用于組織工程的基質和植入物的制作方法
【專利說明】用于組織工程的基質和植入物
[0001] 本發(fā)明涉及如權利要求1所述的用于組織工程的基質、如權利要求9所述的該 基質的制備方法以及如權利要求14所述的包含所述基質和至少一種胰島（Isletsof Langerhans)細胞的植入物。
[0002] 組織工程是將工程和材料科學與醫(yī)學結合的交叉學科領域，其提供了治療功能障 礙或喪失的器官的替代性方法。在這種方法中，臨時支架（也稱基質）充當植入細胞的附 著基底和引導新器官形成的物理支持體。因此，這種基質用來通過將細胞遞送至體內所需 位點、限定工程化組織的潛在空間和促進細胞生長來引導組織發(fā)育過程。為了使這些過程 能夠進行，組織工程用基質應該滿足以下標準：
[0003] 表面應允許細胞粘附、促進細胞生長并允許保留分化的細胞功能。此外，基質應具 有生物相容性和生物降解性，從而使該基質能最終在體內被清除而不會導致炎癥或毒性降 解副產(chǎn)物。就其結構而言，基質的孔隙度應該足夠高以便提供足夠的細胞粘附用的空間、胞 外基質再生和培養(yǎng)期間最小的擴散限制。其孔結構應允許在整個基質中產(chǎn)生均勻的空間細 胞分布以有助于均一的組織形成，且所述材料應該能被可再現(xiàn)地加工為三維結構并且具有 機械強度。
[0004] 已經(jīng)開發(fā)出許多由各種生物降解性材料制造的三維多孔基質。例如， EP-A-2256155公開了基于生物相容性聚合物或聚合物混合物的多孔基質。根據(jù)該文獻，多 孔基質通過所謂的浸出過程來制備，在該浸出過程中，將由具有限定粒徑的聚合物顆粒和 鹽顆粒組成的混合物緊密化并隨后使所述鹽顆粒浸出。
[0005] 現(xiàn)今通常使用合成的生物降解性聚合物，因其易于成形為所需形狀并且比天然來 源的聚合物具有更好的機械強度。合成的生物降解性聚合物具有額外優(yōu)點：其降解周期還 能通過控制結晶度、分子量和共聚比來操控。
[0006] 雖然有這些優(yōu)點，源自合成聚合物的基質也受到一些限制，例如，缺乏細胞識別信 號、生物接受性和功能容量有限。另外的限制在于，如與水的較高接觸角所示，合成聚合物 通常是疏水性的，據(jù)發(fā)現(xiàn)這在基質上的細胞附著和細胞接種活性方面具有極負面的影響。
[0007] 因此，本發(fā)明的目的在于提供一種生物相容性和生物降解性聚合物基質，其允許 高效的細胞保留和增殖，同時維持已知基質、特別是合成基質的理想機械性質。根據(jù)更具體 的方面，本發(fā)明旨在提供允許在植入物、特別是肝植入物的制備中使用的聚合物基質。
[0008] 該目的通過如權利要求1所述的多孔基質、如權利要求9所述的制備基質的方法 和如權利要求13所述的植入物來實現(xiàn)。進一步優(yōu)選的實施方式是從屬權利要求的主題。本 發(fā)明的用于組織工程的多孔基質包含形成具有一級孔（primarypore)的三維一級結構的 第一生物降解性和生物相容性聚合物組分，并且還包含不同于第一聚合物組分的第二生物 降解性和生物相容性聚合物組分，所述第二生物降解性和生物相容性聚合物組分選自由膠 原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白及其混合物組成的組。
[0009] 本申請通篇所用術語"基質"是指三維支持體，即支架或海綿樣結構，其適于被細 胞拓殖。就此意義而言，基質充當能被細胞或組織拓殖的三維模板。這種拓殖可以在體外 或體內發(fā)生。此外，在移植方面，基質起到使移植物定位的作用并且充當在體內逐漸形成的 組織的占位物。
[0010] 術語"生物相容性聚合物"是指在生物學上耐受且在被引入活的生物體時不會導 致排斥的聚合物。對于本發(fā)明，生物相容性聚合物還涵蓋：被宿主識別為外來物的聚合物， 但可通過適當?shù)拿庖咭种苼硪种茖υ摼酆衔锏呐懦狻?br>[0011] "生物降解性"的表述是指在活的生物體內（或源自活生物體的體液或細胞培養(yǎng) 物）能被轉化為可代謝產(chǎn)物的材料。生物學降解性聚合物包括例如具有生物吸收性和/或 生物侵蝕性的聚合物。"生物侵蝕性"是指在生物液體中可溶或可懸浮的能力。生物吸收性 是指能夠被活的生物體的細胞、組織或流體所攝取的能力。
[0012] 因此，第一聚合物組分原則上可以是能夠用在醫(yī)學領域、特別是移植醫(yī)學領域的 任何生物降解性和生物相容性聚合物。如下文將更詳細描述的，第一聚合物化合物通常是 合成的聚合物化合物。與天然聚合物相比，合成聚合物通常提供更高的機械強度，并因此使 得可以制備適于充當細胞附著和拓殖的物理支持體的基質。
[0013] 現(xiàn)已出人意料地發(fā)現(xiàn)，如果存在形成具有二級孔的三維二級結構的第二聚合物組 分，其中所述二級結構包含在一級結構的至少部分一級孔的內部空間內，則基質的親水性 得到顯著增強，同時能夠保持有益性質，即第一生物降解性和生物相容性聚合物組分的機 械強度。由于親水性的增強，基質上的細胞附著和細胞拓殖得到極大地促進。這進而增加 了植入程序的成功機會，即植入的基質被接受者所接受而不發(fā)生排斥。
[0014] 因此，本發(fā)明提供了允許將合成聚合物和天然聚合物兩者的有益性質結合起來的 方案。
[0015] 具體而言，本發(fā)明允許使用合成聚合物作為為基質提供必要的機械強度的第一生 物降解性和生物相容性聚合物組分，而第二生物降解性和生物相容性聚合物組分是選自膠 原蛋白、層粘連蛋白和纖連蛋白的組的天然聚合物，其為基質提供極為有益的親水性。用在 組織工程中的聚合物基質的親水性被認為對于在三維空間中均勻且充分的細胞接種而言 極為重要。
[0016] 此外，如下文將更詳細說明的，就本發(fā)明基質的孔結構而言，第二聚合物組分的存 在極大地增加了可能的設計選擇方案的數(shù)目。根據(jù)第二聚合物組分在一級聚合物組分的孔 內的特定排布，一級孔的尺寸和形式能夠自由地相適應。這使得能夠例如通過同時提供容 納細胞尺寸較大的細胞的較大孔和保留細胞尺寸較小的細胞的較小孔而在基質的孔內包 埋和接種多于一種細胞類型。
[0017] 詞語"孔"用于指代存在于本發(fā)明的基質中的空腔或空隙區(qū)域。其可以在二維截面 上具有圓形和/或有角形狀、特別是八角形，和/或在以三維觀察時具有傾斜形狀。此外， 所述形狀優(yōu)選地具有延伸部分特征，從而使空腔的形狀能與神經(jīng)細胞的形狀相類比。由此， 術語"孔"也指由包圍空隙區(qū)域的纖絲形成的空腔。這些孔或空腔可以相互連通，意味著兩 個相鄰孔之間的孔壁可以包含洞，從而在所述相鄰孔之間形成連接。雖然"一級孔"和"二 級孔"均被稱作"孔"，但其在結構上可能彼此明顯不同，例如在其形狀、尺寸和/或互通性 方面。
[0018] 孔的尺寸可以借助其平均孔徑來指定，即在二維截面所能分辨的孔的最長和最短 尺寸的平均值。孔徑和孔分布可以借助掃描電子顯微鏡（SEM)來確定，例如以本領域技術 人員公知的方式確定。
[0019] 本發(fā)明的基質具有另外的優(yōu)點：其不僅允許適配其中的孔的尺寸，而且還可以通 過適配具有給定尺寸和/或形狀的孔的密度梯度來制備具有各種滲透性和/或孔隙度的基 質。
[0020] 例如，孔可以高度互通或高度不相交。高度互通的孔通常產(chǎn)生具有提高的滲透性 (例如，水滲透性或對于給定類型的材料的滲透性）的組合物，而高度不相交的孔通常產(chǎn)生 具有對于相同的孔隙度而言降低的滲透性的組合物，所述孔隙度通過將基質的代表性樣品 的空隙體積除以其總體積來計算。
[0021] 因此，如果基質應當發(fā)揮具有提高的滲透性的滲透性或半滲透性基質的功能，則 將該基質設計為具有更高的互通孔數(shù)目。另一方面，具有更高的不相交孔數(shù)目的結構對于 需要具有特別尚的機械穩(wěn)定性的基質而目有利。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明，基質的一級結構允許液體和（大）分子擴散進入基質，或甚至穿過基 質。對于在組織工程中的應用，這種遵守Fick方程的滲透性是本發(fā)明基質的一大優(yōu)點，因 為對于允許和促進這類基質中或其附近的細胞增殖而言，氣體（例如氧氣）、液體和化合物 (例如，細胞養(yǎng)料和廢物）的交換至關重要。
[0023] 另外，據(jù)發(fā)現(xiàn)，基質的一級結構的表面能夠通過在植入位點處與接受者的組織相 互作用而活化例如血管生長因子（VGF)等生長因子?；罨纳L因子對于刺激和吸引導致 進入基質的小血管（毛細血管）形成和向內生長的細胞而言很重要?；罨纳L因子可能 已存在于植入位點處的周圍組織中，或者也可與基質一同提供至植入位點，例如，作為一級 和/或二級聚合物材料中的組分、處在一級和/或二級結構的孔內或者通過包覆有包含所 述生長因子的材料的基質來提供。
[0024] 因此，本發(fā)明的基質能被完美地調節(jié)至即將被基質修復或代替的器官的特定功 能。另外，由于其親水性增強，本發(fā)明的基質滿足了高度改善的接受者的接受度，且因而非 常適用于組織工程。
[0025] 就基質的材料而言，進一步優(yōu)選的是第一聚合物組分選自由聚（乙醇酸）（PGA)、 聚（乳酸）（PLA)、聚（乙醇酸-乳酸）（PGLA)及其混合物組成的組。對于制造生物降解性 基質而言，乳酸（PLA)聚合物組分（例如聚-L-乳酸（PLLA)、聚-D，L-乳酸（L-丙交酯和 D-丙交酯的外消旋混合物；PDLLA)、聚（乙醇酸）（PGA)或其混合物（PLGA;現(xiàn)也稱作聚（丙 交酯-co-乙交酯）或PLG))由于其柔性和明確定義的物理性質和相對的生物相容性而是 具吸引力的候選物。另外，其降解產(chǎn)物是進入一般代謝途徑的低分子量化合物（例如乳酸 和乙醇酸）。此外，通過簡單地改變乳酸與乙醇酸的共聚比，聚（乳酸-co-乙醇酸）提供了 從數(shù)日至數(shù)年的廣譜降解速率的優(yōu)點。
[0026] 在特別優(yōu)選的實施方式中，第一聚合物是PGA和PLA的共聚物。通過在基本的PLA/ PGA主題下改變聚合物組成，可以對這些聚合物的性質進行諧調。
[0027] 更具體地，第一聚合物組分優(yōu)選為乳酸含量為約85mol%且乙醇酸含量為約 15mol%的聚（乙醇酸-乳酸）。聚乳酸（PLLA)和聚（丙交酯-co-乙交酯）（85/15) (PLGA85/15)的這種混合物可以購自例如EvonikIndustriesAG(Essen，德國）。進 一步優(yōu)選的PGA/PLA混合物是：聚（D，L-丙交酯-co-乙交酯）50:50，例如RES0ΜERκ 1? 502;聚（0，1^-丙交酯-(3〇-乙交酯）65:35，例如1^:801^[-:^1? 653;聚（0，1^-丙交 酯-co-乙交酯）75:25,例如RES0ME:R?RG752 ;聚（D，L-丙交酯-co-乙交酯）85:15,例 如llBSOMEg?RG858。
[0028] 如上所述，第二聚合物組分選自由作為胞外基質蛋白的膠原蛋白、層粘連蛋白、纖 連蛋白及其混合物組成的組，它們可以以本身已知的方式以純化形式制備或者商購獲得。
[0029] 在這些胞外基質蛋白中，最優(yōu)選的是膠原蛋白。由于其納米纖維構造，膠原蛋白在 促進組織培養(yǎng)物中的細胞附著、生長和分化功能方面特別有效。然而，還發(fā)現(xiàn)如果第二聚合 物組分