專利名稱：與表皮生長(zhǎng)因子結(jié)合的c－erbB2癌基因的反義短核苷酸及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種反義短核苷酸，特別涉及一種增強(qiáng)對(duì)腫瘤靶向作用的EGFR介導(dǎo)的c-erbB2癌基因反義短核苷酸及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著醫(yī)學(xué)生物技術(shù)的發(fā)展，人類在惡性腫瘤的診斷、治療藥物方面已經(jīng)進(jìn)入分子水平，其中反義基因已經(jīng)用于靶向診斷和靶向治療腫瘤領(lǐng)域。反義基因是指含有與靶基因互補(bǔ)的、能抑制基因表達(dá)的核苷酸序列，反義基因技術(shù)采用癌基因的DNA或核糖核酸mRNA作為靶(target)序列，人工合成的互補(bǔ)于該靶序列的13-20mer單鏈反義短核糖核苷酸(antisenseoligonucleotide，ASON)，可與該靶序列特異結(jié)合，阻斷基因表達(dá)，抑制腫瘤生長(zhǎng)?；蛴梅派湫院怂貥?biāo)記其反義短核糖核苷酸，制成反義短核糖核苷酸探針，引入體內(nèi)的反義短核糖核苷酸探針按堿基互補(bǔ)原則與癌基因的mRNA能特異結(jié)合，反義短核糖核苷酸探針能特異地分布在癌基因擴(kuò)增和過度表達(dá)的腫瘤組織中，用放射性核素體外顯像方法，就可診斷出腫瘤的存在及其形狀、大小。理論上反義癌基因顯象可探測(cè)出只有癌基因擴(kuò)增和過度表達(dá)還沒有形成實(shí)體的腫瘤組織，因此可實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期診斷。研究表明在乳腺癌、卵巢癌、胃癌、食管癌、結(jié)腸癌和膠質(zhì)瘤等腫瘤細(xì)胞中c-erbB2癌基因的表達(dá)量是正常細(xì)胞的百倍以上，與腫瘤的形成、發(fā)展和預(yù)后有密切關(guān)系。在反義基因研究中，最重要的是有多少反義短核糖核苷酸(ASON)進(jìn)入細(xì)胞與靶序列互補(bǔ)結(jié)合，發(fā)揮對(duì)腫瘤的反義抑制作用，這是放射性核素反義基因顯像和反義基因治療成功的關(guān)鍵，現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)下，以c-erbB2為靶基因的反義基因核苷酸進(jìn)入細(xì)胞后，靶/非靶比值較小，影響了腫瘤的診斷和治療效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種c-erbB2癌基因的反義短核苷酸，該反義短核苷酸通過多聚賴氨酸與表皮生長(zhǎng)因子結(jié)合形成復(fù)合物，與機(jī)體內(nèi)的表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)結(jié)合后進(jìn)入細(xì)胞，能夠有效的提高靶/非靶比值。本發(fā)明的目的還在于提供該反義短核苷酸與表皮生長(zhǎng)因子結(jié)合物的制備方法及其在制備診斷和治療c-erbB2癌基因高表達(dá)的惡性腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
具體技術(shù)方案如下一種c-erbB2癌基因的反義短核苷酸，其序列為SEQ ID NO 1所述c-erbB2癌基因的反義短核苷酸，在序列5′和3′端的堿基分別經(jīng)硫代磷酸化修飾成F、Q，并在5′端接上氨基。
所述c-erbB2癌基因的反義短核苷酸，其制備方法包括以下步驟(1)表皮生長(zhǎng)因子與多聚賴氨酸結(jié)合物的合成 按每500μg表皮生長(zhǎng)因子、2.5mg多聚賴氨酸、2.6mg EDAC及50μl濃度為10.1M/L、pH7.3的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液這一比例取樣并置于反應(yīng)瓶中，室溫下攪拌反應(yīng)25～35小時(shí)，然后將反應(yīng)物裝入透吸袋中，在HBS緩沖液中透析20～30小時(shí)，在此期間更換2次透析液，得到表皮生長(zhǎng)因子-多聚賴氨酸結(jié)合物的HBS溶液，濃度為5μg/μl；所述HBS緩沖液為150mM/L NaCl、20mM/L Hepes酸混合而成的pH7.3的溶液；(2)表皮生長(zhǎng)因子-多聚賴氨酸結(jié)合物與序列是SEQ ID NO 1的反義短核苷酸形成復(fù)合物 將步驟1所得表皮生長(zhǎng)因子-多聚賴氨酸結(jié)合物的HBS溶液與序列是SEQ ID NO 1的反義短核苷酸以15～25∶1摩爾比混合，室溫反應(yīng)25～35分鐘，混合物經(jīng)瓊脂糖/三羥甲基氨基甲烷-乙酸緩沖液電泳100V，30分鐘后分析，證實(shí)形成復(fù)合物。
表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)由53個(gè)氨基酸組成的相對(duì)分子量為6045的小分子多肽，EGFR基因與c-erbB2同屬I型成長(zhǎng)因子受體家族，c-erbB2的表達(dá)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與EGFR高度同源。EGFR是原癌基因c-erbB1(也稱HER-1或erbB-1)的表達(dá)產(chǎn)物，分子量為170kDa，由1186個(gè)氨基酸殘基組成，許多腫瘤細(xì)胞表面存在EGFR高表達(dá)，文獻(xiàn)報(bào)道，EGFR在腫瘤組織中的被檢出率乳癌為35％、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌為50％，肺腺癌為56％，證實(shí)腫瘤發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后與EGFR密切相關(guān)。EGFR受體與c-erbB2癌基因同屬表皮生長(zhǎng)因子受體家族，它們?cè)诮M織中分布有一致性和同源性。c-erbB2癌基因的反義基因可與相應(yīng)的靶序列特異結(jié)合，阻斷基因表達(dá)，抑制腫瘤生長(zhǎng)。本發(fā)明篩選出序列為SEQ ID NO 1的反義短核苷酸，采用該核苷酸與表皮生長(zhǎng)因子相結(jié)合形成復(fù)合物，利用表皮生長(zhǎng)受體EGFR介導(dǎo)c-erbB2癌基因反義短核糖核苷酸進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，EGFR受體與c-erbB2同屬表皮生長(zhǎng)因子受體家族，在組織中分布的一致性和同源性，從而增加靶/非靶比值，將這兩種先進(jìn)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)和兩對(duì)結(jié)合體的結(jié)合力和特異性結(jié)合起來，相互協(xié)同、相互促進(jìn)提高診斷的靈敏度及基因治療的效果。
本發(fā)明所述的EGFR受體介導(dǎo)的c-erbB2癌基因反義短核糖核苷酸可利用常規(guī)技術(shù)所用的載體或放射性核素標(biāo)記制成治療和診斷惡性腫瘤所用的試劑。特別可用于c-erbB2癌基因高表達(dá)的惡性腫瘤的診斷和治療，如SKBR-3乳腺癌的治療。c-erbB2癌基因反義短核糖核苷酸可以根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)好的序列按常規(guī)技術(shù)進(jìn)行人工合成。
為證明本發(fā)明能夠增強(qiáng)腫瘤靶向性，做了以下對(duì)比實(shí)驗(yàn)利用常規(guī)技術(shù)用放射性核素99mTc標(biāo)記，EGFR介導(dǎo)的反義短核糖核苷酸(EGF-99mTc-ASON)與未用EGFR介導(dǎo)的反義短核糖核苷酸99mTc-ASON對(duì)c-erbB2癌基因過度表達(dá)的SKBR-3乳腺癌細(xì)胞的靶向性進(jìn)行比較。比較指標(biāo)如下腫瘤細(xì)胞(SKBR-3乳腺癌細(xì)胞)攝取率、細(xì)胞返流比率、腫瘤細(xì)胞存活率(MTT實(shí)驗(yàn))、癌蛋白的表達(dá)水平(c-erbB2蛋白(p185)的流式細(xì)胞儀測(cè)定)。
1.腫瘤細(xì)胞攝取率EGFR介導(dǎo)的反義短核糖核苷酸(EGF-99mTc-ASON)轉(zhuǎn)染和未用EGFR介導(dǎo)的反義短核糖核苷酸(99mTc-ASON)的轉(zhuǎn)染，在各時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞對(duì)EGF-99mTc-ASON復(fù)合物的攝取均比99mTc-ASON高(P＜0.01，有顯著性差異)，每一時(shí)間點(diǎn)前者的攝取率均比后者高3倍以上(見附圖1)，附圖所示曲線A表示腫瘤組織對(duì)EGF-99mTc-ASON的攝取，曲線B表示腫瘤組織對(duì)99mTc-ASON的攝取。
2.細(xì)胞返流比率反義核苷酸進(jìn)入靶細(xì)胞后，如沒有發(fā)生特異結(jié)合，就會(huì)從細(xì)胞中返流出，因此細(xì)胞的返流比率對(duì)放射性核素反義基因顯像和反義基因治療有著非常重要的意義。
將三種復(fù)合物EGF-99mTc-ASON、EGF-99mTc-SON(正義短核糖核苷酸)、EGF-99mTc-NON(無義短核糖核苷酸)注入SKBR-3細(xì)胞后18小時(shí)，分析細(xì)胞的返流比率，如下表1表1 18h SKBR-3細(xì)胞返流比率(％，X±SD，n＝3)

Note*Comparison with EGF-99mTc-ASON group P＜0.01三種EGF-99mTc-ON復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞后，18h的返流比率有顯著性差異(P＜0.01)；ASON低于SON和NON(P＜0.01)，SON低于NON的返流百分比率(P＜0.05)。細(xì)胞返流比率低，表明反義短核糖核苷酸在細(xì)胞內(nèi)能特異結(jié)合，實(shí)驗(yàn)組反義短核糖核苷酸返流百分比率明顯低于正義和無義短核糖核苷酸(對(duì)照組)(P＜0.05)，表明EGFR受體介導(dǎo)的EGF-99mTc-ASON與腫瘤細(xì)胞能特異結(jié)合。
3.腫瘤細(xì)胞存活率(MTT實(shí)驗(yàn))四唑鹽比色實(shí)驗(yàn)(MT法)，四唑鹽比色實(shí)驗(yàn)是一種檢測(cè)腫瘤細(xì)胞存活及生長(zhǎng)狀況的方法。
EGF-99mTc-ASON組的吸光度值隨著濃度的增大而逐漸降低，與其它各組相比有顯著性差異(P＜0.05)，不含EGF組99mTc-ASON組吸光度值也隨濃度增大而輕微下降，但與對(duì)照組及其它各組相比，無顯著性差異(P＞0.05)(表2)。
表2 四唑鹽比色實(shí)驗(yàn)(MTT法)各組隨濃度變化的吸光度值(X±SD，n＝3)

由上表可以看出吸光度值EGF-99mTc-ASON＜99mTc-ASON＜其余各組，表明EGFR介導(dǎo)組(EGF-99mTc-ASON)腫瘤細(xì)胞存活率最低，表明癌基因被抑制。腫瘤細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)受抑制。
4.c-erbB2癌蛋白的流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果。
通過流式細(xì)胞儀測(cè)定c-erbB2癌蛋白的熒光強(qiáng)度，可反映各組ON對(duì)SKBR-3細(xì)胞過表達(dá)抑制程度的強(qiáng)弱。結(jié)果見表3。
表3 c-erbB2癌蛋白熒光強(qiáng)度(X±SD，n＝3)

注*與EGF-99mTc-ASON和99mTc-ASON比較，P＜0.05EGF-99mTc-ASON組和99mTc-ASON組熒光強(qiáng)度明顯低于其它各組(P＜0.05)，而EGF-99mTc-ASON組的熒光強(qiáng)度又比99mTc-ASON組低(P＜0.05，表明99mTc-ASON與c-erbB2癌基因mRNA特異結(jié)合，抑制了c-erbB2癌蛋白的表達(dá)，同時(shí)，由于EGFR的介導(dǎo)使更多的ASON進(jìn)入細(xì)胞，因而EGF-99mTc-ASON組的癌蛋白量下降更為明顯。對(duì)照組EGF-99mTc-SON(正義序列)、EGF-99mTc-NON組(無義序列)和EGF-PL組(單純EGF組)的熒光強(qiáng)度與空白對(duì)照組比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示EGF-99mTc-SON、EGF-99mTc-NON和EGF-PL對(duì)c-erbB2癌蛋白(p185)的表達(dá)無明顯影響。
與表皮生長(zhǎng)因子結(jié)合的c-erbB2癌基因的反義短核苷酸可以制成診斷和治療c-erbB2癌基因過度表達(dá)的惡性腫瘤的藥物，特別是制成治療SKBR-3乳腺癌的藥物。
本發(fā)明的有益效果是以c-erbB2為靶基因的反義基因核苷酸與表皮生長(zhǎng)因子結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞后，能提高腫瘤靶向性，增加靶/非靶比值，從而提高了c-erbB2基因過度表達(dá)腫瘤的診斷特別是早期診斷的靈敏度，同時(shí)提高了反義基因的治療效果。


圖1是在不同的時(shí)間腫瘤組織攝取EGF-99mTc-ASON和99mTc-ASON的曲線圖具體實(shí)施例(共2例)下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明實(shí)施例1與表皮生長(zhǎng)因子結(jié)合的c-erbB2癌基因的反義短核苷酸的制備方法，包括以下步驟(1)EGF-多聚賴氨酸結(jié)合物(EGF-PL)的合成將500μg EGF，2.5mg多聚賴氨酸(PL)，2.6mg EDAC及50μl三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(0.1M/L，pH＝7.3)置于反應(yīng)瓶中，室溫?cái)嚢柘路磻?yīng)30h，將反應(yīng)物小心地裝入透吸袋中，在HBS緩沖液(150mM/L NaCl、20mM/LHepes酸，pH＝7.3)中透析25h，期間更換2次透析液，得到EGF-PL的HBS溶液(濃度為5u g/μl)；(2)EGF-PL與反義短核糖核苷酸(ASON)形成復(fù)合物將EGF-PL與ASON洗脫液以20∶1摩爾比混合，室溫反應(yīng)25min，混合物經(jīng)瓊脂糖/三羥甲基氨基甲烷-乙酸緩沖液(1×)電泳(100V，30min)分析，證實(shí)形成EGF-PL-ASON復(fù)合物。
實(shí)施例2顯像研究荷瘤裸鼠顯像，將EGF-99mTc-ASON注入荷瘤裸鼠體內(nèi)1小時(shí)后，腫瘤組織開始出現(xiàn)放射性濃聚，體內(nèi)分布以肝、腎為主，腫瘤組織中放射性高，注入0.1mCi即可保證顯像成功。
2小時(shí)腫瘤清晰顯像，3小時(shí)腫瘤顯像變淡，4小時(shí)逐漸消退。利用這一性能可以為腫瘤的形態(tài)、大小、數(shù)目等提供相關(guān)信息。
序列表<160>1<210>1<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>由于核酸分子內(nèi)堿基配對(duì)形成的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)造成大部份的分子不能與互補(bǔ)核酸相互作用。為了減少反義毒性以及減少非特異性作用，我們采用mRNA的計(jì)算機(jī)折疊、寡核苷酸芯片掃描、用脫氧核酶尋找可接近位點(diǎn)、導(dǎo)向核酶庫、RNaseT1足跡法等方法用以詳盡地設(shè)計(jì)mRNA中的可接近位點(diǎn)，從而找到更有潛力更有效的反義短核苷酸。
<400>15′-NH2-FCAAGTGTGC ACCGQ-3′
權(quán)利要求
1.一種c-erbB2癌基因的反義短核苷酸，其序列為SEQ ID NO 1。
2.一種與表皮生長(zhǎng)因子結(jié)合的c-erbB2癌基因的反義短核苷酸，其特征是按以下制備方法制得(1)表皮生長(zhǎng)因子與多聚賴氨酸結(jié)合物的合成按每500μg表皮生長(zhǎng)因子、2.5mg多聚賴氨酸、2.6mg EDAC及50μl濃度為10.1M/L、pH7.3的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液這一比例取樣并置于反應(yīng)瓶中，室溫下攪拌反應(yīng)25～35小時(shí)，然后將反應(yīng)物裝入透吸袋中，在HBS緩沖液中透析20～30小時(shí)，在此期間更換2次透析液，得到表皮生長(zhǎng)因子-多聚賴氨酸結(jié)合物的HBS溶液，濃度為5μg/μl；所述HBS緩沖液為150mM/L NaCl、20mM/L Hepes酸混合而成的pH 7.3的溶液；(2)表皮生長(zhǎng)因子-多聚賴氨酸結(jié)合物與序列是SEQ ID NO 1的反義短核苷酸形成復(fù)合物 將步驟1所得表皮生長(zhǎng)因子-多聚賴氨酸結(jié)合物的HBS溶液與序列是SEQ ID NO 1的反義短核苷酸以15～25∶1摩爾比混合，室溫反應(yīng)25～35分鐘，混合物經(jīng)瓊脂糖/三羥甲基氨基甲烷-乙酸緩沖液電泳100V，30分鐘后分析，證實(shí)形成復(fù)合物。
3.如權(quán)利要求2所述的與表皮生長(zhǎng)因子結(jié)合的c-erbB2癌基因的反義短核苷酸在制備治療c-erbB2癌基因過度表達(dá)的惡性腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求2所述的與表皮生長(zhǎng)因子結(jié)合的c-erbB2癌基因的反義短核苷酸在制備診斷c-erbB2癌基因過度表達(dá)的惡性腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求2所述的與表皮生長(zhǎng)因子結(jié)合的c-erbB2癌基因的反義短核苷酸在制備治療SKBR-3乳腺癌的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種c－erbB2癌基因的反義短核苷酸，其序列為SEQID NO 1。該反義短核苷酸經(jīng)多聚賴氨酸與表皮生長(zhǎng)因子結(jié)合后的結(jié)合物注入體內(nèi)存在的腫瘤細(xì)胞，利用EGFR受體與c－erbB2同屬表皮生長(zhǎng)因子受體家族，在組織中分布的一致性和同源性，從而增加靶/非靶比值，針對(duì)c－erbB2癌基因過度表達(dá)的惡性腫瘤，可提高診斷的靈敏度和反義基因治療的效果。
文檔編號(hào)A61K48/00GK101037689SQ20071007820
公開日2007年9月19日 申請(qǐng)日期2007年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月9日
發(fā)明者李少林, 吳永中, 季平, 段紅, 王穎, 彭志平, 杜銘, 龐華, 謝娟, 黃家君, 李兵, 傣家富, 劉方欣 申請(qǐng)人:重慶醫(yī)科大學(xué)