專利名稱：活體組織片及其制作方法、以及應用該片的移植方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及活體組織片。具體來講，本發(fā)明涉及活體組織片及其制作方法以及該片的利用(移植方法等)，所述活體組織片不使用來自于異種動物的細胞作為飼養(yǎng)細胞，而是將來自于角結(jié)膜上皮細胞、皮膚表皮細胞、毛囊上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、氣管粘膜上皮細胞或腸粘膜上皮細胞等活體細胞在羊膜上培養(yǎng)而使其增殖來制作的。
背景技術(shù)：
皮膚是被覆機體最外層的器官，是使機體免受外界損害的屏障。皮膚由表皮、真皮及皮下組織構(gòu)成，表皮主要含有角化細胞，其中混有少量的色素細胞和郎格罕細胞等。構(gòu)成表皮的細胞主要是角化細胞，其包括(1)處于最外層的、核消失了的角質(zhì)細胞，(2)其下層由有核的細胞(顆粒細胞、棘細胞、基底細胞)。接著在最下層的基底細胞和真皮之間存在表皮基底膜?；讓邮且粚蛹毎麑樱潜砥そ腔毎哪讣毎麑?，目前認為只有基底細胞具有分裂能力。
由某些原因缺失了表皮的狀態(tài)就是潰瘍。在表皮的缺損部位，由來自于周邊的角化細胞的增殖以及一部分來自毛囊的角化細胞的增殖來再生表皮，使?jié)兠嫔掀せ?。但是，對于一次性產(chǎn)生大范圍表皮缺損的燙傷和難治性的深度、毛囊欠缺的潰瘍而言，只靠由周邊表皮的再生來上皮化需要很長時間。
基底層的細胞周期約450小時。由分裂產(chǎn)生的子細胞，向棘細胞層移動的同時其形態(tài)和功能發(fā)生變化，接著經(jīng)過顆粒層角化成角質(zhì)層、最終脫落到體外。把直到脫落為止的時間稱為更新時間(turnover time)，認為是47～48天。
在目前公認的表皮的再生模型中，根據(jù)其分裂能力把表皮角化細胞分為干細胞(stem cell)、過渡放大細胞(transit-amplifying cell)、有絲分裂后細胞(post-mitotic cell)3種。干細胞是具有無限自我再生能力的細胞，經(jīng)分裂產(chǎn)生過渡放大細胞。過渡放大細胞具有一定的分裂能力，分裂后成為過渡放大細胞，但最終失去分裂能力而成為有絲分裂后細胞。
表皮的干細胞具有以下特征(1)干細胞本身的細胞周期長(slowcycling)；(2)根據(jù)部位，存在的地方不同；(3)聚集存在。(4)強烈表達α2β1以及α3β1整合蛋白。但基底細胞中約有40％的細胞強烈表達整合蛋白，推測干細胞實際上約占基底細胞的10％左右。即基底層中不僅有干細胞，也存在過渡放大細胞、有絲分裂后細胞。
當表皮受損傷時，引起增殖刺激，細胞開始旺盛地增殖，開始再生。這時，具有最重要作用的是一系列的上皮細胞生長因子群。上皮細胞生長因子(epidermal growth factor、EGF)家族包括EGF、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor、TGF)-α、肝素結(jié)合性EGF樣增殖因子(heparin binding EGF like growth factor、HB-EGF)、β-動物纖維素(betacellulin)、兩棲調(diào)節(jié)素(amphiregulin)、神經(jīng)生長調(diào)節(jié)因子(neuregulins)，但認為實際上與表皮角化細胞的增殖相關(guān)的是TGF-α、HB-EGF、兩棲調(diào)節(jié)素，這些因子顯示出對表皮角化細胞具有自我增殖的作用。相反，對表皮角化細胞的增殖起抑制作用的因子，已知的有TGF-β、維生素D3、視黃酸(retinoic acid)等。
在再生醫(yī)學的領(lǐng)域中，用于移植人皮膚的真皮、上皮的全層缺損的損傷部位的移植片的開發(fā)不斷發(fā)展。例如，特開平10-277143號公報(專利文獻1)中，記載有用于治療人皮膚等全層缺損創(chuàng)傷治療的移植片及其制備方法。該文獻中公開的移植片是在人的纖維蛋白片內(nèi)包埋來自于真皮組織的成纖維細胞，并將表皮組織附著于該片的表面而制作的。
以往，對于皮膚缺損的修復，進行移植皮膚全層的全層植皮及移植表皮和真皮上層的分層植皮，但受到取材部位大小的限制。在該點上，培養(yǎng)表皮具有一次只采取小的皮膚片就能獲得數(shù)千倍面積皮膚的優(yōu)點，而且可以凍存，因此可以反復使用，與以往植皮術(shù)相比較，這是最大的優(yōu)點。
表皮片根據(jù)所使用細胞的由來不同而分為自體培養(yǎng)表皮片與異體培養(yǎng)表皮片。自體培養(yǎng)表皮片移植在多數(shù)情況下主要是為了覆蓋表皮缺損部位、使其存活，而異體培養(yǎng)表皮片移植在多數(shù)情況下是為了起到作為生物學的生物敷料(biological dressing)的效果。通過表皮細胞的基礎(chǔ)研究，確定表皮角化細胞產(chǎn)生多種細胞生長因子、細胞因子，從而明確了異體培養(yǎng)表皮片的有效性。
如果建立安全且穩(wěn)定地提供培養(yǎng)表皮的技術(shù)，結(jié)合移植技術(shù)的發(fā)展，則再生醫(yī)療可以實用化，對患者帶來無限的福音?？紤]表皮的再生時，把具有分裂·增殖能力的基底細胞分離、培養(yǎng)，使其大量增殖而再生表皮，從而應用于移植，這可以說非常有道理。可是，基底細胞中不僅僅是干細胞，也含有過渡放大細胞、有絲分裂后細胞，為了更高效地制備良好的培養(yǎng)皮膚，希望建立選擇性地培養(yǎng)表皮干細胞的技術(shù)。
以往許多研究者嘗試了表皮細胞培養(yǎng)技術(shù)的研究及開發(fā)，其成果對皮膚生物學領(lǐng)域帶來了很大的益處。具體來講，通過使用培養(yǎng)的角化細胞，不斷迅速闡明表皮細胞的特性、表皮的再生、分化、增殖機制。另外，采取患者的小皮膚片，把角化細胞傳代培養(yǎng)，使其大量增殖成為可能，并且能凍存，因此，培養(yǎng)皮膚不斷被應用于大面積燙傷、難治性潰瘍等的治療中。
與皮膚并列可以期待著對再生醫(yī)療貢獻的另一個組織是角膜。角膜位于構(gòu)成眼球光學系的最外層，是沒有血管的透明組織，與淚液共同形成平滑的表面，由此在獲得良好的視力中起作用。并且角結(jié)膜上皮細胞通常與外界接觸，具有保護眼球使之免受外界微生物等的異物、紫外線等的光線的損害的防御作用。即角結(jié)膜上皮細胞對角膜透明性和保護整個眼球并維持恒常性具有重要的作用。
角膜有時由于例如角膜炎、角膜潰瘍、穿孔等的病態(tài)而混濁、失去透明性。對于這樣的角膜混濁引起的永久的視力降低，進行用眼球提供者所提供的角膜進行角膜移植的治療。角膜移植是取除患者的失去透明性的角膜后移植透明的角膜，通過該移植恢復透明性，能再次恢復視力。
通過這樣的角膜移植有時可以期待著有效的治療效果，然而也存在著只通過角膜移植不能治療的疾病。例如史蒂芬強森綜合癥、眼類天皰瘡、化學外傷、燙傷等。通常，角結(jié)膜上皮細胞是每天反復分裂，衰老的細胞脫落，并由干細胞組織再生新的細胞。然而，已知在如上病態(tài)中，再生角膜的干細胞組織存在障礙。
再生角膜上皮的干細胞組織被稱為“角膜緣部組織”，正好局限于虹膜和鞏膜的交界部位，位于裸露于外界的特殊環(huán)境。上述的病態(tài)時，認為該干細胞組織本身由于受到某些損害而完全沒有了。而后，由于該干細胞組織的滅絕，其缺損部分由周邊存在的結(jié)膜上皮所覆蓋，透明性欠缺而造成視力的極度下降。這樣，在如上病情時因角膜緣部枯竭，因此只靠單純的角膜移植不能長期維持被移植的角膜。因此，為再建持久的眼表面，有必要移植角膜緣部。作為移植該角膜緣部的一種方法，開發(fā)了羊膜移植法(MEDICAL朝日1999年9月號p62～65、N Engl JMed 3401697～1703、1999非專利文獻1)。該移植法所使用的羊膜是由剖腹產(chǎn)產(chǎn)婦等的胎盤獲得。羊膜因具有厚的基底膜，因此被移植時作為用于角結(jié)膜上皮細胞增殖、分化的基質(zhì)而起作用。而且，羊膜幾乎沒有免疫原性，同時具有抗炎癥、瘢痕形成抑制等的作用，因此被移植到羊膜上的角結(jié)膜上皮及它們的干細胞組織，可以免遭受者的排斥反應。
專利文獻1特開平10-277143號公報非專利文獻1MEDICAL朝日1999年9月號p62～65、N EnglJ Med 3401697～1703、1999發(fā)明內(nèi)容以往認為表皮角化細胞的培養(yǎng)是很困難的事，但1975年由Rheinwald和Green發(fā)表了小鼠3T3飼養(yǎng)層法，表皮角化細胞的培養(yǎng)首次成為可能。該方法是把小鼠3T3細胞作為飼養(yǎng)層、以及使用胎牛血清而存在批量間的差異等，因而培養(yǎng)絕非容易。到了1980年代，由Hennings和Yuspa指出，一旦降低培養(yǎng)液中的Ca2+濃度，則表皮角化細胞變?yōu)槲捶只癄顟B(tài)，增殖加快。進而，Boyce和Ham開發(fā)了低Ca2+濃度培養(yǎng)基的MCDB153培養(yǎng)基，指出了通過添加牛腦下垂體抽取液的人表皮角化細胞的無血清培養(yǎng)法的可能性。1986年，Pittelkow等應用無血清培養(yǎng)法培養(yǎng)了表皮角化細胞，進一步改為胎牛血清添加高鈣的培養(yǎng)基，由此制作了培養(yǎng)表皮片，移植給燙傷患者，得到了良好效果。現(xiàn)在該無血清培養(yǎng)法是主流，但來自于異種動物的3T3細胞作為飼養(yǎng)層使用。在來自于異種動物的細胞共存情況下培養(yǎng)得到的移植片中，存在著混有來自于異種動物的產(chǎn)物的危險性。因此使用該移植片的移植手術(shù)是異種移植或者被認為是以此為基準的移植，認為倫理、安全上存在大的問題。事實上，在醫(yī)療實際中沒有將異種移植實用化的例子。
培養(yǎng)表皮片移植是用郵票大的皮膚進行傳代培養(yǎng)角化細胞，由此使覆蓋大范圍的創(chuàng)面成為可能。而且由于可以凍存，因此可以應用于必需反復移植的難治性、再發(fā)性皮膚潰瘍的治療中。以往的培養(yǎng)法所制作的培養(yǎng)片，例如，使被移植的培養(yǎng)表皮片很好地存活并非容易的事情。這是由于培養(yǎng)表皮片欠缺基底膜的組成成分，重疊的表皮沒有形成堅固的角化層所致。由Bell開發(fā)的三維培養(yǎng)皮膚有角化層、顆粒層，是目前最接近于皮膚的培養(yǎng)皮膚，但其工藝煩瑣，必需特殊的技術(shù)，在日本仍沒有得到普及。三維培養(yǎng)皮膚在海外對異體移植顯示出有效性，已被商品化。雖然在異體移植中促進上皮化作用已被確認，但不能期待永久地存活。在日本，從確保倫理、安全性的角度考慮，異體移植普及的可能性小，焦點集中在自體移植的改善方面。
另一方面，對角膜被結(jié)膜上皮覆蓋而引起混濁的眼表面疾病的外科治療，目前是進行角膜上皮移植術(shù)，但對伴有嚴重炎癥的難治性角結(jié)膜疾病(史蒂芬強森綜合癥(Stevens-Johnson癥候群)或眼類天皰瘡、角膜腐蝕等)而言，其預后非常不好。其最大的原因可以舉出具有強抗原性的異體(アロ)的角膜上皮被宿主的免疫系統(tǒng)所識別，受到排斥。進而為了予防排斥反應而在手術(shù)后全身以及局部給予大量的免疫抑制劑所引起的并發(fā)癥也是其預后不良的重大因素。另一方面，利用異體的角膜上皮時，存在供體不足的問題。如果有利用一只眼獲得的角膜就可制作數(shù)十個角膜上皮片的技術(shù)，就可以解決供體不足的課題。
本發(fā)明是鑒于以上背景及課題而完成的，其目的在于提供可望有很高的治療效果而且在移植時安全性高的活體組織片。為了達到所述目的，本發(fā)明人等首先嘗試了培養(yǎng)表皮片的制作。具體來講，考慮安全性，培養(yǎng)上皮細胞的時侯，在不使用來自于異種動物的細胞(飼養(yǎng)細胞)的條件下，作為以往的培養(yǎng)表皮片自體移植的發(fā)展，制作三維培養(yǎng)皮膚，對基底膜組成成分、細胞粘著分子、分化抗原，進行免疫組織學以及電子顯顯微鏡的研究。其結(jié)果與以往的培養(yǎng)表皮片相比較，可見到堅固的角化層的形成，細胞粘附分子、分化的標記是與體內(nèi)(vivo)表皮相同，有著充分的表達。對于基底膜構(gòu)成成分而言，半橋粒的形成良好，類天皰瘡抗原、β4整合蛋白的表達充分。
培養(yǎng)表皮片的存活性被其基底膜構(gòu)成成分的形成所左右。即培養(yǎng)表皮片是附著于塑料培養(yǎng)皿的底面培養(yǎng)的，制作片時有必要從培養(yǎng)皿底面剝離。其剝離用分散酶或膠原酶，但基底膜的構(gòu)成成分被這些酶所分解。在至今的報告中，報道有由于分散酶，用蛋白質(zhì)印跡法無法檢出類天皰瘡抗原，在熒光抗體法中用GB3單克隆抗體識別的昆布氨酸5被分解。還報道有膠原酶使錨纖維和IV型、VII型膠原的表達減少，但α6β4整合蛋白不受影響。與此相對，發(fā)現(xiàn)三維培養(yǎng)皮膚保持與體內(nèi)表皮相近的結(jié)構(gòu)，形成了基底膜構(gòu)成成分。本發(fā)明人等的研究也確定β1整合蛋白、β4整合蛋白、類天皰瘡抗原的形成比較良好，電子顯微鏡所見也確認了半橋粒的形成良好。
接著，本發(fā)明人等對于能否用與培養(yǎng)表皮片相同的手法制作可以適用于其它組織的移植材料進行了研究。具體來說，嘗試了角膜上皮片的制作。其結(jié)果為通過在載置于含有成纖維細胞的膠原上的羊膜上培養(yǎng)角膜上皮細胞，而不使用飼養(yǎng)細胞，達到了良好的多層化以及上皮化。
如上所述，本發(fā)明人等完全不使用來自于異種動物的細胞，成功地制作了安全而實用的活體組織片。而且發(fā)現(xiàn)了即使在無血清培養(yǎng)條件下也能制作活體組織片。
進而，本發(fā)明人等在特別優(yōu)選羊膜作為表皮細胞的培養(yǎng)基質(zhì)的假設(shè)前提下進行了各種實驗。首先，使羊膜附著于含有成纖維細胞的膠原上，在其上播種人表皮角化細胞(角質(zhì)化細胞)，觀察人表皮角化細胞向周邊的游走情況時，與在含有成纖維細胞的膠原凝膠上直接播種細胞(對照組)相比較，細胞的游走明顯加快。另一方面，將在載置于含有成纖維細胞的膠原凝膠上的羊膜上培養(yǎng)的人表皮角化細胞和羊膜一起回收，然后，載置到附著于含有成纖維細胞的膠原凝膠上的其他羊膜上，觀察人表皮角化細胞向周邊的游走，與載置于含有成纖維細胞的膠原凝膠上(對照組)相比，游走顯著加快。由這些實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在羊膜上面表皮角化細胞的增殖良好并且良好地發(fā)揮細胞的游走能力。即，明確了羊膜極為優(yōu)選作為表皮角化細胞的培養(yǎng)基質(zhì)。另外，基于該認識，認為如下二種移植技術(shù)是優(yōu)異的表皮再建術(shù)即(1)把在載置于含有成纖維細胞的膠原凝膠上的羊膜上培養(yǎng)的表皮角化細胞與羊膜一起回收，然后，載置在另外的羊膜上，將通過培養(yǎng)而得到的片狀構(gòu)筑物(在羊膜(第1羊膜)的另一面粘著另外的羊膜(第2羊膜)，并且具有以一部分覆蓋第1羊膜而以另一部分覆蓋第2羊膜的細胞層的構(gòu)筑物)移植到表皮缺損部位的方法；以及(2)把在載置于含有成纖維細胞的膠原凝膠上的羊膜上培養(yǎng)的表皮角化細胞與羊膜一起回收，并把其移植到預先移植在表皮缺損部的羊膜上的方法。在此，缺損真皮全層以及直到皮下組織時以保存治療就難以上皮化，因此首先有必要備置移植床。真皮缺損時以往使用人工真皮，有一定程度的治療效果。人工真皮中可見到血管的再生，但在其上移植培養(yǎng)表皮時，發(fā)現(xiàn)由于基底膜的構(gòu)成不充分而引起存活不良。另一方面，如果人工真皮移植與上述的(1)或(2)的移植術(shù)相結(jié)合，則通過具有基底膜構(gòu)成成分的羊膜就可以移植培養(yǎng)表皮，因而可以期待高的存活率。而且，在羊膜上形成了培養(yǎng)表皮的狀態(tài)，因此移植后促進構(gòu)成培養(yǎng)表皮細胞良好地增殖以及向周邊游走，其結(jié)果為培養(yǎng)表皮迅速伸展，取得高的治療效果。因此，即使對達到大范圍直至皮下組織的皮膚缺損，通過人工真皮移植與上述的移植術(shù)相組合的方法，可期待對整容也能確立很好的治療方法。
本發(fā)明是基于以上成果以及見解而完成的，提供如下的構(gòu)成。
即本發(fā)明提供含有在不存在異種動物細胞的情況下，于羊膜上增殖的來自于活體的細胞而成的活體組織片。
本發(fā)明的一種方式是以在含有人成纖維細胞的膠原凝膠上載置有羊膜的狀態(tài)來使來自于活體的細胞增殖，由此實現(xiàn)來自于活體的細胞的增殖率的提高。
使來自于活體的細胞增殖時所用的培養(yǎng)基可以用(1)無血清培養(yǎng)基，或者(2)作為血清成分只含有來自于受者的血清的培養(yǎng)基。
來自于活體的細胞優(yōu)選是來自于角膜上皮、結(jié)膜上皮、皮膚表皮、毛囊上皮、口腔粘膜、氣管粘膜或者腸管粘膜的細胞。
作為培養(yǎng)基質(zhì)的羊膜優(yōu)選使用去除上皮的羊膜。
本發(fā)明的另一種方式是除了增殖的細胞之外，還含有作為培養(yǎng)基質(zhì)的羊膜，從而構(gòu)成活體組織片。
本發(fā)明的活體組織片是例如直接，或者與作為培養(yǎng)基質(zhì)而使用的羊膜一起通過另外的羊膜來移植到組織缺損部的。后一種情況典型的是，對組織缺損部移植羊膜(第2羊膜，即與制作活體組織片時使用的羊膜不同的另一羊膜)之后，在該羊膜上移植活體組織片。
本發(fā)明另一種方式的活體組織片，其特征為，含有如下細胞即，把在不存在異種動物細胞的情況下、在載置于含有人成纖維細胞的膠原凝膠上的羊膜上增殖的來自于活體的細胞與上述羊膜共同載置于第2羊膜上，進一步使其增殖而獲得的細胞。
本發(fā)明進一步提供活體組織片的制作方法。本發(fā)明的制作方法的一種方式包括如下的步驟。即(a)調(diào)制來自于活體的細胞的步驟；(b)把上述來自于活體的細胞播種于羊膜上的步驟；以及(c)在不存在異種動物細胞的情況下，培養(yǎng)上述來自于活體的細胞而使其增殖的步驟。
本發(fā)明的一種方式是，上述的步驟b實施以下步驟。即(b-1)在膠原凝膠內(nèi)培養(yǎng)人成纖維細胞的步驟；以及(b-2)在上述的膠原凝膠上載置羊膜之后，把上述來自于活體的細胞播種于該羊膜上的步驟。
本發(fā)明的另一種方式是(d)上述來自于活體的細胞增殖以后，進一步實施使最表層與空氣接觸的步驟。通過該步驟促進細胞層的角質(zhì)化(上皮化)。
本發(fā)明的另一種方式是進一步實施(e)將上述來自于活體的細胞與上述羊膜一起回收的步驟；及(f)把回收的上述來自于活體的細胞和上述羊膜以羊膜側(cè)向下載置在第2羊膜上以后，接著培養(yǎng)上述來自于活體的細胞而使其增殖的步驟。即實施2階段的培養(yǎng)。
實施步驟c時所使用的培養(yǎng)基可以使用(1)無血清培養(yǎng)基，或者(2)作為血清成分只含有來自于受者的血清的培養(yǎng)基。
來自于活體的細胞優(yōu)選是來自于角膜上皮、結(jié)膜上皮、皮膚表皮、毛囊上皮、口腔粘膜、氣管粘膜或者腸管粘膜的細胞。
作為培養(yǎng)基質(zhì)的羊膜優(yōu)選使用去除上皮的羊膜。
本發(fā)明進一步提供了皮膚表皮細胞的調(diào)制方法，其包括以下步驟即(A)把皮膚表皮細胞播種于羊膜上的步驟；(B)培養(yǎng)上述皮膚表皮細胞而使其增殖的步驟；及(C)把增殖的皮膚表皮細胞回收的步驟。


圖1表示用實施例1的方法制作的三維培養(yǎng)皮膚片(培養(yǎng)表皮片)的HE染色圖像(空氣-上舉后第8天)的圖。從上層依次為表皮角化細胞層、羊膜、含有成纖維細胞的膠原凝膠(基質(zhì))。在表皮角化細胞層中，從下依次由基底細胞層、棘細胞層、顆粒層、角質(zhì)層有序構(gòu)成，顯示出與人正常表皮非常接近的形態(tài)。
圖2表示用實施例2的方法制作的三維培養(yǎng)皮膚片(培養(yǎng)表皮片)的HE染色圖像(空氣-上舉后第8天)的圖。羊膜上播種的人表皮角化細胞含有一層基底細胞層和5-6層的細胞層，也可見到角質(zhì)層的形成，表皮被再構(gòu)成。
圖3表示羊膜對表皮角化細胞增殖及游走的效果的試驗結(jié)果圖。右欄是試驗組(在含有成纖維細胞的膠原凝膠上附著的羊膜上培養(yǎng)表皮角化細胞的情況)的結(jié)果(從上依次為第1天、第10天)。左欄是對照組的結(jié)果。
圖4表示羊膜對表皮角化細胞增殖及游走的效果的試驗結(jié)果圖。左欄是試驗組(在含有成纖維細胞的膠原凝膠上附著的羊膜上載置培養(yǎng)表皮片，進行培養(yǎng))的結(jié)果(由上依次為第1天、第7天、第10天、及第14天)。中間欄是對照組1(在含有成纖維細胞的膠原凝膠上載置培養(yǎng)表皮片，進行培養(yǎng))的結(jié)果。同樣，右欄是對照組2(將不使用羊膜而進行三維培養(yǎng)所得到的細胞層載置在含有成纖維細胞的膠原凝膠上，進行培養(yǎng)時)的結(jié)果。
具體實施例方式
本發(fā)明提供含有如下構(gòu)成的活體組織片。即，含有在不存在異種動物細胞的情況下、于羊膜上增殖的來自于活體的細胞的活體組織片。來自于活體的細胞形成細胞層。以下詳述本發(fā)明的活體組織片以及其制法的特征。
本發(fā)明的活體組織片是通過含有如下步驟的方法制作的，所述步驟為(a)調(diào)制來自于活體的細胞的步驟；(b)把上述來自于活體的細胞播種在羊膜上的步驟；(c)在不存在異種動物細胞的情況下，培養(yǎng)上述來自于活體的細胞而使其增殖的步驟。
在步驟(a)中調(diào)制來自于活體的細胞。作為來自于活體的細胞，使用適合用于最終得到的活體組織片的細胞，例如制作皮膚表皮組織再生用的片時，優(yōu)選使用皮膚表皮細胞(包括其干細胞、前體細胞)或毛囊上皮細胞(包括其干細胞、前體細胞)等。同樣，以角膜上皮組織的再生為目的時，優(yōu)選使用角膜上皮細胞(包括其干細胞、前體細胞)；以再生粘膜上皮組織為目的時，優(yōu)選使用粘膜上皮細胞(包括其干細胞、前體細胞)。以粘膜上皮細胞為例，可以舉出口腔粘膜上皮細胞、腸管粘膜上皮細胞、氣管粘膜上皮細胞等。
關(guān)于來自于活體的細胞的調(diào)制方法，以皮膚表皮細胞、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、腸管粘膜上皮細胞以及氣管粘膜上皮細胞為例進行說明。
(皮膚表皮細胞)首先，對于皮膚的采取，事先用聚乙烯吡咯酮碘等消毒藥預防性地消毒采取部位，進行抗真菌劑的外用涂布之后，依照皮膚活檢采取小皮膚片。對于表皮角化細胞的培養(yǎng)，用剪子從皮膚片中盡量剔除脂肪組織和真皮，用杜氏磷酸緩沖液(PBS)清洗數(shù)次。在70％乙醇中浸泡1分鐘來進行滅菌。切成長方條狀，浸于分散酶液，在4℃下靜置一晚。接著將表皮從真皮上剝離。把剝離得到的表皮清洗后，切碎表皮片，調(diào)配表皮角化細胞浮游液。把細胞懸浮在無血清培養(yǎng)液中，播種于膠原被覆培養(yǎng)皿上，進行傳代培養(yǎng)。
(角膜上皮細胞)角膜上皮細胞可從角膜緣部組織中獲得。例如，從角膜緣部組織剝離去除內(nèi)皮細胞，切除結(jié)膜，制作單一細胞懸浮液。然后把它保存于氮罐中，接著迅速在37℃下融解來調(diào)配角膜上皮細胞懸浮液。根據(jù)需要，進行傳代培養(yǎng)。對傳代培養(yǎng)而言，比如，可使用無血清培養(yǎng)基EpilifeTM(CASCADE公司)、MCDB153培養(yǎng)基(日水制藥株式會社)或改變這些培養(yǎng)基的氨基酸組成等而制成的培養(yǎng)基等。
(口腔粘膜上皮細胞)作為口腔粘膜上皮細胞，可以使用存在于齒根部的細胞(口腔內(nèi)緣粘膜上皮細胞)、口唇部細胞、口上顎細胞、頰部細胞等。其中，口腔內(nèi)緣粘膜上皮細胞因其增殖能力高且抗原性低，而特別優(yōu)選使用它?？谇徽衬ど掀ぜ毎梢杂檬中g(shù)刀等切除目標細胞存在的部位，或通過進行刮除來采取。對于口腔內(nèi)緣粘膜上皮細胞，將拔牙上附著的口腔粘膜上皮從牙釉質(zhì)牙骨質(zhì)移行部分離，由此可以采取。在此，為了去除結(jié)締組織等雜質(zhì)，優(yōu)選進行用分散酶和胰蛋白酶等酶的處理或過濾器處理。
(腸管粘膜上皮細胞)腸管粘膜上皮細胞是在大腸內(nèi)窺鏡下從腸管上皮活檢組織中采取，或者用剖腹手術(shù)時用常規(guī)的手法采取。還可以用激光捕捉顯微解剖(lazer capture microdissection)方法從組織中切除上皮細胞。本發(fā)明技術(shù)也適用于用食道、胃、十二指腸、小腸、大腸等人的所有消化道上皮細胞而制作的活體組織片。由于潰瘍和炎癥等人的消化道上皮受到損傷時，來自于骨髓的細胞發(fā)揮應對緊急事態(tài)的急救作用，從而上皮被修復。消化道上皮細胞的一部分也可以說是由骨髓制作。從這個意義上可以認為本發(fā)明的意義與使用角膜上皮細胞等同。通常1000個中只有少數(shù)幾個由骨髓生成的上皮細胞，在胃潰瘍、大腸炎等引起的消化道內(nèi)面的潰瘍(傷口)治愈的過程中增加50倍到100倍，確認大致10個中有1個消化道上皮細胞是來自于骨髓的。這里制作的來自于消化道粘膜上皮細胞的活體組織片，認為對于指定為難癥的重癥腸管感染癥、潰瘍性大腸炎、克隆病、貝切特病等腸道病的難治潰瘍、炎癥而言，促進腸管上皮的再生也是非常有意義的。也期待著對腸管變態(tài)反應的可使用性。
(氣管粘膜上皮細胞)氣管粘膜上皮細胞容易從氣管粘膜活檢組織中得到，與上述的組織相同，為了去除結(jié)締組織等雜質(zhì)，優(yōu)選進行用分散酶或胰蛋白酶等酶處理或過濾器處理。氣管粘膜上皮細胞通過β防御素的生物合成、釋放，對各種感染癥病情發(fā)展起重要的作用。而且，氣管粘膜上皮對哮喘和變態(tài)反應疾病中所起的作用也高。對受到組織損傷的氣管粘膜提供由本發(fā)明的氣管粘膜上皮細胞制作的活體組織片，這超過應急對應，還與人工氣管的提供有關(guān)。尤其羊膜上制作的片所具有的免疫抑制作用是有益的。
口腔粘膜上皮細胞和腸管粘膜上皮細胞等，特別是在采取組織之后，為了去除結(jié)締組織等雜質(zhì)，優(yōu)選進行用分散酶或胰蛋白酶等酶的處理或過濾器處理。
來自于活體的細胞優(yōu)選由接受活體組織片移植的受者(受者)制備。即、優(yōu)選來自于活體的細胞的供體和活體移植片的受者是相同的人。通過使用這樣的自體細胞，解決免疫排斥的問題。
把調(diào)制好的來自于活體的細胞播種(載置)于羊膜上(步驟b)，用于其后的培養(yǎng)(步驟c)“羊膜”是指哺乳動物中覆于子宮和胎盤最表層的膜，是在膠原豐富的實質(zhì)組織上形成基底膜、上皮層而構(gòu)成的。羊膜優(yōu)選使用人的羊膜。人的羊膜例如可以在分娩時從產(chǎn)后得到的人胎兒膜、胎盤等上采取。具體來說，可以通過處理、精制剛剛分娩后得到的含有人胎兒膜、胎盤及臍帶的一體物來調(diào)制人的羊膜。處理、精制方法可以采用特開平5-5698號中所記載的方法等公知的方法。也就是說，從分娩時得到的胎兒膜上剝離羊膜，用超聲波清洗等的物理處理及酶處理等來去除殘存組織，經(jīng)過適當?shù)那逑垂ば蚓涂烧{(diào)制人的羊膜。
這樣制備得到的人羊膜可以凍結(jié)保存到使用時為止。人羊膜的凍結(jié)，例如可以在-80℃下，保存在以體積比等量混合DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)和甘油等的液體中。通過凍結(jié)保存可提高操作性是勿庸置疑的，還有望降低抗原性。
羊膜可以原樣使用，但優(yōu)選使用經(jīng)刮除處理等去除上皮的羊膜。例如，將如上述凍存的人的羊膜解凍以后，用EDTA和蛋白分解酶處理，緩解細胞間的粘附，而后用細胞刮器刮除上皮，由此能調(diào)制去除上皮的人羊膜。
利用去除上皮的人羊膜時，優(yōu)選把來自于活體的細胞播種在去除上皮而裸露的面?zhèn)?即基底膜側(cè))。該側(cè)面豐富地含有IV型膠原，認為所播種的來自于活體的細胞的增殖、多層化可順利進行。
來自于活體的細胞以例如細胞密度為約1×103個/cm2或更高，優(yōu)選為約1×103個/cm2～約1×107個/cm2，進一步優(yōu)選為約1×104個/cm2～約1×106個/cm2的密度播種在羊膜上。
在優(yōu)選的一種方式中，在予先調(diào)制好的含有人成纖維細胞的膠原基質(zhì)上載置羊膜，接著在羊膜上播種來自于活體的細胞，進行培養(yǎng)。即，該方式中實施在膠原凝膠內(nèi)培養(yǎng)人成纖維細胞的步驟(步驟b-1)及在上述膠原凝膠上載置羊膜后把上述來自于活體的細胞播種(載置)在該羊膜上的步驟(步驟b-2)。用該順序制作的活體組織片含有在羊膜上增殖的來自于活體的細胞，所述羊膜載置于含有人成纖維細胞的膠原凝膠上。該方式的活體組織片可以連同膠原基質(zhì)作為移植材料使用。還可以在去除膠原基質(zhì)以后作為移植材料使用?；蛘咭部梢栽谌コz原基質(zhì)和羊膜后作為移植材料使用。
“膠原凝膠”作為人成纖維細胞的培養(yǎng)基質(zhì)而發(fā)揮作用。作為膠原凝膠原材料的膠原種類沒有特殊的限定，可以使用I型膠原、III型膠原、IV型膠原等。也可以使用多種膠原混合存在的膠原。這些膠原可以由豬、牛、羊等動物的皮膚、軟骨等結(jié)締組織，經(jīng)酸溶解法、堿溶解法、酶溶解法等提取、精制。在此，為了降低抗原性，優(yōu)選使用通過用胃蛋白酶或胰蛋白酶等分解酶處理來去除端肽的、所謂的組織修復膠原。作為膠原凝膠的材料可以使用來自于羊膜的、特別是來自于人羊膜的膠原。在此，所謂的來自于羊膜是指廣義的以羊膜為出發(fā)原材料所得到的物質(zhì)。
膠原凝膠所含有的來自于人的成纖維細胞沒有特別限定，只要產(chǎn)生膠原則來自于哪一種組織都可以，例如可以使用由皮膚組織、口腔粘膜組織等調(diào)制的人成纖維細胞。
顯示膠原基質(zhì)的制作方法的具體例子。首先，用以下的順序調(diào)制人成纖維細胞。采取皮膚，接著由皮膚剝離真皮。把真皮切細，使其附著于I型膠原被覆的試皿。靜置培養(yǎng)，將從真皮片游離的人成纖維細胞進行傳代培養(yǎng)。使細胞從試皿底面剝離，調(diào)配細胞懸浮液，播種于細胞培養(yǎng)用的試皿。適宜地凍存細胞(例如在液氮中保存)。
另外，用I型膠原調(diào)制中和膠原液(參照后述的實施例)。把它添加到培養(yǎng)容器(例如培養(yǎng)嵌套(カルチセ一インサ一ト))，在室溫中靜置10分鐘左右，使其凝膠化。接著用上述方法將預先培養(yǎng)好的對數(shù)增殖期的人成纖維細胞混合于該凝膠中，使其再度凝膠化。然后靜置培養(yǎng)。通過以上順序得到含有人成纖維細胞的膠原基質(zhì)。創(chuàng)通過該創(chuàng)意努力，形成了有必需的強度、且能夠載置羊膜層和來自于活體的細胞的膠原基質(zhì)，成為本發(fā)明的根本。膠原基質(zhì)上載置(附著)另外準備的羊膜。
羊膜上播種的來自于活體的細胞的培養(yǎng)(步驟c)是在不存在異種動物細胞的情況下實施的。本發(fā)明的“在不存在異種動物細胞的情況下”是指作為培養(yǎng)來自于活體的細胞時的條件，不使用與該來自于活體的細胞異種的動物細胞。具體來講，使用人的細胞(例如人皮膚表皮細胞或人角膜上皮細胞)作為來自于活體的細胞時，培養(yǎng)液中不存在(并存)小鼠或大鼠等人以外的動物種的細胞的條件。通過在這樣的條件下實施培養(yǎng)，最終得到的移植材料(即活體組織片)中不會混入來自于異種的成分(包括異種細胞本身)的危險。
培養(yǎng)來自于活體的細胞時所使用的培養(yǎng)基，只要使該細胞增殖就沒有特別的限定。例如，可以使用MCDB 153培養(yǎng)基(日水制藥株式會社)、或EpiLifeTM(CASCADE公司)、改變這些培養(yǎng)基的氨基酸組成等制作的培養(yǎng)基、將常用于上皮細胞生長的DMEM(Dulbecco′s modified Eagle′smedium)和Ham′s F12培養(yǎng)基(Ham′s F12 medium)按規(guī)定比例混合得到的培養(yǎng)基等。在本發(fā)明中特別優(yōu)選使用無血清且不含有來自于異種動物的蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基。另一方面，也可以使用添加有生長因子和抗生素等的培養(yǎng)基。但優(yōu)選使用不含血清的培養(yǎng)基。即本發(fā)明的培養(yǎng)方法優(yōu)選采用無血清培養(yǎng)法。這是因為可以避免因來自于血清的成分混入所引起的免疫排斥等的問題。此外，也可以在含有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，但這種情況下優(yōu)選使用來自于同種的血清(培養(yǎng)來自于人的活體細胞時使用來自于人的血清)，或者優(yōu)選使用自體血清。當然，可能的話優(yōu)選使用不會引起免疫排斥反應危險的自體血清。
為了使來自于活體的細胞良好增殖，在培養(yǎng)步驟的過程中也可以改變培養(yǎng)條件。
步驟c的結(jié)果是在羊膜上來自于活體的細胞得到增殖。有必要將這樣得到的細胞層的表層進行角化時(例如用皮膚表皮細胞制作皮膚表皮片或用角膜上皮細胞制作角膜上皮片時)，可以實施使細胞層的表層接觸空氣的步驟(步驟d)。在此，本說明書中把該步驟稱為空氣-上舉(Air-1ifting)。該步驟d是為了形成細胞層細胞的分化以及誘導屏障功能而進行的。
該步驟可以通過如下方式進行用吸液玻璃管、移液管等把部分培養(yǎng)液暫時去除而使培養(yǎng)液表面下降，由此使細胞層最表層暫時露出于培養(yǎng)液外?；蛘?，也可以通過把細胞層與羊膜一起上舉，使最表層從培養(yǎng)液表面暫時裸露出來而進行。還可以用管子等把空氣送入培養(yǎng)液中，使細胞層最上層與空氣接觸。從容易操作的觀點考慮，優(yōu)選用使培養(yǎng)液表面下降而露出細胞層最表層的方法進行。
實施步驟d的時間，即把細胞層最表層與空氣接觸的時間根據(jù)細胞狀態(tài)和培養(yǎng)條件等變動，例如3天～3周左右，優(yōu)選為5天～2周，進一步優(yōu)選為約1周。
本發(fā)明的一種方式為在步驟c(培養(yǎng)步驟)以后，進一步實施(e)把上述來自于活體的細胞與上述羊膜一起回收的步驟與(f)把回收的上述來自于活體的細胞以及上述羊膜以羊膜側(cè)朝下載置在第2羊膜上之后，培養(yǎng)上述來自于活體的細胞而使其增殖的步驟。通過實施步驟e和步驟f，得到在羊膜(第1羊膜)的另一面粘附另外的羊膜(第2羊膜)、且具有以一部分覆蓋第1羊膜而以另一部分覆蓋第2羊膜的細胞層的構(gòu)筑物。此外，通過適當調(diào)配第2羊膜的大小和培養(yǎng)條件等，可以得到第2羊膜的全部表面由細胞層覆蓋的構(gòu)筑物以及第2羊膜表面的一部分由細胞層覆蓋的構(gòu)筑物中的任意一種。
步驟e中，回收培養(yǎng)后的來自于活體的細胞和作為培養(yǎng)基質(zhì)使用的羊膜。例如，在載置于培養(yǎng)皿內(nèi)的羊膜上培養(yǎng)來自于活體的細胞的情況下，培養(yǎng)后把羊膜從培養(yǎng)皿剝離，就能回收增殖的來自于活體的細胞及羊膜。另一方面，在載置于膠原凝膠上的羊膜上培養(yǎng)來自于活體的細胞時，培養(yǎng)后把羊膜從膠原凝膠上剝離，就能回收增殖的來自于活體的細胞及羊膜。
步驟f中，把回收的來自于活體的細胞和羊膜載置于另一羊膜上以后，再次培養(yǎng)來自于活體的細胞。這樣，在本方式中實施二段階的培養(yǎng)(步驟c及步驟f)。
步驟f中，首先，把回收的來自于活體的細胞和羊膜的構(gòu)筑物(以下稱為“細胞-羊膜構(gòu)筑物”)以羊膜側(cè)向下載置于另外準備的羊膜(第2羊膜)上。第2羊膜上也可載置多個細胞-羊膜構(gòu)筑物。例如，通過步驟c把培養(yǎng)后回收的細胞-羊膜構(gòu)筑物裁斷，可以得到多個細胞-羊膜構(gòu)筑物?；蛘邷蕚湎嗷オ毩⒌亩鄠€培養(yǎng)系，通過平行實施步驟c，也能得到多個細胞-羊膜構(gòu)筑物。
把多個細胞-羊膜構(gòu)筑物載置于第2羊膜上時，優(yōu)選以均勻分散的狀態(tài)、即要間隔一定地配置細胞-羊膜構(gòu)筑物。這是因為在其后培養(yǎng)中(及移植于機體后)細胞增殖，細胞層向周圍伸展時，第2羊膜中起初沒有形成細胞層的區(qū)域可以迅速且高效地被細胞層覆蓋的緣故。即，如采用如上方法，在第2羊膜上可以短時間內(nèi)形成大的表面積的細胞層。這樣，可以更加高效地制作細胞層。另一方面，在覆蓋第2羊膜全部表面的細胞層形成之前，也可以把第2羊膜連同細胞層移植于機體的組織缺損部位，在這種情況下，移植后促使細胞層迅速地形成，得到好的治療效果。
由于在短時間內(nèi)能得到大表面積的細胞層，因此，以上的方法特別優(yōu)選制作培養(yǎng)表皮片。應說明的是，有必要將細胞層的表層角化時，在步驟e之前、步驟e和步驟f之間、或步驟f以后，用與上述同樣的方法實施空氣-上舉(步驟d)。
步驟f的培養(yǎng)可以在與上述步驟c的培養(yǎng)條件同樣的條件下實施。即，優(yōu)選在不存在異種動物細胞的情況下培養(yǎng)，培養(yǎng)基優(yōu)選用無血清且不含有來自于異種動物的蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基。采用含血清的培養(yǎng)基時，優(yōu)選使用來自于同種的血清(培養(yǎng)人的來自于活體的細胞時用來自于人的血清)，或者使用自體血清。而且，與步驟c同樣，即使在步驟f中，為了很好地增殖來自于活體的細胞，在培養(yǎng)步驟過程中也可以變更培養(yǎng)條件。
本發(fā)明的活體組織片，在其制作過程中不使用來自于異種動物的細胞，以及培養(yǎng)來自于活體的細胞時使用羊膜作為基底，由此極大地提高了安全性。使用羊膜對提高存活性也有幫助，因此本發(fā)明的活體組織片在移植時可以獲得好的治療效果。特別是在通過使用羊膜及膠原凝膠方法制作的活體組織片中可以形成極其致密的細胞層，移植后的存活性非常高。
本發(fā)明的活體組織片被用于皮膚表皮、毛囊上皮、角膜上皮、口腔粘膜上皮、腸管粘膜上皮以及氣管粘膜上皮等的再生(再建)中。例如，可以把本發(fā)明的活體組織片直接移植于機體組織缺損部。在此所說的“直接移植”是指在組織缺損部和活體組織片之間實質(zhì)上不介有其它物質(zhì)地移植。另一方面，也可以把本發(fā)明的活體組織片(但除了制作過程中使用第2羊膜的情況)移植于機體的組織缺損部，使得在兩者之間介有其它物質(zhì)。例如，可以通過與作為培養(yǎng)基質(zhì)所用的羊膜不同的羊膜(第2羊膜)，把活體組織片移植于組織缺損部。具體來說，可以對組織缺損部移植羊膜(第2羊膜)之后，把預先制作好的活體組織片移植在該羊膜上。通過這樣的移植術(shù)，羊膜以基底形式存在，因此期待著高效地增殖活體組織片中所含有的細胞，并且向周圍良好地游走。即，可期待構(gòu)成活體組織片的細胞層迅速伸展，獲得好的治療效果。另一方面，組織缺損部由羊膜覆蓋，從而保護其免受外部的影響。該點也有助于提高治療效果。
接著本發(fā)明基于羊膜上皮膚表皮細胞的增殖及游走變得更好的知識，提供皮膚表皮細胞的新的調(diào)制方法。本發(fā)明的調(diào)制方法的特征為，包括如下步驟即(A)把皮膚表皮細胞播種于羊膜上的步驟；(B)培養(yǎng)上述皮膚表皮細胞而使其增殖的步驟；以及(C)回收增殖的皮膚表皮細胞的步驟。通過本發(fā)明的調(diào)制方法，能使細胞高效增殖，細胞向周邊的游走也良好。因此有可能以短時間制作大面積的細胞層(培養(yǎng)上皮)。在此，皮膚表皮細胞的采取及培養(yǎng)可以按常規(guī)方法(參照上述)進行。開且，對于回收增殖的皮膚表皮細胞，可以使用物理的方法(用細胞刮器等進行剝離)、酶的方法(用分解酶或胰蛋白酶等進行處理)等。還可以把皮膚表皮細胞以層狀態(tài)原樣回收，或者也可以以分離成一個一個細胞的狀態(tài)進行回收。
以下，用實施例更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于以下的實施例。
實施例1使用羊膜的三維培養(yǎng)皮膚片(培養(yǎng)表皮片)的制作1.羊膜的調(diào)制1-1.羊膜的采取對沒有全身并發(fā)癥的予定剖腹產(chǎn)的孕婦，事先與婦產(chǎn)科醫(yī)生共同進行充分的說明與同意以后，在手術(shù)室剖腹產(chǎn)時采取羊膜。操作要注意清潔，按照手術(shù)操作洗手以后穿上手術(shù)袍。分娩前準備清潔的取羊膜用的搪瓷盤和清洗用的生理鹽水。分娩后把胎盤組織移到搪瓷盤中，用手把羊膜組織從胎盤上剝離。羊膜與胎盤之間粘連強的部分用剪刀切除。
1-2.羊膜的處理羊膜處理的過程是按(1)清洗、(2)修整、(3)保存的順序進行的。所有過程中的操作優(yōu)選在清潔的通風櫥內(nèi)進行，所使用的容器和器具也全部滅菌后使用，培養(yǎng)皿等使用已滅菌的一次性(可任意處理的)器皿。將附著于所采取的羊膜上的血液成分用生理鹽水清洗去除，再用足夠量的生理鹽水(添加0.005％氧氟沙星)清洗。接著用添加有青霉素—鏈霉素(50IU)的磷酸緩沖液(PBS)合計清洗3次。然后把羊膜移到培養(yǎng)皿內(nèi)，用剪刀分割成約4×3cm左右的大小。分割后依據(jù)形狀和厚度選擇狀態(tài)好的羊膜。
1-3.羊膜的保存在滅菌的2cc低溫管內(nèi)各裝入lcc保存液，向其中各加1片采取、清洗后選擇好的羊膜并標記后，保存于-80℃的冷凍裝置中。保存液是使用了含有50％滅菌后甘油的DMEM(杜氏改良MEM培養(yǎng)基、GIBCOBRL公司)。保存的羊膜其使用期限設(shè)為3個月，過期則進行焚燒處理。另外，也可以不進行這樣的保存處理，而實施如下的上皮處理。
1-4.羊膜上皮的處理將-80℃下保存的羊膜在室溫下解凍后，用添加有青霉素—鏈霉素(50IU)的磷酸緩沖液(PBS)清洗2次。把清洗后的羊膜浸在0.02％EDTA溶液(Nacalai tesque公司)中(100mm培養(yǎng)皿)，使其在CO2孵育箱內(nèi)于37℃反應1小時。反應后，用足夠量的PBS清洗羊膜2次，在實體顯微鏡下用細胞刮器(Nunc公司、USA)以手式刮除(除去)上皮。在此，以光學和電子顯微鏡的操作(掃描型電子顯微鏡)確認，用該處理方法把一層羊膜上皮完全刮除去除了。
2.表皮角化細胞的調(diào)制2-1.皮膚的采取事先對采取部位用聚乙烯吡咯酮碘預防性消毒及進行抗真菌劑的外用涂布約3天左右后，按照皮膚活檢采取小皮膚片。
2-2.表皮角化細胞的無血清培養(yǎng)法用剪刀從皮膚片中盡量去除脂肪組織和真皮，在杜氏磷酸緩沖液(PBS)中清洗數(shù)次。浸入70％乙醇中1分鐘進行滅菌。用PBS清洗后，切成寬3mm長10mm左右的長方條，在分散酶液(分散酶II、合同酒精社、250單位/ml杜氏改良MEM培養(yǎng)基；DMEM)中浸泡，在4℃下靜置一晚(18～24小時)。第二天用鑷子把表皮與真皮剝離。剝離的真皮用于成纖維細胞的培養(yǎng)。把剝離的表皮用DMEM清洗，接著用PBS清洗后，在0.25％胰蛋白酶溶液中浸泡，在37℃下處理10分鐘。把表皮移到裝有胰蛋白酶中和液的塑料培養(yǎng)皿中用鑷子揉搓表皮片，然后移到50ml的滅菌試管中。添加PBS，調(diào)配表皮角化細胞浮游液。計數(shù)細胞數(shù)，在1000rpm下離心5分鐘，使細胞沉淀。吸出上清，把細胞用作為無血清培養(yǎng)基的MCDB153培養(yǎng)基懸浮，每100mm膠原被覆培養(yǎng)皿(ASAHI TECHNO GLASS、I型膠原被覆試皿4010-010)中以2～3×106細胞/10ml培養(yǎng)液的比例進行播種。第二天更換培養(yǎng)液，以后每隔1天更換培養(yǎng)液。細胞密度達到70～80％左右時進行傳代培養(yǎng)。
3.成纖維細胞的調(diào)制將剝離的真皮用DMEM清洗后，用手術(shù)刀細切使一邊為1～2mm。把細切得到的真皮片在I型膠原被覆試皿中以約1cm的間隔使其附著。在CO2孵育箱中靜置30分鐘，使其完全附著。其后，添加含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基約5ml，靜置7天。第7天進行第一次培養(yǎng)液更換。確認成纖維細胞從真皮片上游走。細胞增殖，當游走到真皮片周圍5mm的階段進行傳代。用PBS清洗后，添加3ml含有0.125％胰蛋白酶、0.05％EDTA的溶液，在37℃下處理3分鐘。用顯微鏡確認細胞從試皿底面剝離后，添加3ml胰蛋白酶抑制劑，回收細胞，移到50ml的試管里。用PBS回收殘余細胞，以1000rpm離心處理5分鐘使細胞沉淀，吸出上清后，添加含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，調(diào)配細胞懸浮液，播種于細胞培養(yǎng)用試皿中。傳代細胞的密度設(shè)為大約1∶3左右。適宜地凍存細胞。使用含10％甘油、20％FCS、70％DMEM的凍存液，在液氮中保存。
4.中和膠原凝膠的制作相對于I型膠原溶液(細胞基質(zhì)型1A3mg/ml新田明膠)6體積，以0.1N的NaOH∶1體積、8倍濃度DMEM∶1體積、20％FCS/DMEM∶10體積的比例在4℃下制作中和膠原液(膠原的最終濃度1mg/ml)，向直徑24mm的培養(yǎng)嵌套(Corning-Costar公司)中各添加1ml，在室溫下靜置10分鐘，使其凝膠化。將予先培養(yǎng)好的對數(shù)增殖期的成纖維細胞(由經(jīng)分散酶處理、剝離表皮的殘存真皮，用outgrowth法培養(yǎng)，使用傳代5-10代的細胞)調(diào)配為5×105細胞/ml、10％FCS/DMEM的濃度，相對于細胞懸浮液2體積，以中和膠原液8體積的比例進行混合，調(diào)制包含細胞的中和膠原溶液(膠原的最終濃度0.8mg/ml)。每培養(yǎng)嵌套中各添加該溶液3.5ml，在CO2孵育箱內(nèi)(37℃、5％CO2)中靜置。約30分鐘后確認凝膠化。其后，加入10％FCS/DMEM到凝膠浸泡的程度(培養(yǎng)嵌套內(nèi)側(cè)加3ml，培養(yǎng)嵌套外側(cè)加3ml)，靜置培養(yǎng)5天。培養(yǎng)第2天起凝膠開始收縮，在相差顯微鏡下可以觀察到成纖維細胞的增殖。
5.羊膜的粘附培養(yǎng)開始5天后膠原凝膠的底面附著于膜，但膠原凝膠上部收縮，其厚度變成2～3mm。將保存的羊膜(去除上皮的羊膜)用PBS清洗2次，再用角化細胞用培養(yǎng)液清洗1次。把羊膜的實質(zhì)細胞側(cè)朝下移到培養(yǎng)嵌套中，用鑷子使其與膠原凝膠附著。用鑷子展平以防止起皺，在培養(yǎng)嵌套的側(cè)壁上附著羊膜的周邊。移到CO2孵育箱內(nèi)，在37℃下靜置30分鐘。
6.角化細胞的播種將2-2.中調(diào)制成的角化細胞用胰蛋白酶·EDTA從試皿上剝離、回收。以1000rpm離心5分鐘，吸出上清，以200萬個/0.25ml的濃度懸浮細胞。在培養(yǎng)嵌套內(nèi)側(cè)的羊膜上播種0.25ml的細胞懸浮液，移到CO2孵育箱內(nèi)，為使角化細胞在羊膜附著，在孵育箱中靜置1.5～2.0小時，然后將1ml表皮細胞增殖用培養(yǎng)基緩緩地添加到培養(yǎng)嵌套內(nèi)側(cè)，進一步向培養(yǎng)嵌套外側(cè)添加1ml。第二天把表皮細胞增殖用培養(yǎng)基緩慢地追加到培養(yǎng)嵌套內(nèi)側(cè)，進一步向培養(yǎng)嵌套外側(cè)追加1ml。
7.氣相下培養(yǎng)將表皮細胞播種于羊膜后第3天實施空氣曝露(空氣-上舉)。在用于空氣曝露的維持容器中設(shè)置滅菌的濾紙，把多層化用培養(yǎng)基添加到浸沒濾紙的程度(約9ml)。非常仔細地去除在培養(yǎng)嵌套內(nèi)側(cè)的培養(yǎng)液，把培養(yǎng)嵌套移到濾紙上，在CO2孵育箱中進行培養(yǎng)。每隔一天更換培養(yǎng)液。經(jīng)7～14天的空氣曝露完成三維培養(yǎng)皮膚。多層化所用培養(yǎng)液的調(diào)配如下。杜氏改良MEM培養(yǎng)基∶F-12培養(yǎng)基＝1∶1、鈣濃度1.95mM、乙醇胺0.1mM、鄰磷酸乙醇胺0.1mM、胰島素5ug/ml、氫化可的松0.4ug/ml、L-谷氨酰胺4mM、腺嘌呤0.18mM、轉(zhuǎn)鐵蛋白5ug/ml、亞硒酸53nM、三碘甲狀腺原氨酸20pM、絲氨酸1mM、氯化膽堿0.64mM、亞油酸2ug/ml、FCS2％。
以上操作結(jié)果所得到的培養(yǎng)表皮片容易從試皿底面或從膠原基質(zhì)上剝離。在以往的技術(shù)中發(fā)生片收縮，因此有必要將殼制膜(Bas-ChitinW)作為支持體使用，還有發(fā)生很多破損情況，通過以上的方法可制作堅固的片，也看不到片的收縮，因不需要使用支持體。
8.組織學檢查用以上的方法制作培養(yǎng)表皮片時，空氣曝露后第7天表皮成為5～8層，可見角質(zhì)層的形成，呈現(xiàn)出與正常人皮膚幾乎一樣的結(jié)構(gòu)。多層化的角化細胞的組織所見是一層基底細胞樣的細胞及其上面5～8層的多層化、可看到分化了的細胞結(jié)構(gòu)(圖1)。用3代傳代的細胞制作培養(yǎng)表皮片時，采取皮膚后約4周可以使用培養(yǎng)表皮片，計算培養(yǎng)面的表面積，增加到數(shù)千倍。
另一方面，在空氣曝露前后經(jīng)時制作標本，進行HE染色。空氣曝露后第9天用標本制作凍結(jié)組織切片，使用NICHIREI公司的HistofineSAB-AP試劑盒進行免疫組織化學染色，基質(zhì)采用Newfuchsine。使用的抗體如下。單克隆抗體昆布氨酸5(GB3、Sera Lab)、IV型膠原(MAB1910、Chemicon)、VII型膠原(LH7.2、YLEM)、β4整合蛋白(MAB1964、Chemicon)、β1整合蛋白(P4ClO、Gibco BRL)、橋粒芯糖蛋白1(DG3.10、Progen)、γ-鈣緊張素(PG5.1、Progen)、橋粒斑蛋白(DP-2.15、Progen)、E鈣粘素(HECD-1、Takara)、Pan-角蛋白(Dako)、EGF受體(Ab3、Oncogene Science)；多克隆抗體インポルクリン(Biomedical Technologies Inc.)、橋粒芯糖蛋白3(Serotec)。在類天皰抗原的確認上使用類天皰瘡患者血清，使用以FITC標記的抗人IgG抗體，在熒光顯微鏡下觀察。電子顯微鏡檢查是把空氣曝露后第9天的標本用通用的方法固定、包埋，用日立公司制的透射顯微鏡進行觀察。
在空氣曝露前的HE染色所見中，角化細胞為1～2層，看不到角質(zhì)層的形成，空氣曝露后第4天中見到角化細胞的多層化，看到3～4層的棘層和清晰的角質(zhì)層的形成。7天后棘層約增至5～8層左右，這種狀態(tài)確切地維持到第14天左右。與以往培養(yǎng)表皮片相比，明顯形成堅固的片，認為即使不使用支持物也容易操作、非常易于處理。在免疫組織學中昆布氨酸5、IV型膠原、VII型膠原、β4整合蛋白是以基底層的表皮基底細胞為中心來表達的，與體內(nèi)表皮的表達形式不同。作為細胞間粘附分子E鈣粘素、橋粒芯糖蛋白1、橋粒芯糖蛋白3、作為其內(nèi)部蛋白的橋粒斑蛋白、γ-鈣緊張素由基底層到棘層均有表達。EGF受體、β1整合蛋白從基底層到旁基底層均有表達?？梢婎愄彀挴徔乖诨啄げ恐谐示€狀表達。歸納免疫組織所見，可見細胞間粘附分子、分化的標記幾乎與體內(nèi)表皮同樣表達，但認為基底層的構(gòu)成成分的表達不充分。電子顯微鏡所見是橋粒的形成良好。在基底膜部中半橋粒的形成大致良好，雖然觀察到一部分基底板形成，但是片斷的?？梢婂^纖維是片斷形成的。
9.片的保存制作的培養(yǎng)表皮片可以使用少量的保存液與載體一同或者不含載體凍存。具體來說，首先用-80℃的冷凍裝置凍存，第二天用-150℃的超低溫冷凍裝置保存。在-150℃下的保存可以長期保持片的形狀，實際上得到很好的治療效果。此外，也可以使用活體組織保存中使用的保存液在4℃下進行保存，這種情況優(yōu)選添加抗氧化物質(zhì)。
10.培養(yǎng)表皮片的移植以平皿上附著有剝離的片的面覆蓋創(chuàng)面的方式進行移植，進行壓迫、固定。通常用膠帶固定和用繃帶進行壓迫即可。培養(yǎng)片移植也與通常的皮膚移植一樣，可分類為用自身細胞的自體移植和用他人細胞的異體移植。自體移植雖然存活性優(yōu)異但制作時間長。異體移植雖然沒有存活性但有生物敷料的效果，也有一看就像存活的樣子。由于片的保存成為可能，一旦大量制作異體培養(yǎng)片，則具有必需時可以立即使用的優(yōu)點。由于這些理由，異體培養(yǎng)片主要應用于急性期的燙傷患者。在臨床應用中，燙傷、下肢潰瘍、先天性表皮水泡癥、獸皮狀母斑、斑痕、分層采皮部位的覆蓋等都成為應用對象。
實施例2三維培養(yǎng)皮膚片(培養(yǎng)表皮片)的制作(不使用膠原凝膠的情況)1.羊膜、表皮角化細胞的調(diào)制與實施例1同樣的步驟調(diào)制羊膜和表皮角化細胞。
2.角化細胞的播種將保存的羊膜用PBS清洗2次，再用角化細胞用培養(yǎng)液清洗1次。把羊膜的實質(zhì)細胞側(cè)朝下使其粘附到培養(yǎng)嵌套的底面上。將事先培養(yǎng)好的角化細胞使用胰蛋白酶·EDTA從試皿中剝離回收。以1000rpm離心5分鐘，去除上清，以200萬個/0.25ml濃度懸浮細胞。在培養(yǎng)嵌套內(nèi)側(cè)的羊膜上播種0.25ml的細胞懸浮液，移到CO2孵育箱內(nèi)，在孵育箱內(nèi)靜置1.5～2.0小時，使得角化細胞附著于羊膜，然后把1ml的表皮細胞增殖用培養(yǎng)基緩慢地添加到培養(yǎng)嵌套內(nèi)側(cè)，進一步向培養(yǎng)嵌套外側(cè)添加1ml。第二天把表皮細胞增殖用培養(yǎng)基向培養(yǎng)嵌套內(nèi)側(cè)緩慢追加，再向培養(yǎng)嵌套外側(cè)也追加1ml。
3.氣相下培養(yǎng)在羊膜上播種表皮細胞后第3天進行空氣曝露(空氣-上舉)。在用于空氣曝露的維持容器內(nèi)設(shè)置滅菌的濾紙，添加多層化用培養(yǎng)基加到浸沒濾紙的程度(約9ml)。非常仔細地去除培養(yǎng)嵌套內(nèi)側(cè)的培養(yǎng)液，把培養(yǎng)嵌套移到濾紙上，在CO2孵育箱內(nèi)進行培養(yǎng)。培養(yǎng)液每隔一天更換。經(jīng)過7～14天的空氣曝露，完成三維培養(yǎng)皮膚。多層化所用培養(yǎng)基按如下調(diào)配。杜氏改良MEM培養(yǎng)基∶F-12培養(yǎng)基＝1∶1、鈣濃度1.95mM、乙醇胺0.1mM、鄰磷酸乙醇胺0.1mM、胰島素5ug/ml、氫化可的松0.4ug/ml、L-谷氨酰胺4mM、腺嘌呤0.18mM、轉(zhuǎn)鐵蛋白5ug/ml、亞硒酸53nM、三碘甲狀腺原氨酸20pM、絲氨酸1mM、氯化膽堿0.64mM、亞油酸2ug/ml、FCS2％。
4.組織學的檢查用以上方法制作的培養(yǎng)表皮片在空氣曝露后7天，表皮變?yōu)?～8層，可看到角質(zhì)層的形成，呈現(xiàn)出與正常人皮膚大致相同的結(jié)構(gòu)(圖2)。
實施例3使用羊膜的三維角膜上皮片的制作1.羊膜的調(diào)制用與實施例1同樣的步驟調(diào)制羊膜。
2.角膜上皮細胞的調(diào)制2-1.角膜的籌備角膜是從Northwest Lions Eye Bank(西雅圖、美國)購入的供體用角膜。
2-2.角膜上皮細胞的無血清培養(yǎng)法把角膜移到盛有杜氏磷酸緩沖液(PBS)的培養(yǎng)皿中，在實體顯微鏡下用手術(shù)刀把緣部細切成一邊為2～3mm。細切得到的緣部用PBS清洗數(shù)次，用70％乙醇浸泡1分鐘進行滅菌。用PBS清洗后，用分散酶液(分散酶II、合同酒精社、250單位/ml杜氏改良MEM培養(yǎng)基DMEM)浸泡，在4℃下靜置一晚(18～24小時)。第二天在實體顯微鏡下用鑷子從實質(zhì)上剝離上皮。將剝離的角膜上皮用DMEM清洗，接著用PBS清洗后浸入0.25％胰蛋白酶溶液中，37℃下進行10分鐘處理。把表皮移到裝有胰蛋白酶中和液的塑料培養(yǎng)皿中，用鑷子拆開表皮片，移到15ml滅菌試管中。添加PBS，調(diào)配角膜上皮細胞浮游液。計數(shù)細胞數(shù)，以1000rpm離心5分鐘，使細胞沉淀。吸出上清，用作為無血清培養(yǎng)基的EpiLife培養(yǎng)基懸浮細胞，每60mm膠原被覆培養(yǎng)皿(ASAHI TECHNOGLASS、I型膠原被覆試皿4010-020)以1～2×106細胞/5ml培養(yǎng)液的比例進行播種。第二天更換培養(yǎng)液，以后每隔一天更換培養(yǎng)液。細胞密度達到70～80％左右時進行傳代培養(yǎng)。
應說明的是，在以上的方法中使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)角膜上皮細胞，但也可以如下所示的步驟使用含有血清的培養(yǎng)基。
(1)從角膜緣部組織剝離去除內(nèi)皮細胞，切除結(jié)膜。
(2)在分散酶液(分散酶I、合同酒精社、250單位/ml杜氏改良MEM培養(yǎng)基DMEM)中浸泡，4℃下靜置一晚(18～24小時)。
(3)在0.25％胰蛋白酶溶液中浸泡，37℃下處理10分鐘。
(4)顯微鏡下在胰蛋白酶溶液中只剝離上皮。
(5)作吸管操作，添加同量的30％FCS/DMEM進行懸浮。
(6)用PBS(-)進一步回收殘留細胞，進行離心處理。
(7)用適量的培養(yǎng)液制作單一細胞懸浮液。
調(diào)制好的角膜上皮細胞的凍結(jié)保存條件(包括保存液組成)以及融解條件的一例如下所示。
凍結(jié)保存條件以1℃/小時的速度降低溫度至-20℃，然后在氮罐中保存。
保存液的組成20％FCS/10％DMSO/DMEM融解條件盡可能快地在37℃下融解，用PBS稀釋10倍。
3.成纖維細胞的調(diào)制將剝離好的真皮用DMEM清洗后，用手術(shù)刀細切成一邊為1～2mm。細切得到的真皮以約1cm的間隔附著于I型膠原被覆試皿上。在CO2孵育箱中靜置30分鐘，使其完全附著。其后，添加含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基約5ml，靜置7天。第7天進行第一次的培養(yǎng)液更換。確認成纖維細胞從真皮中游走出來。細胞增殖，在游走到真皮片周圍5mm的時候，進行傳代。用PBS清洗后，添加含有0.125％胰蛋白酶、0.05％EDTA的溶液3ml，在37℃處理3分鐘。用顯微鏡確認細胞從試皿底面剝離后，添加3ml的胰蛋白酶抑制劑，回收細胞，移到50ml的試管中。用PBS回收殘留的細胞，以1000rpm離心處理5分鐘，使細胞沉淀，吸出上清后，添加含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，調(diào)配細胞浮游液，向細胞培養(yǎng)用試皿上播種。傳代的細胞密度設(shè)為大致1∶3左右。適當?shù)貎鼋Y(jié)保存細胞。凍存液使用10％甘油、20％FCS、70％DMEM，在液氮中保存。
4.中和膠原凝膠的制作相對于I型膠原溶液(細胞基質(zhì)型1A3mg/ml新田明膠)6體積，以0.1N的NaOH∶1體積、8倍濃度DMEM∶1體積、20％FCS/DMEM∶10體積的比例，在4℃下制作中和膠原液(膠原的最終濃度1mg/ml)，向直徑24mm的培養(yǎng)嵌套(Corning-Costar公司)中各添加1m1，在室溫中靜置10分鐘進行凝膠化。把事先培養(yǎng)的對數(shù)增殖期的成纖維細胞(使用經(jīng)分散酶處理、由剝離了表皮的殘留真皮用outgrowth法培養(yǎng)5-10代傳代的細胞。)調(diào)配成5×105細胞/ml、10％FCS/DMEM的濃度，相對于該細胞懸浮液∶2體積，以中和膠原凝膠液∶8體積的比例進行混合，調(diào)制含有細胞的中和膠原溶液(膠原的最終濃度0.8mg/ml)。將該溶液向各培養(yǎng)嵌套中各添加3.5ml，放入CO2孵育箱中(37℃、5％CO2)靜置。約30分鐘后確認凝膠化。然后添加10％FCS/DMEM使凝膠處于浸泡的程度(培養(yǎng)嵌套內(nèi)側(cè)加3ml、培養(yǎng)嵌套外側(cè)加3ml)，靜置培養(yǎng)5天。培養(yǎng)第2天起凝膠開始收縮，成纖維細胞的增殖可在相差顯微鏡下觀察到。
5.羊膜的粘附培養(yǎng)開始后5天起膠原凝膠的底面附著到膜上，但膠原凝膠上部收縮成2～3mm的厚度。將保存的羊膜用PBS清洗2次，再用角化細胞用培養(yǎng)液清洗1次。羊膜的實質(zhì)細胞側(cè)朝下移到培養(yǎng)嵌套中，用鑷子使其與膠原凝膠附著。用鑷子平展以防止起皺，使羊膜的周邊與培養(yǎng)嵌套的側(cè)壁附著。移到CO2孵育箱中，37℃下靜置30分鐘。
6.角膜上皮細胞的播種將2-2.中調(diào)制成的角膜上皮細胞使用胰蛋白酶·EDTA從試皿中剝離、回收。以1000rpm離心5分鐘，去除上清，把細胞懸浮成200萬個/0.25ml的濃度。在培養(yǎng)嵌套內(nèi)側(cè)的羊膜上播種0.25ml的細胞懸浮液，移到CO2孵育箱內(nèi)，為使角化細胞附著到羊膜上，在孵育箱內(nèi)靜置1.5～2.0小時，然后緩慢添加表皮細胞增殖用無血清培養(yǎng)基(培養(yǎng)嵌套內(nèi)側(cè)加3ml、培養(yǎng)嵌套外側(cè)加3ml)，進一步在液相下繼續(xù)培養(yǎng)14天。角膜上皮細胞播種第3天將培養(yǎng)液更換為多層化用培養(yǎng)液(參照下述)，之后每2天更換培養(yǎng)液1次。
多層化用培養(yǎng)基按如下所述調(diào)配。杜氏改良MEM培養(yǎng)基∶F-12培養(yǎng)基＝1∶1、鈣濃度1.95mM、乙醇胺0.1mM、鄰磷酸乙醇胺0.1mM、胰島素5ug/ml、氫化可的松0.4ug/ml、L-谷氨酰胺4mM、腺嘌呤0.18mM、轉(zhuǎn)鐵蛋白5ug/ml、亞硒酸53nM、三碘甲狀腺原氨酸20pM、絲氨酸1mM、氯化膽堿0.64mM、亞油酸2ug/ml、FCS2％。
7.氣相下培養(yǎng)將角膜上皮細胞播種后第14天進行空氣曝露(空氣-上舉)。在空氣曝露用維持容器中設(shè)置滅菌的濾紙，添加多層化用培養(yǎng)液到浸沒濾紙的程度(約9ml)。非常仔細地去除培養(yǎng)嵌套內(nèi)側(cè)的培養(yǎng)液，把培養(yǎng)嵌套移到濾紙上，在CO2孵育箱內(nèi)進行培養(yǎng)。第3天更換培養(yǎng)液。通過3天的空氣曝露，完成培養(yǎng)角膜。
8.組織學檢查空氣曝露后第3天角膜上皮變?yōu)?～4層，可見角質(zhì)層的形成，呈現(xiàn)出與正常人角膜大致相同的結(jié)構(gòu)。
實施例4羊膜作為細胞培養(yǎng)基質(zhì)的特性評價1.羊膜上的表皮角化細胞的增殖和游走試驗1在含有成纖維細胞的膠原凝膠上，使其上皮存在的一側(cè)朝上，以平展去除了上皮的羊膜的狀態(tài)使其載置、附著。接著，在羊膜上放置不銹鋼制的花生狀環(huán)(內(nèi)徑6mm、高2mm)，在內(nèi)部(6mm孔空穴的部分)播種表皮角化細胞懸浮液。此外，羊膜和表皮角化細胞懸浮液均按實施例1中記載的方法進行調(diào)制。
2天后取出環(huán)，用空氣曝露方法開始多層化。多層化1天后和10天后觀察表皮角化細胞向周圍的游走。除了不使用羊膜以外，把設(shè)成相同條件的情況作為比較對象(對照組)。
多層化后第1天和第10天的培養(yǎng)皿內(nèi)的狀態(tài)示于圖3中。圖3的右欄為實驗組(在附著于含有成纖維細胞的膠原凝膠上的羊膜上培養(yǎng)表皮角化細胞的情況)的結(jié)果(從上依次為第1天、第10天)。左欄為對照組(在含有成纖維細胞的膠原凝膠上培養(yǎng)表皮角化細胞的情況)的結(jié)果。培養(yǎng)皿的中央?yún)^(qū)域中觀察到的圓形、點狀是細胞(細胞層)。
在試驗組(左欄)中，從第1天到第10天細胞層大幅度擴大。即，可知細胞良好地增殖，而且向周邊的游走加快。另一方面，在對照組中，第1天和第10天中看不到細胞層的大小有明顯的變化。從以上的結(jié)果明確，在羊膜上細胞的增殖率高，而且游走明顯加快。
2.羊膜上的表皮角化細胞的增殖及游走試驗2(與三維培養(yǎng)法組合)首先，按實施例1中記述的步驟實施三維培養(yǎng)(在粘附于膠原凝膠上的羊膜上進行表皮角化細胞的培養(yǎng)及其后續(xù)的空氣曝露)，制作羊膜上形成細胞層的培養(yǎng)表皮細胞片(因空氣曝露而多層化開始后第7天的物質(zhì))。另一方面，在含有成纖維細胞的膠原凝膠上，使存在其上皮的一側(cè)朝上，以把去除上皮的羊膜展平的狀態(tài)使其載置、附著。接著，把培表皮片挖出直徑約8mm的圓形，載置到含有成纖維細胞的膠原凝膠上的羊膜上，靜置。然后，觀察表皮角化細胞層向周圍擴散1天后、7天后、10天后以及14天后的情況。把以下兩種情況作為比較對象即除了不使用羊膜以外設(shè)為同樣條件的情況(對照組1)；以及把不使用羊膜進行三維培養(yǎng)而得到的細胞層(在膠原凝膠上直接播種表皮角化細胞，其后培養(yǎng)得到的細胞層)直接載置到含有成纖維細胞的膠原凝膠上的情況(對照組2)。在此，羊膜和表皮角化細胞懸浮液均用實施例1中記載的方法調(diào)制。
從培養(yǎng)開始第1天、第7天、第10天以及第14天的培養(yǎng)皿內(nèi)的狀態(tài)示于圖4中。圖4的左欄為實驗組(在附著于含有成纖維細胞的膠原凝膠上的羊膜上載置培養(yǎng)表皮片，進行培養(yǎng)的情況)的結(jié)果(從上依次為第1天、第7天、第10天以及第14天)。中間欄為對照組1(在含有成纖維細胞的膠原凝膠上載置培養(yǎng)表皮片，進行培養(yǎng)的情況)的結(jié)果。同樣，右欄為對照組2(將不使用羊膜進行三維培養(yǎng)而獲得的細胞層載置到含有成纖維細胞的膠原凝膠上，進行培養(yǎng)的情況)的結(jié)果。
在圖4中，在培養(yǎng)皿的大致中央處觀察到的是細胞(細胞層)。試驗組(左欄)中，隨著時間的經(jīng)過細胞層明顯地擴大。即，可知細胞良好地增殖，而且向周邊游走加快。另外，對照組1(中間欄)中可見到隨著時間的經(jīng)過細胞層稍許擴大，但其程度與實驗組相比相差很大。此外，對照組2(右欄)中觀察期間在細胞層的大小方面沒有發(fā)生明顯變化。如上可知，即使對于構(gòu)成通過三維培養(yǎng)而獲得的培養(yǎng)表皮片的細胞，由于在羊膜上培養(yǎng)可獲得高的細胞增殖率，而且細胞向周邊的游走明顯加快。
3.小結(jié)從1.和2.的結(jié)果明確，在羊膜上表皮角化細胞的增殖良好，而且細胞的游走能力也良好發(fā)揮。此外，根據(jù)2.的結(jié)果，認為把在含有成纖維細胞的膠原凝膠上載置的羊膜上培養(yǎng)的表皮角化細胞與羊膜一起回收，把它移植到事先移植到皮膚缺損部的另外的羊膜上的方法是優(yōu)異的表皮再建術(shù)。這種情況的移植技術(shù)的具體例如下所示。
(1)對于皮膚全層及至皮下組織的缺損創(chuàng)傷，首先進行清創(chuàng)(debridement)，去除壞死組織。詳細地說，在缺損創(chuàng)傷周圍注射1％Xylocaine E之后，用手術(shù)刀或剪子去除壞死組織，使?jié)兠嫫教够?。然后移植人工真皮，進行包扎(tie over)固定。
(2)1～2周后去除植皮紗布，確認人工真皮存活。具體來說，用目視確認人工真皮附著于潰瘍底面，用手指左右揉動確認沒有移動。此外，目視確認人工真皮的下面沒有滲出液、血液貯留。接著，在存活的人工真皮上移植羊膜(確認去除上皮成分、細菌呈陰性，把凍結(jié)保存的羊膜加溫到37℃后，用滅菌生理鹽水清洗2次后的羊膜)，用繃帶、膠帶、植皮紗布等固定。
(3)以固定狀態(tài)保持數(shù)天后，確認羊膜在人工真皮上存活。具體來說，目視確認羊膜與人工真皮之間沒有滲出液、血液貯留。而且確認用手指左右揉動也不移動。
(4)將預先準備好的三維培養(yǎng)表皮片(用羊膜和細胞層構(gòu)成的物質(zhì)，或只有細胞層構(gòu)成的物質(zhì))以小片植皮進行移植(例如一個小片的直徑為15mm)。固定3天，之后以2天1次的頻率進行消毒處理(0.05％洗必泰水、消毒用聚乙烯吡咯烷酮碘液)。
(5)由于被移植到羊膜上，認為構(gòu)成三維培養(yǎng)表皮片的細胞具有良好的增殖和游走。其結(jié)果是，細胞層迅速擴大，期待發(fā)揮更好的治療效果。
產(chǎn)業(yè)上的利用可能性本發(fā)明提供的活體組織片的用途廣，能夠用于皮膚表皮、角膜上皮、口腔粘膜上皮、氣管粘膜上皮以及腸管粘膜上皮等的再生(再建)中。其中，可以優(yōu)選用于皮膚表皮或角膜上皮的再生中。
此外，還可以將本發(fā)明的活體組織片用于基因治療中?；蛑委熤写篌w有體內(nèi)(in vivo)法和體外(ex vivo)法，前者是把基因直接導入到機體內(nèi)的方法，后者是先取出細胞，導入基因后再重新回到體內(nèi)的方法。鑒于目前基因治療的技術(shù)水平，只要向培養(yǎng)皮膚、培養(yǎng)角膜上皮、培養(yǎng)腸管粘膜上皮片中導入基因立即向體外法發(fā)展。各種病毒載體向角質(zhì)化細胞的基因?qū)氲挠行员伙@實出來，特別是使用腺病毒載體的情況幾乎100％地可以導入到角質(zhì)化細胞中。皮膚科領(lǐng)域中的基因治療中，對于以VII型膠原、昆布氨酸5等的異常為原因的先天性皮膚皰疹等的遺傳病的治療，預想用在自體培養(yǎng)表皮片中導入正常基因的方法將獲得極有效的治療效果。此外，對于糖尿病、血友病等缺乏體內(nèi)分子而引起的全身性疾患，向角質(zhì)化細胞中導入基因，使其產(chǎn)生缺乏分子，培養(yǎng)皮膚可以被用作補充的、所謂的傳遞體系，預計今后培養(yǎng)活體組織的應用會進一步發(fā)展。
應說明的是，在日本，有關(guān)異體移植由于倫理性及安全性的確認方面存在問題而一般沒有普及，專注發(fā)展自體移植是目前的現(xiàn)狀，由此認為，今后會推動三維培養(yǎng)活體組織的自體移植。
本發(fā)明并不限于上述發(fā)明的實施方式和實施例的說明。不脫離權(quán)利要求的范圍的記述，在本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的范圍內(nèi)的各種改變方式也包括在發(fā)明中。
本說明書中所示的論文、公開專利公報以及專利公報等的內(nèi)容，通過援用其全部內(nèi)容而引用。
權(quán)利要求
1.活體組織片，其含有在不存在異種動物細胞的情況下，于羊膜上增殖的來自于活體的細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活體組織片，其特征為，在含有人成纖維細胞的膠原凝膠上載置有所述羊膜的狀態(tài)下，使所述來自于活體的細胞增殖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的活體組織片，其特征為，使用無血清培養(yǎng)基，使所述來自于活體的細胞增殖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的活體組織片，其特征為，使用只包含來自于受者的血清作為血清成分的培養(yǎng)基，使所述來自于活體的細胞增殖。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4中的任一項所述的活體組織片，其特征為，所述來自于活體的細胞為來自于角膜上皮、結(jié)膜上皮、皮膚表皮、毛囊上皮、口腔粘膜、氣管粘膜或腸管粘膜的細胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～5中的任一項所述的活體組織片，其特征為，所述羊膜是去除上皮的羊膜。
7.根據(jù)權(quán)利要求1～6中的任一項所述的活體組織片，其特征為，除了增殖的細胞之外，還含有作為培養(yǎng)基質(zhì)的所述羊膜。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的活體組織片，其特征為，其是通過第2羊膜而被移植到組織缺損部的移植材料。
9.根據(jù)權(quán)利要求1～6中的任一項所述的活體組織片，其特征為，含有如下細胞，即將在不存在異種動物細胞的情況下、于載置于含有人成纖維細胞的膠原凝膠上的羊膜上增殖的來自于活體的細胞與所述羊膜一起載置于第2羊膜上，進一步使其增殖而得到的細胞。
10.活體組織片的制作方法，其包括以下步驟(a)調(diào)制來自于活體的細胞的步驟；(b)在羊膜上播種所述來自于活體的細胞的步驟；(c)在不存在異種動物細胞的情況下，培養(yǎng)所述來自于活體的細胞而使其增殖的步驟。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制作方法，其特征為，所述步驟b包括以下步驟(b-1)在膠原凝膠內(nèi)培養(yǎng)人成纖維細胞的步驟；(b-2)在所述膠原凝膠上載置羊膜后，把所述來自于活體的細胞播種到該羊膜上的步驟。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的制作方法，其特征為，進一步包括以下步驟(d)所述來自于活體的細胞增殖后，使最表層與空氣接觸的步驟。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的制作方法，其特征為，進一步包括以下步驟(e)把所述來自于活體的細胞和所述羊膜一起回收的步驟；(f)把回收的所述來自于活體的細胞和所述羊膜以羊膜側(cè)朝下載置在第2羊膜上之后，培養(yǎng)所述來自于活體的細胞而使其增殖的步驟。
14.根據(jù)權(quán)利要求10～13中的任一項所述的制作方法，其特征為，所述步驟c是使用無血清培養(yǎng)基來實施的。
15.根據(jù)權(quán)利要求10～13中的任一項所述的制作方法，其特征為，所述步驟c是使用只含有來自于受者的血清作為血清成分的培養(yǎng)基來實施的。
16.根據(jù)權(quán)利要求10～15中的任一項所述的制作方法，其特征為，所述來自于活體的細胞是來自于角膜上皮、結(jié)膜上皮、皮膚表皮、毛囊上皮、口腔粘膜、氣管粘膜或腸管粘膜的細胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求10～16中的任一項所述的制作方法，其特征為，所述羊膜是去除上皮的羊膜。
18.皮膚表皮細胞的調(diào)制方法，其包括以下步驟(A)把皮膚表皮細胞播種到羊膜上的步驟；(B)培養(yǎng)所述皮膚表皮細胞而使其增殖的步驟；(C)回收增殖的皮膚表皮細胞的步驟。
19.移植方法，其使用權(quán)利要求1～9中的任一項的活體組織片作為移植材料。
全文摘要
本發(fā)明提供有望高治療效果而且移植時安全性高的活體組織片。通過如下方式制作活體組織片(a)調(diào)制來自于活體的細胞；(b)在羊膜上播種上述來自于活體的細胞；(c)在不存在異種動物細胞的情況下，通過培養(yǎng)上述來自于活體的細胞而使其增殖。作為來自于活體的細胞，使用如來自于角膜上皮、結(jié)膜上皮、皮膚表皮、毛囊上皮、口腔粘膜、氣管粘膜或腸管粘膜的細胞。
文檔編號A61L27/38GK1929878SQ20058000777
公開日2007年3月14日 申請日期2005年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月11日
發(fā)明者橋本公二, 白方裕司, 大橋裕一, 羽室淳爾 申請人:阿如布勒斯特有限公司, 橋本公二