專利名稱：人溶菌酶凝膠劑、制法及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，特別是人溶菌酶藥物及其制法、應用。
背景技術：
抗生素創(chuàng)造了許多醫(yī)學奇跡，使許多疾病消失無蹤，如肺炎、腦膜炎、產(chǎn)褥熱、敗血癥、結(jié)核等。21世紀的今天，耐藥菌的發(fā)展令人觸目驚心。如耐青霉素的肺炎鏈球菌，過去對青霉素、紅霉素、磺胺等藥品都很敏感，現(xiàn)在幾乎“刀槍不入”。肺炎克雷伯氏菌對西力欣、復達欣等16種高檔抗生素的耐藥性高達51.85％-100％。而耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)除萬古霉素外已經(jīng)無藥可治。從細菌的耐藥發(fā)展史可以看出，在某種新的抗生素出現(xiàn)以后，就有一批耐藥菌株出現(xiàn)。開發(fā)一種新的抗生素一般需要10年左右的時間，而一代耐藥菌的產(chǎn)生只要2年的時間，抗生素的研制速度遠遠趕不上耐藥菌的發(fā)展速度。目前急需開發(fā)一種針對不同耐藥菌株均有效的“超級抗生素”用于臨床治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服上述不足問題，提供一種人溶菌酶凝膠劑，劑型合理，使用方便、作用時間長、療效更高，另外還提供其制法，制法簡單易操作，提供其最適合的應用，以更佳的提高其作用效果。
本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的所采用的技術方案是人溶菌酶凝膠劑，含有人溶菌酶300U～300萬U/mL。
所述凝膠劑中還可以加入殺螨止癢劑SM-650。
所述人溶菌酶為基因工程表達的重組人溶菌酶或基因工程表達人溶菌酶的氨基端帶有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修飾的人溶菌酶或基因工程表達或化學合成突變體重組人溶菌酶。
所述人溶菌酶凝膠劑的配方可以是下述兩種(1)純度95％的基因重組人溶菌酶300U～300萬U/mL/g，聚乙二醇400在60～600，硬脂醇10～30，甘油5～50，吡咯烷銅酸鈉5～50，尼泊金甲酯0.15～1.5，蒸餾水18.5～268.5。
(2)純度95％的基因重組人溶菌酶300U～300萬U/mL/g，羧甲基纖維素鈉1～10，甘油2～20，吡咯烷銅酸鈉5～50，尼泊金甲酯0.15～1.5，蒸餾水91.85～918.5本發(fā)明所述凝膠劑的制法將純度95％的基因重組人溶菌酶制得300U～300萬U/mL/g，將各原料在常溫下混合均質(zhì)，在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程完成，制成凝膠劑。
本發(fā)明人溶菌酶凝膠劑在治療由金黃色葡萄球菌、化膿性葡萄球菌、銅綠假單胞菌、表葡菌、丙酸桿菌和耐藥菌引起的痤瘡、燙傷、燒傷、皮膚疾病中的應用。
在治療由金黃色葡萄球菌、化膿性葡萄球菌、銅綠假單胞菌、表葡菌、丙酸桿菌和耐藥菌引起的皮膚潰瘍疾病以及病毒引起的皮膚病中的應用。
本發(fā)明人溶菌酶凝膠劑發(fā)掘了人溶菌酶藥物的新的劑型，人溶菌酶安全無毒副作用，有很好的藥用前景。來源豐富，制備工藝簡單，并可做成凝膠劑使用方便，而且針對某些疾病有其特殊的效果，水凝膠含20％-40的固體物，水性凝膠基質(zhì)大多在水中溶脹成水性凝膠而不溶解。凝膠在釋藥系統(tǒng)周圍形成一層稠厚的凝膠屏障，藥物可以通過擴散作用通過凝膠屏障而釋放，釋放速度因凝膠屏障的作用而被延緩。本類基質(zhì)一般易涂展和洗除，由于粘滯度較小而利于藥物釋放，特別是水溶性藥物的釋放，具有釋藥快、對皮膚無刺激性、無油膩感、能吸收組織滲出液不防礙皮膚正常功能。其他劑型與凝膠劑相比有不足，如噴霧劑、滴劑使用不如凝膠劑方便，藥物劑量不如其精確，藥物在創(chuàng)面保留時間短；膏劑由于粘滯度較大，容易黏附其它物質(zhì)，或者被其它物質(zhì)黏附掉，藥物劑量不如其精確，藥物在創(chuàng)面保留時間短。而本發(fā)明凝膠劑使用方便，可直接涂抹于創(chuàng)面并形成一層膜，藥物劑量精確，藥物在創(chuàng)面保留時間長，作用時間長，效果更佳。
為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面將用基因重組人溶菌酶的藥理試驗及結(jié)果來說明其在制藥領域中的新用途。
基因重組人溶菌酶以配制200毫升培養(yǎng)基為基準，用H3PO44-8毫升、MgSO41-5克，K2SO42-6克，KOH1-3克，CaSO42H2O1-3.5克，加蒸餾水至200毫升，高壓滅菌后接種甘油管種子，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為每分鐘250轉(zhuǎn)，培養(yǎng)溫度為20-35℃，在恒溫床上培養(yǎng)36-48小時。進行種子罐培養(yǎng)后進行生產(chǎn)罐培養(yǎng)。將發(fā)酵表達完成的培養(yǎng)液進行提取純化，對提取純化的蛋白濃縮液冰凍干燥，測定蛋白量、純度和溶菌酶活性保存。將制備好的純度95％～99％活性30000U/mL/g基因重組人溶菌酶備用。
一、基因重組人溶菌酶(HLZ)體內(nèi)外抗菌作用評價1體外抗菌作用藥品及試劑1、人溶菌酶(Human Lysozyme HLZ)活性單位30000單位/mL，由大連奇龍生物技術研究所提供。
2、對照溶菌酶(contral Lysozyme，CLZ)白色粉未，活性單位50000單位/mg，美國SIGMA公司產(chǎn)品，批號L6876。
3、克拉霉素效價948μ/mg，中國藥品生物制品檢定所標準品，批號4、羅紅霉素效價878μ/mg，中國藥品生物制品檢定所標準品，批號5、注射用阿莫西林哈爾濱制藥廠產(chǎn)品，批號010504。
6、瓊脂糖(B10WEST AGAROSE)7、三羥甲基氨基甲烷(Tris)成都化學試驗廠，批號010211
試驗菌株所用菌株均為2001.4-2002.4月于四川、北京地區(qū)收集的臨床分離致病菌。經(jīng)本室用API方法重新鑒定后用于試驗。
質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923大腸埃希菌ATCC25922銅綠假單孢菌ATCC27853培養(yǎng)基1、Tris-HCl緩沖液0.1M Tris 100ml，0.1M HCl70ml，High Water 800ml，測PH值，用HCl溶液調(diào)至PH7.2，加High Water至1000ml。
2、Tris-HCl脂瓊養(yǎng)基在Tris-Cl緩沖液中加入脂瓊糖116℃天菌后使用。
3、M-H培養(yǎng)基中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品，M-H肉湯培養(yǎng)基稱取25g加1000ml蒸餾水，加熱溶解，分裝，高壓滅菌，116℃ 20分鐘。M-H固體培養(yǎng)基稱取36g，加1000ml蒸餾水，高壓滅菌，116℃ 20分鐘，用于革蘭陽性、陰性需氧菌的藥敏試驗。
4、血培養(yǎng)基，即在M-H培養(yǎng)基中加5-10％脫纖維兔血配制而成，用于腸球菌、鏈球菌的藥敏試驗。
試驗方法體外抗菌活性(MIC)測定采用瓊脂二倍稀釋法測定受試藥物對試驗菌株的最低抑菌濃度(MIC)。將受試藥物用滅菌蒸餾水溶解，適當稀釋。分別取1ml藥液加9ml融化的Tris-HCl瓊脂糖固體培養(yǎng)基混勻，以二倍稀釋，制備系列含藥平皿。每皿所含藥物終濃度分別為4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03……0.001mg/ml；用多點接種儀將稀釋至105CFU/ml的試驗菌液接種于各含藥平皿表面，置于37℃培養(yǎng)8-10小時，取出分別吸取6ml融化的M-H培養(yǎng)基(50℃)覆蓋上述系列平皿表面，再置于37℃培養(yǎng)10小時取出，觀察結(jié)果，以無細菌生長平皿內(nèi)所含最低藥物濃度為該菌的最低抑菌濃度(MIC)。
2、體內(nèi)抗菌作用評價藥品人溶性酶來源同前。
克拉霉素來源同前。
羅紅霉素來源同前。
阿莫西林來源同前。
細菌金黃色葡球菌01193，金黃色葡球菌MRSA021923均為臨床分離致病菌。
動物昆明種小鼠，體重18-22克，由本所動物室提供。
試驗方法1、體內(nèi)保護試驗挑取一定量的菌苔接種于2ml M-H液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)6小時后，取出用滅菌干酵母液進行適當稀釋(10-1，10-2，10-3，10-4)，再取昆明種小鼠，隨機分組，每組5只鼠，分別腹腔感染不同菌量的受試菌液，測定引起小鼠100％死亡的最小致死菌量(MLD)。再按1∶0.5劑間距設置5個劑量組，每組10只鼠，每只小鼠腹腔感染1MLD菌量的菌液0.5ml，感染后即刻靜脈注射受試藥0.5ml，設感染對照組(不給藥)，觀察1周，記錄小鼠死亡數(shù)。按Bliss法計算半數(shù)有效劑量ED50及95％可信限。
2、小鼠皮膚燒傷感染模型的療效評價昆明種小鼠26-30g，隨機分組，每組5只鼠，分別皮膚燒傷感染模型噴涂金黃色葡萄球菌菌液100ml，菌量為108CFU/ml，連續(xù)噴5次(間隔10分鐘噴一次)，末次噴菌后6小時，分別用無菌棉簽挑取皮膚燒傷感染模型涂于無藥瓊脂平板表面，37℃培養(yǎng)18小時，皮膚燒傷感染模型感染細菌數(shù)在＞103CFU/ml，且經(jīng)革蘭氏染色、光鏡檢測為金黃色葡萄球菌的小鼠為感染模型成功。選取皮膚燒傷感染模型感染成功小鼠隨機分組，每組10只鼠，分別用噴霧器噴涂受試藥物100μl/次，4次/日，連續(xù)5日，每日采用咽試子涂片法，于瓊脂平板表面進行活菌計數(shù)，作統(tǒng)計學處理，與感染對照組和克拉霉素組、羅紅霉素給藥組作比較。
表1人溶菌酶、雞溶菌酶、克拉霉素和羅紅霉素體內(nèi)外抗菌活性

續(xù)表2

續(xù)表3

試驗結(jié)果(1)人溶菌酶對臨床分離菌株的體外抗菌活性見表1。(2)克拉霉素、羅紅霉素、阿莫西林與人溶菌酶以1∶1聯(lián)合用藥的體外抗菌作用結(jié)果見續(xù)表2。(3)人溶菌酶對379株臨床分離致病菌的MIC50、MIC90見續(xù)表3。
以上試驗結(jié)果表明人溶菌酶體外具有一定抗菌作用，體內(nèi)對傷口感染潰爛的療效較確切。
二、動物模型試驗A、人溶菌酶對大鼠的鎮(zhèn)痛作用(大鼠甩尾法)選用120-150克SD健康大鼠50只，雌雄各半，動物自由飲水。試驗室溫度控制在22-28℃左右，動物喂飼大鼠標準飼料。在TF-光熱測痛儀(光源為12V，50W)熱照射下10秒鐘內(nèi)反應的大鼠，隨機分為5組，每組10只，雌雄各半。設空白對照組、人溶菌酶三個劑量組(120、60、30IU/只)、雞溶菌酶(陽性對照)30IU/，均尾部涂藥。涂藥前和涂藥后0.5-4小時測每只大鼠的疼痛反應(甩尾)時間，若痛閾升高到照射30秒鐘不甩尾時即中斷照射，以免損傷皮膚與起泡，并以30秒計算。試驗重復一次。
試驗結(jié)果見表17-21，結(jié)果表明，涂抹人溶菌酶30、60、120IU/只三小時內(nèi)，其痛閾明顯升高，具有鎮(zhèn)痛作用。
表17-21(A)人溶菌酶外涂對大鼠的鎮(zhèn)痛作用(甩尾法)(第一次試驗結(jié)果)

注經(jīng)統(tǒng)計學處理，與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
表17-21(B)人溶菌酶外涂對大鼠的鎮(zhèn)痛作用(甩尾法)

注經(jīng)統(tǒng)計學處理，與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
B、人溶菌酶對巴豆油誘發(fā)小鼠耳廓腫脹的影響選用體重27-30克的健康雄性昆明小鼠50只，隨機分成5組，每組10只。動物自由飲水。試驗室溫度控制在22-28℃左右。動物喂飼大鼠標準飼料。第一組為空白對照組；第二、三、四組為人溶菌酶，劑量分別為120、60、30IU/只；第五組為雞溶菌酶(陽性對照)，30IU/只。首先，各組小鼠全部右耳內(nèi)側(cè)涂1％巴豆油30μL致炎，(巴豆油，淺棕色油狀液體，藥用級，批號000309，由江西吉水縣華寶天然藥用廠生產(chǎn)。臨用前用乙醇∶水∶乙醚25∶5∶70混合溶媒配制成1％濃度備用。)半小時后分別用雙蒸水20μl、人溶菌酶(6000IU/ML)20μl、入溶菌酶(3000IU/ML)20μl、人溶菌酶(1500IU/ML)20μl、雞溶菌酶(1500IU/ML)20μl涂抹各組小鼠右耳內(nèi)側(cè)。致炎后4小時將小鼠脫頸椎致死，沿耳廓基線剪下左右兩耳片，用8mm打孔器沖下兩耳片，精確稱重，左右耳片重量之差為腫脹度。經(jīng)T檢驗，比較藥物組與空白對照組的差異，并求出抑制率。試驗重復一次。試驗結(jié)果見表17-22。小鼠經(jīng)外涂人溶菌酶120、60、30IU/只，使小鼠由巴豆油誘發(fā)耳廓腫脹度明顯減輕，經(jīng)T檢驗，藥物組與空白對照組比較，有顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)果表明人溶菌酶具有抗炎作用。
表17-22人溶菌酶對巴豆油誘發(fā)小鼠耳廓腫脹的影響

注與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
C重組人溶菌酶對角叉菜膠致大鼠足跖腫脹的影響(1)受試藥物重組人溶菌酶白色粉末，批號020110，3萬單位/毫克，由大連奇龍生物技術研究所提供。臨用時用無菌雙蒸水配成所需濃度。
(2)對照品雞溶菌酶白色粉末，2萬單位/毫克，Lysozyine Sigma L6878.臨用時用無菌雙蒸水配制。
(3)試劑角叉菜膠，淺黃白色粉末，批號21H0340，Sigam Chemical CO生產(chǎn)。臨用時用無菌生理鹽水配成1％的濃度。
實驗方法選用體重130-150克的健康雄性SD大鼠50只，由四川抗菌素工業(yè)研究所動物中心提供。合格證川實動管第99-32號。每籠5只。動物自由飲水，試驗室溫度控制在22~28℃左右，動物喂飼大鼠標準飼料。隨機分成5組，每組10只。測量各鼠正常左后足跖容積。第1組為空白對照組，外涂等容積無菌雙蒸水；第2、3、4組為人溶菌酶，劑量分別為120、60、30IU/只；第5組為雞溶菌酶，劑量為30IU/只。每鼠外涂各組藥物(20μl/只)一次后1小時，給大鼠左后足跖皮下注射1％的角叉菜膠0.1ml。致炎后半小時再涂一次藥。致炎前和致炎后1、2、4、6小時按微量吸管測量法測定致炎前后大鼠左后足容積。致炎前后足容積差為腫脹度。試驗重復一次。
數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析對計量資料，把原始數(shù)據(jù)按組分別輸入Microsoft Excel中，各組結(jié)果以算術平均數(shù)±標準差表示。根據(jù)《新藥西藥臨床前研究指導原則匯編》中的有關新藥藥效研究中統(tǒng)計處理的指導原則，選擇Student t檢驗進行各用藥組均數(shù)與模型對照組均數(shù)、相同劑量的受試藥組與對照品組的差異顯著性檢驗。
試驗結(jié)果見表4，大鼠外涂人溶菌酶30、60、120IU/只，在致炎后1-4小時內(nèi)，使由1％角叉菜膠誘發(fā)的左后足跖腫脹度明顯減輕。說明人溶菌酶具有抗炎作用，重組人溶菌酶不但有殺菌作用，而且有很好的抗炎作用。
表4(1)人溶菌酶對大鼠由角叉菜膠所致足跖腫脹的影響(第一次試驗結(jié)果)

注經(jīng)統(tǒng)計學處理，與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
表4(2)人溶菌酶對大鼠由角叉菜膠所致足跖腫脹的影響(第二次試驗結(jié)果)

注經(jīng)統(tǒng)計學處理，與空白對照組比較，*P＜0.05。
D重組人溶菌酶(HLZ)加殺螨止癢劑SM-650體外殺螨作用評價1、基因重組人溶菌酶濃縮液活性單位300單位/mL試驗藥品及試劑1、基因重組人溶菌酶濃縮液(Human Lysozyme HLZ)活性單位300單位/mL，由大連奇龍生物技術研究所提供，2、殺螨止癢劑SM-650白色粉未，純度為≥99％，ph6～8，生產(chǎn)單位北京耐特生化技術研究所試驗螨蟲所用螨蟲標本為第四軍醫(yī)大學臨床門診痤瘡病人。
試驗方法體外殺螨蟲活性測定采用圖片法測定了人溶菌酶(HLZ)加殺螨止癢劑SM-650最低殺螨濃度(MIC)。將螨蟲標本分離到玻片上，用人溶菌酶(HLZ)300單位/mL，殺螨止癢劑SM-650 1％/Ml。滴到玻片螨蟲標本上，觀察結(jié)果，以最低殺螨濃度(MIC)。
試驗結(jié)果見表5，結(jié)果表明人溶菌酶加殺螨止癢劑SM-650體外殺螨有殺滅作用。
表5

2、基因重組人溶菌酶濃縮液活性單位3000單位/mL試驗藥品及試劑1、基因重組人溶菌酶濃縮液(Human Lysozyme HLZ)活性單位3000單位/mL，由大連奇龍生物技術研究所提供，2、殺螨止癢劑SM-650白色粉未，純度為≥99％，ph6～8，生產(chǎn)單位北京耐特生化技術研究所試驗螨蟲所用螨蟲標本為第四軍醫(yī)大學臨床門診痤瘡病人。
試驗方法體外殺螨蟲活性測定采用圖片法測定了人溶菌酶(HLZ)加殺螨止癢劑SM-650最低殺螨濃度(MIC)。將螨蟲標本分離到玻片上，用人溶菌酶(HLZ)3000單位/mL，殺螨止癢劑SM-650 1％/Ml。滴到玻片螨蟲標本上，觀察結(jié)果，以半數(shù)殺螨濃度(MBC)。
試驗結(jié)果見表6，結(jié)果表明人溶菌酶加殺螨止癢劑SM-650體外殺螨有殺滅作用。
表6

3、基因重組人溶菌酶濃縮液活性單位30000單位/mL試驗藥品及試劑1、基因重組人溶菌酶濃縮液(Human Lysozyme HLZ)活性單位30000單位/mL，由大連奇龍生物技術研究所提供，2、殺螨止癢劑SM-650白色粉未，純度為≥99％，ph6～8，生產(chǎn)單位北京耐特生化技術研究所試驗螨蟲所用螨蟲標本為第四軍醫(yī)大學臨床門診痤瘡病人。
試驗方法體外殺螨蟲活性測定采用圖片法測定了人溶菌酶(HLZ)加殺螨止癢劑SM-650最低殺螨濃度(MIC)。將螨蟲標本分離到玻片上，用人溶菌酶(HLZ)30000單位/mL，殺螨止癢劑SM-650 1％/Ml。滴到玻片螨蟲標本上，觀察結(jié)果，以無活螨蟲為殺螨濃度。
試驗結(jié)果見表7，結(jié)果表明人溶菌酶加殺螨止癢劑SM-650體外殺螨有殺滅作用。
表7

采用圖片法測定了人溶菌酶(HLZ)加殺螨止癢劑SM-650對臨床分離五人份的螨蟲標本體外殺螨作用，結(jié)果表明人溶菌酶加殺螨止癢劑SM-650對螨蟲有殺滅作用。殺螨止癢劑SM-650最低殺螨濃度MICRange為0.2％-2％。
E重組人溶菌酶抑制豚鼠牛血清白蛋白過敏反應試驗模型選用體重250克左右的健康豚鼠20只，雄性，隨機均分四組，每組5只，進行靜脈注射牛血清白蛋白造模。將造模后的20只小鼠重新合并后再隨機分成四組，分別設立三個給藥組和一模型組。重組人溶菌酶臨床氣霧劑治療時藥液的濃度為15000u/ml，初步擬定劑量為15000u/次，每日3～5次，即0.5mg/次/日。(按體表面積推算至豚鼠劑量為1.3×10-3mg/只(250g體重計)，由于人通氣量9000ml/分相當于豚鼠通氣量31ml/分的290倍，人用單次劑量0.5mg/70kg相當于小鼠劑量1.3×10-3mg/250g的280倍，以上二者較為接近)。所以設定用臨床人用濃度0.5mg/ml對小鼠進行霧化治療，另考慮到臨床人用氣霧吸入重組人溶菌酶氣體利用率較高，而小鼠在霧化缸內(nèi)只能靠自身呼吸吸入含藥氣體，故只有延長吸入時間才能確保吸入藥量，設定為一小時。在15000u/ml為低劑量濃度基礎上再配制30000u/ml、60000u/ml二濃度作為中、高劑量組治療時的藥液濃度。在第二十一天給每只豚鼠靜脈注射牛血清白蛋白前一個小時，將豚鼠置于玻璃干燥器后，用PAR1.BOY壓縮噴霧器霧化不同濃度的重組人溶菌酶液對豚鼠進行霧化預防。然后給每只豚鼠靜脈注射牛血清白蛋白1mg，肉眼觀察豚鼠形態(tài)變化情況和死亡數(shù)量及時間。
實驗結(jié)果豚鼠靜脈注射牛血清白蛋白后10秒鐘模型組出現(xiàn)咳嗽、氣促和撓唇現(xiàn)象。30秒鐘后模型組豚鼠全部死亡。給藥重組人溶菌酶組30小時豚鼠仍然全部存活。給藥重組人溶菌酶組和一模型組有明顯區(qū)別。見表8、見表9。
表8

表9

綜合以上實驗結(jié)果表明，對豚鼠靜脈注射牛血清白蛋白進行過敏反應試驗重組人溶菌酶霧化保護，有很好的保護預防效果。其保護預防效果與使用劑量無明顯量效關系。
F、重組人溶菌酶抗皰疹病毒抑制豚鼠角膜炎試驗模型選用體重250克左右健康豚鼠20只，雄性，將20只豚鼠隨機均分四組，每組5只，進行滴眼液造模。首先用細針在豚鼠的眼角膜上輕微劃出三道痕跡，然后用四川抗菌素工業(yè)研究所實驗動物中心提供I型皰疹病毒100～1000TCID50感染豚鼠的眼角膜，每天三次。第三天豚鼠眼角膜出現(xiàn)輕微角膜炎，第四天豚鼠眼角膜出現(xiàn)紅腫，角膜炎加重。將造模后的20只豚鼠重新合并后再隨機分成四組，分別設立三個給藥組和一模型組。
重組人溶菌酶滴眼液以15000u/ml(每滴1500U)為低劑量濃度基礎上再配制30000u/ml(每滴3000U)、60000u/ml(每滴6000U)二濃度作為中、高劑量組治療時的藥液濃度。在第五天開始給豚鼠眼角膜用重組人溶菌酶滴眼液，每天三次，每次每只眼一滴，肉眼觀察豚鼠形態(tài)變化情況及時間。
實驗結(jié)果給藥重組人溶菌酶滴眼液第二天，給藥重組人溶菌酶滴眼液中、高劑量組治療效果凸現(xiàn)，豚鼠角膜紅腫減輕。給藥重組人溶菌酶滴眼液第三天，給藥重組人溶菌酶滴眼液低劑量組也出現(xiàn)好轉(zhuǎn)治療效果。給藥重組人溶菌酶滴眼液第六天，給藥模型低、中、高組豚鼠角膜炎和紅腫全部消退好轉(zhuǎn)。模型對照組豚鼠角膜紅腫，角膜炎癥加重并出現(xiàn)潰瘍。給藥重組人溶菌酶組和一模型組有明顯區(qū)別。見表10、見表11。
表10

表11

綜合以上實驗結(jié)果表明，試驗重組人溶菌酶對抗I型皰疹病毒100～1000TCID50感染豚鼠，有很好的治療效果。其治療效果與使用劑量有明顯量效關系。
用法與用量直接作用于病灶局部給藥1500u～30000u/g外用，每日2～3次，每次按病灶部位大小給藥。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的描述，但不限于實施例。
實施例1基因重組人溶菌酶的制備基因重組人溶菌酶經(jīng)高壓滅菌后接種甘油管種子，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為每分鐘250轉(zhuǎn)，培養(yǎng)溫度為20℃，在恒溫床上培養(yǎng)36小時。進行種子罐培養(yǎng)后進行生產(chǎn)罐培養(yǎng)。將發(fā)酵表達完成的培養(yǎng)液進行提取純化，對提取純化的蛋白濃縮液冰凍干燥，測定蛋白量、純度和溶菌酶活性保存?zhèn)溆谩?br> 人溶菌酶凝膠劑的制備將純度95％的基因重組人溶菌酶制得3萬U/mL/g，聚乙二醇400在100，硬脂醇12，甘油10，吡咯烷銅酸鈉15，尼泊金甲酯0.16，蒸餾水26在常溫下混合均質(zhì)，在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程完成，制成凝膠劑。
實施例2根據(jù)實施例1相同的制法制備重組人溶菌酶，然后將純度95％的基因重組人溶菌酶制得30萬U/mL/g，羧甲基纖維素鈉5，甘油15，吡咯烷銅酸鈉22，尼泊金甲酯0.35～1.5，蒸餾水118在常溫下混合均質(zhì)，在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程完成，制成凝膠劑。
實施例3根據(jù)實施例1相同的制法制備重組人溶菌酶，然后將純度95％的基因重組人溶菌酶制得100U萬U/mL，聚乙二醇400在300，硬脂醇23，甘油30，吡咯烷銅酸鈉33，尼泊金甲酯1.0，蒸餾水258，殺螨止癢劑SM-650純度為≥99％ph6～8(商品)1，在常溫下混合均質(zhì)，制成凝膠劑。
實施例4根據(jù)實施例1相同的制法制備重組人溶菌酶，然后將純度95％的基因重組人溶菌酶制得260萬U/mL/g，羧甲基纖維素鈉8，甘油8，吡咯烷銅酸鈉30，尼泊金甲酯0.85，蒸餾水800在常溫下混合均質(zhì)，在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程完成，制成凝膠劑。
權利要求
1.人溶菌酶凝膠劑，其特征是含有人溶菌酶300U～300萬U/mL。
2.根據(jù)權利要求1所述的人溶菌酶凝膠劑，其特征是含有殺螨止癢劑SM-650。
3.根據(jù)權利要求1所述人溶菌酶凝膠劑，其特征是人溶菌酶為基因工程表達的重組人溶菌酶或基因工程表達人溶菌酶的氨基端帶有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修飾的人溶菌酶或基因工程表達或化學合成突變體重組人溶菌酶。
4.根據(jù)權利要求1所述的人溶菌酶凝膠劑，其特征是由以下原料制成，純度95％的基因重組人溶菌酶300U～300萬U/mL/g，聚乙二醇400在60～600，硬脂醇10～30，甘油5～50，吡咯烷銅酸鈉5～50，尼泊金甲酯0.15～1.5，蒸餾水18.5～268.5。
5.根據(jù)權利要求1所述的人溶菌酶凝膠劑，其特征是由以下原料制成，純度95％的基因重組人溶菌酶300U～300萬U/mL/g，羧甲基纖維素鈉1～10，甘油2～20，吡咯烷銅酸鈉5～50，尼泊金甲酯0.15～1.5，蒸餾水91.85～918.5。
6.根據(jù)權利要求1-5任一所述的人溶菌酶凝膠劑在治療由金黃色葡萄球菌、化膿性葡萄球菌、銅綠假單胞菌、表葡菌、丙酸桿菌和耐藥菌引起的痤瘡、燙傷、燒傷和皮膚病中的應用。
7.根據(jù)權利要求1-5任一所述的人溶菌酶凝膠劑在治療由金黃色葡萄球菌、化膿性葡萄球菌、銅綠假單胞菌、表葡菌、丙酸桿菌和耐藥菌引起的皮膚潰瘍疾病及由病毒引起的皮膚病中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，人溶菌酶凝膠劑，含有人溶菌酶300U～300萬U/mL，另外還提供其制法及應用，本發(fā)明基因重組人溶菌酶發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個新的應用領域。安全無毒副作用，有很好的藥用前景。并且基因重組人溶菌酶來源豐富，制備工藝簡單，使用方便。本發(fā)明人溶菌酶凝膠劑發(fā)掘了人溶菌酶藥物的新的劑型，人溶菌酶安全無毒副作用，有很好的藥用前景。來源豐富，制備工藝簡單，制成凝膠劑使用方便，可直接涂抹于創(chuàng)面并形成一層膜，藥物劑量精確，藥物在創(chuàng)面保留時間長，作用時間長，效果更佳。
文檔編號A61K38/48GK1709503SQ200510046498
公開日2005年12月21日 申請日期2005年5月20日 優(yōu)先權日2005年5月20日
發(fā)明者張華 申請人:張華