專(zhuān)利名稱(chēng)：青蒿素及其衍生物與抗菌藥物的聯(lián)合應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物應(yīng)用領(lǐng)域，尤其涉及青蒿素及其衍生物的抗菌應(yīng)用。
背景技術(shù)：
感染性疾病是由于病原微生物侵入體內(nèi)，在體內(nèi)大量地繁殖所引起的疾病，是臨床病人死亡的重要原因之一。造成患者死亡的原因其一是細(xì)菌大量繁殖釋放毒素導(dǎo)致組織器官的損傷；其二是細(xì)菌成分通過(guò)激活免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)TNF-α、IL-1、IL-6、NO等致炎細(xì)胞因子釋放，引起多種炎癥介質(zhì)所形成的瀑布效應(yīng)，可使炎癥反應(yīng)擴(kuò)大甚至失去控制，最終導(dǎo)致以細(xì)胞自身性破壞為特征的全身性炎癥即膿毒癥的發(fā)生。細(xì)菌感染曾是人類(lèi)第一死因，抗生素的發(fā)明帶給了人類(lèi)希望之光。但抗生素的普遍使用使越來(lái)越多的細(xì)菌產(chǎn)生了耐藥性，如果不解決抗生素濫用的問(wèn)題，等待人類(lèi)的將是下一次黑暗。
青蒿提取物用來(lái)治療瘧疾相關(guān)的發(fā)熱已經(jīng)有一千多年的歷史，除傳統(tǒng)的抗瘧作用外，青蒿類(lèi)物質(zhì)還具有其它方面的作用，如平喘、抗癌、抗血吸蟲(chóng)及對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)等。國(guó)內(nèi)外有關(guān)青蒿素及其衍生物的研究很多，但研究范圍主要集中在抗瘧、抗癌、抗血吸蟲(chóng)的作用及其機(jī)制上。
青蒿琥酯(Artesunate)，化學(xué)名為二氫青蒿素-1，2-α-琥珀酸單酯，分子式為C19O8 H28，分子量384，是具有倍半萜結(jié)構(gòu)的抗瘧藥青蒿素的衍生物。青蒿琥酯是新型的抗瘧藥，較之青蒿素，青蒿琥酯可配制成任何常規(guī)的制劑形式，包括固體和液體形式，給藥非常方便。青蒿琥酯作為抗瘧藥，不但效價(jià)高，而且不易產(chǎn)生耐受性。
對(duì)青蒿素及其衍生物的抗炎作用已有報(bào)道，研究發(fā)現(xiàn)青蒿素可抑制LPS/TNF-α誘導(dǎo)性NO合酶的合成及NF-κB的激活；青蒿琥酯對(duì)LPS及合并干擾素刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO的合成有明顯的抑制作用；青蒿琥酯對(duì)LPS刺激的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7也具有相似的保護(hù)作用；譚余慶等還發(fā)現(xiàn)青蒿提取物、青蒿素可降低內(nèi)毒素休克小鼠LPO、ACP、內(nèi)毒素、TNF-α、P450濃度，升高SOD活性，降低小鼠死亡率，延長(zhǎng)小鼠的平均生存時(shí)間，對(duì)小鼠肝、肺組織形態(tài)也有一定的保護(hù)作用；王俊等發(fā)現(xiàn)青蒿素能抑制CpGODN、LPS、熱滅活的EC誘導(dǎo)細(xì)胞釋放炎癥因子，并對(duì)膿毒癥模型小鼠具有顯著保護(hù)作用。但是青蒿琥酯是否具有抗菌作用，是否能改善細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥，增強(qiáng)抗生素的抗菌效力和對(duì)細(xì)菌導(dǎo)致的感染是否有效，未見(jiàn)報(bào)告。我國(guó)是青蒿素和其衍生物的主要生產(chǎn)地，由于該藥物療效高、毒性低，WHO已經(jīng)將青蒿素列為世界治療瘧疾的主要藥物，我國(guó)正在擴(kuò)大青蒿種植和青蒿素生產(chǎn)，因此擴(kuò)寬青蒿素類(lèi)衍生物的適應(yīng)癥，將其應(yīng)用于細(xì)菌感染疾病的防治，無(wú)疑對(duì)提高青蒿素類(lèi)衍生物的利用、增加其經(jīng)濟(jì)價(jià)值并改善抗生素濫用所導(dǎo)致的耐藥現(xiàn)象具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于將青蒿素及其衍生物，特別是青蒿琥酯應(yīng)用到抗菌領(lǐng)域，不僅拓寬青蒿素及其衍生物，特別是青蒿琥酯的用途，而且可以減輕現(xiàn)有抗菌藥物的濫用及其導(dǎo)致的耐藥現(xiàn)象。
基于上述目的，本發(fā)明使用的技術(shù)方案是將青蒿素及其衍生物中的一種與抗菌藥物中的一種進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用，該應(yīng)用不是做為疾病的治療方法的應(yīng)用，而是在配備治療疾病(抗菌)的藥物中的應(yīng)用，其中上述兩種成分的比例為1∶1～4096∶1，上兩種成分可以制備成組合物，也可以是兩種單獨(dú)的藥劑。上述兩種成分能夠產(chǎn)生協(xié)同抗菌效力，能夠降低抗菌藥物的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)。
上述菌包括革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌；上述衍生物包括二氫青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚和青蒿琥酯；上述抗菌藥物包括β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素(青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)、非典型β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素)、氨基糖苷類(lèi)、克林霉素類(lèi)、喹諾酮類(lèi)的藥物，在一較佳實(shí)施例中，上述抗菌藥物為青霉素G、氨芐西林、頭孢呋辛、頭孢匹胺、慶大霉素、克林霉素、洛美沙星、加替沙星、舒氨西林和泰能，優(yōu)選為慶大霉素、舒氨西林、頭孢匹胺和加替沙星。
上述應(yīng)用優(yōu)選為青蒿琥酯與抗菌藥物的聯(lián)合應(yīng)用。
青蒿琥酯單獨(dú)使用可抑制革蘭陰性菌和革蘭陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)，與抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用后可明顯增強(qiáng)抗菌藥物的抗菌效力，減少抗菌藥物的使用劑量；實(shí)驗(yàn)表明青蒿素及青蒿琥酯與抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用可明顯降低細(xì)菌(包括革蘭陰性、陽(yáng)性菌)攻擊小鼠死亡率，顯著抑制小鼠血清LPS含量和細(xì)胞因子TNF-α釋放。
本發(fā)現(xiàn)人對(duì)青蒿琥酯體內(nèi)外的抗菌和抗炎作用進(jìn)行了研究。
首先，本研究人員對(duì)本青蒿琥酯的體外抗菌作用進(jìn)行了藥理學(xué)分析，并與抗生素聯(lián)合應(yīng)用后發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯單獨(dú)使用可抑制革蘭陰性菌和革蘭陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)，與抗生素聯(lián)合應(yīng)用后可明顯增強(qiáng)抗生素的抗菌效力，減少抗生素的使用劑量；其次，青蒿琥酯與抗生素聯(lián)合應(yīng)用和可明顯降低細(xì)菌(包括革蘭陰性、陽(yáng)性菌)攻擊小鼠死亡率，顯著抑制小鼠血清LPS含量和細(xì)胞因子TNF-α釋放。
因此本發(fā)明拓寬了青蒿素及其衍生物，特別是青蒿琥酯的用途，提高了抗菌藥物的抗菌效力，減輕了抗菌藥物濫用和導(dǎo)致的耐藥現(xiàn)象。


圖1表示青蒿琥酯協(xié)同慶大霉素、頭孢匹胺、舒氨西林對(duì)大腸埃希菌ATCC35218的聯(lián)合抑菌曲線；圖2表示青蒿琥酯協(xié)同氨芐西林、加替沙星、舒氨西林對(duì)金葡菌ATCC25923的聯(lián)合抑菌曲線；圖3表示青蒿琥酯協(xié)同慶大霉素、加替沙星、舒氨西林對(duì)大腸埃希菌臨床分離株的聯(lián)合抑菌曲線。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但所述實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。
青蒿琥酯(AS)與抗菌藥物按照表1、表2中的配比，能夠產(chǎn)生協(xié)同抗菌效力，降低抗菌藥物的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度。



實(shí)驗(yàn)例1本實(shí)驗(yàn)例在于研究青蒿琥酯與十種抗菌藥物對(duì)不同細(xì)菌的MIC(最低抑菌濃度)和MBC(最低殺菌濃度)采用微孔稀釋法，調(diào)整細(xì)菌濃度為105CFU/ml，接種于96孔無(wú)菌培養(yǎng)板內(nèi)，青蒿琥酯和青霉素鈉、氨芐西林等10種抗菌藥物分別以生理鹽水稀釋為5.14mg/ml。加入各種藥物至含細(xì)菌培養(yǎng)孔內(nèi)，依次倍比稀釋?zhuān)?～10孔藥物的最終濃度依次為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5ug/ml。置37℃培養(yǎng)箱孵育24h和48h，讀取陽(yáng)性和陰性對(duì)照孔，陰性對(duì)照孔清亮，陽(yáng)性對(duì)照孔混濁。藥物對(duì)細(xì)菌的MIC為24h后抑制細(xì)菌肉眼可見(jiàn)生長(zhǎng)的最低藥物濃度，藥物對(duì)細(xì)菌的MBC為48h后抑制細(xì)菌肉眼可見(jiàn)生長(zhǎng)的最低藥物濃度。此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明青蒿琥酯單獨(dú)使用不能完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，并觀察了不同抗菌藥物對(duì)該五種細(xì)菌的抑菌效力。(見(jiàn)表3)。
表310種抗菌藥物和AS的單獨(dú)使用時(shí)對(duì)不同細(xì)菌的MIC及MBC

實(shí)驗(yàn)例2本實(shí)驗(yàn)例在于研究青蒿琥酯與抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用后對(duì)大腸埃希菌MIC和MBC的影響。
采用棋盤(pán)式微孔稀釋法，調(diào)整細(xì)菌濃度為105CFU/ml，接種于96孔無(wú)菌培養(yǎng)板內(nèi)，將對(duì)五種細(xì)菌中等敏感的抗菌藥物用低于MIC的劑量與不同濃度青蒿琥酯分別配伍，觀察配伍后的藥物對(duì)大腸埃希菌的MIC和MBC。此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明青蒿琥酯單獨(dú)使用雖不能完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，但與抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用后可明顯降低抗菌藥物的MIC和MBC，說(shuō)明青蒿琥酯與抗菌藥物協(xié)同后對(duì)細(xì)菌有協(xié)同的抑菌效力。(見(jiàn)表4)。
表4各抗菌藥物與青蒿琥酯協(xié)同后的最低抑菌濃度

實(shí)驗(yàn)例3本實(shí)驗(yàn)例在于研究青蒿琥酯與1/2MIC濃度的不同抗菌藥物協(xié)同后對(duì)大腸埃希菌生長(zhǎng)的抑制強(qiáng)度。
調(diào)整細(xì)菌濃度為106CFU/ml，測(cè)定菌液OD600為0.002(1OD＝5×108CFU/ml)，參照實(shí)驗(yàn)例1結(jié)果，分別單獨(dú)加入終濃度為256μg/ml青蒿琥酯或1/2MIC濃度的抗菌藥物，以及同時(shí)加入256μg/ml青蒿琥酯和1/2MIC濃度的抗菌藥物后，至于37℃恒溫?fù)u床150rpm振搖，分別測(cè)定1、3、5、7、9、12、16、24h時(shí)菌液的OD值，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)菌量。研究結(jié)果表明青蒿琥酯256μg/ml可使大腸埃希菌ATCC35218，金黃色葡萄球菌ATCC25923和大腸埃希菌臨床分離株生長(zhǎng)速度明顯減慢，與單獨(dú)使用抗菌藥物相比，聯(lián)合了青蒿琥酯后明顯抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，抑制程度比單獨(dú)使用抗菌藥物或青蒿琥酯均強(qiáng)(圖1、2、3)。
實(shí)驗(yàn)例4本實(shí)驗(yàn)例在于研究青蒿琥酯聯(lián)合應(yīng)用抗菌藥物對(duì)革蘭陰性細(xì)菌攻擊小鼠的保護(hù)作用清潔級(jí)昆明種小白鼠70只(重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重19.9±0.5g/只，雌雄各半，隨機(jī)分為對(duì)照組、青蒿琥酯組、大腸埃希菌組，大腸埃希菌+慶大霉素組，青蒿琥酯(1.5、5、15mg/kg)+慶大霉素+大腸埃希菌組。每組10只動(dòng)物。對(duì)照不給予任何試劑；青蒿素組肌肉注射15mg/kg的青蒿琥酯；大腸埃希菌組，給予0.8×106/kg活的大腸埃希菌ATCC35218；大腸埃希菌+慶大霉素組，給予慶大霉素0.5mg/kg肌肉注射后給予活大腸埃希菌ATCC35218；慶大霉素+青蒿琥酯+大腸埃希菌組，在給予青蒿琥酯后，立即給予慶大霉素及大腸埃希菌。給藥完畢后給予正常飲食和飲水，觀察7天內(nèi)小鼠一般情況及死亡率(表5)。結(jié)果顯示青蒿琥酯協(xié)同抗菌藥物后可明顯降低小鼠的死亡率，表明對(duì)青蒿琥酯與抗菌藥物聯(lián)合后出現(xiàn)協(xié)同保護(hù)作用。
表5青蒿琥酯協(xié)同慶大霉素對(duì)大腸埃希菌ATCC35218攻擊小鼠的保護(hù)作用

實(shí)驗(yàn)例5本實(shí)驗(yàn)例在于研究青蒿琥酯聯(lián)合應(yīng)用抗菌藥物對(duì)革蘭陽(yáng)性細(xì)菌攻擊小鼠的保護(hù)作用清潔級(jí)昆明種小白鼠70只(重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重19.9±0.5g/只，雌雄各半，隨機(jī)分為對(duì)照組、青蒿琥酯組、金葡菌組，金葡菌+加替沙星組，青蒿琥酯(5、15、45mg/kg)+加替沙星+金葡菌組。每組10只動(dòng)物。對(duì)照不給予任何試劑；青蒿素組肌肉注射45mg/kg的青蒿琥酯；金葡菌組，給予1.0×107/kg活的金葡菌ATCC25923；金葡菌+加替沙星組，給予加替沙星0.5mg/kg肌肉注射后給予活金葡菌ATCC25923；加替沙星+青蒿琥酯+金葡菌組，在給予青蒿琥酯后，立即給予加替沙星及金葡菌。給藥完畢后給予正常飲食和飲水，觀察7天內(nèi)小鼠一般情況及死亡率(表6)。結(jié)果顯示青蒿琥酯協(xié)同抗菌藥物后可明顯降低小鼠的死亡率，表明對(duì)青蒿琥酯與抗菌藥物聯(lián)合后出現(xiàn)協(xié)同保護(hù)作用。
表6 青蒿琥酯協(xié)同加替沙星對(duì)金葡菌ATCC25923攻擊小鼠的保護(hù)作用

實(shí)驗(yàn)例6本實(shí)驗(yàn)例在于研究青蒿琥酯對(duì)滅活大腸埃希菌攻擊小鼠的保護(hù)作用。
清潔級(jí)昆明種小白鼠60只(重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重19.9±0.5g/只，雌雄各半，隨機(jī)分為對(duì)照組、青蒿琥酯組、滅活大腸埃希菌組，青蒿琥酯(5、15、45mg/ml)+滅活大腸埃希菌組。每組8只動(dòng)物。對(duì)照不給予任何試劑；青蒿琥酯組肌肉注射給予45mg/kg的青蒿琥酯，4h，24h，48h后重復(fù)給藥一次；滅活大腸埃希菌組，給予1.25×1011/kg的滅活大腸埃希菌ATCC35218；青蒿琥酯+滅活大腸埃希菌組，在肌肉注射給予青蒿琥酯后，立即給予滅活大腸埃希菌ATCC35218，4h、24h、48h后重復(fù)肌肉注射給藥青蒿琥酯1次。給藥完畢后給予正常飲食和飲水，觀察7天內(nèi)小鼠一般情況及死亡率(表7)。結(jié)果顯示青蒿琥酯可降低小鼠的死亡率，表明對(duì)致炎因子攻擊的小鼠具有保護(hù)作用。
表7青蒿琥酯對(duì)滅活大腸埃希菌攻擊小鼠的保護(hù)作用


*p＜0.5；**p＜0.01vsE.coli實(shí)驗(yàn)例7本實(shí)驗(yàn)例在于研究青蒿琥酯對(duì)滅活大腸埃希菌攻擊小鼠血清細(xì)胞因子釋放影響清潔級(jí)昆明種小白鼠40只(重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重19.9±0.5g/只，雌雄各半，隨機(jī)分為對(duì)照組、青蒿琥酯組、滅活大腸埃希菌組、青蒿琥酯(5、15、45mg/kg)+滅活大腸埃希菌組，每組動(dòng)物3只。對(duì)照不給予任何試劑。青蒿琥酯組肌肉注射給予45mg/kg的青蒿琥酯；青蒿琥酯(5、15、45mg/kg)+滅活大腸埃希菌組給予青蒿琥酯后立即給予滅活大腸埃希菌ATCC35218；給藥完畢4h后摘眼球取血立即離心留置上清保存于-20℃，待測(cè)定細(xì)胞因子TNF-α(表8)。結(jié)果顯示青蒿琥酯可顯著降低滅活大腸埃希菌攻擊小鼠血清細(xì)胞因子釋放。
表8青蒿琥酯降低滅活大腸埃希菌ATCC35218攻擊小鼠血清細(xì)胞因子TNF-α釋放(n＝6，

)

*p＜0.5；**p＜0.01vsE.coli本發(fā)明將青蒿琥酯與抗菌藥物的聯(lián)合應(yīng)用，提高了抗生素的抗菌效力，將青蒿琥酯與抗生素聯(lián)合應(yīng)用還可以預(yù)防、治療細(xì)菌感染。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明所述內(nèi)容，將青蒿素及其衍生物與抗菌藥物的聯(lián)合同樣可以達(dá)到本發(fā)明所述效果。
權(quán)利要求
1.青蒿素及其衍生物中的一種與抗菌藥物中的一種的聯(lián)合應(yīng)用，其能夠產(chǎn)生協(xié)同抗菌效力，降低抗菌藥物的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中青蒿素及其衍生物中的一種與抗菌藥物中的一種的質(zhì)量比為1∶1～4096∶1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，上述菌為革蘭陽(yáng)性菌或革蘭陰性菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，上述衍生物為二氫青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚和青蒿琥酯。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，該應(yīng)用為青蒿琥酯與一種抗菌藥物的聯(lián)合應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，上述抗菌藥物為β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素、氨基糖苷類(lèi)、克林霉素類(lèi)和喹諾酮類(lèi)抗菌藥物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，上述抗β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素包括青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)和非典型β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種現(xiàn)有的抗瘧藥青蒿素及其衍生物二氫青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚、青蒿琥酯新的用途，即，與抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，增強(qiáng)抗菌藥物抗菌效力。尤其是使得青蒿琥酯除作為治療瘧疾藥物外，能夠在預(yù)防及治療細(xì)菌感染性疾病中得到應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P31/00GK101020056SQ20071007825
公開(kāi)日2007年8月22日 申請(qǐng)日期2007年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月2日
發(fā)明者周紅, 李斌, 鄭江 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)