實驗。實驗前夜禁食，只飲凈水。分別給予上述所制得胰島素制劑。給藥劑量25IU/只分別于給藥前及給藥后5、15、30、45、60、75、90、120、180、240、360分鐘兔耳靜脈，用葡萄糖氧化酶測定法測定血清葡萄糖含量，計算平均血糖，比較各制劑(空白微乳粒徑相近而油脂與胰島素比例不同)的血糖曲線上面積的關(guān)系，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，在相同粒徑(約60nm)時，當(dāng)胰島素與空白乳比例在l:18(g/ml)以上即胰島素與油脂的比例達(dá)到l:0.77(油滴與胰島素疏水面積比為l.O)以上時，其血糖曲線上面積基本保持不變，而低于該比值時降糖效果隨胰島素與油脂比例增大而增加。實施例18動物藥效學(xué)試驗實驗動物和給藥方式Beagle犬6只，體重10.0±0.5kg，雌雄各半，隨機分為2組。飼養(yǎng)7天后，開始實驗。實驗前夜禁食，只飲凈水。組1給予實施例1所制得胰島素經(jīng)鼻粉霧劑、組2給予實施例7所制得胰島素經(jīng)鼻粉霧劑。給藥劑量3IU/kg分別于給藥前及給藥后5、15、30、45、60、75、90、120、180、240、360分鐘兔耳靜脈，用葡萄糖氧化酶測定法測定血清葡萄糖含量，計算平均血糖，結(jié)果見圖6。由結(jié)果顯示，兩處方的降糖效果明顯，僅略微差別；盡管實施例1和7的胰島素與油脂用量比值分別為1:0.67禾n1:1(g/ml)，而其粒徑分別約為45、60nm，油滴與胰島素疏水面積比分別為1.15:1和1.27:1再次驗證了胰島素與油脂用量比的關(guān)系當(dāng)兩者總表面積比在1~1.5:1時，降糖效果也相當(dāng)。實施例19藥動學(xué)試驗試驗方法采用Controlday方法進(jìn)行外源胰島素的測定，故在給藥試驗前一周首先對未給藥時動物的內(nèi)源胰島素和c肽進(jìn)行測定，計算各時間點的F因子。根據(jù)試驗所采血樣中C肽濃度可獲知內(nèi)源性胰島素的濃度，從而由實驗測得的胰島素血藥濃度可計算出相應(yīng)時間點的外源性胰島素濃度，以評估不同給藥途徑的藥代動力學(xué)差異，并在試驗中以一定時間間隔觀察生命體征以評估其安全性。試驗動物及試驗安排本試驗為開放、隨機、交叉試驗，間隔期為1周。受試Beagle犬?dāng)?shù)為6只，雌雄各半，體重8—10kg，隨機分成2組，每組三只。第一周進(jìn)行空白血糖、內(nèi)源胰島素及c肽測定；第二周，給藥時，A組皮下注射胰島素注射劑，B組鼻腔給予胰島素粉霧劑，一周后交叉，每只受試犬分別在不同的試驗日給予人胰島素注射液(諾和靈@11)(6IU)或鼻用重組人胰島素粉霧劑(25IU)，，第四周給予胰島素噴霧劑(25IU)，分別于給藥前和給藥后取血。給藥胰島素注射液(諾和靈10(6IU/只)胰島素粉霧劑，實施例9(25IU/只)胰島素噴霧劑，實施例9凍干前(25IU/只)試驗操作每次試驗前一天晚上開始禁食，于次日早晨用3%戊巴比妥鈉將Beagle麻醉后給予參比制劑或受試制劑。皮下注射分別于給藥前和給藥后5、15、30、60、90、120、180、240、360min后腿抽血3—4ml;經(jīng)鼻給藥組分別于給藥前和給藥后5、10、15、20、30、45、60、75、90、120、180、240、360min后腿抽血3—4ml。其中取血60^1測定葡萄糖濃度，平均血糖曲線見圖7，其中，圖7A為皮下注射胰島素的平均血糖曲線，圖7B為經(jīng)鼻給予胰島素粉霧劑的平均血糖曲線，圖7C為經(jīng)鼻給予胰島素噴霧劑的平均血糖曲線，圖7D為空白平均血糖曲線；余下分離得血清，分別測定血藥濃度與C肽測定，計算外源胰島素血液濃度，求得平均藥時曲線作圖，結(jié)果見圖8。結(jié)果處理根據(jù)血糖測定值，應(yīng)用DAS軟件，按梯形法計算血糖變化-時間曲線上面積(AOC)，計算粉霧劑組和噴霧劑組相對藥理生物利用度，分別為15.1%、14.0%;根據(jù)血藥測定值，應(yīng)用DAS軟件，計算血藥曲線下面積AUC，相對于皮下注射胰島素，粉霧劑相對生物利用度15.41%，噴霧劑13.59%,表明粉霧劑給藥后藥物吸收略優(yōu)于噴霧劑。實施例20局部粘膜刺激性試驗試驗動物及分組家兔，體重2.19±0.16g，共15只，雌8只雄7只，每組動物數(shù)5只A.正常組不給藥，不作任何處理。B.鼻用胰島素粉霧劑給藥組(實施例IO)。C.粉霧劑賦形劑組。給藥劑量每只家兔每天給予一粒泡囊內(nèi)容物，即胰島素lmg，連續(xù)7天。觀察指標(biāo)和時間過程觀察時間為每天給藥后30min內(nèi)的刺激反應(yīng)。末次給藥后24h(即第8d)解剖家兔；解剖時，取出每只家兔的鼻腔進(jìn)行大體觀察。比較給藥組和賦形劑組動物鼻腔黏膜表面有無出血點、有無充血、紅腫等現(xiàn)象。取出的鼻黏膜，用10%福爾馬林液固定5—7d。石蠟包埋、切片5nm，經(jīng)脫蠟、逐級酒精脫水，HE染色；上鏡觀察病理組織學(xué)變化并攝影。結(jié)果觀査給藥后噴嚏、抓鼻、充血、水腫、分泌物等現(xiàn)象，均未見異常。于末次給藥24h后處死動物，取出每只家兔的鼻腔進(jìn)行大體觀察。給藥組和賦形劑組動物鼻腔黏膜表面無出血點、無充血和紅腫等現(xiàn)象。鼻黏膜病理切片未見炎癥細(xì)胞的浸潤以及異常增生或萎縮現(xiàn)象，結(jié)果見圖9，其中，圖9A:正常對照組；圖9B給藥組；圖9C賦形劑組；(x400，H-E染色)。試驗顯示，胰島素粉霧劑經(jīng)鼻給藥后對鼻腔未產(chǎn)生刺激性，具有良好安全性。實施例21空白微乳及胰島素納米乳劑的粒徑及zeta電位測定制備適量實施例9空白微乳，以及配置胰島素的重量與油脂的體積比例為1:0.8(g/ml)的乳液，測定空白乳及配置的胰島素乳劑粒徑及zeta電位，結(jié)果見圖10-13。由粒徑測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胰島素加入到微乳中粒徑增加，表明兩者之間產(chǎn)生了相互作用，同時zeta電位的變化也可以揭示兩者之間的作用。實施例22粉霧劑休止角測定分別取各實施例適量胰島素粉霧劑，將粉體從休止角測定裝置的漏斗上自由落下，在圓盤上形成堆積體，分別測定堆積體的半徑r與高度h，用公式tane=h/r計算休止角e，結(jié)果如下表實施例12345休止角40.541.242.842.238.7實施例68910休止角40.041.239.640.541.6實施例23細(xì)胞毒性試驗試驗方法采用L929細(xì)胞(小鼠成纖維細(xì)胞)傳代72h，經(jīng)消化液作用后制成細(xì)胞混懸液，在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每孔加入lml細(xì)胞液，于5%(:02、37。C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后，吸出原培養(yǎng)液，受試藥物組和陽性對照組用50%的藥液或50%陽性對照液進(jìn)行培養(yǎng)，而陰性組用新鮮培養(yǎng)液交換，繼續(xù)于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別于2、4、7天進(jìn)行顯微鏡觀察，對細(xì)胞數(shù)計數(shù)，計算細(xì)胞相對增殖度(RGR)以評價細(xì)胞毒性。藥液配置①實施例9胰島素粉霧劑加入生理鹽水復(fù)溶，離心取上清夜，稀釋到胰島素濃度為0.8mg/ml②制備實施例9空白干粉(不含胰島素)，同上配置③USP陽性對照液將材料清洗后用高壓蒸汽滅菌(12rC，15min)，然后按6cm7ml的比例進(jìn)入培養(yǎng)液中于37"C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h即得。評價指標(biāo)細(xì)胞相對增殖度。反應(yīng)相對增殖度(RGR)0級》1001級75~992級50~743級25~494級卜245級0試驗結(jié)果見下表，試驗結(jié)果顯示胰島素粉霧劑復(fù)溶后加到培養(yǎng)的細(xì)胞中，未對細(xì)胞產(chǎn)生毒性，具有良好的安全性。時間第2天4天7天組別①②③陽性陰性①②③陽性陰性①②③陽性陰性細(xì)胞個數(shù)(104)2.33±0.382.58±0.29O.OO士O.OO2.75±0.2512.75±1.0013.17±1.38O.OO土O.OO14.33±0.6371.08±2.7971.58±2.92o.oo士o.oo75.83±1.63RGR84.8593.94088.9591.86093.7494.400分級權(quán)利要求1.胰島素經(jīng)鼻吸入粉霧劑，其特征在于，其組分和重量百分比含量為具有自微乳化功能的胰島素凍干粉1～100％載體0～99％所述載體為藥學(xué)上可接受的載體；所說的具有自微乳化功能的胰島素凍干粉，其組分包括胰島素、油脂、乳化劑、抗氧劑、甘露醇、生物凝膠粘附劑和pH調(diào)節(jié)劑；基于1g胰島素抗氧劑0.01～0.045g甘露醇1.0～2.0g生物凝膠粘附劑0.02～1gpH調(diào)節(jié)劑0.05g～0.5g油脂的用量根據(jù)如下關(guān)系確定胰島素的疏水核的表面積∶油滴的表面積＝1∶1～1.5，凍干前油滴的平均粒徑為10～200納米；油脂與乳化劑的體積重量比為1ml∶0.6～1.2g；所說的乳化劑為卵磷脂和吐溫80的混合物，卵磷脂和吐溫80的重量份數(shù)比例為卵磷脂1份，吐溫800.10～0.35份所說的生物凝膠粘附劑選自殼聚糖、海藻酸鹽、阿拉伯膠、羥丙基甲基纖維素、羥丙基纖維素或羧甲基纖維素鈉中的一種或幾種的混合物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胰島素經(jīng)鼻吸入粉霧劑，其特征在于，所述載體選自甘露醇、乳糖、微晶纖維素或殼聚糖中的一種或者幾種的混合物。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胰島素經(jīng)鼻吸入粉霧劑，其特征在于，所述的具有自微乳化功能的胰島素凍干粉，其粒徑為10~150pm。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胰島素經(jīng)鼻吸入粉霧劑，其特征在于，所說的油脂選自合成油脂如辛癸酸甘油酯或天然植物油脂如豆油、椰子油、茶油或花生油，動物油脂如魚油。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胰島素經(jīng)鼻吸入粉霧劑，其特征在于，所說的pH調(diào)節(jié)劑包括HC1、NaOH、有機酸、有機堿如醋酸、檸檬酸、氨基丁三醇、乙醇胺或氨基酸。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胰島素經(jīng)鼻吸入粉霧劑，其特征在于，所說的具有自微乳化功能的胰島素凍干粉包括如下配比的組分胰島素lg，油脂0.42.5ml，乳化劑0.243.0g，生物凝膠粘附劑0.02lg，甘露醇05g，甘油02.5g，抗氧劑0.01~0.045g，pH調(diào)節(jié)劑0.05g0.5g。7.根據(jù)權(quán)利要求16任一項所述的胰島素經(jīng)鼻吸入粉霧劑，其特征在于，還包括0.010.045g抗氧劑，抗氧劑為維生素E。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的胰島素經(jīng)鼻吸入粉霧劑的制備方法，其特征在于，包括下列步驟胰島素納米乳劑的制備(1)將生物凝膠粘附劑與水或鹽酸混合溶解，獲得生物凝膠粘附劑與水或鹽酸的混合物；(2)將油脂、表面活性劑和抗氧劑混合溶解，獲得油相，然后與水混合，攪拌，得初乳，將初乳在乳勻機中，400-800bar壓力下均質(zhì)210個循環(huán)，得到半透明至透明的微乳液，其中，油滴的粒徑為10200納米；(3)將處方量的胰島素，加入步驟(2)中微乳液與步驟(1)的水凝膠，加入濃度為l-6mol/L的鹽酸或其他酸使胰島素溶解；(4)加入甘露醇，并用pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)體系pH為3.58.5，獲得胰島素納米乳劑；具有自微乳化功能的胰島素凍干粉的制備將上述所得胰島素納米乳劑經(jīng)冷凍干燥或噴霧干燥后，篩取粒徑為10150pm的粉末，獲得具有自微乳化功能的胰島素凍干粉。所說的冷凍干燥包括如下步驟將所說的胰島素納米乳劑置于一40一3(TC下34h，然后置于一15一10'C下1012h,然后置于一5(TC下34h，然后置于510。C下l2h，最后置于2025'C下12h，獲得具有自微乳化功能的胰島素凍干粉；所說的噴霧干燥的進(jìn)氣溫度為80120°C，出氣溫度5080°C;胰島素經(jīng)鼻吸入粉霧劑的制備將上述獲得的具有自微乳化功能的胰島素凍干粉按照所需劑量(含活性胰島素0.5~5mg)與載體混合后灌裝于膠囊、泡囊或其他適宜的鼻用吸入裝置中，即獲得胰島素經(jīng)鼻吸入粉霧劑。9.一種胰島素納米乳劑，其特征在于，組分和含量為基于lg胰島素抗氧劑0.01~0.045g甘露醇1.0~2.0g生物凝膠粘附劑0.02~lgpH調(diào)節(jié)劑0.05g0.5g水696ml;油脂的用量根據(jù)如下關(guān)系確定-胰島素的疏水核的表面積油滴的表面積=1:11.5，油滴的平均粒徑為io200納米；油脂與乳化劑的體積重量比為lml:0.6l,2g;所說的乳化劑為卵磷脂和吐溫80的混合物，卵磷脂和吐溫80的重量份數(shù)比例為-卵磷脂l份，吐溫800.100.35份所說的生物凝膠粘附劑選自殼聚糖、海藻酸鹽、阿拉伯膠、羥丙基甲基纖維素、羥丙基纖維素或羧甲基纖維素鈉中的一種或幾種的混合物。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的胰島素納米乳劑，其特征在于，所說的抗氧劑選自維生素E，所說的油脂選自合成油脂、天然植物油脂或動物油脂，所說的pH調(diào)節(jié)劑包括HC1、NaOH、有機酸、有機堿如醋酸、檸檬酸、氨基丁三醇、乙醇胺或氨基酸。全文摘要本發(fā)明提供了一種胰島素經(jīng)鼻吸入粉霧劑，其組分和重量百分比含量為具有自乳化功能的胰島素凍干粉1～100％，載體0～99％。本發(fā)明中，油脂的用量是根據(jù)油滴的表面積和油滴的粒徑確定的，大量的動物試驗證明，在上述的條件和配比下，能夠獲得最佳的藥物治療效果。與液體制劑相比，干粉的穩(wěn)定性增加，且其遇水后可自動復(fù)溶成納米大小的乳劑；含藥組合物進(jìn)入鼻腔后，納米大小的乳劑易于透過鼻黏膜的屏障，經(jīng)鼻黏膜內(nèi)豐富的毛細(xì)血管和淋巴管進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮療效，從而可顯著提高藥物的生物利用度，吸收迅速，而對鼻黏膜無刺激性；另外生物粘附劑的使用，增加了含藥粉末在鼻粘膜上的滯留時間，使得藥物吸收和利用更為完全。文檔編號A61K47/38GK101428009SQ20081003577公開日2009年5月13日申請日期2008年4月9日優(yōu)先權(quán)日2008年4月9日發(fā)明者方金,聰聞,雷伯開申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院