專利名稱：：SiRNA在器官儲(chǔ)存/再灌注溶液中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及在儲(chǔ)存、再灌注和運(yùn)輸過程中對(duì)器官、組織和細(xì)胞的保存。更具體來說，本發(fā)明涉及使用儲(chǔ)存/再灌注溶液對(duì)器官、組織和細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)，該溶液能夠最小化和/或防止器官、組織和細(xì)胞的損傷，從而使器官、組織或細(xì)胞可以用于體內(nèi)移植?？偟膩碚f，本發(fā)明也涉及了將器官、組織和細(xì)胞維持在存活狀態(tài)的方法。
背景技術(shù)：
：樹突狀細(xì)胞(DC)是免疫功能的關(guān)鍵控制物，因?yàn)樗鼈兗饶苷T導(dǎo)免疫刺激又能誘導(dǎo)免疫抑制。決定DC將是刺激性的還是抑制性的關(guān)鍵因素是可溶性的和膜結(jié)合的信號(hào)的表達(dá)。例如，CD80、CD86和IL-12對(duì)DC的抑制賦予它們抑制免疫系統(tǒng)活化的能力。另一方面，對(duì)DC抑制性信號(hào)例如PD-IL的抑制使得DC變成T細(xì)胞反應(yīng)的更有力的激活劑。已經(jīng)通過抗體阻斷(Goldberg等，TransplInt，1994.7Suppl1:p.S252-4)、反義寡聚核苷酸(Liang等，TransplantProc，2001.33(1-2):p.235)和化學(xué)免疫抑制劑(Lagaraine等，2003.75(9Supplm):p.37S-42S)進(jìn)行了對(duì)這些DC衍生信號(hào)的操縱。不幸的是，所有這些方法都具有明顯的缺陷，限制了它們進(jìn)入臨床。最近，已經(jīng)開發(fā)了小干擾RNA(siRNA)，與其它已知的基因抑制方法相比，它提供了更為有力、特異和持續(xù)時(shí)間長的基因抑制(Scherr等，CurrMedChem,2003.10(3):p.245-56)。己經(jīng)證實(shí)低濃度的siRNA可以用于沉默DC細(xì)胞因子的生產(chǎn)，并調(diào)節(jié)DC活化T細(xì)胞的能力。本申請(qǐng)人:的PCTCA03/00867描述了通過使用siRNA對(duì)免疫細(xì)胞、包括DC的操縱，以及使用siRNA沉默的DC修飾T細(xì)胞反應(yīng)的方法。組織和器官的移植需要提供活的組織和器官。自體和異體移植受到組織或器官在移植之前該組織或器官可以維持存活的時(shí)間的限制。供體器官在低溫條件下(4°C)在特別配制的灌注溶液中進(jìn)行沖洗和儲(chǔ)存，以便洗掉碎片并減小在運(yùn)輸過程中的損傷。這些溶液根據(jù)它們模擬的生理環(huán)境可以被廣義上區(qū)分為"細(xì)胞外的"和"細(xì)胞內(nèi)的"。所述溶液含有活性成分，所述活性成分在再灌注過程中能夠最小化由低溫引起的細(xì)胞膨脹、抑制由缺血導(dǎo)致的酸中毒、最小化細(xì)胞外膨脹、最小化自由基損傷并提供ATP再生的底物。美國專利No.5，110，722以及美國專利申請(qǐng)序號(hào)2003/0109433和2005/0100876描述了用來得到更好的移植功能的器官儲(chǔ)存溶液。也可以通過加入自由基保護(hù)劑、胱天蛋白酶(caspase)抑制劑和血管緊張肽轉(zhuǎn)換酶抑制劑來調(diào)節(jié)器官儲(chǔ)存溶液(Baker等，JSurgRes，1999.86(1):p.145-9;McA皿lty等，Cryobiology,1996，33(2):P.217-25;Natori等，LiverTranspl，2003.9(3):p.278-84;Randsbaek等，ScandCardiovascJ,2000192(1):p.31-40)。已經(jīng)嘗試了通過使用抑制供體輔助刺激分子并增加移植存活率的灌注溶液來嘗試免疫調(diào)制(Wekerle等，CurrOpinImmunol,2002.14(5):p.592-600)。已經(jīng)證實(shí)了使用裸反義DNA灌注腎臟移植物能夠抑制細(xì)胞內(nèi)粘附分子-1的表達(dá)(Chen等，Transplantation,l卿.68(6):p.880-7)。類似地，通過在器官儲(chǔ)存溶液中添加誘騙寡核苷酸，在心臟同種異體移植物中進(jìn)行了NF-kB活性的抑制(Vos等，F(xiàn)asebJ，2000.14。)p.592-600)。但是，這兩種方法都需要高濃度的寡核苷酸用于誘導(dǎo)，這導(dǎo)致了邊緣性的療效。美國專利申請(qǐng)公布No.2006/0073127描述了使用選定的RNAi劑來制備用于移植的組織。但是，該方法使用短灌注時(shí)間，并且組織的儲(chǔ)存被維持在通常4。C的冷藏溫度下。此外，使用裸siRNA顯示出導(dǎo)致組織中擴(kuò)散差，因此是無效的。Bradley等(TransplantationProceedings37,233-236,2005)簡(jiǎn)單地證明了使用siRNA進(jìn)行胰島細(xì)胞的成像。因此，非常希望能夠提供改進(jìn)的器官儲(chǔ)存/再灌注溶液以及使用它們的方法，從而有效調(diào)節(jié)器官、組織和細(xì)胞降低免疫識(shí)別，進(jìn)而引起存活率和受體接受程度的改進(jìn)。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及一種組合物，用于在離體儲(chǔ)存、再灌注和運(yùn)輸過程中保存器官、組織和/或細(xì)胞的存活性，使得器官、組織和/或細(xì)胞可以成功用于體內(nèi)移植。移植可以是自體或異體的。本發(fā)明還涉及了使用這樣的組合物以將器官、組織和/或細(xì)胞離體維持在可用于移植的存活狀態(tài)的方法。本發(fā)明還涉及被調(diào)節(jié)的器官、組織和/或細(xì)胞自身。本發(fā)明的組合物包含了siRNA，它們被特異性定靶/定向，以使負(fù)責(zé)器官、組織和/或細(xì)胞中存活力喪失和/或細(xì)胞損傷或與之有關(guān)的基因表達(dá)被沉默。在本發(fā)明的一些方面中，被定靶的基因是參與凋亡、免疫炎性反應(yīng)和補(bǔ)體活化的基因。本發(fā)明的一個(gè)方面是用于將細(xì)胞、組織和/或器官維持在存活狀態(tài)的組合物。在離體儲(chǔ)存過程和體內(nèi)再灌注過程中，細(xì)胞、組織和/或器官被維持在存活狀態(tài)。所述組合物含有一種或多種siRNA，所述siRNA特異性針對(duì)其表達(dá)與離體組織或器官中存活力喪失或細(xì)胞損傷相關(guān)的基因。因此，siRNA耙向這些基因的表達(dá)。這樣的基因可以包括一種或多種凋亡基因、免疫炎性基因和補(bǔ)體基因，以及這些不同基因的各種組合。本發(fā)明的一個(gè)方面是用于在離體儲(chǔ)存過程和體內(nèi)再灌注過程中將細(xì)胞、組織和/或器官維持在存活狀態(tài)的組合物，該組合物含有siRNA，所述siRNA特異性針對(duì)其表達(dá)與離體組織或器官中存活力喪失或細(xì)胞損傷相關(guān)的基因。在本發(fā)明的一些方面中，所述組合物是儲(chǔ)存溶液，其允許細(xì)胞、組織和/或器官在室溫或冷藏溫度下儲(chǔ)存的時(shí)間段比使用現(xiàn)有的臨床接受的溶液所能達(dá)到的更長。在本發(fā)明的一些方面中，組合物被提供為大約37°C，并含有耙向一種或多種凋亡基因、一種或多種免疫炎性基因和一種或多種補(bǔ)體基因、以及它們的各種組合的siRNA的組合。根據(jù)本發(fā)明，提供了一種組合物，用于細(xì)胞、組織和/或器官在再灌注和離體期間維持存活力，使得細(xì)胞、組織和/或器官能夠存活用于移植，該組合物含有靶向一種或多種凋亡基因、免疫炎性基因和補(bǔ)體基因表達(dá)的一種或多種siRNA。在本發(fā)明的一些方面中，所述組合物還可以含有已知能夠幫助細(xì)胞、組織和/或器官離體存活的其它試劑，如后文所述。本發(fā)明的另一方面，是在移植前儲(chǔ)存或運(yùn)輸細(xì)胞、組織和/或器官并同時(shí)將它們維持在存活狀態(tài)的方法。本發(fā)明的另一方面，是延遲缺血對(duì)器官、組織和/或細(xì)胞存活力的有害影響的方法，以及適合于用在這樣的方法中的儲(chǔ)存溶液。本發(fā)明的另一方面，是延遲凋亡對(duì)器官、組織和/或細(xì)胞存活力的有害影響的方法，以及適合于用在這樣的方法中的儲(chǔ)存溶液。本發(fā)明的另一方面，是延遲炎癥對(duì)器官、組織和/或細(xì)胞存活力的有害影響的方法，以及適合于用在這樣的方法中的儲(chǔ)存溶液。本發(fā)明的還另一方面，是維持器官、組織和/或細(xì)胞在從哺乳動(dòng)物宿主中切除之前的再灌注過程中的存活力的方法。本發(fā)明的還另一方面，是改變細(xì)胞、組織和/或器官，致使細(xì)胞、組織和/或器官在移植前以及移植過程中的儲(chǔ)存和再灌注過程中存活的方法。本發(fā)明的另一方面，是在移植前維持組織或器官保持離體存活的方法，包括將組織或器官與特異性針對(duì)其表達(dá)與離體組織或器官的存活力的喪失或細(xì)胞損傷有關(guān)的基因的至少一種siRNA相接觸。這樣的基因可以包括一種或多種凋亡基因、免疫炎性基因、補(bǔ)體基因及其組本發(fā)明的另一方面，是保護(hù)哺乳動(dòng)物的組織或器官免于缺血和/或再灌注損傷的方法，包括將組織或器官與特異性針對(duì)其表達(dá)與缺血和/或再灌注損傷有關(guān)的基因的至少一種siRNA相接觸。在一些方面，所述siRNA被提供為組合物。在其它方面，siRNA組合物在高于4°〇的溫度下提供，在還有的其它方面，則是在大約37t:的溫度下。本發(fā)明的一個(gè)方面，是在移植前維持組織、細(xì)胞或器官離體維持的存活力的方法，該方法包括將組織、細(xì)胞或器官與特異性針對(duì)其表達(dá)與離體組織、細(xì)胞或器官的存活力的喪失或細(xì)胞損傷有關(guān)的基因的至少一種siRNA相接觸，其中所述接觸在高于大約4'C的溫度下進(jìn)行。本發(fā)明的另一方面是保護(hù)哺乳動(dòng)物的組織、細(xì)胞或器官免于缺血和/或再灌注損傷的方法，包括將組織、細(xì)胞或器官與特異性針對(duì)其表達(dá)與缺血和/或再灌注損傷有關(guān)的基因的至少一種siRNA相接觸。本發(fā)明的另一方面是將細(xì)胞、組織或器官儲(chǔ)存在存活狀態(tài)下的方法，該方法包括i)將要儲(chǔ)存的細(xì)胞、組織或器官與含有siRNA的溶液相接觸；以及ii)在非冷凍狀態(tài)下低于環(huán)境的溫度下維持細(xì)胞、組織或器官與溶液的接觸。本發(fā)明的另一方面是將細(xì)胞、組織或器官儲(chǔ)存在存活狀態(tài)下的方法，該方法包括i)將要儲(chǔ)存的細(xì)胞、組織或器官與含有siRNA的溶液相接觸；以及ii)在大約37'C的溫度下維持細(xì)胞、組織或器官與溶液的接觸。本發(fā)明的還另一方面是改變的細(xì)胞、組織或器官，其中所述改變的細(xì)胞、組織或器官含有被靶向以沉默一種或多種凋亡基因、免疫炎性基因和補(bǔ)體基因的表達(dá)的siRNA。在一些方面，細(xì)胞、組織和/或器官被離體提供并維持。在其它方面，細(xì)胞、組織和/或器官被提供在體內(nèi)，即移植到適合的哺乳動(dòng)物受體中。本發(fā)明的還另一方面是制備用于移植的組織的方法，該方法包括-將該組織暴露于含有siRNA的組合物，所述siRNA被靶向以沉默一種或多種凋亡基因、免疫炎性基因和補(bǔ)體基因的表達(dá)，-將所述暴露維持足以下調(diào)所述一種或多種凋亡基因、免疫炎性基因和補(bǔ)體基因的時(shí)間。在一些方面，暴露在大約4"C到大約37"C的溫度下進(jìn)行。在其它方面，所述組織是腎臟。本發(fā)明的另一方面是將細(xì)胞、組織或器官儲(chǔ)存在存活狀態(tài)下的方法，該方法包括i)將要儲(chǔ)存的細(xì)胞、組織或器官與組合物相接觸，所述組合物含有至少一種特異性針對(duì)其表達(dá)與存活力損失或細(xì)胞損傷有關(guān)的基因的siRNA;以及ii)在從大約低于環(huán)境的溫度直到大約37'C的溫度下維持細(xì)胞、組織或器官與溶液的接觸。在閱讀了下面的描述后，本發(fā)明的其它方面和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)清晰。從下面的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的其它特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將變得明顯。但是，應(yīng)該理解的是，詳細(xì)描述和用于表明本發(fā)明的實(shí)施方案的具體實(shí)施例的給出僅僅是為了舉例說明，因?yàn)楦鶕?jù)詳細(xì)描述，對(duì)于本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說，在本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)進(jìn)行的各種改變和修飾將變得顯而易見。現(xiàn)在將參考附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行更全面的描述圖1顯示了在再灌注后缺血腎臟中RdB基因的表達(dá)增加。使用熱局部/再灌注模型使CD1小鼠經(jīng)歷腎臟缺血損傷。在37'C下將左腎的腎靜脈和動(dòng)脈夾住25分鐘。然后取出右腎。在夾住實(shí)驗(yàn)后指定的夾住時(shí)間點(diǎn)后從腎臟提取RNA。對(duì)照是正常小鼠的RNA。RelB的表達(dá)通過RT-PCR測(cè)定。圖2顯示了在再灌注后缺血的腎臟中Fas基因的表達(dá)增加。使用熱缺血/再灌注模型使CD1小鼠經(jīng)歷腎臟缺血損傷。在37'C下將左側(cè)腎臟的腎靜脈和動(dòng)脈夾住25分鐘。然后取出右腎。在夾住實(shí)驗(yàn)后指定的夾住時(shí)間點(diǎn)后從腎臟提取RNA。對(duì)照是正常小鼠的RNA。Fas的表達(dá)通過RT-PCR測(cè)定。圖3顯示了在再灌注后缺血的腎臟中caspaseS基因的表達(dá)增加。使用熱缺血/再灌注模型使CD1小鼠經(jīng)歷腎臟缺血損傷。在37匸下將左腎的腎靜脈和動(dòng)脈夾住25分鐘。然后取出右腎。在夾住實(shí)驗(yàn)后指定的夾住時(shí)間點(diǎn)后從腎臟提取RNA。對(duì)照是正常小鼠的RNA。Caspase8的表達(dá)通過RT-PCR測(cè)定。圖4顯示了在再灌注后缺血的腎臟中caspase3基因的表達(dá)增加。使用熱缺血/再灌注模型使CD1小鼠經(jīng)歷腎臟局部缺血損傷。在37。C下將左腎的腎靜脈和動(dòng)脈夾住25分鐘。然后取出右腎。在夾住實(shí)驗(yàn)后指定的夾住時(shí)間點(diǎn)后，從腎臟提取RNA。對(duì)照是正常小鼠的RNA。Caspase3的表達(dá)通過RT-PCR測(cè)定。圖5顯示了在再灌注后缺血的腎臟中C3基因的表達(dá)增加。使用熱缺血/再灌注模型使CD1小鼠經(jīng)歷腎臟缺血損傷。在37。C下將左腎的腎靜脈和動(dòng)脈夾住25分鐘。然后取出右腎。在夾住實(shí)驗(yàn)后指定的夾住時(shí)間點(diǎn)后從腎臟提取RNA。對(duì)照是正常小鼠的RNA。C3的表達(dá)通過RT-PCR測(cè)定。圖6顯示了在再灌注后缺血的腎臟中C5aR基因的表達(dá)增加。使用熱缺血/再灌注模型使CD1小鼠經(jīng)歷腎臟缺血。在37。C下將左腎的腎靜脈和動(dòng)脈夾住25分鐘。然后取出右腎。在夾住實(shí)驗(yàn)后指定的夾住時(shí)間點(diǎn)后從腎臟提取RNA。對(duì)照是正常小鼠的RNA。C5aR的表達(dá)通過RT-PCR測(cè)定。圖7顯示了在體外使用siRNA對(duì)caspase-3基因的沉默。將Caspase3-siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到表達(dá)Caspase3的巨噬細(xì)胞系中。在基因沉默48小時(shí)后，提取總RNA，通過RT-PCR測(cè)定基因的表達(dá)。圖8顯示了在體外使用siRNA對(duì)caspase-8基因的沉默。將Caspase8-siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到表達(dá)Caspase8的巨噬細(xì)胞系中。在基因沉默48小時(shí)后，提取總RNA，通過RT-PCR測(cè)定基因的表達(dá)。圖9顯示了在體外使用siRNA對(duì)RelB基因的沉默。將RelBcDNA和Re舊-siRNA共轉(zhuǎn)染到巨噬細(xì)胞系中。在基因轉(zhuǎn)染和沉默48小時(shí)后，提取總RNA，通過RT-PCR測(cè)定基因的表達(dá)。證實(shí)了合成的siRNA和siRNA表達(dá)載體都有力地沉默RelB的表達(dá)增加。圖IO顯示了在體外使用siRNA對(duì)Fas基因的沉默。將Fas-siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到表達(dá)Fas的巨噬細(xì)胞系中。在基因沉默48小時(shí)后，提取蛋白，通過Western印跡測(cè)定Fas的表達(dá)。圖11顯示了腎臟中caspase3基因的沉默。對(duì)CD1小鼠靜脈內(nèi)注射50)ig特異性針對(duì)caspase3基因的siRNA。在37"下將腎靜脈和動(dòng)脈夾住25分鐘。在基因沉默48小時(shí)后，從腎臟提取總RNA，通過RT-PCR測(cè)定Caspase的表達(dá)。圖12顯示了腎臟中Fas基因的沉默。對(duì)CD1小鼠靜脈內(nèi)注射50jag特異性針對(duì)Fas基因的siRNA。在37'C下將腎靜脈和動(dòng)脈夾住25分鐘。在基因沉默48小時(shí)后，從腎臟提取總RNA，通過RT-PCR測(cè)定Fas的表達(dá)。圖13A和13B證實(shí)了通過免疫炎性基因的沉默防止腎臟中的缺血再灌注損傷。對(duì)CD1小鼠靜脈內(nèi)注射50pg特異性針對(duì)單獨(dú)或組合的TNFa和RelB基因的siRNA。在基因沉默后，在37。C下將腎靜脈和動(dòng)脈夾住25分鐘。通過在再灌注后24小時(shí)檢測(cè)血肌酐(A)和BUN(B)水平來測(cè)定腎功能。圖14A和14B證實(shí)了通過凋亡基因的沉默防止腎臟中的缺血再灌注損傷。對(duì)CD1小鼠靜脈內(nèi)注射50pg特異性針對(duì)單獨(dú)或組合的Caspase3、Caspase8和Fas基因的siRNA。在基因沉默后，在37'C下將腎靜脈和動(dòng)脈夾住25分鐘。通過在再灌注后24小時(shí)檢測(cè)血肌酐(A)和BUN(B)水平來測(cè)定腎功能。圖15A和15B證實(shí)了通過組合的基因沉默防止腎臟中的缺血再灌注損傷。對(duì)CD1小鼠靜脈內(nèi)注射50pg特異性針對(duì)下列組的siRNA:第一組，caspase3、caspase8禾BFas基因；第二組，TNFoc禾BRelB基因；第三組，C3和C5aR基因；第四組，所有上述基因(S-mix)。在基因沉默后，在37'C下將腎靜脈和動(dòng)脈夾住25分鐘。通過在再灌注后24小時(shí)檢測(cè)血肌酐(A)和BUN(B)水平來測(cè)定腎功能。圖16證實(shí)了基因沉默防止缺血再灌注損傷后小鼠的死亡。對(duì)CD1小鼠靜脈內(nèi)注射50fig特異性針對(duì)Caspase3、Caspase8、Fas、C3、C5aR、TNFa和RelB基因的siRNA混合物的混合物。在基因沉默后，在37°C下將腎靜脈和動(dòng)脈夾住35分鐘。圖17A-D證實(shí)了C3和Caspase3基因的體外基因沉默。(C3-17A&17B)L929細(xì)胞株使用lipofectamine2000用C3cDNA載體轉(zhuǎn)染，并與C3siRNA、空載體或無siRNA(對(duì)照)共轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，收獲細(xì)胞，提取總RNA。使用RT-PCR(17A)和定量PCR(17B)測(cè)定C3禾BGAPDH的轉(zhuǎn)錄本。(Caspase3-17C&17D)為了沉默Caspase3基因，將L929細(xì)胞用Caspase3siRNA、空載體或無siRNA(對(duì)照)轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，使用RT-PCR(17C)和定量PCR(17D)測(cè)定Caspase3的表達(dá)。圖18A-B證實(shí)了C3的體內(nèi)沉默。(18A)I/R損傷后腎臟中C3和Caspase3基因的表達(dá)上調(diào)。如實(shí)施例部分所述將左腎夾住25分鐘。在夾住后指定的時(shí)間點(diǎn)獲取腎臟。通過RT-PCR檢測(cè)C3和Caspase3的表達(dá)。(18B)將小鼠用50(igC3siRNA和Caspase3siRNA或空載體預(yù)處理48小時(shí)，然后進(jìn)行I/R實(shí)驗(yàn)。在I/R后24小時(shí)獲取腎臟，使用RT-PCR檢測(cè)C3和Caspase3基因的表達(dá)。圖19A-D顯示了1/R損傷的腎臟中的組織學(xué)變化。按照?qǐng)D18B中的描述將小鼠用siRNA處理并進(jìn)行I/R損傷實(shí)驗(yàn)。I/R后24小時(shí)獲取腎臟組織并切片，然后用H&E染色。(19A)正常的未鉗夾腎臟；(19B)PBS處理的I/R腎臟；(19C)空載體處理的I/R腎臟；(19D)C3siRNA和Caspase3siRNA處理的I/R腎臟。圖20顯示了使用Caspase3和C3，siRNA保護(hù)腎臟免于I/R損傷。a)在1/R損傷實(shí)驗(yàn)之前48小時(shí)，靜脈內(nèi)50mgsiRNA或空載體處理小鼠。在I/R后24小時(shí)，采集血液測(cè)定BUN和血清肌酐的水平。數(shù)據(jù)被顯示為平均值士SEM。p值使用Student'st檢驗(yàn)與PBS處理的對(duì)照組相比較。在I/R損傷實(shí)驗(yàn)之前48小時(shí)，靜脈內(nèi)50mgsiRNA或空載體處理小鼠。小鼠的存活率被觀察到1/R損傷后第八天。圖21A-B顯示了腎臟IRI中caspase-3/8的表達(dá)增加。(21A)通過RT-PCR檢測(cè)的Caspase-3的表達(dá)。如材料與方法中所述，將左腎鉗住25分鐘。鉗住后24小時(shí)，獲取腎臟，提取總RNA。使用特異性針對(duì)caspase-3(21A)和caspase-S(21B)以及GAPDH基因的引物擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄。顯示的數(shù)據(jù)代表了對(duì)每組5只動(dòng)物進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。圖22A-D顯示了體內(nèi)對(duì)caspase-3/8的沉默。50嗎pRNATU6.1載體含有caSpase-3siRNA或caspase-8siRNA。對(duì)照包括空白載體(無siRNA)處理和PBS處理組?；虺聊?8小時(shí)，將腎臟鉗住25分鐘。夾住后24小時(shí)，獲取腎臟，提取總RNA。通過RT-PCR(22A&22B)以及定量實(shí)時(shí)PCR(22C&22D)測(cè)定caspase-3(22A&22C)和caspase-8(22B&22D)以及GAPDH的轉(zhuǎn)錄本。圖23A-B顯示了在IRI中siRNA保護(hù)了腎功能。將腎蒂鉗住25分鐘。在鉗住前(Oh)和再灌注后24小時(shí)(24h)收集血液以測(cè)定BUN(23A)和血清肌酐(23B)水平。數(shù)據(jù)被顯示為平均值士SEM(承p<0.05，caspase-3/8-siRNA處理的小鼠對(duì)比未處理的和鉗住的小鼠)。圖24顯示了siRNA防護(hù)致命的腎臟缺血。將小鼠用50ngcaspase-3禾P8-siRNA載體或空白載體或PBS靜脈處理，然后鉗住35分鐘。siRNA處理的(n=10)和對(duì)照載體處理的(n=10)或PBS對(duì)照小鼠的存活率被觀察8天(p<0.05，caspase-3/8siRNA處理的小鼠對(duì)比未處理的和鉗住的小鼠)。圖25顯示了RelBsiRNA在體外沉默RelB基因的表達(dá)。在用RPMI、轉(zhuǎn)染試劑、空載體、混合的siRNA和RelBsiRNA處理的L929細(xì)胞株中，通過RelB和GAPDH表達(dá)的RT-PCR分析了RelBmRNA的沉默。顯示了代表性的樣品。圖26A-B顯示了在體內(nèi)缺血再灌注后RelB表達(dá)的上調(diào)，通過RelB和GAPDH表達(dá)的RT-PCR測(cè)試了來自未處理的小鼠或被夾住25分鐘的小鼠在24小時(shí)點(diǎn)時(shí)的腎臟組織勻漿液中的RelB沉默效率(26A、B)。siRNA對(duì)RelB下調(diào)的基因表達(dá)。動(dòng)物按照實(shí)施例部分中的描述進(jìn)行處理。組織來自未處理的動(dòng)物、用RelBsiRNA處理24小時(shí)和48小時(shí)的動(dòng)物。RelB基因表達(dá)按照方法中的描述通過RT-PCR評(píng)估。結(jié)果也表示為與GAPDH相比的變化倍數(shù)的平均值+ASD。圖27A-B顯示了在RelBsiRNA沉默后腎功能的改善。按照實(shí)施例部分中的描述，小鼠在2天前接受溶于PBS的siRNA(實(shí)心條)或僅僅是PBS(斑點(diǎn)條)的單劑流體力學(xué)注射。按照指示，在夾住后24小時(shí)獲取樣品。(27A)BUN在陽性對(duì)照動(dòng)物(PBS)中增加，但是在siRNA處理的小鼠中減少。(27B)肌酐水平在用PBS注射的小鼠中身高，但在用siRNA處理的組中不高。圖28A-B顯示了siRNA對(duì)腎臟缺血損傷的保護(hù)。小鼠腎臟經(jīng)過缺血25分鐘，然后進(jìn)行24小時(shí)的再灌注。腎臟組織在10%中性緩沖的福爾馬林中固定48小時(shí)，然后包埋在石蠟中。(28A)缺血再灌注導(dǎo)致了嚴(yán)重的嗜中性白細(xì)胞浸潤管狀空泡形成和管型形成。(28B)RelBsiRNA降低了缺血再灌注的損傷。圖29顯示了RelBsiRNA的流體動(dòng)力學(xué)注射保護(hù)了小鼠免于致命的腎臟缺血再灌注損傷在35分鐘的腎臟缺血和灌注后的存活率。圖30顯示了從小鼠獲得并保存在本發(fā)明的含有針對(duì)RelB、Fas、caspase-3、caspase-8、TNFot、C5aR禾卩C3的siRNA的siRNA組合物中的心臟，可以被移植到受體小鼠中并且心臟存活了，而在相比較的對(duì)照組中心臟死亡了。心臟從BALB/c小鼠獲得，在本發(fā)明的含有UW溶液的siRNA組合物中于4'C保存48小時(shí)。體外保存的器官在心臟移植中用作供體。受體是同源種系的BALB/c小鼠。每天監(jiān)測(cè)心跳。對(duì)照僅僅保存在UW溶液中。對(duì)照器官在使用UW溶液保存48小時(shí)后死亡。siRNA處理的心臟一直跳動(dòng)到試驗(yàn)結(jié)束時(shí)(40天)。照片顯示了移植后40天的心臟器官。具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及能夠維持細(xì)胞、組織和/或器官離體的存活力、使得它們可以儲(chǔ)存、運(yùn)輸并然后用于體內(nèi)移植的組合物。該組合物含有一種或多種siRNA，其特異性針對(duì)靶向選自凋亡基因、免疫炎性基因、補(bǔ)體基因及其組合的基因。靶向siRNA有效地抑制(下調(diào))細(xì)胞、組織和器官中被靶向的基因的表達(dá)，導(dǎo)致了細(xì)胞、組織和器官的存活。本發(fā)明還提供了使用這些組合物的方法。有利的是，siRNA是非病毒性的改變基因表達(dá)的方法，因此對(duì)于被免疫抑制的移植病人來說是優(yōu)選的。"存活"或"存活的"是指細(xì)胞、組織或器官能夠保留原有的功能。因此，細(xì)胞、組織或器官能夠以基本上保留其功能的方式被灌注、運(yùn)輸、然后移植到體內(nèi)。本文中使用的術(shù)語"小干擾RNA"("siRNA")(在本
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中也被稱為"短干擾RNA")是指含有大約10到50個(gè)之間的核苷酸(或核苷酸類似物)、能夠指導(dǎo)或介導(dǎo)RNA干擾的RNA(或RNA類似物)。在一些方面，siRNA含有大約15到30個(gè)之間的核苷酸或核苷酸類似物，在其它方面含有大約16到25個(gè)之間的核苷酸(或核苷酸類似物)，在另外一些方面含有大約18到23個(gè)之間的核苷酸(或核苷酸類似物)，在還有一些方面含有大約19到22個(gè)之間的核苷酸或(核苷酸類似物)(例如19、20、21或22個(gè)核苷酸或核苷酸類似物)。本文中使用的術(shù)語siRNA或RNAi試劑的"反義鏈"是指與被靶向沉默的基因的mRNA的大約10-50個(gè)核苷酸、例如大約15-30、16-25、18-23或19-22個(gè)核苷酸的部分基本上互補(bǔ)的鏈。反義鏈具有與所需的靶mRNA序列足夠互補(bǔ)的序列以指導(dǎo)靶特異性的RNA干擾(RNAi)，例如足以通過RNAi機(jī)制或過程觸發(fā)所需的靶mRNA破壞的互補(bǔ)性。術(shù)語siRNA或RNAi試劑的"有義鏈"是指與反義鏈互補(bǔ)的鏈。反義和有義鏈也可以被稱為第一或第二鏈，與靶序列具有互補(bǔ)性的第一或第二鏈，以及與所述第一或第二鏈具有互補(bǔ)性的相應(yīng)第二或第一鏈。指導(dǎo)鏈則是指進(jìn)入RISC復(fù)合物并指導(dǎo)靶mRNA的切割的RNAi試劑的鏈，例如siRNA雙鏈體的反義鏈。術(shù)語"指導(dǎo)鏈"在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中通常與術(shù)語"反義鏈"互換使用。"耙基因"是指其表達(dá)將被選擇性抑制或"沉默"的基因。這種沉默是通過RNAi途徑或過程切割靶基因的mRNA來實(shí)現(xiàn)的。在本發(fā)明中，耙基因是其表達(dá)與存活力的喪失或細(xì)胞損傷有關(guān)的基因。這樣的基因選自一種或多種凋亡基因、一種或多種補(bǔ)體基因、一種或多種免疫炎性基因及其組合。本文中使用的術(shù)語"灌注"是傾注或通過的行動(dòng)，特別是指流體通過特定器官的血管。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，含有siRNA的流體通過移植組織的脈管系統(tǒng)被灌注。術(shù)語"凋亡"或"程序性細(xì)胞死亡"是指在發(fā)育和其它正常的生物過程中將不想要的或無用的細(xì)胞消除的生理過程。凋亡是在正常的生理?xiàng)l件下發(fā)生的細(xì)胞死亡的模式，細(xì)胞在其自身的死亡中是主動(dòng)的參與者("細(xì)胞自殺")。它在正常細(xì)胞的更新和組織動(dòng)態(tài)平衡、胚胎發(fā)生、免疫耐受的誘導(dǎo)和維持、祌經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和內(nèi)分泌依賴性組織萎縮過程中最為常見。凋亡也可以由外部事件或刺激引發(fā)，例如在本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案的情況下的缺血損傷。經(jīng)歷凋亡的細(xì)胞顯示出特征性的形態(tài)和生化特點(diǎn)。"基因表達(dá)的抑制"是指來自靶基因的蛋白和/或mRNA產(chǎn)物水平的缺乏(或可察覺的減少)。"特異性"是指抑制靶基因而不明顯影響細(xì)胞的其它基因的能力。抑制的結(jié)果可以通過檢査細(xì)胞或生物體的外部性質(zhì)或通過生物化學(xué)技術(shù)例如RNA溶液雜交、核酸酶保護(hù)、Northern雜交、逆轉(zhuǎn)錄、使用微陣列的基因表達(dá)監(jiān)測(cè)、抗體結(jié)合、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、Western印跡、放射免疫分析(RIA)、其它免疫分析和熒光激活的細(xì)胞分析(FACS)來證實(shí)。正如本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員所理解的那樣，可以斷言任何類型移植所需和使用的細(xì)胞、組織或器官都可以用于本發(fā)明。器官的代表性的例子是心臟、肝臟、肺、胰和腎臟，但不限于此。細(xì)胞(即胰島細(xì)胞)或其它組織(即血管)也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。簡(jiǎn)單來說，"RNA是一種在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中用于抑制基因表達(dá)的RNA干擾方法(Bertrand等，2002.BiochemBiophysResCommun296(4):1000-1004)。SiRNA是短的雙鏈RNA分子，大約21-25個(gè)堿基對(duì)長，它們與細(xì)胞質(zhì)蛋白相互作用形成細(xì)胞內(nèi)RNAi誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)。RISC使用siRNA的反義鏈結(jié)合和切割相關(guān)的mRNA序列，然后被非特異性的RNA酶降解。SiRNA在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用，與反義寡聚核苷酸相比，實(shí)現(xiàn)靶基因的敲除所需要的濃度更低。當(dāng)獲取器官用于移植時(shí)，隨后的缺氧時(shí)期，接著是器官的再灌注，都伴隨著顯著的組織損傷，包括內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和器質(zhì)性功能障礙。這種局部缺血/再灌注(I/R)損傷可能參與部分由轉(zhuǎn)錄因子NF-kB及其亞基RelB控制的炎性反應(yīng)、凋亡途徑通過例如caspase的活化、補(bǔ)體系統(tǒng)的激活以及免疫炎性基因例如Fas和TNF-a基因的活化。本發(fā)明是基于使用siRNA來靶向那些可以導(dǎo)致用于移植的細(xì)胞、組織和/或器官不能存活和存活力降低的那些基因的表達(dá)。這些基因可以包括例如凋亡基因、免疫炎性基因和補(bǔ)體基因及其組合。本發(fā)明提供了含有一種或多種凋亡基因、一種或多種免疫炎性基因、一種或多種補(bǔ)體基因及其組合的組合物，以及使用這樣的組合物的方法。以這種方式，提供了更有效的方法，更有效地將組織/細(xì)胞維持在存活狀態(tài)，以提高移植的成功率。在本發(fā)明的一些方面中，適合的凋亡基因可以包括但不限于caspase3基因、caspase8基因和fas基因。適合的免疫炎性基因可以包括但不限于TNF-a基因和RelB基因。適合的補(bǔ)體基因可以包括但不限于C3和C5aR。本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員也可以理解的是，如果需要，可以使用siRNA靶向基因的組合。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)容易地理解哪些參與凋亡、免疫炎性的其它基因和參與啟動(dòng)凝結(jié)的基因可以被用于本發(fā)明的組合物中。本領(lǐng)域的技術(shù)人員也將會(huì)容易地理解能夠用于本發(fā)明的短基因序列，在本文的實(shí)施例部分中列舉了其中的一些，僅作為代表性的例子而不意味著限制。此外，用于本發(fā)明的凋亡基因的代表性例子顯示在表1中，用于本發(fā)明的補(bǔ)體基因的代表性例子顯示在表2中。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以獲得這些基因的序列用于本發(fā)明組合物以及方法中的siRNA?，F(xiàn)在，本發(fā)明在一個(gè)實(shí)施方案中，使用已接受的小鼠缺血/再灌注(I/R)損傷系統(tǒng)模型，證實(shí)了用特異性靶向一種或多種上述與組織損傷反應(yīng)有關(guān)的基因的siRNA來灌注經(jīng)受I/R損傷的器官，減少了這些基因的表達(dá)，從而防止了組織損傷的狀況并提高了器官的存活力。在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，盡管I/R損傷在對(duì)照組中產(chǎn)生了腎損傷，但在siRNA處理過的腎臟中已經(jīng)證實(shí)維持了良好的腎功能。這表明了本發(fā)明的方法和組合物提供了改善的存活力。當(dāng)經(jīng)歷缺血和再灌注的器官被維持在37'C時(shí)，即比通常用于移植器官的條件(通常維持在低溫下)嚴(yán)酷得多的條件下，觀察到了基因表達(dá)的抑制。正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所了解的那樣，本發(fā)明可以應(yīng)用于細(xì)胞、組織或器官。適合的器官可以是但不限于心臟、肝臟、肺臟、胰臟和腎臟。在本發(fā)明的一些方面，SiRNA的投送是在獲取器官的過程中或始終(例如通過所述器官的脈管系統(tǒng)用藥)以及從器官分離可移植的細(xì)胞的過程中或始終進(jìn)行的。siRNA組合物和方法可用于器官獲取過程的幾種情況中l(wèi))獲取前在死亡供體中通過靜脈內(nèi)灌注；2)在包裝以運(yùn)輸之前通過器官灌注；和/或3)在細(xì)胞培養(yǎng)中。更具體來說，可以通過在供移植的獲取之前或獲取之后用選定的siRNA進(jìn)行處理，來保護(hù)組織或器官免于細(xì)胞損傷。例如，可以使用本發(fā)明的siRNA組合物對(duì)組織或器官再灌注所需的時(shí)間；簡(jiǎn)單地將組織或器官在本發(fā)明的siRNA組合物中浸泡和儲(chǔ)存所需的時(shí)間；或者組織或器官可以再灌注并浸泡和儲(chǔ)存在本發(fā)明的siRNA組合物中。當(dāng)然，正如本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員所了解的那樣，這也適用于細(xì)胞。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，組織或器官在獲取前用siRNA溶液灌注。所需器官的灌注可以長達(dá)例如大約30或60分鐘，如本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員所了解的那樣。然后將獲取的灌注過的組織或器官儲(chǔ)存在siRNA溶液中，根據(jù)組織或器官的類型，這種儲(chǔ)存可以長達(dá)大約24小時(shí)或48小時(shí)，正如本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員所了解的那樣。這樣，本發(fā)明的siRNA可以用于各種方法中以防止細(xì)胞的凋亡、延長組織和器官的壽命、防止和/或最小化缺血損傷、以及幫助防止組織/器官的排斥，這是因?yàn)榻M織/器官處于存活狀態(tài)中從而提供了較少的有害自身免疫反應(yīng)。本發(fā)明的組合物可以用于各種溫度，包括大約2-4"C的冷藏溫度到大約37"C的體溫，這是本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員早就了解的。本發(fā)明的組合物的使用可以利用已知用于再灌注和浸泡并儲(chǔ)存組織、細(xì)胞和器官的標(biāo)準(zhǔn)程序來進(jìn)行。在本發(fā)明的特定方面，所述組合物和方法在超過4"C直到約37°C或更高的溫度下有效，并且仍然能夠有效抑制/防止/最小化對(duì)細(xì)胞、組織和器官的缺血損傷。這是特別有利的，因?yàn)椴恍枰獡?dān)心將組織或器官保持冷藏以用于移植。本發(fā)明的siRNA組合物通過用含有siRNA的適合的生理溶液灌注和/或浸泡離體組織、器官或細(xì)胞，來施用于器官或組織或細(xì)胞(Hamar,P.，等，ProcNatlAcadSci2004;101:41)。例如，可以使用可商購的器官儲(chǔ)存溶液，例如但不限于Collins溶液、(UW)-溶液、組氨酸-色氨酸-酮戊二酸(HTK)溶液、ViaSpan(細(xì)胞內(nèi))和Celsior溶液(細(xì)胞外)(Muhlbacher等，1999，TransplantProc31(5):2069-2070)。此外，其它已知的添加劑也可以與本發(fā)明的siRNA組合用于組合物中。這樣的添加劑可以包括例如但不限于超氧化物歧化酶和其它自由基清除劑(Baker等，1999,JSurgRes86(1):145-149;McAnulty禾卩Huang1996,Cryobiology33(2):217-225;McLaren禾口Friend2003,TransplInt16(10):701-708)、21-氨基類固醇(lazaroids)、抗凋亡劑(El-Gibaly等，2004，Hepatology39(6):1553-1562;Natori等，2003，LiverTranspl9(3):278-284)、！丐通道阻斷齊U(Arnault等，2003,Transplantation76(l):77-83)、細(xì)胞間粘附分子-1抑制劑(Stepkowski等，1998,Transplantation66(6):699-707;Chen等，1999,Transplantation68(6):880-887)、己酮可可豆堿(Randsbaek等，2000,ScandCardiovascJ34(2):201-208)以及它們的組合。siRNA可以用于各種策略中來沉默選定的基因。例如，可以使用下面的4種策略1)使用商業(yè)上預(yù)先合成的"siRNA池"(DharmaconInc)，由21個(gè)堿基對(duì)的寡核苷酸組成，同時(shí)靶向靶基因的位點(diǎn)例如RelB基因的4個(gè)位點(diǎn)(圖1)，顯示出大于75%的基因沉默效能；2)使用帶有polIII啟動(dòng)子的siRNA表達(dá)載體(pSUencer,Ambionlnc)，其驅(qū)動(dòng)發(fā)夾RNA表達(dá)以形成雙鏈RNA，用作內(nèi)源表達(dá)的siRNA。通過克隆技術(shù)可以制備大量的沉默子-siRNA，用于體外(圖2)和體內(nèi)基因沉默；3)使用siRNA表達(dá)盒(SEC)，它作為PCR產(chǎn)物被產(chǎn)生，由側(cè)翼帶有啟動(dòng)子和終止子序列的發(fā)夾siRNA模板組成(圖3)。一旦SEC被轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，發(fā)夾siRNA從PCR產(chǎn)物表達(dá)并導(dǎo)致基因沉默(圖4)。SEC的優(yōu)點(diǎn)在于它極富時(shí)間效率的事實(shí)，能夠在許多候選序列中快速篩選出最有潛力的siRNA;4)使用SEC載體。由于SEC收率低，因此有效的SEC隨后必須被克隆到病毒或非病毒載體中(圖5)。當(dāng)然，正如本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員所悉知的那樣，其它的策略也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。根據(jù)具體的耙基因或基因組合以及投送的siRNA劑量，可以獲得靶基因功能的部分或完全喪失。例如靶細(xì)胞的基因表達(dá)可以減小或喪失至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%或以上。抑制基因表達(dá)是指靶基因的蛋白和/或mRNA產(chǎn)物水平的缺少(或可察覺的降低)。特異性是指抑制靶基因而對(duì)細(xì)胞的其它基因沒有明顯影響的能力。抑制的結(jié)果可以通過檢查細(xì)胞或生物體的外部性質(zhì)(如下面實(shí)施例中所述)或通過生物化學(xué)技術(shù)例如RNA溶液雜交、核酸酶保護(hù)、Northern雜交、逆轉(zhuǎn)錄、使用微陣列的基因表達(dá)監(jiān)測(cè)、抗體結(jié)合、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、Western印跡、放射免疫分析(RIA)、其它免疫分析和熒光激活的細(xì)胞分析(FACS)來證實(shí)。siRNA可以以各種形式施用于組織或器官或細(xì)胞，例如(1)作為裸siRNA寡核苷酸；(2)摻入到siRNA表達(dá)載體中，該表達(dá)載體驅(qū)動(dòng)發(fā)夾RNA表達(dá)以形成雙鏈RNA，用作內(nèi)源表達(dá)的siRNA。例如，可以使用pSilencer2.0-U6(AmbionInc.AustinTX)構(gòu)建siRNA表達(dá)載體。特定的siRNA插入寡核苷酸應(yīng)該按照用戶說明書設(shè)計(jì)。寡聚核苷酸含有19mer的特異性針對(duì)mRNA耙的發(fā)夾序列、將兩個(gè)互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域分隔開的環(huán)序列、兩個(gè)3'-末端突出的核苷酸和多聚胸腺嘧啶核苷尾用于終止轉(zhuǎn)錄、以及5'單鏈突出端用于以BamHl和HindIII連接到pSilencer中。編碼有義和反義發(fā)夾siRNA的寡核苷酸被退火，作為插入片段，如在Shi,Y.,(2003)，TrendsGenet"v.19，pp.9-12中所述；(3)作為siRNA表達(dá)盒(SEC)的形式，它作為PCR產(chǎn)物被產(chǎn)生，由兩側(cè)帶有啟動(dòng)子和終止子序列的發(fā)夾siRNA模板以及組成，如Castanotto等，(2002)，Rna,v.8，pp.1454-60中描述的那樣。簡(jiǎn)單來說，SEC是使用沉默子表達(dá)試劑盒(Ambionlnc，AustinTX)產(chǎn)生的。按照用戶說明書設(shè)計(jì)用于前體SEC的有義和反義發(fā)夾siRNA模板寡核苷酸。寡核苷酸含有19-mer特異性針對(duì)mRNA靶的發(fā)夾序列、將兩個(gè)互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域分隔開的環(huán)、兩個(gè)3'-末端突出的核苷酸。簡(jiǎn)單來說，進(jìn)行了兩個(gè)PCR反應(yīng)，使用啟動(dòng)子元件(小鼠U6)作為模板、啟動(dòng)子PCR引物和基因特異性的有義和反義寡核苷酸產(chǎn)生前體SEC。第一個(gè)PCR產(chǎn)物被用作第二個(gè)PCR的模板。進(jìn)行了第三個(gè)PCR以在5'末端修飾核苷酸，并編碼EcoRI和HindIII限制性位點(diǎn)(圖1)。在PCR中使用Taq聚合酶(InvetregeneInc.);以及(4)摻入到載體中的SEC。一旦鑒定到有效的SEC，將SEC用MunI(與EcoRI相容)禾卩HindIII位點(diǎn)克隆到pVP22中，如同Paul(2003),Mol.Ther,v.7，pp.237-247中描述的那樣。本文描述的任何上述形式的siRNA都可對(duì)哺乳動(dòng)物應(yīng)用使用并施用，包括動(dòng)物和人類。至于組合物中使用的siRNA的量，在動(dòng)物例如小鼠中可以每次注射使用大約1-50微克，這足以在體內(nèi)使基因沉默。溶液中每種不同的siRNA大約可達(dá)0.2到100pg/mlsiRNA可以用于沖洗和儲(chǔ)存心臟和腎臟器官。這包括了其間的任何范圍。劑量方案可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的使用。劑量方案可以在數(shù)分鐘、數(shù)小時(shí)或數(shù)天的時(shí)期內(nèi)完成，并可以使用各種劑量的siRNA。當(dāng)然，用于組合物的siRNA的量可以根據(jù)具體的組織或器官類型及其大小而變化，這可以被本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地確定。因此，本文提供的范圍是指導(dǎo)，事實(shí)上可以更大。siRNA可以被直接導(dǎo)入細(xì)胞(即細(xì)胞內(nèi))、組織、器官、同種異體移植物或生物體；也可以細(xì)胞外導(dǎo)入到腔、間隙空間、生物體的循環(huán)中，口服導(dǎo)入，或可以通過將細(xì)胞、組織、器官、同種異體移植物或生物體浸泡在含有siRNA的溶液中來導(dǎo)入。膽汁或膽管系統(tǒng)、血管或血管外循環(huán)、血液或淋巴系統(tǒng)、以及腦脊液是可以導(dǎo)入siRNA的位點(diǎn)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，siRNA通過灌注被提供給移植組織(例如器官)。上面的公開內(nèi)容對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了一般性描述。參考下面具體的實(shí)施例可以獲得更完整的理解。描述這些實(shí)施例的目的僅僅是為了說明，并不打算限制本發(fā)明的范圍。形式變換和等同替換被視為情況可能提示或賦予了方便。盡管在本文中使用了特定的術(shù)語，但這些術(shù)語的目的是描述性的而不是為了限制。表l凋亡基因的例子基因家族<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>基因符號(hào):<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>沒有被批準(zhǔn)的符號(hào)的基因<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>Clq:y鏈C1QG1p34.1-p36.3C8:a鏈C8Alp32C8:卩鏈C8Blp32C4結(jié)合蛋白:ot鏈C4BPAlq32(a)C4結(jié)合蛋白:(3鏈C4BPBlq32(a)補(bǔ)體受體1(CD35)CR1lq32(a)補(bǔ)體受體2(CD21)CR2lq32(a)衰退加速因子(CD55)DAFlq32(a)膜輔助因子蛋白(CD46)MCPlq32(a)因子HHFlq32(a)因子IIF4q25C6C65p13(b)C7C75pl3(b)C9C95pl3(b)C2C26p21.3(c)因子BBF6p21.3(c)C4A(同種型)C4A6p21.3(c)C4B(同種型)C4B6p21.3(c)C8:-連C8G9q22.3-q32C5C59q33結(jié)合甘露糖的凝集素MBL10qll.2-q21穿孔素PRF110q22表面活性蛋白Al和A2SFTPA1，A210q22-q23表面活性蛋白DSFTPD10q22-q23膜反應(yīng)性溶解的抑制物(MIRL，CD59)CD5911pl3Cl抑制物C1NH11qll-ql3.1ClrC1R12pl3ClsCIS補(bǔ)體受體3:a鏈二a-M整合蛋白ITGAM(CR3A，CD11A)玻連蛋白(S-蛋白)VTNC3C3C5a受體lC5R1白細(xì)胞粘附分子:卩鏈=(3-2整合蛋白ITGB2(LCAMB,CD18)備解素PFC腳注(a)補(bǔ)體活化調(diào)節(jié)物(RCA)基因簇(b)膜攻擊復(fù)合物(MAC)基因簇(c)III類MHC補(bǔ)體基因簇實(shí)施例下面的實(shí)施例被用來舉例說明本發(fā)明的各種實(shí)施方案，而并非旨在限制發(fā)明的范圍。使用的一般性方法缺血方案1)通過腹膜內(nèi)施用氯胺酮結(jié)合吸入安氟醚使小鼠(25-30g)麻醉。2)通過在動(dòng)物底下放置暖墊(37°C)將小鼠的體溫保持恒定。3)使用腹中線切開，用無創(chuàng)傷血管鉗將左腎蒂阻斷長達(dá)35分鐘。阻斷后，將0.8ml預(yù)熱(37°C)的鹽水放置在腹腔中，將腹部用浸濕了無菌鹽水的棉花蓋住。4)取下鉗子后，觀察腎臟1分鐘以觀察指示血液重新流動(dòng)的顏色變化。然后取下對(duì)側(cè)腎臟，將傷口以兩層封閉。對(duì)照小鼠進(jìn)行同樣的手術(shù)操作，除了不使用血管鉗。5)在再灌注24小時(shí)后將小鼠處死；通過下腔靜脈收集血液樣品；12pl316pll.217qll19pl3.3-pl3.219ql3.3-ql3.421q22.3Xpll.4-p11.2然后獲取左腎以評(píng)估腎損傷。siRNA注射1)對(duì)于全身性注射來說，合成的siRNA(在0.8-1mlPBS中)被快速注射(在10秒內(nèi))到尾側(cè)靜脈或陰莖靜脈之一中。為了使尾靜脈膨脹，在用乙醚麻醉5±1秒的情況下將尾部浸泡在溫水中(50-55°C)。2)對(duì)于局部注射來說，從中線剖腹術(shù)中可以看到左側(cè)腎蒂。在主動(dòng)脈左側(cè)進(jìn)行腎血管上方的最小制備以插入阻斷鉗。夾住主動(dòng)脈和腔靜脈，用30號(hào)針頭刺入腎靜脈，以注射0.1ml含有siRNA的PBS。將針頭在原地保持5秒鐘，然后緩慢取出，同時(shí)用鑷子夾住一點(diǎn)Avitene壓迫腎靜脈30秒。然后將Avitene留在原地。在左腎蒂被阻斷進(jìn)行缺血后立即取下主動(dòng)脈和腔靜脈鉗。用于灌注研究中沉默指定基因的siRNA:Caspase3基因GATCTATCTGGACAGTAGT:AAGCTCTTCTTCCCTCCCTAAAAGTGCAAGTGCAAACCAGACAAGACAACCAACTAGTGGTGCGGAATCGAGAGCAAACGAACTGTGCAAGACTTCCTAAAGAGCACACTGTATGTGGTATTAACaspase8基因Fas基因TNF-a基因RelB基因C3基因C5aR基因使用的一般性方法(圖17-20)C3禾口Caspase3siRNA的設(shè)計(jì)選擇耙序列5'-CTGTGCAAGACTTCCTAAAGA-3'(特異性針對(duì)C3)和5'-GGATCTATCTGGACAGTAGTT-3'(特異性針對(duì)Caspase3)。含有有義和反義耙序列和環(huán)序列的寡核苷酸被合成、退火、并構(gòu)建到pRNAT-U6.1/NeosiRNA表達(dá)載體中，該載體具有cGFP基因和驅(qū)動(dòng)siRNA表達(dá)的U6啟動(dòng)子(Genescript,Piscataway，NJ)。C3和Caspase3基因的體外沉默使用lipofectamine2000(Invitrogen)將L929細(xì)胞用C3siRNA或Caspase3siRNA轉(zhuǎn)染。單獨(dú)的載體和混雜的(無義的)siRNA被用作陰性對(duì)照。簡(jiǎn)單來說，將細(xì)胞鋪在12孔板中(每個(gè)孔2xl()S個(gè)細(xì)胞)，使其生長過夜，達(dá)到90%匯合。將細(xì)胞用2ngC3siRNA、Caspase3siRNA或陰性對(duì)照siRNA質(zhì)粒在減少血清的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染5小時(shí)，然后在完全培養(yǎng)基中孵育24小時(shí)。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)從被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中提取RNA。腎臟I/R損傷模型6-8周齡的CDl小鼠通過腹膜內(nèi)注射氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(20mg/kg)進(jìn)行麻醉，并置于加熱的墊子上以便在手術(shù)中維持它們的體溫。在腹部切開之后，鈍性分離腎蒂，將微血管鉗(RobozSurgicalInstrument,Washington,DC)放置在左腎蒂上25分鐘。在該過程中，動(dòng)物用溫暖的鹽水保持水分并在恒定的溫度下(37°C)。在缺血25分鐘后取下鉗子。將右腎切除。腎功能的評(píng)估在缺血后24小時(shí)，從下腔靜脈獲得血液樣品。由倫敦衛(wèi)生科學(xué)中心(LondonHealthSciencesCentre)的中心實(shí)驗(yàn)室測(cè)定血清肌酐水平和血尿素氮(BUN)，以監(jiān)測(cè)腎功能。組織學(xué)檢測(cè)在缺血24小時(shí)后，從小鼠切下腎臟，將組織切片固定在10%福爾馬林中，然后使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行處理，用于組織學(xué)檢査。福爾馬林組織被包埋在石蠟中，用H&E對(duì)5nm的切片進(jìn)行染色。這些切片由病理學(xué)家以盲法模式進(jìn)行檢査。檢査了皮質(zhì)和髓質(zhì)中的組織學(xué)變化。通過逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR和定量PCR測(cè)量腎臟C3和Caspase3的mRNA水平使用Trizol(Invitrogen)從腎臟和細(xì)胞中提取總RNA。使用寡-dT引物和逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)對(duì)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。用于擴(kuò)增鼠的C3、Caspase3禾卩GAPDH的引物如下C3，5'-CCCTgCCCCTTACCCCTTCATTC-3'(正向)禾口5'-CGTACTTGTGCCCCTCCTTATCTG-3'(反向)；Caspase3，5'-CGGGGTACGGAGCTGGACTGT-3'(正向)和5'-AATTCCGTTGCCACCTTCCTGTT-3'(反向)；以及GAPDH，5'陽tgatgacatcaagaaggtggtgaa-3'(正向)禾口5'-tgggatggaaattgtgagggagat-3'(反向)。PCR反應(yīng)在下述條件下進(jìn)行95°C30秒，58°C30秒，然后72°C30秒(30個(gè)循環(huán))。實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)使用SYBRGreenPCRMaster混合物(Stratagene)和100nM與RT-PCR序列相同的基因特異性的正向和反向引物進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件是95°C10分鐘，95°C30秒，58°C1分鐘和72°C30秒(40個(gè)循環(huán))。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)被表示為平均值士SEM。組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較使用Student'st檢驗(yàn)進(jìn)行。統(tǒng)計(jì)學(xué)重要性被定義為p<0.05。使用的一般性方法(圖21-24)Caspase-3禾卩caspase-8siRNA的設(shè)計(jì)選擇caspase-3基因和caspase-8基因的靶序列。合成含有特異性針對(duì)caspase-3序列的寡核苷酸(有義TCTATCTGGACAGTAGTTTTTTTTCCAAA-3'5'-AGCTTTTGGAAAAAAA反義TAGTTGG-3')禾卩caspase-8(GATCCGACCTTTAAGGAGCTTCATTTCAAGAGAATGAAGCTCCTTAAAGGTCTTTTTTGGAAA-3'，反義5'-AGCTTTTCCAAAAAAGCG-3')，并進(jìn)行退火。通過將退火的DNA寡核苷酸對(duì)插入到用BamHI禾口HindIII(Genescript，Piscataway,NJ)消化的pRNAT-U6.1/NeosiRNA表達(dá)載體中，構(gòu)建在小鼠U6啟動(dòng)子和cGFP基因控制下表達(dá)發(fā)夾siRNA的Caspase-3siRNA禾Bcaspase-8siRNA載體。caspase-3禾Pcaspase-8基因的體外沉默使用lipofectamine2000將L929細(xì)胞用caspase-3/8siRNA轉(zhuǎn)染。單獨(dú)的載體和混雜的(無義的)siRNA被用作陰性對(duì)照。簡(jiǎn)單來說，將細(xì)胞鋪在24孔板中(每個(gè)孔lxl()S個(gè)細(xì)胞)，使其生長過夜，達(dá)到90%匯合。將細(xì)胞用2嗎caspase-3/8siRNA或陰性對(duì)照siRNA質(zhì)粒在減少血清的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染5小時(shí)，然后在完全培養(yǎng)基中孵育24小時(shí)。制備總RNA用于隨后的分析。RelBSiRNA的制備RelBsiRNA寡聚物由Welgen，Inc合成。通過限制性位點(diǎn)將siRNA克隆到pQuiet載體中。RdB基因的體外沉默使用lipofectamine2000(Invitrogen)將L929細(xì)胞用RelBsiRNA轉(zhuǎn)染。單獨(dú)的載體和混雜的(無義的)siRNA被用作陰性對(duì)照。簡(jiǎn)單來說，在培養(yǎng)24小時(shí)后使用TRIzol提取RNA用于逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)。用于體內(nèi)研究的動(dòng)物CD1小鼠從TheJackson實(shí)驗(yàn)室(BarHarbor,ME)購買。將小鼠維持在特定的無病原條件下。所有的小鼠都是雄性的，6到10周齡。所有的試驗(yàn)都按照動(dòng)物委員會(huì)指南的護(hù)理和使用指導(dǎo)(GuidefortheCareandUseofonAnimalsCommitteeGuidelines)進(jìn)行。SiRNA注射在腎臟IRI前48小時(shí)，將siRNAs(50溶于1mlPBS中)或1mlPBS快速注射(在IO秒鐘內(nèi))到一條尾部靜脈中。為了使尾靜脈膨脹，將尾巴浸泡在溫水中或用燈加熱。腎臟IRI模型稱重25-27g的小鼠通過腹膜內(nèi)注射氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)進(jìn)行麻醉，并置于加熱的墊子上以在手術(shù)中維持它們的體溫。腹部切開之后，鈍性分離腎蒂，將微血管鉗(RobozSurgicalInstrument,Washington,DC)放置在左腎蒂上25分鐘。在該過程中動(dòng)物用溫暖的鹽水良好保持水分并在恒定的溫度下(37°C)。選擇缺血的時(shí)間為25分鐘，以獲得具有最小的血管血栓形成的可逆的缺血ARF模型，以避免動(dòng)物死亡。在取下鉗子后，觀察左腎1分鐘以看到指示血液重新流動(dòng)的顏色變化，然后切下對(duì)側(cè)腎臟。然后將切口縫合，使動(dòng)物恢復(fù)，允許自由進(jìn)食和進(jìn)水。在再灌注后24小時(shí)從下腔靜脈收集血液，并獲取左腎用于分析。對(duì)于存活觀察實(shí)驗(yàn)來說，按照同樣的方式進(jìn)行手術(shù)，只是缺血(鉗住)的時(shí)間是35分鐘。腎功能的評(píng)估在(缺血前)和缺血后24小時(shí)后從下腔靜脈獲得血液樣品。由倫敦衛(wèi)生科學(xué)中心(LondonHealthSciencesCenter)的中心實(shí)驗(yàn)室使用SYNCHRONLX系統(tǒng)(BeckmanCoulter,Inc.)測(cè)定血尿素氮(BUN)和血清肌酐(Cr)水平。通過定量實(shí)時(shí)PCR測(cè)量腎臟RelBmRNA水平使用TRIzol(LifeTechnologies,Gaithersburg，MD)從細(xì)胞或腎臟分離總RNA。用于RelBRT-PCR的引物是有義CCCCTACAATGCTGGCTCCCTGAA，反義CACGGCCCGCTCTCCTTGTTGATT。使用eppendorf循環(huán)儀(Mastercyclergradient)進(jìn)行RT-PCR。所有的反應(yīng)都是在50pl反應(yīng)體積中按照制造商的說明進(jìn)行的。PCR參數(shù)的組成為在42"C逆轉(zhuǎn)錄50分鐘，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR:94°C30秒，58°C30秒和72'C30秒。在100伏下運(yùn)行凝膠電泳，然后在紫外燈下觀察結(jié)果。樣品還進(jìn)行基因表達(dá)的實(shí)時(shí)PCR。腎臟形態(tài)學(xué)變化的評(píng)估在缺血后24小時(shí)，從小鼠切下腎臟，將組織切片固定在10%福爾馬林中，并使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行處理以用于組織學(xué)檢査。福爾馬林組織被包埋在石蠟中，用H&E對(duì)5nm的切片進(jìn)行染色。這些切片由病理學(xué)家以盲法模式檢查。使用設(shè)計(jì)用于評(píng)估梗死、管狀空泡形成和管型形成程度的半定量尺度，在根據(jù)涉及的傷口面積的5點(diǎn)尺度上，為皮質(zhì)和髓質(zhì)中組織學(xué)變化的百分?jǐn)?shù)打分，如下0，正常腎臟；0.5，<10%;1，10-25%;2，25-50%;3，50-75%;和4，75-100%。病理學(xué)家通過對(duì)5個(gè)視野中的每個(gè)高倍視野(x400)中嗜中性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后將嗜中性細(xì)胞的數(shù)量平均，來定量評(píng)估嗜中性細(xì)胞浸潤。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)比較使用雙側(cè)Student'st檢驗(yàn)進(jìn)行。存活率通過Kaplan-Meier檢驗(yàn)進(jìn)行分析。使用的一般性方法(圖25-29)動(dòng)物稱重25-27g的6周齡的雄性CD1(CharlesRiver)小鼠在使用前被飼養(yǎng)在我們大學(xué)的實(shí)驗(yàn)室中。所有的步驟都按照動(dòng)物委員會(huì)的護(hù)理和使用指南(GuidefortheCareandUseonAnimalCommittee)所設(shè)定的準(zhǔn)則進(jìn)行。細(xì)胞系細(xì)胞lL929和巨噬細(xì)胞被用在我們的實(shí)驗(yàn)中，用于檢測(cè)siRNA的沉默效能。為了分析siRNA的沉默效能，我們通過使用Lipofectamine2000(Invitrogen)將siRNA轉(zhuǎn)染到L929細(xì)胞蓋中，然后用tTRIzol提取RNA用于逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)。SiRNA的制備和注射TNFasiRNA由公司(Invitrogen)合成。將該TNFasiRNA構(gòu)建到pSilence載體或pRNATU6.1載體中。對(duì)于流體動(dòng)力學(xué)注射來說，將siRNA(50|ig溶于1mlPBS)或1mlPBS快速注射(在10秒鐘內(nèi))到一條尾部靜脈中。為了使尾靜脈膨脹，將尾巴浸泡在溫水中或用燈加熱。缺血方案小鼠(25-27g)通過腹膜內(nèi)施用氯胺酮/甲苯噻嗪(100mg/kg和10g/kg)進(jìn)行麻醉。通過在動(dòng)物的下面放置暖墊使其體溫保持恒定。使用腹中線切開術(shù)，使用微動(dòng)脈瘤鉗(InternationalFineSciencceTools,Inc.CA)將左腎臟動(dòng)脈和靜脈阻斷25或35分鐘，同時(shí)取下右腎。阻斷后，將0.5ml預(yù)溫?zé)?37°C)的鹽水放置在腹腔中，將腹部關(guān)閉。在取下鉗子后，再觀察腎臟1分鐘以看到指示血液重新流動(dòng)的顏色變化?？p合后，將被切口的小鼠放回籠子中。假處理小鼠經(jīng)過同樣的手術(shù)程序，只是不使用微動(dòng)脈瘤鉗。在24小時(shí)時(shí)將小鼠處死，通過下腔靜脈收集血液樣品。對(duì)于存活實(shí)驗(yàn)來說，在所有存活的動(dòng)物沒有生病的跡象之后對(duì)動(dòng)物觀察幾天。腎功能的評(píng)估由我們的中心實(shí)驗(yàn)室使用SYNCHRONLX系統(tǒng)(BeckmanCoulter,Inc.)測(cè)量血清中的血尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)。RT-PCR使用TRIzol(LifeTechnologies,Gaithersburg，MD)從細(xì)胞或腎臟分離總RNA。使用eppendorf循環(huán)儀(Mastercycler梯度)進(jìn)行RT-PCR。所有的反應(yīng)都是在50反應(yīng)體積中按照制造商的說明進(jìn)行的。PCR參數(shù)的組成為在42"C的逆轉(zhuǎn)錄50分鐘，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR:94°C30秒，58°C30秒和72。C30秒。在100伏下進(jìn)行凝膠電泳，然后在紫外燈下觀察結(jié)果。腎臟形態(tài)學(xué)變化的評(píng)估從小鼠手術(shù)切下之后，腎臟被冠狀切片，固定在10%甲醛中，并包埋在石蠟中。用H&E對(duì)切片(5pm)進(jìn)行染色。在顯微鏡下對(duì)一個(gè)全深度的冠狀切片進(jìn)行檢查。使用5點(diǎn)尺度對(duì)皮質(zhì)髓質(zhì)交界處損傷的腎小管的百分?jǐn)?shù)進(jìn)行估計(jì)。RelB免疫組織化學(xué)在脫去石蠟并重新水化后，將腎臟的石蠟切片用3%的過氧化氫孵育15分鐘以猝滅內(nèi)源的過氧化物酶活性。在微波20分鐘后，將切片在含有5%正常小鼠血清的清洗緩沖液中封閉30分鐘。將切片與用PBSl:lOO稀釋的倉鼠抗小鼠FasmAb(BDPharmingen)在室溫孵育1小時(shí)。在用PBS清洗后，將切片與生物素化的小鼠抗倉鼠Ig、然后與結(jié)合了辣根過氧化物酶的鏈親和素(LSAB檢測(cè)試劑盒，DAKO)孵育。在PBS中進(jìn)一步清洗后，染色用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯影，然后將載玻片用蘇木精輕微復(fù)染。對(duì)照玻片用倉鼠IgG代替第一抗體進(jìn)行染色。在單個(gè)腎小管中，F(xiàn)as免疫染色出現(xiàn)在所有上皮細(xì)胞中或完全不出現(xiàn)。盲法評(píng)價(jià)連續(xù)5個(gè)觀察視野(放大x200)中陽性腎小管的百分?jǐn)?shù)。組織學(xué)計(jì)分在腎臟缺血后取出腎臟，在10%福爾馬林中固定，用于組織學(xué)檢查。將組織包埋在石蠟中，用H&E對(duì)切片進(jìn)行染色。從盲法分析計(jì)算出平均值，使用分值O，無損傷；0.5，<10%;1，10-25%;2，25-50%;3，50-75%;以及4，75-100%。通過對(duì)5個(gè)視野(x400)中嗜中性細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)來評(píng)估嗜中性細(xì)胞浸潤。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)比較使用雙側(cè)Student'st檢驗(yàn)進(jìn)行。存活率通過Kaplan-Meier檢驗(yàn)進(jìn)行分析。用于TNF-a的一般性方案被relBsiRNA沉默的TNF-a基因?yàn)榱擞^察體外基因沉默的結(jié)果，用載體relBsiRNA轉(zhuǎn)染L929細(xì)胞。24小時(shí)后收集細(xì)胞并制備RNA。通過RT-PCR測(cè)定，relBmRNA在L929中的表達(dá)降低了。接下來測(cè)定了在缺血再灌注損傷后，注射TNF-asiRNA是否能夠沉默被上調(diào)的TNF-a表達(dá)。首先觀察IRI后TNF-a的表達(dá)。在IRI后24小時(shí)和48小時(shí)，TNF-a的表達(dá)增加了，在腎臟中最高表達(dá)是在48小時(shí)時(shí)。然后通過單次流體動(dòng)力學(xué)注射將載體siRNA(50fig)投送到尾靜脈中。在24小時(shí)和48小時(shí)后，取出腎臟并制成勻漿液。制備RNA和cDNA，并進(jìn)行RT-PCR。結(jié)果顯示在用siRNA處理后reffi的表達(dá)降低了。siRNA處理改善了腎功能基因沉默的結(jié)果表明siRNA能夠阻斷NF-KB途徑。證實(shí)了TNFa能夠防止腎臟在缺血后的損傷。BUN和肌酐由我們的中心實(shí)驗(yàn)室測(cè)量。在夾住25分鐘后，BUN和肌酐的水平與未處理的對(duì)照小鼠相比明顯增加了。如果與陽性對(duì)照組相比，BUN水平降低了30%。但是肌酐含量顯著降低了。形態(tài)學(xué)變化接下來觀察了腎臟的病理學(xué)變化。腎臟病理學(xué)通過H&E(蘇木精)染色來確定，其在缺血的腎臟中隨著TNFot表達(dá)的沉默而明顯降低了。由于腎臟中TNFa的表達(dá)和缺血損傷被抑制的情況，小鼠的死亡率得到了改善。接下來證明了TNFasiRNA在小鼠中能夠提供嚴(yán)重缺血的保護(hù)，在嚴(yán)重缺血中左腎蒂被鉗住35分鐘，并且對(duì)側(cè)腎臟被移除。在鉗住之前48小時(shí)，通過流體動(dòng)力學(xué)尾靜脈注射向小鼠注射了鹽水、載體siRNA和TNFa.siRNA。11只通過流體動(dòng)力學(xué)尾靜脈注射接受鹽水的小鼠中的10只在5天內(nèi)死于急性腎衰竭。但是，10只用TNFgsiRNA注射的小鼠中的8只存活了(對(duì)照空載體P<0.01，對(duì)照鹽水PO.01)。實(shí)施例(圖1-16)實(shí)施例1如上所述，將CD1小鼠的左腎靜脈和動(dòng)脈在37t:鉗住25分鐘。在再灌注24或48小時(shí)后取出被處理的腎臟。時(shí)間點(diǎn)是從鉗住時(shí)計(jì)算的。從用TRIzol試劑(GibcoBRL)按照制造商的說明分離的IDO-沉默的、無義siRNA沉默的或假轉(zhuǎn)染的B16F10細(xì)胞中提取總RNA。通過RT-PCR測(cè)定RelB基因的表達(dá)。使用RNAPCR試劑盒(GibcoBRL)，用提供的寡d(T)16引物來合成第一鏈cDNA。1(imol逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物用于后面的PCR反應(yīng)。用于RelB的引物位于RelB-siRNA靶序列兩側(cè)，并使用了GAPDH(內(nèi)部陰性對(duì)照)引物。使用的PCR條件如下94°C30秒，58°C30秒，以及72°C30秒(30個(gè)循環(huán))。使用凝膠電泳在1.5。/。瓊脂糖凝膠中通過用溴化乙錠染色使PCR產(chǎn)物可見(Hill,J.A.,Ichim,T.E.,Kusznieruk,K.P.，Li,M.，H腿g,X"Yan,X.，Zhong，R.，Cairns,E.，Bell,D.A.，禾口Min，W.P.2003.ImmunemodulationbysilencingIL-12productionindendriticcellsusingsmallinterferingRNA.(在樹突狀細(xì)胞中通過使用小干擾RNA沉默IL-12的產(chǎn)生來進(jìn)行免疫調(diào)節(jié))JImmunol171:691-696)。正如在圖1中看到的那樣，在腎臟缺血后RelB的表達(dá)增加了。實(shí)施例2按照實(shí)施例1中的描述對(duì)CD1小鼠進(jìn)行處理，在再灌注O、2、12和24小時(shí)后，通過RT-PCR測(cè)定被處理的腎臟中Fas基因的表達(dá)。如在圖2中看到的那樣，F(xiàn)as的表達(dá)在缺血后增加了。實(shí)施例3按照實(shí)施例1中的描述對(duì)CD1小鼠進(jìn)行處理，在再灌注0、2、12、24或48小時(shí)后測(cè)定被處理的腎臟中caspase8基因的表達(dá)。如在圖3中看到的那樣，caspase8的表達(dá)在缺血后增加了。實(shí)施例4按照實(shí)施例1中的描述對(duì)CD1小鼠進(jìn)行處理，并測(cè)定了caspase3和GAPDH基因的表達(dá)。圖4顯示了在再灌注后0、2和24小時(shí)時(shí)caspase3:GAPDH表達(dá)的比率。實(shí)施例5按照實(shí)施例1中的描述對(duì)CD1小鼠進(jìn)行處理，在再灌注24和48小時(shí)后測(cè)定被處理的腎臟中C3基因的表達(dá)。圖5顯示了C3基因的表達(dá)在缺血后增加了。實(shí)施例6按照實(shí)施例1中的描述對(duì)CD1小鼠進(jìn)行處理，在再灌注24和48小時(shí)后測(cè)定被處理的腎臟中C5aR基因的表達(dá)。圖6顯示C5aR的表達(dá)在缺血后增加了。實(shí)施例7圖7顯示了在巨噬細(xì)胞系中Caspase3基因的體外沉默。簡(jiǎn)單來說，將細(xì)胞鋪在12孔板中(每個(gè)孔2xl()S個(gè)細(xì)胞)，使其在l或2ml不含抗生素的完全培養(yǎng)基中生長過夜。將4嗎含有Caspase3-siRNA的質(zhì)粒與10(ilLipofectamine2000試劑在250|il最適的減少血清的培養(yǎng)基中(Invitrogen)在室溫孵育20分鐘。然后將混合物加到生長到90%-95%匯合的細(xì)胞培養(yǎng)物中。孵育4小時(shí)后加入等體積的補(bǔ)充有20%FCS的RPMI1640。24到48小時(shí)后，收獲轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，通過RT-PCR檢測(cè)Caspase基因的表達(dá)。(M0=巨噬細(xì)胞)實(shí)施例8將實(shí)施例7中的巨噬細(xì)胞按照實(shí)施例7中的描述用表達(dá)caspase8-siRNA的載體轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，提取總RNA,通過RT-PCR測(cè)定caspase8基因的表達(dá)。1、2、3和4代表了不同的siRNA。圖8顯示了在處理過的細(xì)胞中caspase8的表達(dá)降低了。實(shí)施例9將實(shí)施例7中的巨噬細(xì)胞按照實(shí)施例7中描述的方法用RelBcDNA和RelB-siRNA共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，提取總RNA，通過RT-PCR測(cè)定RelB基因的表達(dá)。siRNA池是幾種靶向同樣基因但是不同位點(diǎn)的siRNA的混合物，并且siRNA載體是含有SEC序列或在本申請(qǐng)中描述的發(fā)夾siRNA序列的載體。所有的泳道都是DC細(xì)胞。如在圖9中所見，RelB的表達(dá)被siRNA池和siRNA載體降低了。實(shí)施例10如上所述用Fas-siRNA在表達(dá)Fas-siRNA的載體中轉(zhuǎn)染表達(dá)Fas的巨噬細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，提取蛋白，通過Western印跡測(cè)定Fas的表達(dá)。如在圖10中所見，在Fas-siRNA處理的細(xì)胞中蛋白的水平降低了。siRNA1、3、4和5是耙想Fas基因的不同siRNA序列。實(shí)施例11將50ng特異性針對(duì)caspase3基因的siRNA靜脈內(nèi)注射到CD1小鼠中。然后按照實(shí)施例1中的描述鉗住左腎靜脈和動(dòng)脈。在注射siRNA后48小時(shí)，獲取左腎，提取總RNA，通過RT-PCR測(cè)定caspase3的表達(dá)。實(shí)施例12按照實(shí)施例11中的描述處理CD1小鼠，除了注射特異性針對(duì)Fas基因的siRNA外。圖12顯示了在siRNA處理后Fas基因的表達(dá)降低了。從左到右為對(duì)照1-3和小鼠1-5。實(shí)施例13CD1小鼠靜脈注射特異性針對(duì)TNFa和/或RelB基因的siRNA(組合中每種siRNA各50ng)，然后按照實(shí)施例1中的描述進(jìn)行左腎缺血。通過在再灌注后24小時(shí)測(cè)量血肌酐和BUN水平來確定腎功能。圖13顯示，當(dāng)使用同時(shí)針對(duì)TNFoc和RelB基因的siRNA時(shí)，缺血后的腎功能被保護(hù)為接近正常。實(shí)施例14CD1小鼠靜脈注射特異性針對(duì)凋亡基因caspase3、caspase8和Fas的siRNA，或分別或組合，并按照實(shí)施例1中的描述進(jìn)行左腎缺血。在再灌注后24小時(shí)確定腎功能。如圖14中所見，單獨(dú)沉默caspase3或caspase8保護(hù)了缺血后的腎功能。最有效的是使用靶向caspase3、caspase8禾口Fas的siRNA的混合物。實(shí)施例15按照實(shí)施例13中的描述處理CD1小鼠，不同之處在于使用下列的siRNA組合組合1:caspase3、caspase8禾口Fas;組合2:TNFa禾卩RelB;組合3:C3和C5aR;組合4(S-mix):所有的混合物l、2和3的siRNA。圖15顯示了所有的siRNA組合對(duì)缺血后腎功能的良好保護(hù)。實(shí)施例16CD1小鼠靜脈注射50)ig特異性針對(duì)caspase3、caspase8、Fas、C3、C5aR、TNFa禾PRelB基因的siRNA混合物或鹽水(對(duì)照)，并通過在37。C下夾住腎靜脈和動(dòng)脈35分鐘使左腎缺血。在再灌注后跟蹤小鼠的存活，結(jié)果顯示在圖16中。所有siRNA處理的小鼠在再灌注后8天仍然存活，而所有的對(duì)照小鼠在再灌注后5天都死亡了。盡管在這里已經(jīng)詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員將會(huì)了解到，可以對(duì)其進(jìn)行改變而不背離本發(fā)明的精神或隨附的權(quán)利要求的范圍。權(quán)利要求1.在離體儲(chǔ)存過程中和體內(nèi)再灌注過程中將細(xì)胞、組織和/或器官維持在存活狀態(tài)的組合物，所述組合物包含特異性針對(duì)其表達(dá)與離體組織或器官的存活力喪失或細(xì)胞損傷有關(guān)的基因的siRNA。2.權(quán)利要求1中的組合物，性基因、補(bǔ)體基因及其組合。3.權(quán)利要求2中的組合物，C3spas68、fas及其組合o4.權(quán)利要求2中的組合物，RelB及其組合。5.權(quán)利要求2中的組合物，其組合。其中所述基因選自凋亡基因、免疫炎其中所述凋亡基因選自Caspase3、其中所述免疫炎性基因選自TNF-a、其中所述補(bǔ)體基因選自C3、C5aR及6.權(quán)利要求2-5任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物包含特異性針對(duì)Caspase3、Caspase8、Fas、C3、C5aR、TNFa禾口RelB的siRNA。7.權(quán)利要求2-5任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物包含特異性針對(duì)caspase3、caspase8禾口Fas的siRNA。8.權(quán)利要求2-5任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物包含特異性針對(duì)TNFa禾卩RelB的siRNA。9.權(quán)利要求2-5任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物包含特異性針對(duì)C3禾PC5aR的siRNA。10.權(quán)利要求i中的組合物，其中所述組合物以大約4t:直到大約37。C的溫度提供。11.權(quán)利要求10中的組合物，其中所述組合物以37'C提供。12.權(quán)利要求1到11任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物還包含可商購的器官儲(chǔ)存溶液。13.權(quán)利要求1到12任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物還包含添加劑，所述添加劑選自自由基清除劑、21-氨基類固醇、抗凋亡劑、鈣通道阻滯劑、分子間粘附分子-1抑制劑、己酮可可堿及其組合。14.權(quán)利要求1到13任一項(xiàng)的組合物，其中所述siRNA的提供量多達(dá)大約100|ug/ml。15.在移植前維持離體組織、細(xì)胞或器官的存活力的方法，所述方法包括將組織、細(xì)胞或器官與特異性針對(duì)其表達(dá)與離體組織、細(xì)胞或器官的存活力喪失或細(xì)胞損傷有關(guān)的基因的至少一種siRNA相接觸，其中所述接觸在高于大約4'C的溫度下進(jìn)行。16.保護(hù)哺乳動(dòng)物的組織、細(xì)胞或器官免于缺血和/或再灌注損傷的方法，包括將組織、細(xì)胞或器官與特異性針對(duì)其表達(dá)與缺血和/或再灌注損傷有關(guān)的基因的至少一種siRNA相接觸。17.權(quán)利要求15或16中的方法，其中siRNA特異性針對(duì)選自凋亡基因、免疫炎性基因、補(bǔ)體基因及其組合的基因。18.權(quán)利要求17中的方法，其中所述凋亡基因選自caspase-3、caspase-8、fas及其組合。19.權(quán)利要求17中的方法，其中所述免疫炎性基因選自TNF-a、RelB及其組合。20.權(quán)利要求17中的方法，其中所述補(bǔ)體基因選自C3、C5aR及其組合。21.權(quán)利要求18到20任一項(xiàng)的方法，其中所用的siRNA基因是Caspase3、Caspase8、Fas、C3、C5aR、TNF-a和RelB。22.權(quán)利要求17到21任一項(xiàng)的方法，其中所述組合物包含特異性針對(duì)caspase3、caspase8禾卩Fas的siRNA。23.權(quán)利要求17到21任一項(xiàng)的方法，其中所述組合物包含特異性針對(duì)TNFa禾BRelB的siRNA。24.權(quán)利要求17到21任一項(xiàng)的方法，其中所述組合物包含特異性針對(duì)C3和C5aR的siRNA。25.權(quán)利要求15到24任一項(xiàng)的方法，其中所述siRNA的提供量為每種所述siRNA多達(dá)大約100(ig/ml。26.將細(xì)胞、組織或器官儲(chǔ)存在存活狀態(tài)的方法，所述方法包括i)將要儲(chǔ)存的細(xì)胞、組織或器官與包含特異性針對(duì)其表達(dá)與存活力喪失或細(xì)胞損傷有關(guān)的基因的至少一種siRNA相接觸；以及ii)在從大約低于環(huán)境直到大約37'C的溫度下維持所述細(xì)胞、組織或器官與溶液的接觸。27.權(quán)利要求26中的方法，其中使用siRNA的組合。28.權(quán)利要求26或27中的方法，其中所述基因選自凋亡基因、免疫炎性基因、補(bǔ)體基因及其組合。29.權(quán)利要求28中的方法，其中所述凋亡基因選自caspase-3、caspase-8、fas及其組合。30.權(quán)利要求28中的方法，其中所述免疫炎性基因選自TNF-a、RelB及其組合。31.權(quán)利要求28中的方法，其中所述補(bǔ)體基因選自C3、C5aR及其組合。32.權(quán)利要求28到31任一項(xiàng)的方法，其中所用的siRNA基因是Caspase3、Caspase8、Fas、C3、C5aR、TNF-a和RelB。33.權(quán)利要求28到32任一項(xiàng)的方法，其中所述組合物包含特異性針對(duì)caspase3、caspase8禾卩Fas的siRNA。34.權(quán)利要求28到32任一項(xiàng)的方法，其中所述組合物包含特異性針對(duì)TNFa禾卩RelB的siRNA。35.權(quán)利要求28到32任一項(xiàng)的方法，其中所述組合物包含特異性針對(duì)C3和C5aR的siRNA。36.權(quán)利要求15到35任一項(xiàng)的方法，其中所述siRNA的提供量為每種所述siRNA多達(dá)大約100ng/ml。37.權(quán)利要求15到36任一項(xiàng)的方法，其中所述方法在高達(dá)大約37'C的溫度下進(jìn)行。38.權(quán)利要求15到37任一項(xiàng)的方法，其中所述組合物還包含可商購的器官儲(chǔ)存溶液。39.權(quán)利要求15到38任一項(xiàng)的方法，其中所述組合物還包含添加劑，所述添加劑選自自由基清除劑、21-氨基類固醇、抗凋亡劑、鈣通道阻滯劑、分子間粘附分子-1抑制劑、己酮可可堿及其組合。40.使用權(quán)利要求1中的組合物制備的離體改變的細(xì)胞、組織或器官，其中所述改變的細(xì)胞、組織或器官包含被靶向以沉默一種或多種凋亡基因、免疫炎性基因和補(bǔ)體基因的表達(dá)的siRNA的組合。41.權(quán)利要求40中的細(xì)胞、組織和/或器官，其中所述凋亡基因選自caspase-3、caspase-8、fas及其組合。42.權(quán)利要求40中的細(xì)胞、組織和/或器官，其中所述免疫炎性基因選自TNF-ot、RelB及其組合。43.權(quán)利要求40中的細(xì)胞、組織和/或器官，其中所述補(bǔ)體基因選自C3、C5aR及其組合。44.權(quán)利要求40中的細(xì)胞、組織和/或器官，其中所述siRNA基因是Caspase3、Caspase8、Fas、C3、C5aR、TNF-a禾BRelB。45.權(quán)利要求40到44任一項(xiàng)的細(xì)胞、組織和/或器官，其中所述基因包含特異性針對(duì)caspase3、caspase8和Fas的siRNA。46.權(quán)利要求40到44任一項(xiàng)的細(xì)胞、組織和/或器官，其中所述基因包含特異性針對(duì)TNFa禾nRelB的siRNA。47.權(quán)利要求40到44任一項(xiàng)的細(xì)胞、組織和/或器官，其中所述基因包含特異性針對(duì)C3和C5aR的siRNA。48.權(quán)利要求15、16或26中的方法，其中所述器官選自心臟、肺臟、腎臟、肝臟和胰臟。49.權(quán)利要求48中的方法，其中所述器官是腎臟。50.權(quán)利要求1中的組合物，其中所述細(xì)胞、組織和/或器官選自心臟、肺臟、腎臟、肝臟和胰臟。全文摘要本發(fā)明涉及使用包含siRNAs的儲(chǔ)存/再灌注溶液對(duì)器官、組織和細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)，所述siRNAs特異性針對(duì)其表達(dá)與存活力喪失或細(xì)胞損傷有關(guān)的基因。在儲(chǔ)存/再灌注溶液中存在siRNAs最小化和/或防止了器官、組織和細(xì)胞的損傷，從而使得器官、組織和細(xì)胞可以用于體內(nèi)移植。本發(fā)明也一般性涉及了使用儲(chǔ)存/再灌注溶液將器官、組織和細(xì)胞維持在存活狀態(tài)的方法。文檔編號(hào)A61P37/02GK101341246SQ200680043316公開日2009年1月7日申請(qǐng)日期2006年9月20日優(yōu)先權(quán)日2005年9月20日發(fā)明者閔衛(wèi)平申請(qǐng)人:倫敦健康科學(xué)中心研究公司