專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)異常上皮細(xì)胞脫落的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及活體檢測(cè)異常上皮細(xì)胞脫落速率的方法，其可用作診斷方法。
相關(guān)技術(shù)的描述已知上皮細(xì)胞動(dòng)力學(xué)(稱(chēng)為細(xì)胞增殖、遷移、分化、衰老和喪失的現(xiàn)象)的變化與不同的疾病狀態(tài)有關(guān)，包括炎癥和癌癥(上皮細(xì)胞的惡性癌)。因此，建立測(cè)定細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的精確方法對(duì)于醫(yī)學(xué)和相關(guān)領(lǐng)域是非常重要的。在使用氚化的胸苷(3H-胸苷)的自體放射照相法之前，細(xì)胞動(dòng)力學(xué)通常是使用各種方法學(xué)來(lái)測(cè)定，包括檢測(cè)細(xì)胞有絲分裂、測(cè)量胃腸腺體的尺寸(例如通過(guò)顯微計(jì)數(shù)或測(cè)量)、以及在體外細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行簡(jiǎn)單的細(xì)胞計(jì)數(shù)。
分析細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的常規(guī)方法使用與增殖細(xì)胞中的DNA合成有關(guān)的標(biāo)記物。增殖細(xì)胞可用3H-胸苷或者胸苷類(lèi)似物—溴代脫氧尿苷(BrdU)來(lái)標(biāo)記，它們?cè)贒NA合成期間能夠快速地插入在細(xì)胞DNA中。但是，該方法僅測(cè)量DNA合成的速率，而不是直接測(cè)量細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)、遷移或脫落。
因?yàn)槭褂门cDNA合成有關(guān)的標(biāo)記物的方法易于實(shí)施，它們已通常作為評(píng)估疑有異常動(dòng)力學(xué)的上皮細(xì)胞的首選方法。這些方法的使用受制于以下因素必須用增殖細(xì)胞培養(yǎng)3-H胸苷和BrdU固定長(zhǎng)度的時(shí)間。另外，用3H-胸苷和BrdU標(biāo)記不能在人體內(nèi)進(jìn)行。必須從患者身上提取人上皮細(xì)胞樣品，然后在包含3H-胸苷或BrdU的培養(yǎng)基中進(jìn)行組織培養(yǎng)。
測(cè)定某些酶的水平，如增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和胸苷激酶，也被用于測(cè)定細(xì)胞動(dòng)力學(xué)。雖然這些方法不需要組織培養(yǎng)，但它們也不能用作評(píng)估細(xì)胞動(dòng)力學(xué)(包括細(xì)胞遷移或脫落)的體內(nèi)方法。
花青染料已用于多種生物應(yīng)用中。二氧羰花青染料已用于進(jìn)行白細(xì)胞分化計(jì)數(shù)。Gunter Valet，Max Plank Ges Wissensch；Patent Accession No.84-102307/17，通過(guò)選擇性染色和測(cè)量體積及熒光同時(shí)定量測(cè)定白細(xì)胞(Simultaneous Quantitative Determination of Blood Cells by SelectiveStaining and Measuring volume and Fluorescence)。用于這些研究中的染料是短鏈羰花青染料(低于10個(gè)碳原子)，而且對(duì)膜電勢(shì)的變化產(chǎn)生反應(yīng)。短鏈羰花青染料進(jìn)入細(xì)胞線粒體中，而且是細(xì)胞毒性的。當(dāng)洗滌細(xì)胞時(shí)，無(wú)論細(xì)胞的膜電勢(shì)是否發(fā)生變化，這些染料都容易從細(xì)胞中泄漏出來(lái)。三羰花青染料(Fox，I.J.等人，Proc.May Clinic，32478-484，1957)和Evans藍(lán)染料(Schad，H.等人，Pfluegers Arch.Eur.J.Physiol.，370(2)139-144，1977)已用于通過(guò)稀釋法在活體中評(píng)估心輸出。Dow(Dow，P.，Physiol.Rev.，3677-102，1956)描述了此等方法，其包括在肺的靜脈側(cè)注射已知量的血管內(nèi)指示劑，然后測(cè)量指示劑隨時(shí)間的動(dòng)脈濃度，以測(cè)定注射點(diǎn)和取樣點(diǎn)之間的體積。但是這些染料不用于染色細(xì)胞。
第4,762,701號(hào)美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)了用于追蹤花青標(biāo)記之細(xì)胞并通過(guò)測(cè)量給藥于宿主之花青染料標(biāo)記的細(xì)胞的消失速率來(lái)測(cè)定細(xì)胞壽命的體內(nèi)方法，該文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容在此并入。
第4,783,401號(hào)美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)了用花青染料標(biāo)記存活細(xì)胞的方法，其目的之一是測(cè)量所培養(yǎng)之細(xì)胞的生長(zhǎng)速率。該文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容在此并入。
第4,859,584號(hào)美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)了測(cè)定體外和體內(nèi)生長(zhǎng)之花青標(biāo)記的細(xì)胞的生長(zhǎng)速率的方法，該文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容在此并入。
在本發(fā)明之前，尚沒(méi)有人通過(guò)體內(nèi)檢查成熟表面上皮細(xì)胞的脫落速率來(lái)研究細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)。因此，已公開(kāi)的文獻(xiàn)包括非常少的有關(guān)例如胃腸道或其它粘膜表面上的健康或異常成熟上皮細(xì)胞的脫落速率。洗滌胃襯固定長(zhǎng)的時(shí)間，然后通過(guò)測(cè)量洗滌溶液中的細(xì)胞DNA來(lái)測(cè)定細(xì)胞損失，由此可評(píng)估胃中的細(xì)胞脫落。該方法已被證明是不精確的，這是因?yàn)槠涑绦驈?fù)雜且難以標(biāo)準(zhǔn)化，洗滌期間獲得的細(xì)胞不足以進(jìn)行DNA分析，而且在洗滌期間不小心有可能得到非確定目標(biāo)位置處的細(xì)胞。
發(fā)明簡(jiǎn)述因此，本發(fā)明的目的是提供一種體內(nèi)檢測(cè)異常上皮細(xì)胞脫落速率的方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種體內(nèi)診斷以成熟上皮細(xì)胞中異常細(xì)胞脫落速率為特征的疾病狀態(tài)的方法，其包括體內(nèi)測(cè)定溫血?jiǎng)游锏哪繕?biāo)位置處的表面上皮細(xì)胞的脫落速率是正常還是異常。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種診斷癌癥的改進(jìn)方法，所述癌癥例如是胃癌和結(jié)腸癌、以及其它以異常上皮細(xì)胞脫落速率為特征的疾病。
為實(shí)現(xiàn)上述及其它目的，本發(fā)明提供一種體內(nèi)檢測(cè)溫血?jiǎng)游镏墒焐掀ぜ?xì)胞如粘膜表面的上皮細(xì)胞中異常細(xì)胞脫落速率的方法，其包括以下步驟標(biāo)記目標(biāo)位置處的成熟表面上皮細(xì)胞，然后監(jiān)測(cè)該位置是否存在標(biāo)記物。在該方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，已標(biāo)記的細(xì)胞存留在粘膜表面上，其中胃腸道的粘膜表面提供特別優(yōu)選的目標(biāo)。
本發(fā)明還提供一種診斷以溫血?jiǎng)游锏某墒焐掀ぜ?xì)胞中異常細(xì)胞脫落速率為特征的疾病狀態(tài)的方法，其包括標(biāo)記成熟的上皮細(xì)胞，測(cè)定標(biāo)記細(xì)胞的脫落速率，然后對(duì)比標(biāo)記細(xì)胞的脫落速率和處于相似位置處的健康上皮細(xì)胞的已知脫落速率。
附圖簡(jiǎn)述圖l是胃粘膜的部分示意圖。
圖2是結(jié)腸粘膜的部分示意圖。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述以下將詳細(xì)描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。本發(fā)明提供體內(nèi)檢測(cè)溫血?jiǎng)游锏某墒焐掀ぜ?xì)胞的異常細(xì)胞脫落速率的改進(jìn)方法，所述溫血?jiǎng)游锇ㄈ恕Ｄ繕?biāo)位置如粘膜表面處的成熟表面上皮細(xì)胞用標(biāo)記組合物進(jìn)行標(biāo)記。適合于體內(nèi)標(biāo)記上皮細(xì)胞的標(biāo)記組合物是已知的，其包括花青染料，其它化學(xué)染料如乙酸結(jié)晶紫、Hoechsdye H33342、曙紅和Floxyn，以及抗體基標(biāo)記物(即、可檢測(cè)并共價(jià)鍵連接在抗體上的部分，如熒光分子、放射性同位素、不透X射線的化合物)。在此優(yōu)選包含花青染料部分的標(biāo)記組合物?；ㄇ嗳玖喜糠挚稍跇?biāo)記組合物中起到可檢測(cè)的單獨(dú)物質(zhì)的作用。另外，其它可檢測(cè)的物質(zhì)如其它化學(xué)染料或者不透X射線的化合物(X射線顯影劑)也可存在于標(biāo)記組合物中。該其它可檢測(cè)的物質(zhì)可化學(xué)偶聯(lián)在花青染料部分上，或者也可簡(jiǎn)單地存在于與花青染料或其它標(biāo)記化合物的混合物中。
根據(jù)本發(fā)明靶向標(biāo)記的細(xì)胞群優(yōu)選主要(如果不是完全的話)由成熟上皮細(xì)胞組成。成熟上皮細(xì)胞是那些有絲分裂已經(jīng)完成而且已失去增殖能力的細(xì)胞。因此，在目標(biāo)位置處丟失可檢測(cè)的標(biāo)記物是由于已標(biāo)記的細(xì)胞從上皮脫落，這不同于標(biāo)記細(xì)胞之間的細(xì)胞分裂導(dǎo)致的標(biāo)記物稀釋。
標(biāo)記細(xì)胞從目標(biāo)位置處脫落的速率，以在預(yù)定長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)丟失的可檢測(cè)標(biāo)記物表示，可用多種方法來(lái)測(cè)定。目前優(yōu)選由醫(yī)生直接目視檢測(cè)目標(biāo)位置，但也可使用測(cè)定是否存在標(biāo)記物的其它方法(例如，使用X射線或者結(jié)合使用X射線顯影劑標(biāo)記物的其它放射性成象法)。
在此所用術(shù)語(yǔ)“異常細(xì)胞脫落速率”是指較正常細(xì)胞脫落速率更高或更低的脫落速率。本發(fā)明的獨(dú)特之處在于，成熟表面上皮細(xì)胞的脫落速率可直接在體內(nèi)評(píng)估，以評(píng)價(jià)細(xì)胞動(dòng)力學(xué)并有助于確定疾病狀態(tài)的存在。
沒(méi)有細(xì)胞更新就不能維持組織功能和形態(tài)學(xué)的完整性。人胃粘膜和結(jié)腸粘膜是連續(xù)進(jìn)行快速細(xì)胞丟失(通過(guò)管腔內(nèi)表皮脫落和細(xì)胞死亡)和更新的組織的例子。在進(jìn)行恒定細(xì)胞更新以維持特定數(shù)量的細(xì)胞的器官中，細(xì)胞產(chǎn)生和細(xì)胞丟失在健康的組織中幾乎是以相同的速率進(jìn)行。在胃粘膜中，具有固定壽命的胃粘膜上皮細(xì)胞在位于胃窩底部和腺體的連續(xù)上部分處的增殖區(qū)域中產(chǎn)生。這些細(xì)胞向上遷移至上皮的表面，以補(bǔ)充粘膜細(xì)胞，而且在該過(guò)程中分化和成熟，向下替代胃腺細(xì)胞。因?yàn)槲干掀ぜ?xì)胞具有advanced junction complexes，所以在遷移過(guò)程中細(xì)胞的順序不發(fā)生改變。其結(jié)果是，老的上皮細(xì)胞首先脫落在管腔中。該根據(jù)細(xì)胞年齡而順序脫落在管腔中的現(xiàn)象稱(chēng)為“管線系統(tǒng)(pipe line system)”。在結(jié)腸的上皮中，增殖區(qū)域位于腺管的下三分之二部分中。這些細(xì)胞也表現(xiàn)有順序脫落的“管線系統(tǒng)”，但是與胃上皮細(xì)胞不同，其僅向上遷移。這些過(guò)程在健康和異常上皮組織中通常都具有細(xì)胞增加和細(xì)胞丟失的特征，在此統(tǒng)稱(chēng)為“細(xì)胞脫落”。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，當(dāng)標(biāo)記例如內(nèi)臟器官的粘膜表面上的成熟上皮細(xì)胞時(shí)，可通過(guò)觀察標(biāo)記細(xì)胞從粘膜表面上的脫落速率來(lái)評(píng)估細(xì)胞動(dòng)力學(xué)。觀察到的脫落速率可與(1)該器官的其它位置處的成熟上皮細(xì)胞的脫落速率和/或(2)所評(píng)估的具體類(lèi)型和位置處的細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)脫落速率進(jìn)行比較。因此，與當(dāng)前測(cè)量細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的方法相反，本發(fā)明是測(cè)量已分化的成熟上皮細(xì)胞的脫落速率，而不是測(cè)量增殖細(xì)胞的生長(zhǎng)速率。評(píng)估這些成熟表面上皮細(xì)胞的脫落速率可向醫(yī)生提供用于診斷和/或監(jiān)控上皮細(xì)胞群之健康狀態(tài)的重要信息。具體而言，這些信息有助于診斷和監(jiān)控高增殖及低增殖病變以及以異常細(xì)胞動(dòng)力學(xué)為特征的疾病狀態(tài)，包括胃癌和大腸癌。
根據(jù)本發(fā)明，為檢測(cè)表面上皮細(xì)胞的異常脫落速率，用可檢測(cè)的物質(zhì)標(biāo)記細(xì)胞，該物質(zhì)優(yōu)選為花青染料。本發(fā)明的方法不限于任何具體的目標(biāo)器官或任何具體的標(biāo)記組合物，且通常適用于對(duì)身體的任何上皮化表面(上皮)所進(jìn)行的細(xì)胞脫落速率研究。此等表面包括胃、膽管、結(jié)腸、尿道、血管、包括鼻腔的呼吸道、角膜、食管、胰管、小腸、包括陰道和卵巢的生殖器官、以及前列腺。胃的上皮襯里(胃粘膜)和大腸的上皮襯里(結(jié)腸粘膜)是特別易于形成癌的部位，而且占世界死亡人口的大部分。因此，以下將針對(duì)這兩個(gè)目標(biāo)位置來(lái)詳細(xì)地闡明本發(fā)明。
在實(shí)施本發(fā)明時(shí)，細(xì)胞標(biāo)記物的選擇應(yīng)使得在其結(jié)合于目標(biāo)上皮表面時(shí)易于檢測(cè)其存在。標(biāo)記物應(yīng)連接在上皮上，但不會(huì)不利地改變上皮細(xì)胞的本質(zhì)。標(biāo)記物還應(yīng)保持連接足夠長(zhǎng)的時(shí)間，而且在進(jìn)行診斷的時(shí)間中不會(huì)降解。
用于本發(fā)明方法中的優(yōu)選標(biāo)記組合物包含下式的花青染料
其中Y是氧、硫、亞甲基或者烷基取代的亞甲基；m是0-3；及n是12-22。在此所用的“烷基取代的亞甲基”是指單或二取代的亞甲基，取代基為甲基、乙基或者丙基。上述結(jié)構(gòu)的化合物也可用以下簡(jiǎn)單通式表示(Sims，P.J.等人，Biochem.，133315(1974))DiYCn(2m+1)因此，例如其中Y是硫并具有三個(gè)橋接環(huán)的碳原子和兩個(gè)14碳脂族鏈的化合物稱(chēng)為DiSC14(3)。類(lèi)似地，DiIC14(5)表示其中Y是異丙基并具有五個(gè)橋接環(huán)的碳和兩個(gè)14碳脂族鏈的化合物。
具有一個(gè)或更多個(gè)取代的上式化合物也包括在以上稱(chēng)為花青染料的化合物中，其條件是此等經(jīng)取代的化合物可溶解在至少是標(biāo)記所需的細(xì)胞標(biāo)記介質(zhì)中，而且具有足夠高的膜分配系數(shù)以保持與細(xì)胞的締合。此等化合物還必須在標(biāo)記所需的濃度時(shí)不對(duì)細(xì)胞的存活性產(chǎn)生任何負(fù)面影響。除碘鹽外，也可使用藥物學(xué)上可接受形式的花青染料，包括其它藥物學(xué)上可接受的鹽。
更優(yōu)選的是，用包含下式之花青染料的組合物進(jìn)行標(biāo)記
或
式I的染料(“PKH2”，碘化1-二十二烷基-1′-丙基氧羰花青)和式II的染料(“PKH26”，碘化1-二十二烷基-1′-十四烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青)都可從Sigma BioSciences購(gòu)得，并由Phanos Technologies，Inc.制造。PKH2和PKH26在體內(nèi)都特異性和選擇性地染色細(xì)胞膜，而且不對(duì)細(xì)胞的性質(zhì)產(chǎn)生負(fù)面影響。這兩種染料可通過(guò)熒光容易地鑒別。這些化合物也可作為具有親脂親和性的結(jié)合劑，其它診斷化合物或者其它治療化合物可連接于其上。
除這些優(yōu)點(diǎn)外，PKH2和PKH26是非抗原性的、非細(xì)胞毒性的，具有長(zhǎng)的半衰期，而且具有穩(wěn)定和持續(xù)染色細(xì)胞的能力。該染料僅需要施用在表面上皮細(xì)胞上幾分鐘，就可實(shí)現(xiàn)足夠的染色。
其它花青染料可從各種來(lái)源購(gòu)得，或者也可使用已知的合成方法從已有的起始物制得。參見(jiàn)Hamer，F(xiàn).M.，花青染料及相關(guān)化合物(TheCynine Dyes and Related Compounds)，Interscience Publishers(1964)。當(dāng)用于人體內(nèi)時(shí)，將有效量的染料溶解于蔗糖水溶液中，由此可制備PKH2或者PKH26的溶液。PKH2和PKH26都可從Phanos Technologies，Inc.售賣(mài)的染料試劑盒中得到，它們提供500μl的染料原料液和60ml的稀釋劑。因此，在使用其中一種染料試劑盒制備染料溶液時(shí)，染料對(duì)稀釋劑的濃度為1∶120。
PKH2和PKH26在用于本發(fā)明的組合物中的濃度水平類(lèi)似于這些染料在體外染色細(xì)胞時(shí)已知的濃度水平。待使用的精確濃度是可變的，而且容易最佳化。待使用的染料組合物的體積取決于該組合物中花青染料的濃度以及目標(biāo)位置的大小而變化。施用體積例如可在1-100ml之間變化，而且在許多情況下可使用約10ml的染料組合物。精確的施用體積是可變的，而且容易最佳化。
標(biāo)記組合物包含在介質(zhì)(稀釋劑)中的花青染料，該介質(zhì)在施用時(shí)是安全的，而且提供可重復(fù)的細(xì)胞標(biāo)記。通常使用滲透壓調(diào)節(jié)劑，使花青染料至少在需要標(biāo)記的時(shí)間內(nèi)形成穩(wěn)定的溶液?？山邮艿臐B透壓調(diào)節(jié)劑包括糖，包括單糖如葡萄糖、果糖、山梨糖、木糖、核糖，以及二糖如蔗糖；糖醇，包括甘露糖醇、甘油、肌醇、木糖醇、和核糖醇；氨基酸，包括甘氨酸和精氨酸；以及某些Good′s緩沖劑，如N-三(羥甲基)-甲基-3-氨基丙磺酸?？稍跇?biāo)記介質(zhì)中添加少量的緩沖劑，以調(diào)節(jié)氫離子濃度(pH)。還可使用其它常規(guī)試劑，如抗生素和防腐劑。
在準(zhǔn)備受試者以實(shí)施本發(fā)明的方法時(shí)，可使用進(jìn)行內(nèi)窺鏡檢查所需的常規(guī)制劑。在進(jìn)行本發(fā)明的方法前應(yīng)遵循常規(guī)的準(zhǔn)備程序，例如節(jié)食。為增加花青染料如PKH2和PKH26與上皮粘膜的粘結(jié)力，可使用粘液去除法，該法利用蛋白酶(鏈酶蛋白酶，由Kaken Seiyaku制造)。此等粘液去除法描述于K.Ida等人的“Endoscopic Diagnosis of GastricCancer with Dye Scattering”(Amer.J.Gastroenterology，第63卷，第4號(hào)，316-320頁(yè)，1975年4月)。該文獻(xiàn)的內(nèi)容在此完全并入。簡(jiǎn)而言之，在檢查前20分鐘給藥抗驚厥藥，然后口服給藥約80ml經(jīng)十倍稀釋的二甲基聚硅氧烷(Gasoon)溶液，該溶液混有1g的碳酸氫鈉和20000p.u.的蛋白酶(鏈酶蛋白酶)。
可使用各種途徑向目標(biāo)位置處的表面上皮細(xì)胞給藥標(biāo)記組合物。可使用緩釋口服劑型來(lái)給藥標(biāo)記組合物。優(yōu)選的是，在內(nèi)窺鏡的觀察下直接將溶液形式的組合物施用(噴涂)在上皮粘膜的表面上，或者以飲劑的形式將溶液給藥于受試者。雖然期望直接將溶液噴涂在表面上皮上可增加與粘膜的粘結(jié)力，但口服給藥溶液也是優(yōu)選的，這是因?yàn)榭蓽p輕受試者的負(fù)擔(dān)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，將標(biāo)記組合物施用在上皮化表面的具體區(qū)域中。通過(guò)內(nèi)窺鏡檢查，醫(yī)生可容易地確定該局部區(qū)域是否為異常的，并由此確立是否為本發(fā)明之脫落速率評(píng)估方法的好的候選者。醫(yī)生也可將標(biāo)記組合物施用在鄰近的正常位置處，以在這兩個(gè)位置之間進(jìn)行比較。
僅在細(xì)胞的局部區(qū)域而不是在整個(gè)粘膜表面的大部分上施用標(biāo)記組合物的優(yōu)點(diǎn)是節(jié)省染料并降低給藥和診斷時(shí)間。在優(yōu)選的方法中，當(dāng)然也可施用標(biāo)記組合物以覆蓋內(nèi)臟目標(biāo)器官之整個(gè)粘膜表面的大部分。例如在將花青染料施用在整個(gè)胃襯里的大部分上時(shí)，可通過(guò)檢查染色上皮細(xì)胞位置處的熒光強(qiáng)度來(lái)觀察成熟內(nèi)皮細(xì)胞的正常脫落速率。
在根據(jù)本發(fā)明標(biāo)記胃上皮細(xì)胞時(shí)，與其它器官的上皮細(xì)胞不同，給藥標(biāo)記組合物至觀察時(shí)的時(shí)間長(zhǎng)度平均來(lái)說(shuō)取決于以下事實(shí)胃表面粘膜細(xì)胞的壽命約為2天。因此，在評(píng)估胃上皮細(xì)胞的脫落速率(其中癌癥使正常的脫落速率減慢)時(shí)，給藥2天后至少進(jìn)行一次檢查。相反地，為測(cè)定是否存在使胃粘膜細(xì)胞過(guò)度增殖的疾病，在給藥后的頭2天內(nèi)至少進(jìn)行一次檢查。在此期間，受試者可維持其正常的生活及飲食方式，但應(yīng)避免可加速胃及其它上皮細(xì)胞脫落速率的物質(zhì)如阿斯匹林和酒精。
如在動(dòng)物和人實(shí)驗(yàn)中所觀察到的，結(jié)腸中整個(gè)腺體的壽命周期估計(jì)約為4-7天。通常情況下，應(yīng)在給藥染料溶液后4-7天再進(jìn)行結(jié)腸癌的診斷。
在實(shí)施本發(fā)明時(shí)，可直接肉眼觀察經(jīng)標(biāo)記的表面上皮細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方法，直接肉眼觀察在給藥部位是否存在經(jīng)標(biāo)記的成熟上皮細(xì)胞，由此可將此等細(xì)胞的脫落速率評(píng)估為正?；虍惓?。目標(biāo)部位處觀察到的熒光強(qiáng)度隨標(biāo)記細(xì)胞的脫落而降低。如果超過(guò)標(biāo)記部位處正常上皮細(xì)胞脫落的時(shí)間仍存在標(biāo)記物，則表明過(guò)度增殖。同樣，在正常上皮細(xì)胞脫落前標(biāo)記物消失，則表明增殖過(guò)低。有利的是，僅在標(biāo)記步驟后的預(yù)選時(shí)間處定性測(cè)定是否存在標(biāo)記物。雖然可以對(duì)標(biāo)記物進(jìn)行定量，但這對(duì)于實(shí)施本發(fā)明的診斷步驟并不是必須的。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方法，將標(biāo)記細(xì)胞的部位暴露于激發(fā)光，然后觀察和/或測(cè)量熒光強(qiáng)度，由此可檢測(cè)花青染料標(biāo)記物。例如，PKH2和PKH26都具有固定的吸收波長(zhǎng)和熒光波長(zhǎng)。在觀察最大熒光時(shí)，PKH2需要約490-504nm的激發(fā)光，而PKH26需要約551-567nm的激發(fā)光。使用例如合適的濾波器和光檢測(cè)器，通過(guò)內(nèi)窺鏡即可觀察熒光。
在實(shí)施本發(fā)明時(shí)，可使用普通的纖維鏡。具體而言，可選擇性地將上皮粘膜暴露于特定波長(zhǎng)的光，其中使用帶有濾波器的纖維鏡，而且所述濾波器設(shè)定為只能傳輸總光譜中所希望的部分。優(yōu)選的是，對(duì)于PKH2濾波器從光源(如鹵燈)傳輸波長(zhǎng)約為490-504nm的光，而對(duì)于PKH26則傳輸波長(zhǎng)約為55l-567nm的光。使從標(biāo)記細(xì)胞中發(fā)射的光從合適的窄帶濾波器中通過(guò)，并任選地從圖象增強(qiáng)器中通過(guò)，到達(dá)產(chǎn)生相應(yīng)于被檢測(cè)光強(qiáng)度的信號(hào)的光學(xué)檢測(cè)器，由此即可檢測(cè)熒光。觀察目標(biāo)部位時(shí)還可使用其它裝置，如裝有高分辨CCD檢測(cè)器的內(nèi)窺鏡。
洗滌胃腔，測(cè)量洗滌溶液中的DNA，然后測(cè)量胃液中脫落細(xì)胞的數(shù)量，由此已可得到有關(guān)成熟上皮細(xì)胞從胃腸道粘膜脫落之速率的已有公開(kāi)數(shù)據(jù)。根據(jù)該數(shù)據(jù)，每分鐘約有500000個(gè)細(xì)胞從胃粘膜上脫落下來(lái)。已認(rèn)識(shí)到，在萎縮性胃炎時(shí)該細(xì)胞丟失增加。
雖然有關(guān)脫落速率的數(shù)據(jù)是有限的，但腫瘤的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)卻是已知的。通常情況下，當(dāng)在某一器官中發(fā)生癌變，而且該器官中健康細(xì)胞周轉(zhuǎn)的動(dòng)力學(xué)在健康組織中變慢時(shí)，癌細(xì)胞的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)增加。相反地，如果健康器官的上皮細(xì)胞動(dòng)力學(xué)高并發(fā)生癌變時(shí)，細(xì)胞動(dòng)力學(xué)則降低。例如，健康肝細(xì)胞幾乎不經(jīng)歷細(xì)胞分裂。在肝癌細(xì)胞中細(xì)胞動(dòng)力學(xué)則增加。在胃腸道粘膜的健康細(xì)胞中，細(xì)胞動(dòng)力學(xué)在正常情況下是極快的。當(dāng)有癌癥時(shí)，細(xì)胞動(dòng)力學(xué)急劇下降。
在健康人的胃腸道粘膜中，S期(DNA合成期)的長(zhǎng)度約在10-11小時(shí)之間。已知的是，人的胃粘膜循環(huán)時(shí)間(T)為約24-48小時(shí)，腸組織轉(zhuǎn)化的循環(huán)時(shí)間為約37小時(shí)，結(jié)腸粘膜的循環(huán)時(shí)間為約40小時(shí)，而直腸粘膜的循環(huán)時(shí)間為約24-48小時(shí)。相比較而言，人的胃癌循環(huán)時(shí)間為約2.5-13天，而結(jié)腸癌的循環(huán)時(shí)間為約4.2-7.0天。因此，可明確地看出，在癌癥時(shí)細(xì)胞增殖明顯降低。另外，在人的癌癥中，雖然腫瘤細(xì)胞增加一倍的時(shí)間(D)(即、細(xì)胞個(gè)數(shù)加倍所需要的時(shí)間)通常在約30-120天之間，但對(duì)于胃腸道癌癥是極緩慢的；早期胃癌為約555-3076天，晚期胃癌為約105-305天，而結(jié)腸癌為約636天。
健康和癌細(xì)胞之間的細(xì)胞循環(huán)時(shí)間(T)差異約為10倍。該生長(zhǎng)速率的差異也反映在正常及癌變粘膜上皮細(xì)胞所表現(xiàn)的上皮脫落速率上。胃表面粘膜細(xì)胞的正常壽命周期為約1-2天。結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞的正常壽命周期為約4-7天。如果癌細(xì)胞的脫落速率等于該正常的循環(huán)周期，則表明癌細(xì)胞的脫落速率比其T更快，基本上意味著癌細(xì)胞從身體中消失了。因此，可認(rèn)為癌細(xì)胞的脫落速率必須慢于正常細(xì)胞的脫落速率十倍(癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的T差異)，以使癌細(xì)胞存留在身體中。所以明顯的是，在正常和癌變粘膜的脫落速率之間存在著明顯的差異。本發(fā)明的獨(dú)特方法利用了該脫落速率的不同。
在實(shí)施本發(fā)明時(shí)，觀察所用的具體儀器的精度(即、區(qū)分正常細(xì)胞和癌癥)是非常重要的。兩種最經(jīng)常使用的內(nèi)窺鏡是纖維鏡和電子內(nèi)窺鏡。雖然各制造商的纖維鏡和電子內(nèi)窺鏡的分辨率差別較大，但是纖維鏡的分辨率通常為600μm，而電子內(nèi)窺鏡的分辨率通常為約100μm。作為本發(fā)明的目標(biāo)物，直徑為5-10mm損傷內(nèi)的上皮細(xì)胞的脫落速率對(duì)于正?；虍惓Ｕ呤强梢苑直娴?。因此，應(yīng)選擇合適的儀器。
因?yàn)檎Ｎ副砻嬲衬ぜ?xì)胞的脫落速率為約2天，花青染色在該時(shí)間前顯著消失說(shuō)明有脫落速率較正常者更快的病癥存在。如果花青染色在2天后仍可明顯觀察到，則表明有脫落速率減緩的病癥(如胃癌)存在。
萎縮性胃炎通常隨年齡老化而在胃粘膜中發(fā)生。因?yàn)橐阎谖s性胃炎時(shí)細(xì)胞周轉(zhuǎn)增加，所以認(rèn)為脫落速率也增加。
胃潰瘍時(shí)的細(xì)胞周轉(zhuǎn)通常高于正常胃組織的。沒(méi)有有關(guān)脫落速率的數(shù)據(jù)，但為補(bǔ)償粘膜的損失，進(jìn)行正常的生長(zhǎng)。因此，可認(rèn)為細(xì)胞丟失沒(méi)有被延遲。還可認(rèn)為，在該病癥和胃癌之間存在明顯的差異，后者中細(xì)胞周轉(zhuǎn)降低。
以下將通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1為調(diào)查是否可以通過(guò)檢查標(biāo)記上皮細(xì)胞的脫落速率來(lái)分析細(xì)胞動(dòng)力學(xué)，用PKH2和PKH26染色鼠胃粘膜中的上皮細(xì)胞。本研究的目的是在增殖細(xì)胞中相對(duì)于已知調(diào)查DNA合成的方法在成熟上皮細(xì)胞的遷移和脫落速率的基礎(chǔ)上評(píng)估細(xì)胞動(dòng)力學(xué)。在2周齡(160-200g)雄性Wistar鼠上進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。
為降低在胃中的殘留，給大鼠喂以7％蔗糖、0.5％氯化鈉溶液2天。為標(biāo)記胃粘膜的重生性(generative)細(xì)胞區(qū)域，以6小時(shí)的間隔腹膜內(nèi)給藥50mg/kg(每只動(dòng)物約10mg)的BrdU(5-溴-2-脫氧尿苷(sigma Chemical Co.))4次。在第4次給藥BrdU后立即通過(guò)口腔插管向大鼠給藥3ml的鏈酶蛋白酶溶液(鏈酶蛋白酶20000單位和1g碳酸氫鈉在80ml水中)，以除去附著在胃粘膜上的表面粘液。在口服給藥鏈酶蛋白酶溶液后30分鐘時(shí)，通過(guò)口腔插管以相同的方式向胃中給藥3ml的PKH2或者PKH26。在最終給藥BrdU后的1、8、16、24、32、40、48、60和72小時(shí)殺死大鼠，并切除胃，然后立即在液氮中冷凍。
用恒冷切片機(jī)切割經(jīng)冷凍的組織，制備4個(gè)分別為5μm厚的樣品。
用第一個(gè)冷凍樣品證明PKH2或PKH26的存在。使用氰基丙烯酸樹(shù)脂(Bond Aron Alpha，由Toa Gousei Kagaku Co.制造)立即固定該樣品，制成未經(jīng)染色的樣品。將其余3個(gè)冷凍樣品固定在10％經(jīng)緩沖的福爾馬林中3分鐘。一個(gè)樣品用蘇木紫—曙紅染色。其余2個(gè)樣品通過(guò)酶—抗體法用如下所述的抗—BrdU單克隆抗體染色。
用0.1MPBS(磷酸鹽緩沖鹽水，Experimental Bio Medical ResearchInc.)沖洗樣品，然后在2N鹽酸中于37℃下溫育30分鐘，以斷裂DNA。在0.1MPBS中沖洗樣品3次。為阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化酶，在室溫下用0.3％過(guò)氧化氫溶液處理樣品10分鐘，并在0.1M PBS中洗滌3次。接著，為阻斷非特異性反應(yīng)，在雙倍稀釋的Block-ACE(Snow Brand ProductsCo.，Ltd.)中溫育10分鐘，然后在0.1M PBS中洗滌3次。之后，一個(gè)樣品用原抗體(抗—BrdU，鼠單克隆，Becton Dickinson)在室溫下溫育1小時(shí)，所述原抗體用包含1％BSA的0.1MPBS稀釋50倍。作為負(fù)對(duì)照，其余樣品在室溫下用正常鼠血清溫育1小時(shí)，所述鼠血清在包含1％BSA的0.1M PBS中稀釋10000倍。然后樣品用0.1M PBS沖洗3次，并在室溫下用生物素化的鼠IgG溫育30分鐘。用0.1M PBS沖洗3次后，樣品與ABC試劑(Vector)在室溫下反應(yīng)30分鐘，并再用0.1M PBS沖洗3次，然后在DAB溶液(Dojindo)中溫育1分鐘。在流水中洗滌后，樣品用Mayer蘇木紫染色劑(Merck)進(jìn)行核染色1分鐘，然后再用流水洗滌10分鐘。用乙醇使樣品脫水，在甲苯中清潔，然后嵌入HSR。
對(duì)垂直于粘膜表面切除的各部分進(jìn)行以下研究。

圖1顯示了一部分切除的胃粘膜的各種區(qū)域。重生性細(xì)胞區(qū)域(G)定義為在第4次給藥BrdU后1小時(shí)在增殖性區(qū)域中從最上層BrdU染色的細(xì)胞至最下層BrdU染色的細(xì)胞之間的距離。在最上層BrdU染色的細(xì)胞至粘膜表面的區(qū)域稱(chēng)為表面粘膜細(xì)胞區(qū)域(S)。此時(shí)在重生性細(xì)胞區(qū)域中BrdU陽(yáng)性細(xì)胞與細(xì)胞總數(shù)的比例稱(chēng)為增殖區(qū)域標(biāo)記指數(shù)。測(cè)量上皮細(xì)胞從BrdU陽(yáng)性細(xì)胞遷移至粘膜表面所需要的時(shí)間。BrdU陽(yáng)性細(xì)胞到達(dá)粘膜表面所用的時(shí)間稱(chēng)為表面粘膜細(xì)胞更新時(shí)間。如圖1所示，距離(A)是相當(dāng)于從粘膜表面至PKH2染色的最下層細(xì)胞的距離，而距離(B)相當(dāng)于從粘膜表面至PKH26染色的最下層細(xì)胞的距離。
用熒光顯微鏡檢查在末染色樣品中存在PKH2和PKH26。PKH2使用用于FITC的濾波器檢查，而PKH6使用用于若丹明(rhodamine)的濾波器檢查。測(cè)量被PKH2和PKH26染色的粘膜表面的距離。染色細(xì)胞的丟失稱(chēng)為周轉(zhuǎn)。使用目鏡測(cè)微計(jì)測(cè)量各樣品的組織學(xué)測(cè)量距離。
第4次給藥50mg/kg BrdU后，在6小時(shí)間隔中的第1小時(shí)作為對(duì)照樣品。BrdU陽(yáng)性細(xì)胞主要局限在腺體的上部。在重生性細(xì)胞區(qū)域中的細(xì)胞中，98.2％是BrdU陽(yáng)性細(xì)胞。因此，重生性細(xì)胞區(qū)域中的大多數(shù)細(xì)胞已吸收了BrdU。
連續(xù)檢查BrdU陽(yáng)性細(xì)胞的遷移，由此可觀察表面粘膜細(xì)胞的遷移。在給藥后1小時(shí)取得的第一個(gè)樣品中，在約110μ處可看見(jiàn)最上層的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞(即、在重生性細(xì)胞區(qū)域上可看見(jiàn)110μ的表面細(xì)胞區(qū)域)。因此，可以清楚地得出，BrdU陽(yáng)性細(xì)胞隨時(shí)間向上遷移，而且在給藥后60小時(shí)的時(shí)候，可在粘膜表面處看見(jiàn)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞。所以，可測(cè)定大鼠的表面粘膜細(xì)胞的壽命周期為約60小時(shí)。
已有報(bào)道稱(chēng)，人表面粘膜細(xì)胞的壽命周期約為72小時(shí)。由涉及BrdU標(biāo)記細(xì)胞到達(dá)粘膜表面所需要的時(shí)間的本研究得到的數(shù)據(jù)非常接近文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)值。
從粘膜表面計(jì)算，染料PKH2可染色在深度約為75μ處的表面粘膜細(xì)胞。PKH2染色的深度隨時(shí)間流逝而變得越來(lái)越淺，并在40小時(shí)后消失。PKH26染色較PKH2更淺，從粘膜表面計(jì)算可染色最多至約45μ。在此情況下，經(jīng)染色的細(xì)胞深度也隨時(shí)間流逝而變得越來(lái)越淺，并在24小時(shí)后消失。如在約110μ處以BrdU所測(cè)定的，表面粘膜細(xì)胞脫落所需要的時(shí)間為60小時(shí)，從粘膜表面計(jì)算約75μ時(shí)以PKH2染色時(shí)為40小時(shí)，在約45μ時(shí)以PKH26染色時(shí)為24小時(shí)。據(jù)信，脫落速率的不同是由于各標(biāo)記物的染色深度不同。該研究的結(jié)果是，可明顯得出PKH2和PKH26可作為分析表面粘膜細(xì)胞脫落的標(biāo)記物。實(shí)施例2為調(diào)查是否可以通過(guò)檢查標(biāo)記上皮細(xì)胞的脫落速率來(lái)分析細(xì)胞動(dòng)力學(xué)，用PKH2和PKH26染色鼠結(jié)腸粘膜中的上皮細(xì)胞。在2周齡(160-200g)雄性Wistar鼠上進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。
為降低在結(jié)腸中的殘留，給大鼠喂以7％蔗糖、0.5％氯化鈉溶液2天。為標(biāo)記結(jié)腸粘膜的重生細(xì)胞區(qū)域，以6小時(shí)的間隔腹膜內(nèi)給藥50mg/kg(每只動(dòng)物約10mg)的BrdU4次。在第4次給藥BrdU后立即通過(guò)肛門(mén)向大鼠給藥3ml的鏈酶蛋白酶溶液(鏈酶蛋白酶20000單位和1g碳酸氫鈉在80ml水中)，以除去附著在結(jié)腸粘膜上的表面粘液。在口服給藥鏈酶蛋白酶溶液后30分鐘時(shí)，也通過(guò)肛門(mén)向結(jié)腸中給藥3ml的PKH2或者PKH26。在最終給藥BrdU后的1、8、16、24、32、40、48、60和72小時(shí)殺死大鼠，并切除結(jié)腸，然后立即在液氮中冷凍。
用恒冷切片機(jī)切割經(jīng)冷凍的組織，制備4個(gè)分別為5μm厚的樣品。
用第一個(gè)冷凍樣品證明PKH2或PKH26的存在。使用氰基丙烯酸樹(shù)脂(Bond Aron Alpha，由Toa Gousei Kagaku Co.制造)立即固定該樣品，制成未經(jīng)染色的樣品。將其余3個(gè)冷凍樣品固定在10％經(jīng)緩沖的福爾馬林中3分鐘。一個(gè)樣品用蘇木紫—曙紅染色。其余2個(gè)樣品通過(guò)酶—抗體法用如下所述的抗—BrdU單克隆抗體染色。
用0.1M PBS(磷酸鹽緩沖鹽水，Experimental Bio Medical ResearchInc.)沖洗樣品，然后在2N鹽酸中于37℃下溫育30分鐘，以斷裂DNA。在0.1M PBS中沖洗樣品3次。為阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化酶，在室溫下用0.3％過(guò)氧化氫溶液處理樣品10分鐘，并在0.1M PBS中洗滌3次。接著，為阻斷非特異性反應(yīng)，在雙倍稀釋的Block-ACE(Snow Brand ProductsCo.，Ltd.)中溫育10分鐘，然后在0.1M PBS中洗滌3次。之后，一個(gè)樣品用原抗體(抗—BrdU，鼠單克隆，Becton Dickinson)在室溫下溫育1小時(shí)，所述原抗體用包含1％BSA的0.1M PBS稀釋50倍。作為負(fù)對(duì)照，其余樣品在室溫下用正常鼠血清溫育1小時(shí)，所述鼠血清在包含1％BSA的0.1M PBS中稀釋10000倍。然后樣品用0.1M PBS沖洗3次，并在室溫下用生物素化的鼠IgG溫育30分鐘。用0.1M PBS沖洗3次后，樣品與ABC試劑(Vector)在室溫下反應(yīng)30分鐘，并再用0.1M PBS沖洗3次，然后在DAB溶液(Dojindo)中溫育1分鐘。在流水中洗滌后，樣品用Mayer蘇木紫染色劑(Merck)進(jìn)行核染色1分鐘，然后再用流水洗滌10分鐘。用乙醇使樣品脫水，在甲苯中清潔，然后嵌入HSR。
對(duì)垂直于粘膜表面切除的各部分進(jìn)行以下研究。圖2顯示了一部分切除的結(jié)腸粘膜的各種區(qū)域。重生性細(xì)胞區(qū)域(G)定義為在第4次給藥BrdU后1小時(shí)在增殖性區(qū)域中從最上層BrdU染色的細(xì)胞至最下層BrdU染色的細(xì)胞之間的腺體距離。在最上層BrdU染色的細(xì)胞至粘膜表面的區(qū)域稱(chēng)為表而粘膜細(xì)胞區(qū)域(S)。此時(shí)在重生性細(xì)胞區(qū)域中BrdU陽(yáng)性細(xì)胞與細(xì)胞總數(shù)的比例稱(chēng)為增殖區(qū)域標(biāo)記指數(shù)。測(cè)量上皮細(xì)胞從BrdU陽(yáng)性細(xì)胞遷移至粘膜表面所需要的時(shí)間。BrdU陽(yáng)性細(xì)胞到達(dá)粘膜表面所用的時(shí)間稱(chēng)為表面粘膜細(xì)胞更新時(shí)間。如圖2所示，距離(A)是相當(dāng)于從粘膜表面至PKH2染色的最下層細(xì)胞的距離，而距離(B)相當(dāng)于從粘膜表面至PKH26染色的最下層細(xì)胞的距離。
用熒光顯微鏡檢查在未染色樣品中存在PKH2和PKH26。PKH2使用用于FITC的濾波器檢查，而PKH6使用用于若丹明的濾波器檢查。測(cè)量被PKH2和PKH26染色的粘膜表面的距離。染色細(xì)胞的丟失稱(chēng)為周轉(zhuǎn)。使用目鏡測(cè)微計(jì)測(cè)量各樣品的組織學(xué)測(cè)量距離。
第4次給藥50mg/kg BrdU(約10mg/動(dòng)物)后，在6小時(shí)間隔中的第1小時(shí)作為對(duì)照時(shí)間。BrdU陽(yáng)性細(xì)胞主要局限在腺體的底部7/10中。上3/10是表面細(xì)胞區(qū)域，測(cè)量深度約為60μ在重生性細(xì)胞區(qū)域中的細(xì)胞中，98.2％是BrdU陽(yáng)性細(xì)胞。因此，重生性細(xì)胞區(qū)域中的大多數(shù)細(xì)胞已吸收了BrdU。
連續(xù)檢查BrdU陽(yáng)性細(xì)胞的遷移，由此可觀察表面粘膜細(xì)胞的遷移。在給藥后1小時(shí)的時(shí)候，在約60μ處可看見(jiàn)最高的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞(即、在重生性細(xì)胞區(qū)域上可看見(jiàn)60μ的表面細(xì)胞區(qū)域)?？梢郧宄氐贸觯珺rdU陽(yáng)性細(xì)胞隨時(shí)間向上遷移，而且在給藥后32小時(shí)的時(shí)候，可在粘膜表而處看見(jiàn)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞。所以，可測(cè)定大鼠的表面粘膜細(xì)胞的壽命周期為約32小時(shí)。因?yàn)槭驜rdU陽(yáng)性結(jié)腸表面粘膜細(xì)胞的壽命為約32小時(shí)，而該部分細(xì)胞占腺體的上3/10，所以估計(jì)整個(gè)腺體的壽命為約107小時(shí)或者4.5天。
已有報(bào)道稱(chēng)，人表面粘膜細(xì)胞的壽命周期約為4-7天。由涉及BrdU標(biāo)記細(xì)胞到達(dá)粘膜表面所需要的時(shí)間的本研究得到的數(shù)據(jù)非常接近文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)值。
從粘膜表面計(jì)算，染料PKH2可染色在深度約為40μ處的表面粘膜細(xì)胞。PKH2染色的深度隨時(shí)間流逝而變得越來(lái)越淺，并在16小時(shí)后消失。PKH26染色較PKH2更深，從粘膜表面計(jì)算可染色最多至約50μ。該標(biāo)記物的深度也隨時(shí)間流逝而變得越來(lái)越淺，并在32小時(shí)后消失。如在約60μ處以BrdU所測(cè)定的，表面粘膜細(xì)胞脫落所需要的時(shí)間為32小時(shí)，在約40μ處以PKH2染色時(shí)為16小時(shí)，而在約50μ處以PKH26染色時(shí)為32小時(shí)。據(jù)信，脫落速率的不同是由于各標(biāo)記物的染色深度不同。實(shí)施例3進(jìn)行體外檢查，以確定是否可通過(guò)鑒別人結(jié)腸癌細(xì)胞和胃癌細(xì)胞與正常的人結(jié)腸細(xì)胞和胃細(xì)胞的脫落速率不同，來(lái)從正常粘膜中區(qū)分出癌損傷。所得結(jié)果表明人結(jié)腸癌和胃癌可通過(guò)測(cè)定脫落速率來(lái)診斷。
借助于內(nèi)窺鏡通過(guò)直接觀察將包含PKH2和PKH26的細(xì)胞標(biāo)記組合物噴涂在目標(biāo)部位上，然后切除疾病損傷及該損傷周?chē)恼＝M織。用熒光顯微鏡觀察經(jīng)冷凍的樣品，以鑒別PKH2或PKH26的存在，并測(cè)定脫落速率。為制備用于本方法的胃，首先使用包含鏈酶蛋白酶20000單位和1g碳酸氫鈉在80ml水中的溶液消除胃粘液。清除后，進(jìn)行正常的結(jié)腸鏡檢查，其中借助于內(nèi)窺鏡通過(guò)直接觀察將PKH2和PKH26溶液噴涂在損傷部位和周?chē)鷧^(qū)域上。
在結(jié)腸中，進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查，并制備在正常的結(jié)腸鏡檢查后切除的患病區(qū)域，其中使用約137g聚乙二醇及2-4升的水。患者禁用食物、藥物、其它有可能影響細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的藥劑如甾體藥物、阿斯匹林、以及酒精，4天后進(jìn)行首次檢查，然后再進(jìn)行以下的檢查。
因?yàn)樗芯康牟±婕霸缙诎┌Y，所以進(jìn)行內(nèi)窺鏡切除(活組織檢查)，以切除損傷部位。經(jīng)切除的部分立即保存在液氮中。用恒冷切片機(jī)將組織切成5μm的樣品，由此形成兩個(gè)樣品。在制備冷凍樣品后，立即固定其中的一個(gè)樣品，并形成未經(jīng)染色的樣品，以鑒別是否存在PKH2或者PKH26。第二個(gè)樣品固定在10％經(jīng)緩沖的福爾馬林中3分鐘，然后用蘇木紫—曙紅染色。在蘇木紫—曙紅染色的樣品上進(jìn)行損傷診斷。使用熒光顯微鏡和用于FITC的濾波器來(lái)鑒別PKH2的存在，并用熒光顯微鏡和用于若丹明的濾波器鑒別PKH26的存在?；颊?患者1為60歲的男人，在幽門(mén)竇患有早期胃癌(隆腫型，IIa型)，直徑為20mm。使用鏈酶蛋白酶20000單位和1g碳酸氫鈉在80ml水中的溶液進(jìn)行胃粘液清除后，進(jìn)行正常的內(nèi)窺鏡檢查。使用內(nèi)窺鏡肉眼證實(shí)損傷存在后，立即噴涂10ml的PKH2溶液，以染色損傷。在內(nèi)窺鏡檢查后4天時(shí)，使用剝除活體組織檢查法切除IIa型早期胃癌。使用上述方法冷凍組織樣品，并用顯微鏡進(jìn)行檢查。從H-E染色組織的圖象來(lái)看，區(qū)別明顯的腺癌區(qū)域所處的粘膜周?chē)钦５恼衬?。用熒光顯微鏡并使用FITC濾波器觀察癌癥區(qū)域后，發(fā)現(xiàn)癌變組織的表面被PKH2染色的深度為30μ。
相反地，雖然在周?chē)＜?xì)胞中鑒別出腸組織變形和幽門(mén)腺，但未檢測(cè)出PKH2熒光。因此，被PKH2染色的正常粘膜上皮細(xì)胞已由于脫落而丟失，而被PKH2染色的癌細(xì)胞卻沒(méi)有?；颊?患者2是一位63歲的男性，患有直腸癌(隆腫I型直腸癌)，直徑為10mm。用聚乙二醇清楚糞便后，進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查。使用內(nèi)窺鏡肉眼證實(shí)損傷存在后，立即噴涂10ml的PKH26溶液，以染色損傷及周?chē)鷧^(qū)域。在結(jié)腸鏡檢查后4天時(shí)，在內(nèi)窺鏡直接觀察下切除損傷。使用與上述患者1相同的方法制備切除組織。H-E染色的組織顯示出區(qū)別明顯的腺癌局限在粘膜上，熒光顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)癌變組織的表面被PKH26染色至60μ的深度。還發(fā)現(xiàn)在周?chē)衬ぶ斜籔KH26染色的上皮細(xì)胞已脫落。因此，被PKH26染色的正常粘膜已脫落，而被PKH26染色的癌粘膜仍存在。所以，可以明顯地看出，在癌粘膜和正常結(jié)腸粘膜的脫落速率之間存在差異。
在結(jié)腸粘膜中，增殖細(xì)胞的區(qū)域包括腺體的下三分之二。當(dāng)在體外進(jìn)行測(cè)量時(shí)，S階段的持續(xù)時(shí)間為9-20小時(shí)，而總循環(huán)時(shí)間在24-48小時(shí)之間。根據(jù)體外實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，S階段的大腸中的細(xì)胞數(shù)量(或者標(biāo)記指數(shù)LI.)在12-25％之間變化。從這些數(shù)值計(jì)算出，該組織的替換時(shí)間為4-8天。體內(nèi)研究通常提供較短的S階段持續(xù)時(shí)間(7.2-11.2小時(shí))和較低的標(biāo)記指數(shù)數(shù)值(1.5-17％)。因此，總細(xì)胞時(shí)間的估計(jì)值可提供比體內(nèi)得到的更大的數(shù)值(體外為77.2-129.9小時(shí)，體內(nèi)為24-48小時(shí))。
上述描述和附圖僅是用于說(shuō)明實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的、特征和優(yōu)點(diǎn)的優(yōu)選實(shí)施方案，而不意味著本發(fā)明的范圍就囿于此。在本發(fā)明的精髓和范圍內(nèi)還可進(jìn)行各種改進(jìn)。
權(quán)利要求
1.體內(nèi)檢測(cè)溫血?jiǎng)游镏墒毂砻嫔掀ぜ?xì)胞的異常細(xì)胞脫落速率的方法，其包括以下步驟標(biāo)記所述動(dòng)物之目標(biāo)部位處的成熟表面上皮細(xì)胞，然后在上述標(biāo)記步驟后監(jiān)測(cè)該部位是否存在標(biāo)記物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述細(xì)胞用花青染料標(biāo)記。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述花青染料為下式者
其中Y是氧、硫、亞甲基或烷基取代的亞甲基；m是0-3；及n是12-22。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述花青染料是下式者
或
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述部位是粘膜表面。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述部位是胃的粘膜表面。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述部位是結(jié)腸的粘膜表面。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，在所述標(biāo)記步驟后在預(yù)選的時(shí)間處觀察所述部位處的標(biāo)記物濃度變化，由此檢測(cè)細(xì)胞脫落。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述標(biāo)記物是花青染料，并將所述部位暴露于激發(fā)光，然后檢測(cè)由此得到的熒光強(qiáng)度，由此觀察標(biāo)記物濃度的變化。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述激發(fā)光的波長(zhǎng)為約490-504nm或者為約551-567nm。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，直接將標(biāo)記組合物施用在所述部位上，由此來(lái)標(biāo)記所述上皮細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，將標(biāo)記組合物口服給藥于所述溫血?jiǎng)游铮纱藖?lái)標(biāo)記所述上皮細(xì)胞。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，將標(biāo)記組合物直腸給藥于所述溫血?jiǎng)游铮纱藖?lái)標(biāo)記所述上皮細(xì)胞。
14.一種評(píng)估溫血?jiǎng)游锏恼衬け砻嫔铣墒毂砻嫔掀ぜ?xì)胞之脫落速率的方法，其包括將包括可檢測(cè)之標(biāo)記物的標(biāo)記組合物施用在目標(biāo)部位處的成熟表面上皮細(xì)胞上，然后觀察標(biāo)記物從所述目標(biāo)部位上丟失的速率。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其包括在施用標(biāo)記組合物前從目標(biāo)部位除去粘液的步驟。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述標(biāo)記物是花青染料。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述花青染料為下式者
其中Y是氧、硫、亞甲基或烷基取代的亞甲基；m是0-3；及n是12-22。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)溫血?jiǎng)游锏某墒焐掀ぜ?xì)胞的異常細(xì)胞脫落速率的方法,所述成熟上皮細(xì)胞例如是胃或結(jié)腸腺的上皮細(xì)胞。在上皮細(xì)胞上施用包含例如花青染料的標(biāo)記組合物,然后隨時(shí)間觀察該部位。異常細(xì)胞脫落速率說(shuō)明有疾病存在,如癌癥。
文檔編號(hào)A61K49/00GK1245437SQ97181675
公開(kāi)日2000年2月23日 申請(qǐng)日期1997年2月4日 優(yōu)先權(quán)日1997年2月4日
發(fā)明者多田正弘 申請(qǐng)人:法諾斯技術(shù)公司