專利名稱：重組水禽流感病毒 h7 亞型血凝素抗原、制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及到一種重組水禽流感病毒H7亞型血凝素抗原、制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
禽流感(avian influenza)，全稱禽類流行性感冒病毒感染，是由正粘病毒科、流感病毒屬的A型流感病毒引起禽類的一種從呼吸系統(tǒng)感染到敗血癥等多種癥狀的傳染病，禽類感染后病死率很高。1878年，Perroncito在意大利首次發(fā)現(xiàn)禽流感。1900年其病原體首次被人發(fā)現(xiàn)，1955年才經(jīng)血清學(xué)證實(shí)屬A(甲)型流感病毒。此后禽流感病毒一直在世界各地家禽中普遍存在，并造成了程度不同的影響。特別是1997年香港爆發(fā)的禽流感已經(jīng)對人類健康構(gòu)成威脅。至此，禽流感問題引起了世界各地的廣泛關(guān)注。禽流感在全球廣泛分布，其主要的儲存宿主是水禽和遷徙的鳥類。
由于A型流感病毒引起的禽流感，其病理變化因感染病毒毒株毒力的強(qiáng)弱、病程長短和禽種的不同而不同。其臨床癥狀因感染禽的種類、年齡、性別、并發(fā)感染情況及所感染毒株的毒力和其他環(huán)境等不同而表現(xiàn)出的癥狀很不一致。雞的流感病毒的抗體檢測相繼建立了雞流感瓊脂擴(kuò)散(AGP)、血球凝集抑制試驗(yàn)(HI)、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等血清學(xué)檢測技術(shù)。然而，由于水禽的品種特殊性，其流感抗體的檢測方法一直是困惑水禽疫苗免疫效果評估和水禽流感診斷的難題。因此，研制開發(fā)適用于水禽流感抗體檢測的特異的、敏感的、生物安全度高的、適合于基層使用的診斷檢測的器具，對水禽免疫水平進(jìn)行實(shí)時監(jiān)控和建立科學(xué)、靈活的水禽流感的免疫程序，以及對疫病的預(yù)防和控制有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種重組水禽流感病毒H7亞型血凝素抗原、制備方法及其用途。
重組水禽流感病毒H7亞型血凝素抗原水禽流感病毒H7亞型的核糖核酸為模板，通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增獲得血凝素基因，將該基因克隆于大腸桿菌原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞后，用異丙基-b-d-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)并純化獲得血凝素蛋白抗原。
所述的血凝素基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸開放讀碼框序列，并且編碼具有SEQID No.2所示的多肽序列。
重組水禽流感病毒H7亞型血凝素抗原的制備方法的步驟如下1)水禽流感病毒H7亞型的核糖核酸為模板，以5’-CGAGATCTGACAAAATTTGCCTTGG-3’，5’-ACAAGCTTTTACCCTGTTGCCAGTAGT-3’引物，通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴(kuò)增獲得血凝素基因；2)將血凝素基因插入到原核表達(dá)載體PET28a，獲得含有血凝素基因的原核表達(dá)重組載體PET-血凝素；3)將該重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞BL21，并用異丙基-b-d-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)；4)誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白經(jīng)Ni-NTA Argarose純化系統(tǒng)可得到純的H7血凝素蛋白抗原。
重組水禽流感病毒H7亞型血凝素抗原在診斷中的用途利用原核表達(dá)的血凝素蛋白作為抗原檢測H7亞型流感病毒感染產(chǎn)生的抗血凝素蛋白抗體，診斷水禽流感病毒及免疫動物的抗體水平。
本發(fā)明具有如下積極效果1.基于重組的水禽流感病毒H7亞型血凝素抗原的診斷技術(shù)的建立為在我國對水禽流感的流行病學(xué)調(diào)查及診斷提供了重要的技術(shù)基礎(chǔ)；2.所生產(chǎn)的重組膜蛋白不僅生產(chǎn)容易，操作簡單而且純度較高，具有良好的特異性和敏感性；3.將重組膜蛋白純化后包被聚苯乙烯微量反應(yīng)板也可建立敏感性更高的ELISA診斷方法；4.建立了簡單、方便、快速易于推廣的水禽流感診斷方法，解決了一直困惑于我國的關(guān)于水禽流感的診斷問題。制作過程簡單，而且成本低，便于推廣使用；5.由于血凝素/HI技術(shù)除需要一定的技術(shù)條件外也容易產(chǎn)生非特異性的結(jié)果。而在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的膜蛋白不僅表達(dá)量高而且具有生物反應(yīng)活性，是近來用于生產(chǎn)診斷性抗原的一種新型方法，利用表達(dá)產(chǎn)物的生物活性可直接檢測病毒的感染，而且所表達(dá)的膜蛋白融合了組氨酸標(biāo)簽，這同時也使蛋白質(zhì)的純化易于操作。為建立更為敏感的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷方法提供了技術(shù)支持；6.高致病性禽流感是世界各國重點(diǎn)檢疫和防范的疫病，危害巨大，除直接影響?zhàn)B禽業(yè)的發(fā)展，給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成沉重打擊外，還影響禽類產(chǎn)品的安全和影響國內(nèi)、國際貿(mào)易。而且，還具有重要的公共衛(wèi)生意義，向人類健康提出了新的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。野生水禽尤其是鴨、鵝，被公認(rèn)為是禽流感病毒的儲存宿主和傳染源，因此為了研究和控制禽流感的廣泛流行，必須對野生水禽免疫水平進(jìn)行實(shí)時監(jiān)控并建立科學(xué)、靈活的水禽流感的免疫程序，為控制其流行達(dá)到預(yù)防目的。本產(chǎn)品為防治工作開創(chuàng)了新的途徑；7.水禽流感病毒H7亞型血凝素抗體間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷技術(shù)的建立為我國對該病的流行進(jìn)行調(diào)查及及時準(zhǔn)確的診斷和防治本病提供了技術(shù)基礎(chǔ)。以水禽流感病毒H7亞型血凝素蛋白為基礎(chǔ)可以進(jìn)行多方面的開發(fā)應(yīng)用，例如a.以重組蛋白為基礎(chǔ)的ELISA診斷技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對野生水禽及家禽的H7亞型禽流感感染的鑒別診斷；b.以重組膜蛋白為基礎(chǔ)可進(jìn)行血凝素蛋白的純化，進(jìn)而可用于研究血凝素蛋白的功能結(jié)構(gòu)等；以重組膜蛋白為基礎(chǔ)可進(jìn)行血凝素蛋白的純化，進(jìn)而建立更敏感的Dot-ELISA，免疫熒光和免疫印跡等診斷方法。


附圖是重組AIV/H7血凝素蛋白的抗原活性鑒定結(jié)果，圖中A為重組蛋白的聚丙稀酰胺凝膠電泳分析，B為重組蛋白的免疫印跡試驗(yàn)鑒定，M.為蛋白質(zhì)Marker，1為大腸桿菌BL21(DE3)菌體蛋白，2為重組質(zhì)粒未誘導(dǎo)菌體蛋白，3為重組質(zhì)粒誘導(dǎo)4h表達(dá)產(chǎn)物，4為純化的重組H7/血凝素融合蛋白，5為表達(dá)產(chǎn)物H7/血凝素蛋白的免疫印跡具體實(shí)施方式
重組水禽流感病毒H7亞型血凝素抗原是診斷水禽流感病毒H7亞型感染的重組膜蛋白，它采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了我國H7亞型水禽流感病毒分離株(H7N1亞型)血凝素基因，利用原核表達(dá)的血凝素蛋白作為抗原檢測水禽流感病毒H7亞型感染產(chǎn)生的抗血凝素蛋白抗體。
重組水禽流感病毒H7亞型血凝素抗原的表達(dá)方法是利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法克隆了分離于H7亞型水禽流感病毒的血凝素基因，然后將血凝素基因用限制性內(nèi)切酶消化下來再與相同處理的原核表達(dá)載體PET28a進(jìn)行連接，獲得含有血凝素基因的表達(dá)質(zhì)粒PET-血凝素(PETHA)；用PETHA轉(zhuǎn)化受體菌BL21(DE3)，挑取單個菌落，用誘導(dǎo)劑以不同濃度進(jìn)行誘導(dǎo)馴化，并在不同時間收集樣品。經(jīng)聚丙稀酰胺凝膠電泳分析證實(shí)血凝素的表達(dá)并確定異丙基-b-d-硫代半乳糖苷的最佳誘導(dǎo)濃度及誘導(dǎo)時間分別為1毫摩爾和4小時。用聚丙稀酰胺凝膠電泳后的蛋白帶進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，免疫印跡試驗(yàn)證實(shí)了所表達(dá)的重組膜蛋白大小相符，并具有反應(yīng)活性。通過特異性、敏感性及工作條件的選擇性實(shí)驗(yàn)，建立了水禽流感病毒H7亞型血凝素抗體間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測技術(shù)。
重組水禽流感病毒H7亞型血凝素抗原在診斷中可應(yīng)用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，瓊擴(kuò)診斷技術(shù)(AGIP)，免疫印跡試驗(yàn)(Western Blot)，也可用于檢測H7亞型流感病毒感染，包括H7亞型鴨流感病毒，H7亞型鵝流感病毒等其它水禽流感病毒。
實(shí)施例1重組水禽流感病毒H7亞型血凝素抗原的表達(dá)和制備方法一、H7N1亞型AIV的培養(yǎng)及RNA的提取取H7N1種毒經(jīng)尿囊腔接種于9-11日齡SPF雞胚，35℃溫箱孵育，收集24h后死亡雞胚尿囊液，采用差速離心法純化病毒，用TEN緩沖液重懸病毒，RNA提取按Trizol試劑盒說明書進(jìn)行；所提取的RNA用于RT-PCR。
合成用于擴(kuò)增AIV血凝素基因的引物根據(jù)Genebank中AIV/H7亞型的血凝素基因序列，針對血凝素基因的ORF兩端設(shè)計了5’端和3’端一對引物。5’端引物和3’端引物分別引入BglII、HindIII酶切位點(diǎn)。合成以下兩條引物5’端引物(P1)5’-CGAGATCTGACAAAATTTGCCTTGG-3’3’端引物(P2)5’-ACAAGCTTTTACCCTGTTGCCAGTAGT-3’二、血凝素基因的RT-PCR(一)AIV RNA的反轉(zhuǎn)錄取上述病毒RNA溶液，加入12umol/L的血凝素P1引物1ul，瞬時離心后置70℃孵育5分鐘，取出置冰上；然后加入反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的5×reaction buffer 4ul、20U/ul Rnasin 1ul、10mMdNTPs 2ul，混勻后置37℃孵育5分鐘，取出置冰上；再加入200U/ul AMV-Rnase 1ul，混勻后置42℃孵育1小時。最后置70℃水浴10分鐘滅活A(yù)MV-Rnase，迅速取出后置冰浴中5分鐘。
(二)血凝素基因的PCR取上述的4ul cDNA產(chǎn)物用作PCR模板，PCR反應(yīng)組成(50ul體系)TaKaRa LA Taq(5u/ul) 0.5ul10×LapCR Buffer(含Mg2+) 5uldNTP Mixture(各2.5mM) 1ul引物P1(12umol/L) 1ul引物P2(12umol/L) 1ul滅菌去離子水 37.5ulPCR反應(yīng)條件95℃預(yù)變性1min、94℃ 1min，50℃ 45s、72℃ 1.0min，進(jìn)行30個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束前72℃延伸10min。
三、表達(dá)載體PET-血凝素的構(gòu)建1、PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收目的片段，利用T-A克隆策略直接連接于PMD18-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選。挑取陽性克隆，分別進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定。
2、經(jīng)BglII、HindIII雙酶切后，回收目的片段并克隆于表達(dá)質(zhì)粒PET28a的BglII+HindIII酶切窗口中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒PET/血凝素(H7)，轉(zhuǎn)化宿主菌TOP10，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR、雙酶切鑒定和序列測定。
四、血凝素基因的誘導(dǎo)表達(dá)經(jīng)鑒定的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)宿主菌，挑取單克隆接種到含有卡那霉素的10mlLB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，按1∶100的比例將培養(yǎng)物接種于100mlLB培養(yǎng)基中，250rpm震蕩培養(yǎng)2小時左右，使OD600≈0.5，以10mM、5mM、1mM、0.5mM、0.1mM的終濃度加入100mM異丙基-b-d-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)馴化，分別在誘導(dǎo)后1小時、2小時、3小時、4小時和5小時收集菌液，離心收集菌體。將菌體加入適量的1×SDS上樣緩沖液，采用12％的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，考馬斯亮蘭染色，觀察結(jié)果。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析證實(shí)血凝素已表達(dá)，大小約35kD的融合蛋白并隨誘導(dǎo)時間的增加，表達(dá)量也增加，誘導(dǎo)4小時表達(dá)量最大。不同終濃度的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)時，目的蛋白都能表達(dá)，但在終濃度小于1mM時表達(dá)不明顯，因此確定IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度為1mM。薄層掃描分析，該蛋白可占菌體蛋白總量的10～15％。
五、蛋白活性的測定和純化Western-blot分析表達(dá)蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC)上，用含有5％(w/v)脫脂奶粉的PBS(PH＝7.4)37℃溫育1-2小時封閉NC膜；然后加入含5％脫脂奶粉、1％水禽流感標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的PBS 37℃溫育1小時；PBS洗滌膜三次后，加入用含5％(w/v)脫脂奶粉的PBS1/5000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗水禽IgG 37℃溫育1小時；PBS洗滌膜三次后，加入TMB顯色液進(jìn)行顯色，結(jié)果能見到與SDS-PAGE特異性條帶相對應(yīng)的反應(yīng)條帶。誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白采用Ni-NTA Argarose純化，具體操作參照說明書進(jìn)行。
實(shí)施例2H7亞型水禽流感病毒血凝素抗體間接ELISA檢測技術(shù)的建立一、水禽AIV/H7抗體檢測板的制備用pH8.5的0.05M Tris-HCl緩沖液作包被液，將水禽流感病毒H7/HA蛋白稀釋為10μg/ml，按100μl/孔加入可拆96孔酶標(biāo)板，37℃2小時，再4℃包被過夜，用含5％脫脂奶的PBS 37℃封閉2小時，以含0.05％吐溫-20的PBS(pH7.4)洗滌液充分洗滌，甩干。再加入20％蔗糖磷酸鹽緩沖液室溫保護(hù)3小時，置干燥室干燥后，用于H7亞型水禽流感病毒血凝素抗體間接ELISA檢測試劑盒裝配。
二、兔抗水禽IgG多克隆抗體的制備采取水禽全血，分離血清，以辛酸-硫酸銨沉淀法粗提水禽IgG。再經(jīng)Sephadex G200凝膠層析和DEAE纖維素離子交換層析進(jìn)一步純化，獲得IgG純品。將純化的水禽IgG蛋白按600～1000g/kg體重皮下和肌肉注射免疫健康兔4～5次，末次免疫一周后，靜脈采血，以ELISA測定其血清抗體效價在1∶2000以上時，心臟采血或頸動脈放血，收集高免血清；以辛酸-硫酸銨沉淀法純化兔抗水禽IgG抗體，不重述，再經(jīng)DEAE纖維素離子交換層析純化，收集濃縮兔抗水禽多克隆抗體，用于制備H7亞型水禽流感病毒血凝素抗體檢測試劑盒酶結(jié)合物工作液。
三、酶結(jié)合物工作液的制備用改良過碘酸鈉法將辣根過氧化物(HRP)酶偶聯(lián)于兔抗水禽IgG多克隆抗體。用超純水1ml溶解辣根過氧化物酶(HRP，RZ≥3.0)5mg溶液，加入1ml 0.06M過碘酸鈉溶液4℃避光1小時，加入1ml 160mM乙二醇，室溫反應(yīng)30分鐘，加入PH4.4的醋酸緩沖液2-8℃透析過夜，換液兩次。將10mg純化的兔抗水禽IgG加入上述活化的酶中，轉(zhuǎn)移至透析袋，于0.05mMPH9.6的碳酸緩沖液中透析，4℃攪拌過夜(換液兩次)。透析液吸至離心管中，加入5mg/ml的NaBH4液0.4ml，4℃反應(yīng)2小時。加入等量的飽和硫酸銨溶液，4℃30分鐘，4℃4000轉(zhuǎn)離心20分鐘，棄上清，瀝干。將沉淀溶于少量PBS，裝入透析袋中，對0.02M PBS(PH7.4)透析，4℃過夜。將透析液中液體吸至離心管中，離心，將上清液吸出，加等量甘油，混勻，-20℃保存。再以含0.1％BSA，0.05％吐溫-20，0.01％硫柳汞鈉的磷酸緩沖液(pH7.4)按1∶200-5000稀釋凍存的標(biāo)記酶作為酶結(jié)合物工作液。
四、樣品稀釋液、洗滌液、終止液的配制樣品稀釋液為含0.05％吐溫-20的0.01M磷酸鹽緩沖液(KH2PO4 0.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，NaCl 8g，定容至1000ml，pH7.4，再加0.5ml吐溫-20)；10×濃縮洗滌液為含0.5％吐溫-20的0.1M磷酸鹽緩沖液(KH2PO4 2g，Na2HPO4·12H2O 29g，NaCl 80g，定容至1000ml，pH7.4，再加5ml吐溫-20)；終止液為2M硫酸溶液，即量取111.2ml濃硫酸(18M)稀釋定容至1000ml。
五、陽性對照和陰性對照的制備將用H7/HA蛋白免疫獲得的H7亞型水禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清用樣品稀釋液1∶100稀釋(OD450nm≥1.00)加入少量紅色顏料并按1000U/ml加入青霉素和鏈霉素，無菌過濾，作為H7亞型AIV血凝素抗體間接ELISA檢測試劑盒陽性對照；將篩選獲得的水禽標(biāo)準(zhǔn)陰性血清用樣品稀釋液1∶100稀釋(OD450nm≤0.150)，按1000U/ml加入青霉素和鏈霉素，無菌過濾，作為H7亞型水禽流感病毒血凝素抗體間接ELISA檢測試劑盒陰性對照。
六、顯色液的配制稱取200mg四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，用100ml無水乙醇或DMSO溶解后，以雙蒸水定容至1000ml，配制顯色液A；稱取21g一水檸檬酸，28.2g無水磷酸氫二鈉(Na2HPO4)，6.4ml 0.75％過氧化氫尿素，雙蒸水定容至1000ml，調(diào)pH值到4.5-5.0，配制顯色液B。
七、試劑盒檢測操作程序其檢測程序?yàn)?)將10×濃縮洗滌液稀釋10倍即為洗滌液；2)將待檢血清用樣品稀釋液作1∶100稀釋，按100μl/孔加入抗體檢測板中，同時設(shè)空白(只加100μl樣品稀釋液)、陰性對照(水禽標(biāo)準(zhǔn)陰性血清)、陽性對照(H7亞型水禽標(biāo)準(zhǔn)陽性血清)，37℃孵育20-45分鐘，甩干；3)每孔加洗滌液200μl，洗滌6次，每次間隔1分鐘，拍干；4)每孔加100μl酶結(jié)合物工作液(空白不加)，37℃孵育20-45分鐘，甩干；5)每孔加洗滌液200μl，洗滌6次，每次間隔1分鐘，拍干；6)依次加50μl顯色液A和50μl顯色液B，混勻，37℃避光孵育5-15分鐘；7)加50μl終止液，用酶標(biāo)儀在450nm波長下讀取每孔光吸收值(OD450nm值)。
八、結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)判定標(biāo)準(zhǔn)以待檢樣本OD450nm值與標(biāo)準(zhǔn)陰性O(shè)D450nm值比值(P/N)，大于等于2.1判為陽性，小于等于1.7為陰性。介于1.7-2.1之間為可疑，須重檢，重測時P/N值大于等于2.0判為陽性，小于2.0為陰性。如果陽性對照無明顯顯色反應(yīng)，或陰性對照出現(xiàn)顯色，表明試劑盒失效或檢測操作有誤，需重新檢測。
實(shí)施例3.
利用瓊擴(kuò)診斷技術(shù)(AGIP)鑒定H7亞型流感抗體一、實(shí)驗(yàn)所用器材載玻片(2.6×7.6cm)，水平儀，毛細(xì)滴管，打孔器(常用直徑3mm的繪圖筆尖)，濕盒等。
二、實(shí)驗(yàn)用試劑pH8.6 0.1M巴比妥緩沖液巴比妥鈉10.3g，巴比妥1.84g，硫柳汞100mg，蒸餾水加至500.0ml。1-1.2％瓊脂凝膠優(yōu)質(zhì)瓊脂粉1.1-1.2g，蒸餾水50.0ml，水浴煮沸溶解，加上上述溫?zé)岚捅韧拙彌_液50.0ml，充分混勻，分裝(每支試管3.5-4.0ml，融化后澆一塊載玻片)，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 三、方法1.制板將載玻片置水平臺上，將水浴煮沸融化了的瓊脂澆板(一支試管的瓊脂澆一塊載玻片)。
2.打孔瓊脂冷卻后，用打孔器打孔，一般打成梅花型，挑去孔內(nèi)瓊脂。一塊載玻片上可打兩組孔，兩組孔之間的距離應(yīng)盡可能大些，但組內(nèi)抗原孔與抗體孔之間的距離不能過大，通常以3-4mm為宜。
3.加樣梅花型中間的孔加標(biāo)準(zhǔn)抗原即純化的AIV/H7HA蛋白，周圍孔中的一個孔加H7亞型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，其余的5孔分別加入5份待檢血清。
4.擴(kuò)散加樣后瓊脂板置濕盒中，于37℃溫箱中擴(kuò)散24-48小時后，觀察結(jié)果。
四、結(jié)果判定待檢血清與標(biāo)準(zhǔn)抗原孔之間產(chǎn)生沉淀線并與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清所產(chǎn)生的沉淀線吻接成一線，表明待檢血清為陽性(即該血清中含有AIV/H7亞型抗體)；待檢血清與已知抗原孔之間無沉淀線，或與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清所產(chǎn)生的沉淀線交叉，表明待檢血清陰性(即該血清中不含有AIV/H7亞型抗體)。
實(shí)施例4.
應(yīng)用免疫印跡試驗(yàn)(Western Blot)鑒定H7亞型流感抗體一、抗原分離用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血凝素蛋白。
二、抗原印跡切取抗原分離膠，置轉(zhuǎn)移緩沖液(甘氨酸2.98g，Trisbase 5.8g，SDS 0.37g，甲醇200ml，定容至1升)中平衡10-20分鐘。將硝酸纖維素濾膜(NC膜)、濾紙預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕，將兩張濾紙鋪在石墨板上，再依次鋪上NC膜，膠和另外兩張濾紙(注意不能讓上下兩層濾紙直接接觸，以免短路，每層之間不能留有氣泡)。用0.5-2mA/cm2的電流恒流轉(zhuǎn)移1-2小時。
三、抗原鑒定1.抗原印跡后將NC膜放在含5％脫脂奶粉的TBS(Trisbase 2.4228g，NaCl8.766g，定容至1升)溶液中37℃封閉2小時。
2.待檢血清和標(biāo)準(zhǔn)陽性血清用封閉液稀釋(TBS)至100倍，NC膜浸在其中37℃反應(yīng)1.5小時。
3.反應(yīng)完畢用TBST(1升TBS中加入500ul吐溫-20)清洗5次，每次在37℃慢搖5分鐘。
4.HRP標(biāo)記兔抗水禽二抗用封閉液稀釋500倍，將NC膜浸在其中37℃反應(yīng)1.5小時。
5.反應(yīng)完畢用TBST清洗5次，每次在37℃慢搖5分鐘。
6.將適量顯色底物TMB倒入一干凈平皿，再將NC膜浸入TMB中反應(yīng)，待出現(xiàn)明顯條帶或底色是用水沖洗NC膜，終止反應(yīng)。
四、結(jié)果判定觀察顯色后的NC膜，在加入標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的膜上出現(xiàn)一條與H7HA蛋白大小一致的顯色條帶，說明此次實(shí)驗(yàn)是成功的，在加入待檢血清的膜上出現(xiàn)一條與陽性條帶一致的顯色條帶時，說明此待檢血清為陽性，如果沒有出現(xiàn)，表明待檢血清不含有AIV/H7抗體。
序列表(1)SEQ ID No.1的信息(a)序列特征長度930個堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA(c)最初來源水禽鴨流感病毒(d)序列描述SEQ ID No.1SEQ ID No.1GACAAAATTTGCCTTGGACATCATGCTGTGTCAAACGGAACTAAGATAAACACACTAACTGAGAGAGGGGTAGAGGTTGTCAACGCAACTGAAACAGTGGAGCGAACAAACCTTCCCAAAATATGTTCAAAAGGGAAAAGAACAATCGACCTTGGCCAGT
GTGGACTGTTGGGAACAGTCACTGGACCACCTCAGTGTGATCAATTCCTAGAATTCTCAGCTGATTTGATCATCGAGAGGCGAGAAGGAAATGATGTTTGTTACCCTGGAAAATTTGTAAACGGAGAGGCTCTGCGGCAAATTCTCAGGGAATCAGGCGGAATTGACAAGGAAACAATGGGATTCACATACAGCGGAATAAGAACCAATGGAGCAACTAGTGCATGCAAAAGATCAGGATCTTCATTCTATGCAGAGATGAAATGGCTTCTGTCGAATACAGACAATGCTGCTTTCCCGCAAATGACGAAATCGTACAAAAACACAAGGAAGGATCCAGCTCTGATAGTCTGGGGGATTCATCATTCCGGATCAACCACAGAACAGACCAAATTATATGGAAGTGGGAACAAGTTAATAACAGTTGGGAGCTCCAATTATCAACAGTCCTTTGTACCAAGTCCGGGGGCGAGACCACAAGTGAATGGCCAATCTGGACGGATCGATTTCCATTGGCTAATACTGAATTCCAATGACACAGTCACTTTCAGCTTCAATGGGGCTTTCATAGCTCCAGATCGTGCAAGTTTTCTGAGAGGGAAGTCCATGGGAATCCAGAGTGATGTACAAGTTGACGCCAACTGTGAAGGGGATTGCTACCATAGTGGAGGAACAATAATAAGTAATTTGCCCTTTCAAAATATCAATAGCGGAGCAGTAGGAAAATGTCCGAGGTATGTGAAACAAGAGAGCCTACTACTGGCAACAGGG(2)SEQ ID No.2的信息(a)序列特征長度310個氨基酸類型氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型多肽(c)序列描述SEQ ID No.2SEQ ID NO.2DKICLGHHAVSNGTKINTLTERGVEVVNATETVERTNLPKICSKGKRTIDLGQCGLLGTVTGPPQCDQFLEFSADLIIERREGNDVCYPGKFVNGEALRQILRESGGIDKETMGFTYSGIRTNGATSACKRSGSSFYAEMKWLLSNTDNAAFPQMTKSYKNTRKDPALIVWGIHHSGSTTEQTKLYGSGNKLITVGSSNYQQSFVPSPGARPQVNGQSGRIDFHWLILNSNDTVTFSFNGAFIAPDRASFLRGKSMGIQSDVQVDANCEGDCYHSGGTIISNLPFQNINSGAVGKCPRYVKQESLLLATG
權(quán)利要求
1.一種重組水禽流感病毒H7亞型血凝素抗原，其特征在于水禽流感病毒H7亞型的核糖核酸為模板，通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增獲得血凝素基因，將該基因克隆于大腸桿菌原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞后，用異丙基-b-d-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)并純化獲得血凝素蛋白抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組水禽流感病毒H7亞型血凝素抗原，其特征在于所述的血凝素基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸開放讀碼框序列，并且編碼具有SEQ ID No.2所示的多肽序列。
3.一種重組水禽流感病毒H7亞型血凝素抗原的制備方法，其特征在于，方法的步驟如下1)水禽流感病毒H7亞型的核糖核酸為模板，以5’-CGAGATCTGACAAAATTTGCCTTGG-3’，5’-ACAAGCTTTTACCCTGTTGCCAGTAGT-3’為引物，通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴(kuò)增獲得血凝素基因；2)將血凝素基因插入到原核表達(dá)載體PET28a，獲得含有血凝素基因的原核表達(dá)重組載體PET-血凝素；3)將該重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞BL21，并用異丙基-b-d-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)；4)誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白經(jīng)Ni-NTA Argarose純化系統(tǒng)可得到純的H7血凝素蛋白抗原。
4.一種重組水禽流感病毒H7亞型血凝素抗原在診斷中的用途，其特征在于利用原核表達(dá)的血凝素蛋白作為抗原檢測H7亞型流感病毒感染產(chǎn)生的抗血凝素蛋白抗體，診斷水禽流感病毒及免疫動物的抗體水平。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組水禽流感病毒H7亞型血凝素(HA)抗原、制備方法及其用途。本發(fā)明的重組水禽流感病毒H7亞型血凝素抗原，它采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了我國水禽流感病毒分離株的血凝素基因，利用表達(dá)的血凝素蛋白作為抗原可檢測H7亞型流感病毒及感染產(chǎn)生的抗血凝素蛋白抗體。雖然A型流感病毒亞型眾多，但血凝素抗原是流感病毒分類和診斷基礎(chǔ)，因此，基于重組水禽流感病毒血凝素蛋白抗原建立的診斷技術(shù)可以檢測鴨、鵝等水禽流感病毒的感染。本發(fā)明所生產(chǎn)的重組膜蛋白不僅生產(chǎn)容易，操作簡單而且純度較高，具有良好的特異性和敏感性。且重組膜蛋白純化后包被聚苯乙烯微量反應(yīng)板也可建立敏感性更高的ELISA診斷方法。
文檔編號A61K39/145GK1772763SQ20051006137
公開日2006年5月17日 申請日期2005年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月2日
發(fā)明者周繼勇, 吳建祥, 陳洪勛 申請人:浙江大學(xué)