專利名稱：：減少細(xì)菌攜帶和中樞神經(jīng)系統(tǒng)侵害的組合物及其使用方法相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2003年11月10日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)No.60/518,799的權(quán)益，因此其全部?jī)?nèi)容作為參考文獻(xiàn)在此處納入本文。致謝本發(fā)明由國家健康學(xué)會(huì)的DC04976、AI21548及P30DK54781號(hào)資助和國家過敏和傳染病學(xué)會(huì)的NO1AI65299號(hào)合約的政府支持下完成。政府對(duì)本發(fā)明擁有一定的權(quán)利。
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：肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)是一種存在相當(dāng)廣泛的人類病原體，它可感染包括肺部、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)、中耳和鼻道在內(nèi)的一些器官。這些組織的感染導(dǎo)致諸如支氣管炎、肺炎、腦膜炎和鼻竇感染之類的各種癥狀。肺炎鏈球菌是人類細(xì)菌性腦膜炎的一個(gè)主要病因，即使經(jīng)抗生素治療仍具有相當(dāng)高的死亡率和發(fā)病率。Quagliarelloetal.，(1992)N.Eng.J.Med.327869-872。肺炎鏈球菌腦膜炎可引起永久性的神經(jīng)性后遺癥。肺炎鏈球菌腦膜炎在發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家中的發(fā)病率分別為每10萬人1-2和20。Anon，(2000)CDSCEuropeanBacterialMeningitisSurveillanceProject。在美國肺炎球菌腦膜炎的致死率大約是18％。Fedsonetal.，(1994)Arch.Intern.Med.1542531-2535。肺炎球菌腦膜炎的最高發(fā)病率發(fā)生于1-4歲的兒童(占所有細(xì)菌性腦膜炎的30％)，然后是15-19歲(14％)和1-11月大的嬰兒(13％)。Anon，(2000)CDSCEuropeanBacterialMeningitisSurveillanceProject。在發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家中的老年人也受到鏈球菌腦膜炎的嚴(yán)重侵襲。Butleretal.，(1999)DrugsAging15(Suppl.1)11-19；Fedsonetal.，(1999)Vaccine17Suppl.1S11-18。世界上主要的肺炎球菌病原體庫存在于人的鼻攜帶物。通常從攜帶者處獲得感染并且鼻攜帶總是在感染之前。鼻咽建群(colonizationofthenasopharynx)被認(rèn)為是肺炎球菌蔓延到下呼吸道、鼻竇和中耳的必要條件。因此，任何防止攜帶的醫(yī)療干預(yù)不僅會(huì)消除受治個(gè)體的患病風(fēng)險(xiǎn)，還可產(chǎn)生群體免疫甚至還能大大降低群體中未治療成員的感染風(fēng)險(xiǎn)。雖然肺炎鏈球菌是一種重要的人類病原體，但是人們對(duì)肺炎鏈球菌造成鼻攜帶或腦膜炎的機(jī)理卻知之甚少。一些現(xiàn)有資料顯示神經(jīng)氨酸酶是鼻道的獨(dú)特致病因子。一個(gè)這樣的觀測(cè)來自對(duì)NanA缺陷型肺炎鏈球菌菌株D39的研究，該菌株比其親本菌株更快地從鼻咽中被消除。Tongetal.，(2002)Infect.Immun.68921-924。神經(jīng)氨酸酶切割在宿主細(xì)胞表面和體液中的多種糖脂、糖蛋白和寡聚糖的末端唾液酸殘基。肺炎球菌腦膜炎患者腦脊液(CSF)中游離唾液酸水平的提高與預(yù)后不良相關(guān)。O′Tooleetal.，(1971)J.Clin.Invest.50979-985。兩個(gè)獨(dú)立的研究發(fā)現(xiàn)每個(gè)新的臨床上的肺炎鏈球菌分離株都具有神經(jīng)氨酸酶活性，這進(jìn)一步說明了這種酶對(duì)肺炎鏈球菌致人生病的重要性。O′Tooleetal.，(1971)J.Clin.Invest.50979-985；Kellyetal.，J.Bacteriol.94272-273。而且，小鼠傳代經(jīng)常提高肺炎球菌分離株的致病性，它已被報(bào)道也會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)氨酸酶活性的2-5倍的提高。Vishniakovaetal.，(1992)ZhurnalMikrobiologii，EpidemiologiiiImmunobiologii9-1026-9。肺炎球菌C-多糖，亦被稱為磷壁酸，其結(jié)構(gòu)上與亦被稱為脂磷壁酸質(zhì)的肺炎球菌F-抗原的多糖部分相同。Fischeretal.，(1993)Eur.J.Biochem215851-857。這些分子是肺炎鏈球菌區(qū)別于其它革蘭氏陽性菌的獨(dú)特特征。這些分子上的免疫顯性決定子是磷酸膽堿(PC)殘基，PC的抗體對(duì)于腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)和鼻部的肺炎球菌的攻擊有保護(hù)作用。Brilesetal.，(1984)Eur.J.Immunol.141027-1030；Brilesetal.，(1981)Nature29488-90；Yotheretal.，(1982)Infect.Immun.36184-188；Brilesetal.，(1984)J.Mol.Cell.Immunol.1305-309。然而，雖然所有這些研究都評(píng)估了含藥血清對(duì)全身感染的保護(hù)作用，卻沒有關(guān)于這些抗體對(duì)鼻建群的保護(hù)作用的可用信息。然而，表面磷酸膽堿殘基通常位于呼吸器官細(xì)菌的表面。Lysenko，etal.，(2000)Infect.Immun.681664-71。肺炎鏈球菌引起鼻攜帶和后續(xù)疾病的機(jī)理還相對(duì)未知。迄今為止還沒有研究已經(jīng)確定了減少或防止鼻攜帶的機(jī)理。由于鼻咽建群被認(rèn)為是肺炎球菌全身性蔓延到下呼吸道、鼻竇乃至到腦的必要條件，所以本領(lǐng)域需要一種在初始的肺炎球菌建群位置提供粘膜免疫的手段。防止鼻咽中初始的肺炎球菌建群將防止鼻攜帶并減少肺炎鏈球菌在個(gè)體之間的傳播。而且，在鼻咽部的粘膜表面提供免疫能防止或減少由肺炎鏈球菌引起的后續(xù)疾病。
發(fā)明內(nèi)容在此提供用于減少或防止細(xì)菌感染(例如肺炎球菌感染)、鼻攜帶、鼻建群和中樞神經(jīng)系統(tǒng)侵害的組合物。任選地，該組合物被設(shè)計(jì)為用于粘膜給藥。在此提供去毒的肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶、磷酸膽堿、肺炎球菌磷壁酸、肺炎球菌脂磷壁酸質(zhì)，或這些中任意一個(gè)的抗原性部分和包括這些去毒試劑的組合物。還提供組合物，它包括肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶、磷酸膽堿、肺炎球菌磷壁酸、肺炎球菌脂磷壁酸質(zhì)或這些中任意一個(gè)的抗原性部分和可藥用的載體。任選地，該組合物可包括肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶、磷酸膽堿、肺炎球菌磷壁酸、肺炎球菌脂磷壁酸質(zhì)或這些中任意一個(gè)的抗原性部分的任意組合。還提供了去毒的肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶、磷酸膽堿、肺炎球菌磷壁酸、肺炎球菌脂磷壁酸質(zhì)，或這些中任意一個(gè)的抗原性部分和包括這些去毒試劑的組合物以及使用該試劑的方法。還提供了在受試者體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶、磷酸膽堿、肺炎球菌磷壁酸、肺炎球菌脂磷壁酸質(zhì)，或肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶、磷酸膽堿、肺炎球菌磷壁酸或肺炎球菌脂磷壁酸質(zhì)的任意一個(gè)的抗原性部分的抗體的方法，包括給予受試者包括試劑的組合物。任選地，該組合物適用于給藥至粘膜表面或全身給藥。進(jìn)一步提供了包括針對(duì)肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶、磷酸膽堿、肺炎球菌磷壁酸、肺炎球菌脂磷壁酸質(zhì)或這些中任意一個(gè)的抗原性部分的抗體和可藥用的載體的組合物。任選地，該組合物適用于給藥至粘膜表面或全身給藥。進(jìn)一步提供了在受試者體內(nèi)減少或防止鼻攜帶、鼻建群或細(xì)菌感染(例如肺炎球菌感染)的方法，包括將在此教導(dǎo)的組合物與受試者的鼻粘膜相接觸。另外的優(yōu)點(diǎn)一部分將在隨后的描述中闡明，還有部分可從描述中顯而易見，或者從下述的各方面實(shí)踐中知道。下述的優(yōu)點(diǎn)將通過所附的權(quán)利要求中具體指出的要素和組合的方式實(shí)現(xiàn)和獲得。應(yīng)當(dāng)理解前述的一般性描述和隨后的細(xì)節(jié)描述僅僅是示例性和解釋性的，而非限制性的。納入說明書中并作為說明書一部分的附圖解釋了下述的一些方面。圖1顯示了將3×106CFU的肺炎球菌的未包膜的R36A菌株或致病性的EF3030菌株經(jīng)鼻給予xid小鼠。鼻部攻擊后1和4天，采集神經(jīng)組織ON/E、OB、腦和淋巴組織(NALT，CLN和肺)，攪碎并對(duì)活肺炎球菌的存在進(jìn)行分析。示出了log10菌落形成單位(CFU)的平均值+一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)。Y軸上的0值表示沒有可檢出的CFU。示出的是每組5只小鼠的平均CFU+SE，代表了三組不同的實(shí)驗(yàn)。圖2顯示了肺炎鏈球菌EF3030菌株在鼻部攻擊后的CFU器官分布動(dòng)力學(xué)。在第4、11、18、25和39天采集了ON/E、OB、腦、血、NW、NALT、CLN和肺組織并分析肺炎鏈球菌的存在。3×106CFU的肺炎鏈球菌的等分試樣導(dǎo)致了鼻道建群和隨后的OB感染。Y軸上的0值表示沒有可檢出的CFU。示出的是三個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的平均CFU+SE。除39天的時(shí)間點(diǎn)代表5只小鼠之外，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)代表10只小鼠。圖3顯示了在與GLS預(yù)培養(yǎng)之后肺炎鏈球菌菌株EF3030的分布。在鼻部使用之前用20μg的無唾液酸基的GM1(a-GM1)或125μg的混合GLS(MG)培養(yǎng)肺炎鏈球菌的等分試樣(3×107CFU)30分鐘。在四天之后采集ON/E、OB、腦和NW、NALT和肺，并對(duì)肺炎鏈球菌的數(shù)量進(jìn)行分析。Y軸上的0值表示沒有可檢出的CFU。示出的是5只小鼠的平均值+一個(gè)SE，在統(tǒng)計(jì)分析后獲得P值。該數(shù)據(jù)表示兩個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)。圖4顯示了在鼻部攻擊后OB中肺炎鏈球菌的TIGR4菌株的檢測(cè)。5×105CFU的等分試樣由鼻部和血液給樣，攻擊后一周分析NW、ON/E、OB和腦組織的建群(分圖A和B)。還用PCR分析了這些組織(10μgDNA)中肺炎球菌溶血素基因的存在(分圖C)。另外，還用PspA特異性抗體的免疫熒光法觀察了對(duì)照組(D)或受肺炎鏈球菌攻擊的小鼠的OB肺炎鏈球菌(分圖E和F)。示出的是平均值+一個(gè)SE。該數(shù)據(jù)表示三個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)。圖5顯示了分泌型NanA、TIGR4和R6(2型)的基序比較，后者具有用于附著細(xì)胞壁的LPXTG(SEQIDNO14)基序。TIGR4基因包括一個(gè)在編碼LPETG(SEQIDNO13)基序序列之前的終止密碼子。NanA沒有這個(gè)基序，經(jīng)由TIGR4分泌到環(huán)境中。圖6A顯示了在被肺炎鏈球菌親代菌株TIGR4(■)或NanA等基因(isogenic)突變體TIGR4/nanA-(○)鼻內(nèi)感染的CBA/N小鼠的鼻洗出物中活性肺炎球菌的動(dòng)力學(xué)。每個(gè)點(diǎn)表示了每只小鼠的每毫升鼻洗出液中的細(xì)菌總數(shù)。與用TIGR4接種的小鼠比較，*為P＜0.05；**為P＜0.01；***為P＜0.005。圖6B顯示了被肺炎鏈球菌親代菌株TIGR4(■)或NanA等基因突變體TIGR4/nanA-(○)鼻內(nèi)感染的CBA/N小鼠的鼻建群動(dòng)力學(xué)。每個(gè)點(diǎn)表示了每只小鼠的每克組織中的細(xì)菌總數(shù)。與用TIGR4接種的小鼠比較，*為P＜0.05；**為P＜0.01；***為P＜0.005。圖6C顯示了被肺炎鏈球菌親代菌株TIGR4(■)或TIGR4/nanA-(○)鼻內(nèi)感染的CBA/N小鼠的嗅球中CFU的動(dòng)力學(xué)。每個(gè)點(diǎn)表示了每只小鼠的每克組織中的細(xì)菌總數(shù)。與用TIGR4接種的小鼠比較，*為P＜0.05；**為P＜0.01；***為P＜0.005。圖7A顯示了在被肺炎鏈球菌親代菌株EF3030(■)或EF3030/nanA-(○)鼻內(nèi)感染的CBA/N小鼠的鼻建群動(dòng)力學(xué)。每個(gè)點(diǎn)表示了每只小鼠的每毫升鼻洗出液中的細(xì)菌總數(shù)。與用EF3030接種的小鼠比較，*為P＜0.05；**為P＜0.01；***為P＜0.005。圖7B顯示了在被肺炎鏈球菌親代菌株EF3030(■)或EF3030/nanA-(○)鼻內(nèi)感染的CBA/N小鼠的鼻建群動(dòng)力學(xué)。每個(gè)點(diǎn)表示了每只小鼠的每克組織中的細(xì)菌總數(shù)。與用EF3030接種的小鼠比較，*為P＜0.05；**為P＜0.01；***為P＜0.005。圖7C顯示了在被肺炎鏈球菌親代菌株EF3030(■)或NanA等基因突變體EF3030/nanA-(○)鼻內(nèi)感染的CBA/N小鼠的鼻建群動(dòng)力學(xué)。每個(gè)點(diǎn)表示了每只小鼠的每克組織中的細(xì)菌總數(shù)。與用EF3030接種的小鼠比較，*為P＜0.05；**為P＜0.01；***為P＜0.005。當(dāng)集合了全部時(shí)間點(diǎn)的野生型和突變型的數(shù)據(jù)時(shí)，EF3030和EF3030NanB-的比較是P＝0.001。圖8顯示了在被肺炎鏈球菌親代菌株TIGR4(■)或TIGR4/nanB-(○)鼻內(nèi)感染的CBA/N小鼠在接種4天后的鼻建群動(dòng)力學(xué)。每個(gè)點(diǎn)表示了每只小鼠的每毫升鼻洗出液或每克組織中的細(xì)菌總數(shù)。每組中的TIGR4和TIGR4/nanB-之間均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異。圖9顯示了在被肺炎鏈球菌親代菌株TIGR4(■)或TIGR4/nanA-(○)或TIGR4/AB-鼻內(nèi)感染的CBA/N小鼠在接種4天后的鼻建群動(dòng)力學(xué)。每個(gè)點(diǎn)表示了每只小鼠的每毫升鼻洗出液或每克組織中的細(xì)菌總數(shù)。每組中的TIGR4/nanA-和雙突變體TIGR4/nanAB-之間均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異。圖10顯示了在鼻攻擊之后抗磷酸膽堿的特異性單克隆抗體對(duì)肺炎鏈球菌鼻建群的抑制。在鼻攻擊之后抗磷酸膽堿的特異性單克隆抗體對(duì)肺炎鏈球菌鼻建群的抑制?？偣?×106CFU的TIGR4菌株與5μg的IgG3亞類或IgM同種型的抗磷酸膽堿單抗共培養(yǎng)。每只鼻孔的總給藥量為5μl。示出的是分別在使用后9和12小時(shí)時(shí)500μl鼻洗出液中的CFU。示出的是每組5只小鼠的平均值+SD。具體實(shí)施例方式在本化合物、組合物、物品、裝置和/或方法公開和描述之前，應(yīng)當(dāng)理解下述各方面并不限于特定的合成方法或特定的給藥方法，因?yàn)樗鼈兝硭?dāng)然地可有多種變化。還應(yīng)理解在此使用的術(shù)語僅是出于描述具體方面的目的而非意在限制。必須指出，除非上下文中明確指出，否則在說明書和所附的權(quán)利要求中使用的單數(shù)形式“一”“一個(gè)”和“該”包括復(fù)數(shù)指代物。因而例如提及“一種抗原片段”包括抗原片段的混合物，提及“一種藥用載體”或“佐劑”包括兩種或更多這樣的載體或佐劑的混合物，等等。正如通篇所使用的，“受試者”意為一個(gè)個(gè)體。因而，“受試者”可以包括馴養(yǎng)的動(dòng)物，如貓、狗等，家畜(例如牛、馬、豬、綿羊、山羊等)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)和鳥類。一方面，受試者為例如靈長(zhǎng)類動(dòng)物或人的哺乳動(dòng)物?！叭芜x的”或“任選地”意為后來描述的事件或情況可能發(fā)生或可能不發(fā)生，并且該描述包括該事件或情況發(fā)生和不發(fā)生的實(shí)例。例如，短語“任選地該組合物可以包括一個(gè)組合”意為該組合物可以包括不同分子的組合或可以不包括組合，以致于該描述包括存在該組合和缺少該組合(即組合的單個(gè)成員)。范圍在這里被表述為從“大約”一個(gè)具體的值，和/或到“大約”另一個(gè)具體的值。當(dāng)表述這樣一個(gè)范圍時(shí)，另一方面包括從一個(gè)具體的值和/或到另一個(gè)具體的值。類似地，當(dāng)值通過前面冠以“大約”被表述為近似值時(shí)，它應(yīng)被理解為該具體值形成了另一方面。應(yīng)進(jìn)一步理解每一個(gè)范圍的端點(diǎn)在相關(guān)和獨(dú)立于另一個(gè)端點(diǎn)時(shí)都是有意義的。在此提供用于減少或防止細(xì)菌感染(例如肺炎球菌感染)、鼻攜帶、鼻建群和中樞神經(jīng)系統(tǒng)侵害的組合物和方法。肺炎鏈球菌在鼻道內(nèi)建群，部分是通過C-多糖-神經(jīng)節(jié)苷脂相互作用穿過上皮細(xì)胞屏障，再通過內(nèi)吞作用進(jìn)入上皮細(xì)胞。C-多糖通過結(jié)合神經(jīng)節(jié)苷脂的末端或內(nèi)部的GalNAcβ1-4Gal序列來結(jié)合無唾液酸基GM1、無唾液酸基GM2和巖藻糖基無唾液酸基GM1。雖然無唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂在細(xì)胞質(zhì)膜中含量在正常情況下較低，但在人肺部的肺炎鏈球菌有兩種神經(jīng)氨酸酶NanA和NanB時(shí)例外(Berryetal.，(1996)J.Bacteriol.1784854-4860)，NanA和NanB可以各自切割N-乙酰神經(jīng)氨酸的α2，3-和α2，6-鍵生成半乳糖，及α2，6-鍵生成N-乙酰半乳糖胺。Scanlonetal.，(1989)Enzyme41143-150。神經(jīng)節(jié)苷脂的唾液酸殘基以α2，3連接半乳糖。肺炎鏈球菌的神經(jīng)氨酸酶去除存在于所有單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂的尾端唾液酸殘基和可見于雙-和三唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂中的半乳糖連接的多個(gè)唾液酸殘基。因此，他們可以暴露發(fā)現(xiàn)于最常見的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的神經(jīng)節(jié)苷脂中的GalNAcβ1-4Gal序列。這些殘基是推測(cè)的細(xì)胞表面的C-多糖結(jié)合位點(diǎn)。肺炎鏈球菌通過使用通常較多與細(xì)胞壁相連的NanA和被認(rèn)為是分泌型的NanB，產(chǎn)生它自己在呼吸道上皮細(xì)胞上的附著位點(diǎn)。這樣肺炎球菌C-多糖結(jié)合無唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂，特別是無唾液酸GM1，和可將大量GM1轉(zhuǎn)化為無唾液酸GM1的神經(jīng)氨酸酶，可以在ON/E上產(chǎn)生大量的C-多糖結(jié)合位點(diǎn)。這種機(jī)制為鼻攜帶提供了便利并使肺炎鏈球菌可通過鼻嗅覺神經(jīng)和覆蓋鼻甲(ON/E)和嗅球(OB)的上皮組織進(jìn)入CNS。類似地，中耳炎和其他包括肺炎鏈球菌的感染也可以類似地通過支配中耳的神經(jīng)得以進(jìn)入CNS。除肺炎鏈球菌以外的其他細(xì)菌也有類似的神經(jīng)氨酸酶，因此同樣的機(jī)制也發(fā)生于其他細(xì)菌。因此在此公開的組合物和方法是靶向于多種細(xì)菌的這種機(jī)制的。在此教導(dǎo)的試劑、組合物和方法涉及阻斷這種機(jī)制從而減少攜帶和防止CNS侵害。任選地，該組合物被設(shè)計(jì)為用于粘膜給藥。例如，在此提供一種組合物，包括肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶、磷酸膽堿、肺炎球菌磷壁酸、肺炎球菌脂磷壁酸質(zhì)或這些中任意一個(gè)的抗原性部分和可藥用的載體，其中的組合物適用于粘膜表面給藥。任選地，該組合物可以包括肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶、磷酸膽堿、肺炎球菌磷壁酸、肺炎球菌脂磷壁酸質(zhì)或這些中任意一個(gè)的抗原性部分的任意組合。任選地，組合物的形式是氣霧劑、鼻腔霧劑、鼻腔噴劑(nasalspray)、滴鼻劑、噴霧溶液(nebulizersolution)、氣霧吸入劑(aerosolinhalant)、栓劑或任何適于粘膜給藥的形式(包括口服給藥)。任選地，該組合物可存在于用于給藥的微球或脂質(zhì)體中?！敖o藥至粘膜表面”意為給藥至包括呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)或泌尿生殖系統(tǒng)的任何粘膜表面。粘膜表面的實(shí)例包括但不限于鼻腔(屬于嗅覺神經(jīng)上皮)、鼻咽、直腸、陰道、喉部、口部、咽鼓管、氣管、支氣管和其他氣道以及腸粘膜。粘膜佐劑可用于粘膜表面給藥。該佐劑的給藥可伴隨本發(fā)明的組合物一起、剛剛先于或后于組合物的給藥。任選地，該組合物進(jìn)一步包括佐劑。粘膜佐劑的組成包括例如靶向粘膜誘導(dǎo)位點(diǎn)的試劑。該佐劑可任選地從包括但不限于細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子、血管生成因子、細(xì)胞凋亡抑制素或它們的組合中選擇。當(dāng)選擇細(xì)胞因子作為佐劑時(shí)，該細(xì)胞因子可以從包括但不限于白介素(包括IL-1、IL-1γ、IL-1β、IL-2、IL-5、IL-6、IL-12、IL-15和EL-18)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)；粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)；干擾素-γ(IFN-γ)或其他有佐劑活性的細(xì)胞因子中選擇。有佐劑活性或其他生物活性的細(xì)胞因子的片段或突變體或模擬的細(xì)胞因子(或它們的組合)也可以被用于本發(fā)明的組合物和方法。當(dāng)選擇趨化因子作為佐劑時(shí)，該趨化因子可以任選地從包括但不限于淋巴細(xì)胞趨化因子、RANTES、LARC、PARC、MDC、TARC、SLC和FKN中選擇。當(dāng)選擇細(xì)胞凋亡抑制素作為佐劑時(shí)，該細(xì)胞凋亡抑制素可以任選地從包括但不限于半胱天冬酶-8的抑制素和它們的組合中選擇。當(dāng)選擇血管生成因子作為佐劑時(shí)，該血管生成因子可以任選地從包括但不限于堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、透明質(zhì)烷(HA)片段和它們的組合中選擇。事實(shí)上，可選擇正型(+)和負(fù)型(-)血管生成因子作為佐劑。本發(fā)明的基本上無毒的生物活性粘膜佐劑的其他實(shí)例包括激素、酶、生長(zhǎng)因子或它們的生物活性部分。這樣的激素、酶、生長(zhǎng)因子或它們的生物活性部分可以來源于人、牛、豬、羊、犬、貓、馬或鳥類，例如，可為腫瘤壞死因子(TNF)、催乳素、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(GCSF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)、促生長(zhǎng)素(生長(zhǎng)激素)或胰島素，或其受體在免疫系統(tǒng)細(xì)胞上表達(dá)的任何其他激素或生長(zhǎng)因子。粘膜給藥的佐劑也包括細(xì)菌毒素，例如霍亂毒素(CT)、大腸桿菌(E.coli)不耐熱毒素(LT)、艱難梭菌毒素A和百日咳毒素(PT)，或它們的組合、亞基、類毒素、嵌合體或突變體。例如，可使用天然霍亂毒素亞基B(CTB)的純化制品。這些毒素中任一個(gè)的片段、同系物、衍生物和融合體，只要還保持佐劑活性，也是適用的。優(yōu)選地，使用一個(gè)降低毒性的突變體。合適的突變體在例如WO95/17211(Arg-7-LysCT突變體)、WO96/6627(Arg-192-GlyLT突變體)和WO95/34323(Arg-9-Lys和Glu-129-GlyPT突變體)中有所描述。另外可用于本發(fā)明的方法和組合物的LT突變體包括例如Ser-63-Lys、Ala-69-Gly、Glu-110-Asp和Glu-112-Asp突變體。其他的佐劑例如RH-3配體；CpG基序寡核苷酸；例如大腸桿菌、明尼蘇達(dá)沙門氏菌(Salmonellaminnesota)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)或弗氏志賀氏菌(Shigellaflexneri)的細(xì)菌單磷酸類脂A(MPLA)；皂甙(例如QS21)或聚乳酸乙醇酸交酯(PLGA)微球也可以被用于粘膜給藥?？赡艿钠渌衬ぷ魟┯蟹烙睾桶–pG基序的寡核苷酸。正如通篇所使用的，“可藥用的載體”意為一種生物學(xué)或其他方面沒有不良效果的材料，即該材料可與所選化合物一起給藥至個(gè)體而不會(huì)產(chǎn)生任何不良生物學(xué)效果或與包括該材料的藥物組合物的任何其它成分以有害的方式相互作用。任何在此描述的組合物都可以與一種可藥用的載體一起在治療上使用。在此描述的化合物可以方便地配制成由一種或多種化合物以及可藥用載體組成的組合物。見于例如Remington′sPharmaceuticalSciences，latestedition，byE.W.MartinMackPub.Co.，Easton，PA，它公開了制備藥物組合物的典型載體和常規(guī)方法，這些載體和方法也可用于制備本文所述的化合物制劑，其全部?jī)?nèi)容作為參考文獻(xiàn)在此處納入本文。最典型情況下，它們是將組合物給藥至人體的標(biāo)準(zhǔn)載體。一方面，人類和非人類，包括例如無菌水、鹽溶液、生理pH的緩沖溶液的溶液。其他化合物可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員使用的標(biāo)準(zhǔn)程序給藥。在此描述的藥物組合物除選擇的分子之外可包括但不限于載體、增稠劑、稀釋劑、緩沖液、防腐劑、表面活性劑等等。藥物組合物還可包括一種或多種活性成分例如抗菌試劑、抗炎試劑、麻醉劑等等。肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶意為肺炎球菌中發(fā)現(xiàn)的任何神經(jīng)氨酸酶分子，表1示出了幾個(gè)菌種的神經(jīng)氨酸酶的序列比對(duì)。神經(jīng)氨酸酶分子還包括例如SP1326。SP1326的氨基酸序列可以通過GenBank登記號(hào)No.AAK75424得到。Tettelin，H.，etal.，(2001)Science293498-506。由GenBank登記號(hào)No.AAK75424提供的包括SP1326的任何氨基酸序列和核酸序列的全部信息完整地作為參考文獻(xiàn)在此處納入本文。正如通篇所定義的，所有氨基酸序列的氨基酸殘基根據(jù)表1所示的肺炎球菌R6菌株的氨基酸序列進(jìn)行編號(hào)。表1ClustalW(v1.4)多序列比對(duì)比對(duì)了3個(gè)序列比對(duì)得分＝6332插入空位＝32保守性相同(ConservedIdentities)＝105配對(duì)比對(duì)方式慢配對(duì)比對(duì)參數(shù)開放空位罰分(OpenGapPenalty)＝10.0擴(kuò)展空位罰分(ExtendGapPenalty)＝0.1相似性矩陣(SimilarityMatrix)blosum多序列比對(duì)參數(shù)開放空位罰分(OpenGapPenalty)＝10.0擴(kuò)展空位罰分(ExtendGapPenalty)＝0.1延遲差異(DelayDivergent)＝40％空位距離＝8相似性矩陣(SimilarityMatrix)blosum處理時(shí)間3.5秒R6NanA1MSYFRNRDIDIERNSMNRSVQERKCRYSIRKLSVGAVSMIVGAVVFGTSP50TIGR4NanA1MNRSVQERKCRYSIRKLSVGAVSMIVGAVVNGTSP35S.typhimirium10R6NanA51VLAQEGASEQPLANETQLSGESSTLTDTEKSQPSSETELSGNKQEQERKD100TIGR4NanA36VLAQEGASEQPLANETQLSGESSTLTDTEKSQPSSETELSGNKQEQERKD85S.typhimirium10R6NanA101KQEEKIPRDYYARDLENVETVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLE150TIGR4NanA86KQEEKIPRDYYARDLENVETVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLE135S.typhimirium10R6NanA151NATVHMEFKPDAKAPAFYNLFSVSSATKKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSD200TIGR4NanA136NATVHMENKPDAKAPAFYNLNSVSSATKKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSD185S.typhimirium10R6NanA201GKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTVEKPTAELPKGRVRLYVNGVLSRT250TIGR4NanA186GKQNYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTVEKPTAELPKGRVRLYVNGVLSRT235S.typhimirium1MTVEKSVVFKAEG----------EHF16*****.R6NanA251SLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIRNLTVYNRALTPEE300TIGR4NanA236SLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIRNLTVYNRALTPEE285S.typhimirium17TDQKG---------------------NTIVGS------------------27..***.**R6NanA301VQKRSQLFKRSDLEKKLPEGAALTEKTDIFESGRNGKPNKDGIKSYRIPA350TIGR4NanA286VQKRSQLNKRSDLEKKLPEGAALTEKTDIFESGRNGNPNKDGIKSYRIPA335S.typhimirium28--------------------------------GSGG-----TTKYFRIPA40*.**.****R6NanA351LLKTDKGTLIAGADERRLHSSDWGDIGMVIRRSEDNGKTWGDRVTITNLR400TIGR4NanA336LLKTDKGTLIAGADERRLHSSDWGDIGMVIRRSEDNGKTWGDRVTITNLR385S.typhimirium41MCTTSKGTIVVFADARHNTASDQSFIDTAAARSTDGGKTWNKKIAIYNDR90.****..***..******.****....***R6NanA401DNPKASDPSIGSPVNIDMVLVQDPETKRIFSIYDMFPEGKGIFGMSSQKE450TIGR4NanA386DNPKASDPSIGSPVNIDMVLVQDPETKRINSIYDMFPEGKGINGMSSQKE435S.typhimirium91VNSKLSR-------------VMDP--------------------------101******R6NanA451EAYKKIDGKTYQILYREGEKGAYTIRENGTVYTPDGKATDYRVVVDPVKP500TIGR4NanA436EAYKKIDGKTYQILYREGEKGAYTIRENGTVYTPDGKATDYRVVVDPVKP485S.typhimirium102---------TCIVANIQG-------RE--TILVMVGKWNNN----DKTWG129*..****.**.*R6NanA501AYSDKGDLYKGNQLLGNIYFTTNKTSPFRIAKDSYLWMSYSDDDGKTWSA550TIGR4NanA486AYSDKGDLYKGDQLLGNIYFTTNKTSPNRIAKDSYLWMSYSDDDGKTWSA535S.typhimirium130AYRDK--------------------AP---DTDWDLVLYKSTDDGVTFSK156****.***.******R6NanA551PQDITPMVKADWMKFLGVGPGTGIVLRNGPHKGRILIPVYTTNNVSHLNG600TIGR4NanA536PQDITPMVKADWMKFLGVGPGTGIVLRNGPHKGRILIPVYTTNNVSHLDG585S.typhimirium157VETNIHDIVTKNGTISAMLGGVGSGLQLN--DGKLVFPVQMVR-TKNITT203....***..*...**..R6NanA601SQSSRIIYSDDHGKTWHAGEAVNDNRQVDGQKIHSSTMNNRRAQNTESTV650TIGR4NanA586SQSSRVIYSDDHGKTWHAGEAVNDNRQVDGQKIHSSTMNNRRAQNTESTV635S.typhimirium204VLNTSFIYSTD-GITWSLPSGYCEGFGSE---------NN---------I234.*******...**.R6NanA651VQLNNGDVKLFMRGLTGDLQVATSKDGGVTWEKDIKRYPQVKDVYVQMSA700TIGR4NanA636VQLNNGDVKLNMRGLTGDLQVATSKDGGVTWEKDIKRYPQVKDVYVQMSA685S.typhimirium235IEFN-ASLVNNIR-NSGLRRSFETKDFGKTWTEFPPMDKKVDNR------276..*..*.*..*****.*R6NanA701IHTMHEGKEYIILSNAGGPKRENGMVHLARVEENGELTWLKHNPIQKGEF750TIGR4NanA686IHTMHEGKEYIILSNAGGPKRENGMVHLARVEENGELTWLKHNPIQKGEN735S.typhimirium277----NHGVQGSTITIPSG----NKLVAAHSSAQNKNNDYTRSDISLYAHN318.*...**.*.*.R6NanA751AYNSLQELGNGEYGILYEHTEKGQNAYTLSFRKFNWDFLSKDLISPTEAK800TIGR4NanA736AYNSLQELGNGEYGILYEHTEKGQNAYTLSNRKNNWENLSKNLISPTEAN785S.typhimirium319LYSGEVKLIDDFYPKVGNAS--GAGYSCLSYRKN---VDKETLYVVYEAN363***..*..*******R6NanA801VKRTREMGKGVIGLEFDSEVLVNKAPTLQLANGKTARFMTQYDTKTLLFT850TIGR4NaNA786NRDGQRR-----------------DGQRSYWLGVRLRSIGQQGSNPSIGK818S.typhimirium364------------------------------------------------GS365R6NanA851VDSEDMGQKVTGLAEGAIESMHNLPVSVAGTKLSNGMNGSEAAVHEVPEY900TIGR4NanA819WNNSDNPNPVN---------NQDLVVCSRNGRYRTGNYWYSNRKHRKYAN859S.typhimirium366IEFQDLSRHLP-------------VIKSYN(SEQIDNO17)382*...R6NanA901TGPLGTSGEEPAPTVEKPEYTGPLGTSGEEPAPTVEKPEYTGPLGTAGEE950TIGR4NanA860SSCKSSR----CQSSWRSKWNQSSGANSSR----IYR-------GSNWYR894S.typhimirium383382R6NanA951AAPTVEKPEFTGGVNGTEPAVHEIAEYKGSDSLVTLTTKEDYTYKAPLAQ1000TIGR4NanA895ASCSNNR--RVNGINFACNSYYKKRLYLQSSSCSAGTSNNRK-------Q935S.typhimirium383382R6NanA1001QALPETGNKESDLLASLGLTAFFLGLFTLGKKREQ(SEQIDNO15)1035TIGR4NanA936GENPPSFTRTN--------SNLPWSVYAREKERTI(SEQIDNO16)962S.typhimirium383382任意的神經(jīng)氨酸酶的抗原性變體也可用于在此教導(dǎo)的組合物或方法。因此，天然存在的神經(jīng)氨酸酶可以根據(jù)在此教導(dǎo)的方法以置換、缺失或改變氨基酸殘基的方式被修飾。任選地，這種修飾將被設(shè)計(jì)為去除神經(jīng)氨酸酶的毒性。“去毒”意為降低或消除酶的活性，但保留抗原性或免疫原性。這可以通過在神經(jīng)氨酸酶活性位點(diǎn)用位點(diǎn)專一誘變置換、缺失或改變氨基酸的方式實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選地，這種對(duì)氨基酸的置換、缺失或改變?cè)贏sp盒(Aspbox)范圍內(nèi)進(jìn)行(即在氨基酸殘基460-480、530-560或600-620范圍內(nèi))。見于Crennelletal.，PNAS909852-9856，其中教導(dǎo)的神經(jīng)氨酸酶結(jié)構(gòu)的全部?jī)?nèi)容作為參考文獻(xiàn)在此處納入本文。這種置換、缺失或改變也可以在氨基酸殘基383-387、467-473、541-546或610-616范圍內(nèi)的Asp盒中進(jìn)行。在Asp盒內(nèi)的改變可以包括例如將天冬氨酸置換為谷氨酸或蘇氨酸。也可以在Asp盒內(nèi)的天冬氨酸殘基或其他任何殘基的位置進(jìn)行其他保守性或非保守性的氨基酸置換來降低毒性。可以任選神經(jīng)氨酸酶的其他區(qū)域作為位點(diǎn)專一誘變的靶位。例如，公開了在殘基570-580的相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行修飾，包括例如在572位點(diǎn)的纈氨酸或谷氨酰胺的保守性和非保守性氨基酸置換。還公開了在殘基750-760的相應(yīng)區(qū)域更具體地說是在754位置的酪氨酸進(jìn)行了修飾的神經(jīng)氨酸酶。酪氨酸殘基的保守性氨基酸置換包括例如絲氨酸或蘇氨酸。還公開了在氨基酸殘基340-350、600-610或360-370的相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行了修飾的神經(jīng)氨酸酶。更具體地說是347、605、366或367位置的精氨酸可被置換為賴氨酸或谷氨酰胺或其他任意保守性或非保守性的氨基酸。在此教導(dǎo)的各種修飾可組合使用。因此，一個(gè)或多個(gè)保守性或非保守性的氨基酸置換可任選地存在于同一神經(jīng)氨酸酶中。如前所述，去毒神經(jīng)氨酸酶是比非去毒神經(jīng)氨酸酶活性低的神經(jīng)氨酸酶，該活性由本領(lǐng)域熟知的Lock等人的分析方法(Microb.Pathog.433-43，1988)測(cè)定。在Lock分析中，以2’-(4-甲基傘形酮酰)-α-D-N-乙酰神經(jīng)氨酸為底物在酶反應(yīng)中測(cè)定溶胞產(chǎn)物、血清或血液中的NanA活性(Locketal.1988)。10微升的底物與10μL血清相結(jié)合并于37℃培養(yǎng)5分鐘。用0.5M碳酸鈉終止反應(yīng)。神經(jīng)氨酸酶的活性以每分鐘釋放的4-甲基傘形酮(MU)的量測(cè)定。MU具有366nM的激發(fā)波長(zhǎng)和445nM的發(fā)射波長(zhǎng)。與非去毒神經(jīng)氨酸酶相比，優(yōu)選去毒神經(jīng)氨酸酶保持大體相同的抗原性或免疫原性，這樣它可與可藥用的載體一起組合為免疫組合物。出于比較的目的，非去毒的神經(jīng)氨酸酶包括但不限于如表1所示的R6NanA。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，去毒神經(jīng)氨酸酶顯示了非去毒神經(jīng)氨酸酶活性的至少60％、70％、80％或90％。去毒神經(jīng)氨酸酶包括與非去毒神經(jīng)氨酸酶相比氨基酸序列的改變(例如置換、修飾或缺失)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，去毒神經(jīng)氨酸酶包括了非去毒神經(jīng)氨酸酶中大約7％、10％、15％或20％的氨基酸改變。優(yōu)選的氨基酸缺失包括了非去毒神經(jīng)氨酸酶N端大約5、10或15個(gè)氨基酸的缺失。其他優(yōu)選的實(shí)施方案包括非去毒神經(jīng)氨酸酶C端大約60、50、40、30、20、10或5個(gè)氨基酸的缺失(根據(jù)本申請(qǐng)的目的，表1示出了從R6NanA的氨基酸800處開始的C端序列)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，去毒神經(jīng)氨酸酶包括從非去毒神經(jīng)氨酸酶C端17、9、8、7、4或2個(gè)氨基酸的缺失。表1表明了一些示例性的優(yōu)選的缺失(即TIGR4NanA的氨基酸序列)。任何上述改變都可以與一個(gè)或多個(gè)其他改變相結(jié)合。優(yōu)選地，這樣的去毒神經(jīng)氨酸酶種類具有非去毒神經(jīng)氨酸酶大約60％、70％、80％或90％的活性。只要神經(jīng)氨酸酶能保持其抗原性或免疫原性，也可以使用其他的保守性和非保守性置換。這些保守性置換是指一個(gè)天然存在的氨基酸被一個(gè)具有相似性質(zhì)的氨基酸替換。這樣的保守性和非保守性置換任選地改變?cè)摱嚯牡拿笇W(xué)功能。例如，可以根據(jù)表2進(jìn)行保守性置換。應(yīng)當(dāng)理解，在需要時(shí)可以對(duì)編碼本發(fā)明的多肽和/或本發(fā)明的氨基酸序列的核酸進(jìn)行修飾和改變，并獲得具有類似或另外需要的特性(例如抗原性或免疫原性)的多肽。這種改變可在天然分離株中發(fā)生或者可以用位點(diǎn)專一誘變的方式人為引入，位點(diǎn)專一誘變的程序例如錯(cuò)配聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的程序?yàn)楸绢I(lǐng)域所熟知。例如，多肽中的某些氨基酸可以被另外的氨基酸置換而不會(huì)造成功能活性的明顯損失。因此可以考慮在本發(fā)明的多肽的氨基酸序列(或基礎(chǔ)的核酸序列)中實(shí)行多種改變，這些改變不會(huì)造成多肽生物效用或活性的明顯改變并且可能提高其效用或活性。運(yùn)用Sungetal.，(2001)ApplEnvironMicrobiol675190-5196中描述的方法實(shí)行了nanA基因或nanA基因任意部分的缺失，在其中教導(dǎo)的方法其全部?jī)?nèi)容作為參考文獻(xiàn)在此處納入本文。使用可以特異性地與蛋白質(zhì)中的精氨酸殘基反應(yīng)的試劑2，3-丁二酮(2，3butadione)來評(píng)價(jià)精氨酸殘基對(duì)NanA分子折疊的重要性。使用位點(diǎn)定向誘變來改變特定的氨基酸。神經(jīng)氨酸酶也可以通過例如變性的化學(xué)處理而被去毒?；瘜W(xué)處理也可以與位點(diǎn)專一誘變相結(jié)合而進(jìn)一步降低消極的副作用并提高抗原性或免疫原性。在用去毒神經(jīng)氨酸酶對(duì)受試者免疫接種之前，去毒免疫神經(jīng)氨酸酶可用例如福爾馬林、戊二醛、加熱等試劑或其他本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的試劑進(jìn)行處理。因此在此提供去毒肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶或它的抗原性或免疫原性部分。還提供了包括去毒肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶和可藥用載體的組合物。任選地，該組合物還包括佐劑(包括例如粘膜佐劑)。此外，可在神經(jīng)氨酸酶中加入一部分包括例如可增加抗原性或免疫原性的部分。這些部分包括例如細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子、血管生成因子、細(xì)胞凋亡抑制素、激素、毒素或其他本文所討論的用于佐劑的部分。該部分可任選地被修飾或截短以用于改變的分子中。因此在此提供肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶嵌合體，該嵌合體包括神經(jīng)氨酸酶或其抗原性或免疫原性片段和提高抗原性或免疫原性的部分。還提供了包括肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶衍生物和可藥用載體的組合物。任選地，該組合物還包括佐劑(包括例如粘膜佐劑)。任選地，本發(fā)明中被修飾的神經(jīng)氨酸酶片段或其部分具有與天然存在的肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶或其片段至少約70％的同源性。進(jìn)一步提供了編碼被修飾的神經(jīng)氨酸酶或其片段的核酸。應(yīng)該理解，一種定義在此公開的核酸和蛋白質(zhì)中任何已知的或那些可能產(chǎn)生的變體和衍生物的方法是通過變體和衍生物與特定的已知序列的同源性來定義。例如，表1所示的由R6肺炎球菌菌株的nanA基因編碼的氨基酸序列闡明了肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶的一個(gè)具體序列以及闡明了該蛋白的一個(gè)具體的氨基酸序列。具體公開了這個(gè)在此公開的序列的一些變體，它們與所述序列有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同源性。那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解如何測(cè)定兩個(gè)蛋白質(zhì)或核酸的同源性。例如，在序列比對(duì)后計(jì)算同源性以使同源性處于其最高水平。另一種計(jì)算同源性的方法可根據(jù)已發(fā)表的算法進(jìn)行。最佳的用于比較的序列比對(duì)可在以下的文獻(xiàn)指導(dǎo)下或通過觀察進(jìn)行局部同源性算法SmithandWatermanAdv.Appl.Math.2482(1981)、同源比對(duì)算法NeedlemanandWunsch，J.MolBiol.48443(1970)、相似性搜索方法PearsonandLipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.852444(1988)、這些算法的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)(GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA和TFASTA，它們?cè)赪isconsin遺傳學(xué)軟件包中，GeneticsComputerGroup，575ScienceDr.，Madison，WI)。相同類型的核酸的同源性可從以下文獻(xiàn)所公開的算法中獲得Zuker，M.Science24448-52，1989；Jaegeretal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA867706-7710，1989；Jaegeretal.MethodsEnzymol.183281-306，1989。以上文獻(xiàn)中至少關(guān)于核酸序列比對(duì)的內(nèi)容作為參考文獻(xiàn)在此處納入本文?！胺窝浊蚓姿崮憠A、肺炎球菌磷壁酸、肺炎球菌脂磷壁酸質(zhì)”意為存在于肺炎球菌中的磷酸膽堿、磷壁酸或脂磷壁酸質(zhì)。這些化合物可如以上對(duì)神經(jīng)氨酸酶的敘述進(jìn)行修飾、去毒或增強(qiáng)。在此提供的組合物包括經(jīng)修飾、去毒和增強(qiáng)的化合物?！捌淇乖圆糠帧币鉃榉肿踊蚧衔?例如神經(jīng)氨酸酶、磷酸膽堿、肺炎球菌磷壁酸、肺炎球菌脂磷壁酸質(zhì))可以引發(fā)針對(duì)該分子的抗體產(chǎn)生的任意表位。優(yōu)選地該抗原性部分引發(fā)對(duì)該分子或肺炎鏈球菌的免疫性。優(yōu)選地該抗體針對(duì)或者干擾神經(jīng)氨酸酶的活性位點(diǎn)?？乖云蔚膶?shí)例包括但不限于對(duì)應(yīng)于nanA-R6氨基酸序列殘基63-361部分的殘基，片段中可能含有或不含有保守性氨基酸的置換或修飾。其他實(shí)例包括神經(jīng)氨酸酶的Asp區(qū)(對(duì)應(yīng)于NanA-R6氨基酸序列的460-480、530-560、610-620殘基)和對(duì)應(yīng)于NanA-R6氨基酸序列340-350、360-370、600-610、570-580和750-760的部分，片段中可能含有或不含有保守性氨基酸的置換或修飾。任選地，針對(duì)干擾神經(jīng)氨酸酶活性部位的抗體可以結(jié)合或阻止其他分子結(jié)合下述位點(diǎn)位于SEQIDNO15的殘基347、367或605處的NanA的精氨酸殘基；或位于SEQIDNO15的殘基383-387、467-473、541-546和610-616處的NanA的Asp盒。此外，該抗體還能結(jié)合或阻止其他分子結(jié)合位于SEQIDNO15的殘基575的纈氨酸或位于SEQIDNO15的殘基752的酪氨酸。該抗體還能結(jié)合或阻止其他分子結(jié)合以上列出的SEQIDNO15的殘基的任意組合。其他NanA片段的實(shí)例包括氨基酸1到340、330到630、620到800、700到1030和330到800。進(jìn)一步提供的片段為兩個(gè)或更多的上述片段的融合體。融合片段包括但不限于1到340區(qū)域與620-680區(qū)域的融合。融合片段以重組蛋白的形式表達(dá)。編碼這些片段的片段被克隆至表達(dá)載體(pET載體；Novagen公司)中并純化蛋白質(zhì)?；蛘撸慰捎蓮S商以合成多肽的形式生產(chǎn)。片段用于免疫動(dòng)物以產(chǎn)生抗體并結(jié)晶以獲得三維結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步提供了編碼片段的核酸，其中含有或不含有在此描述的保守性或非保守性氨基酸的修飾或置換。還提供了包括核酸的載體或表達(dá)系統(tǒng)。在此提供包括分離的抗體的組合物，該抗體特異性地結(jié)合肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶、磷酸膽堿、磷壁酸、脂磷壁酸質(zhì)或這些中一個(gè)或兩個(gè)的抗原性部分。還提供了包括這些抗體任意組合的組合物。這些抗體可用于開發(fā)對(duì)肺炎鏈球菌的被動(dòng)免疫?？贵w組合物進(jìn)一步包括可藥用的載體。任選地，組合物適用于粘膜表面給藥，但其他給藥途徑包括在此描述的全身給藥也被公開。還公開了產(chǎn)生抗體的方法，該抗體特異性地針對(duì)肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶、磷酸膽堿、磷壁酸、脂磷壁酸質(zhì)或肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶、磷酸膽堿、磷壁酸或脂磷壁酸質(zhì)的任意表位。任選地，以有效量的在此公開的組合物與受試者鼻粘膜相接觸，在受試者內(nèi)(即體內(nèi))產(chǎn)生抗體。還公開了產(chǎn)生抗體的方法，該抗體特異性地針對(duì)肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶、磷酸膽堿、磷壁酸、脂磷壁酸質(zhì)或肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶、磷酸膽堿、磷壁酸或脂磷壁酸質(zhì)的任意表位的任意組合，該方法是用有效量的包括靶分子組合或針對(duì)該分子的抗體的組合物與受試者鼻粘膜相接觸。任選地，在此描述的試劑不論是天然存在的還是經(jīng)過去毒或修飾的，都可以任選地以核酸的形式給藥，例如以載體中的核酸的形式。核酸的表達(dá)可以導(dǎo)致受試者與期望表達(dá)的核酸相接觸。因此，例如，如果將編碼肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶的核酸以一種能在受試者體內(nèi)表達(dá)的形式給藥的話，那么受試者就會(huì)與神經(jīng)氨酸酶接觸。在此描述的包括將外源DNA給藥和攝取到受試者細(xì)胞的方法(例如基因轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染)中，如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，公開的核酸可為裸露的DNA或RNA形式，或者核酸在一個(gè)能將核酸運(yùn)送至細(xì)胞的載體中，由此使編碼抗體的DNA片段處于啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控之下。該載體可以為市售制劑例如腺病毒載體(QuantumBiotechnologies，Inc.(Laval，Quebec，Canada)。將核酸或載體運(yùn)送至細(xì)胞內(nèi)可經(jīng)由多種機(jī)制。一個(gè)實(shí)例中，可由脂質(zhì)體運(yùn)送，可使用市售脂質(zhì)體制劑如LIPOFECTIN、LIPOFECTAMINE(GIBCO-BRL，Inc.，Gaithersburg，MD)、SUPERFECT(Qiagen，Inc.Hilden，Germany)和TRANSFECTAM(PromegaBiotec，Inc.，Madison，WI)，也可使用根據(jù)本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)程序開發(fā)的其他脂質(zhì)體。此外，公開的核酸或載體也可以由基因槍或例如電穿孔或SONOPORATION機(jī)器(ImaRxPharmaceuticalCorp.，Tucson，AZ)的方法運(yùn)送至體內(nèi)，其中電穿孔技術(shù)可由Genetronics公司(SanDiego，CA)得到。一個(gè)實(shí)例中，可以經(jīng)由病毒系統(tǒng)運(yùn)送載體，例如可組裝重組逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)(見于例如Pastanetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.854486，1988；Milleretal.，Mol.Cell.Biol.62895，1986)。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒可用于轉(zhuǎn)染并由此將核酸運(yùn)送至被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，該核酸可編碼例如肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶或廣泛的中和抗體(或其活性片段)。將改變的核酸轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的正確方法當(dāng)然不限于使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。其他技術(shù)也廣泛應(yīng)用于這一程序，包括使用腺病毒載體(Mitanietal.，Hum.GeneTher.5941-948，1994)、腺相關(guān)病毒(adeno-associatedviral，AAV)載體(Goodmanetal.，Blood841492-1500，1994)、慢病毒載體(Naidinietal.，Science272263-267，1996)、假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(Agrawaletal.，Exper.Hematol.24738-747，1996)。也可以使用物理轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，例如脂質(zhì)體運(yùn)送和受體介導(dǎo)和其他胞吞作用機(jī)制(見于例如Schwartzenbergeretal.，Blood87472-478，1996)。公開的組合物和方法可與任何這里提到的或其他常用的基因轉(zhuǎn)移方法聯(lián)合使用。一個(gè)實(shí)例中，如果編碼抗體的核酸在腺病毒載體中被運(yùn)送至受試者細(xì)胞，給予人體的腺病毒的劑量范圍為每次注射大約107到109噬菌斑形成單位(pfu)，最高可為每次注射1012pfu(Crystal，Hum.GeneTher.8985-1001，1997；AlvarezandCuriel，Hum.GeneTher.8597-613，1997)。受試者可接受一次注射，或者如果必須要追加注射的話，可以以六個(gè)月的時(shí)間間隔(或由有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)生決定的其他合適時(shí)間間隔)重復(fù)注射一段不定的時(shí)間和/或直至確定了療效為止。如果使用核酸或載體的非消化道給藥，其通常以注射為特征。注射物可以制備為常規(guī)形式，可以是液體溶液或懸液，也可以是適于在注射前溶于液體成為溶液或懸液的固體形式，或者是乳液。非消化道給藥的一個(gè)更新的修改方案包括使用緩慢釋放或持續(xù)釋放系統(tǒng)，以保持穩(wěn)定的劑量。見于例如美國專利No.3,610,795，該專利作為參考文獻(xiàn)在此處納入本文。關(guān)于治療化合物的適當(dāng)制劑和各種給藥途徑的更多討論見于例如RemingtonTheScienceandPracticeofPharmacy(19thed.)ed.A.R.Gennaro，MackPublishingCompany，Easton，PA1995。還公開了一種減少或防止受試者中肺炎球菌鼻攜帶的方法，包括將有效量的在此公開的組合物與受試者的鼻粘膜相接觸。這樣的給藥對(duì)于肺炎球菌感染或鼻攜帶產(chǎn)生主動(dòng)或被動(dòng)免疫或保護(hù)作用是有用的。進(jìn)一步提供減少或防止受試者中肺炎球菌感染的方法，包括將有效量的在此公開的組合物與受試者的粘膜表面相接觸。例如，該方法可防止肺炎球菌腦膜炎、中耳炎、肺炎或溶血性尿毒癥。防止或減少可以通過減少鼻攜帶和或防止CNS侵害、全身性侵害、咽鼓管或下呼吸道侵害來實(shí)現(xiàn)。在此提供的術(shù)語化合物的“有效量”意為無毒害作用但可產(chǎn)生所需效果的化合物的足夠劑量。如下文將要指出的，所需的準(zhǔn)確劑量將根據(jù)受試者的人種、年齡和綜合情況；所治療疾病的嚴(yán)重程度；使用的具體化合物；給藥方式等等條件而變化。因此，不可能指定一個(gè)準(zhǔn)確的“有效量”。然而，合適的有效量由一個(gè)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員僅使用常規(guī)試驗(yàn)就能確定。在此描述的化合物的劑量或用量大到足夠在給藥方法中產(chǎn)生所需效果。該劑量不應(yīng)大到引起如交叉反應(yīng)、過敏反應(yīng)等有害的副作用。通常劑量要根據(jù)受試者的年齡、身體狀況、性別和病情而變化并可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。該劑量也可由個(gè)別的醫(yī)生根據(jù)受試者的臨床情況進(jìn)行調(diào)整。單次劑量、用藥日程和給藥途徑也可能變化。優(yōu)選的包括抗原的鼻部施用的劑量為每次接種約1-1000μg或者這之間的任何劑量，包括例如10-100μg。根據(jù)在此描述的方法的一次特定劑量的化合物或組合物的給藥效果可以通過評(píng)估醫(yī)療史、體征、癥狀和客觀的實(shí)驗(yàn)室測(cè)試這些評(píng)價(jià)肺炎球菌感染的受試者或肺炎球菌攜帶者狀態(tài)的已知有用手段來確定。如本領(lǐng)域治療這些病人的臨床醫(yī)生和執(zhí)行這些實(shí)驗(yàn)的研究者所知，這些體征、癥狀和客觀的實(shí)驗(yàn)室測(cè)試根據(jù)要治療或預(yù)防的特定的疾病或狀況而變化。例如如果在一般人群或特定個(gè)體之間，基于合適的對(duì)照組和/或疾病的正常進(jìn)程的知識(shí)進(jìn)行比較1)受試者的身體健康狀況表現(xiàn)出有所改善(例如鼻攜帶已減少或消失)，2)疾病、感染或鼻攜帶的進(jìn)程表現(xiàn)出穩(wěn)定、減慢或逆轉(zhuǎn)，或3)疾病或病癥的其他藥物治療的需要減少或消除，那么特定的治療方案被認(rèn)為有效。例如，減少或防止受試者中或人群中的鼻攜帶，避免或減少發(fā)生CNS侵害或其他繼發(fā)性肺炎球菌感染，即可說明有效。上述效果可在一個(gè)受試者(如通過粘膜表面進(jìn)行傳統(tǒng)的擦拭時(shí)檢出細(xì)菌數(shù)目的減少)或一個(gè)群體中(如運(yùn)用流行病學(xué)研究)被確定。在此描述的化合物和藥物組合物可根據(jù)需要局部還是全身性治療和需治療的面積而有多種方式給藥至受試者。因此，例如，在此描述的化合物和藥物組合物可以如下方式給藥靜脈內(nèi)給藥、皮下給藥、肌肉內(nèi)給藥、包裹于脂質(zhì)體內(nèi)或微球內(nèi)給藥、作為眼科滴液和/或軟膏在眼表面給藥、作為鼻腔噴劑、作為噴霧溶液或作為鼻腔或呼吸道的氣霧劑。此外，化合物或藥物組合物可以通過陰道、直腸、鼻內(nèi)、口服、吸入、口服或插管的方式給藥至受試者。任選地該組合物可以通過靜脈內(nèi)、皮下、肌肉或腹膜內(nèi)注射的方式給藥。該組合物可以制備為傳統(tǒng)的形式，如液體溶液或懸液、適于在液體中形成溶液或懸液的固體形式或者為乳液。任選地，給藥可以應(yīng)用緩慢釋放或持續(xù)釋放系統(tǒng)，以保持穩(wěn)定的劑量。見于例如美國專利No.3,610,795，其中教導(dǎo)的方法作為參考文獻(xiàn)在此處納入本文。在此教導(dǎo)的組合物包括無菌的含水或非水溶液、懸液和乳液，也可能包括緩沖液、稀釋液和其他合適的添加劑。非水性溶劑的例子為丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油、有機(jī)酯類如油酸乙酯。水性載體包括水、醇/水溶液、乳液或懸液，包括鹽類和緩沖介質(zhì)。運(yùn)載工具包括氯化鈉溶液、林格氏(Ring’s)右旋糖、右旋糖和氯化鈉、乳酸林格氏注射液或不揮發(fā)性油。也可能存在防腐劑或其他添加劑，例如抗菌劑、抗氧化劑、螯合試劑和惰性氣體等等。用于局部給藥的制劑可能包括軟膏、洗液、霜?jiǎng)⒛z劑、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體、氣溶膠、噴霧溶液和粉劑?？赡鼙匦杌蛘咝枰Ｒ?guī)的藥用載體，水、粉底或油底，增稠劑等等?？诜o藥的組合物包括粉劑或顆粒、水或非水介質(zhì)的懸液或溶液、膠囊、藥袋或片劑?？赡苄枰龀韯?、調(diào)味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或結(jié)合劑。在此提供減少或防止受試者鼻攜帶或肺炎球菌感染的方法，包括給予受試者有效量的神經(jīng)氨酸酶抑制劑。優(yōu)選地，該神經(jīng)氨酸酶抑制劑抑制肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶活性但是不會(huì)明顯減少受試者內(nèi)源性的神經(jīng)氨酸酶。因此，例如，當(dāng)神經(jīng)氨酸酶被給予至人體時(shí)，該抑制劑優(yōu)選抑制肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶但是不會(huì)減少人神經(jīng)氨酸酶的活性，或不會(huì)將人神經(jīng)氨酸酶活性減少到在人體內(nèi)產(chǎn)生消極副作用的程度。已知神經(jīng)氨酸酶抑制劑的例子包括DANA、NANA、扎那米韋和奧塞米韋。在此提供減少或防止受試者鼻攜帶或肺炎球菌感染的方法，包括給予受試者有效量的組合物，該組合物包括針對(duì)肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶、磷酸膽堿、肺炎球菌磷壁酸、肺炎球菌脂磷壁酸質(zhì)的抗體或其片段或針對(duì)這些中任意一個(gè)的一部分的抗體。任選地，給藥包括將組合物與受試者的粘膜表面相接觸。還提供了包括抗體的組合物和容器。在此使用的術(shù)語“磷酸膽堿抗體”指的是優(yōu)先結(jié)合磷酸膽堿或其抗原性片段的抗體。本發(fā)明的抗體可優(yōu)先結(jié)合肺炎球菌磷壁酸或肺炎球菌脂磷壁酸質(zhì)或他們的抗原性部分，或神經(jīng)氨酸酶或其片段。在此使用的術(shù)語“抗體”是廣義的，它可包括多克隆抗體和單克隆抗體。具有雙重或多重抗原或表位特異性的嵌合抗體和雜合抗體，和例如F(ab’)2，F(xiàn)ab’，F(xiàn)ab，scFv等的片段，包括雜合片段也可以用于在此描述的組合物和方法。因此，提供了保留著結(jié)合其特異性抗原能力的抗體片段。例如，保留著神經(jīng)氨酸酶、磷酸膽堿、磷壁酸或脂磷壁酸質(zhì)結(jié)合活性的抗體片段是包括于術(shù)語“抗體片段”的意義中的。這樣的抗體和片段可以由本領(lǐng)域已知的技術(shù)制得，也可以根據(jù)實(shí)施例中提供的方法和一般生產(chǎn)抗體和由特異性和活性篩選抗體的方法進(jìn)行特異性和活性篩選而得(見于HarlowandLane.Antibodies，ALaboratoryManual.ColdSpringHarborPublications，NewYork，(1988))?？贵w片段和抗原結(jié)合蛋白(單鏈抗體)的結(jié)合物可以用于本發(fā)明的組合物中。這樣的結(jié)合物描述于例如美國專利No.4,704,692中，該內(nèi)容作為參考文獻(xiàn)在此處納入本文?？贵w經(jīng)體外測(cè)定或類似方法檢測(cè)其期望活性后，根據(jù)已知的臨床試驗(yàn)方法，檢測(cè)它在體內(nèi)的治療和/或預(yù)防活性。本文使用的術(shù)語“單克隆抗體”指的是從一組基本上同質(zhì)的抗體所得到的抗體，即除了在抗體分子的小亞型中存在可能自然出現(xiàn)的突變以外，該組中的抗體個(gè)體是完全相同的。公開的單克隆抗體可以用任何生產(chǎn)單克隆抗體的程序制得。例如，公開的單克隆抗體可以用雜交瘤方法制備，這樣的方法描述于KohlerandMilstein，Nature，256495(1975)。在雜交瘤方法中，通常用免疫劑免疫小鼠或其他合適的宿主動(dòng)物，激發(fā)產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生的抗體會(huì)特異性地結(jié)合免疫劑。或者在體外免疫淋巴細(xì)胞，例如使用在此描述的HIVEnv-CD4-共同受體復(fù)合物。單克隆抗體也可以用重組DNA的方法制備，這樣的方法描述于美國專利No.4,816,567(Cabillyetal.)中。編碼公開的單克隆抗體的DNA用常規(guī)程序(例如使用可以特異結(jié)合編碼鼠類抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)可以容易的被分離和測(cè)序。用噬菌體展示技術(shù)可以產(chǎn)生和篩選抗體或活性抗體片段文庫，例如Burton等的美國專利No.5,804,440和Barbas等的美國專利No.6,096,441中有所描述。體外方法也適用于制備單價(jià)抗體。使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)就可實(shí)現(xiàn)對(duì)抗體的消化而產(chǎn)生其片段，尤其是Fab片段。例如，可用木瓜蛋白酶進(jìn)行消化。木瓜蛋白酶消化的例子描述于1994年12月22日公布的WO94/29348和美國專利No.4,342,566中。木瓜蛋白酶消化抗體通常產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，稱為Fab片段，每個(gè)片段具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，還產(chǎn)生一個(gè)殘留的Fc片段。胃蛋白酶處理產(chǎn)生有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的片段并仍然能交聯(lián)抗原。不論抗體片段是否附著于其他序列上，它都可包括在特定區(qū)域或特定的氨基酸殘基處的插入、缺失、置換或其他的所選修飾，只要與未修飾的抗體或抗體片段相比，這些修飾不顯著改變或損害抗體或抗體片段的活性。這些修飾可提供一些額外的屬性，例如移除/增加能夠形成二硫鍵的氨基酸而增加其生物壽命、改變分泌特性等等。無論如何，抗體或抗體片段必須具有生物活性，例如與其同源抗原的特異性結(jié)合。抗體或抗體片段的功能或活性區(qū)可通過下述方法識(shí)別對(duì)蛋白的特定區(qū)域進(jìn)行誘變，然后進(jìn)行表達(dá)并檢測(cè)表達(dá)的多肽。上述方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見，可包括對(duì)編碼抗體或抗體片段的核酸進(jìn)行位點(diǎn)專一誘變。(Zoller，M.J.Curr.Opin.Biotechnol.3348-354，1992)。正如在此使用的，術(shù)語“抗體”或“抗體片段”也可以指人類的抗體和/或人源化抗體。許多非人類抗體(例如從小鼠、大鼠或兔中產(chǎn)生的抗體)在人體內(nèi)是天然的抗原，當(dāng)給藥至人體時(shí)會(huì)引發(fā)不需要的免疫反應(yīng)。所以在方法中使用人類或人源化抗體可以減少給藥至人體時(shí)引發(fā)不需要的免疫反應(yīng)的可能性。因此，包括抗體的組合物任選地包括人源化或全人抗體?？贵w人源化技術(shù)通常包括使用重組DNA技術(shù)操作編碼抗體分子的一個(gè)或多個(gè)多肽鏈的DNA序列。因此，非人類抗體(或其片段)的人源化形式是嵌合抗體或抗體鏈(或其片段例如Fv、Fab、Fab’，或抗體的其他抗原結(jié)合部分)，它包括整合到人類(受體)抗體框架中的非人類(供體)抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)部分。公開的人類抗體可以使用任何技術(shù)制備。人類單克隆抗體生產(chǎn)技術(shù)的例子包括下述文獻(xiàn)所描述的Coleetal.(MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy，AlanR.Liss，p.77，1985)、Boerneretal.(J.Immunol.，147(1)86-95，1991)。人類抗體(和其片段)也可以使用噬菌體展示文庫來產(chǎn)生(Hoogenboometal.，J.Mol.Biol.，227381，1991；Marksetal.，J.Mol.Biol.，222581，1991)。公開的人類抗體也可以從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中獲得。例如有關(guān)文獻(xiàn)描述了轉(zhuǎn)基因突變小鼠可以在免疫反應(yīng)中產(chǎn)生人類抗體的全部組成成分(見于例如Jakobovitsetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551-255(1993)；Jakobovitsetal.，Nature，362255-258(1993)；Bruggermannetal.，YearinImmunol.，733(1993))。特別地，這些嵌合體或者種系突變的小鼠的抗體重鏈連接區(qū)(J(H))的純合子缺失導(dǎo)致內(nèi)源性抗體的產(chǎn)生完全被抑制，人類種系抗體基因陣列向這樣的種系突變體小鼠的成功轉(zhuǎn)移使得小鼠在受到抗原攻擊時(shí)產(chǎn)生人類抗體。具有期望活性的抗體使用在此描述的Env-CD4共同受體復(fù)合物篩選。為產(chǎn)生人源化抗體，受體(人類)抗體分子中一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基被已知具有期望的抗原結(jié)合特性(例如對(duì)靶抗原一定水平的特異性和親和力)的供體(非人類)抗體分子的一個(gè)或多個(gè)CDR的殘基所取代。在一些實(shí)例中，人類抗體的Fv框架(FR)的殘基被非人類的相應(yīng)殘基所取代。人源化抗體還可包括既不存在于受體抗體中也不存在于移入的CDR或框架序列中的殘基。通常，一個(gè)人源化抗體中有一個(gè)或多個(gè)從非人源引入的氨基酸殘基。實(shí)際上，通常人源化抗體是其中一些CDR殘基和可能一些FR殘基被嚙齒類動(dòng)物抗體的類似位點(diǎn)殘基取代的人類抗體。人源化抗體通常包括至少一部分抗體恒定區(qū)(Fc)，通常是人類抗體的恒定區(qū)(Jonesetal.，Nature，321522-525(1986)；Reichmannetal.，Nature，332323-327(1988)；Presta，Curr.Opin.Struct.Biol.，2593-596(1992))。使非人類抗體人源化的方法在本領(lǐng)域廣為人知。例如，人源化抗體可根據(jù)Winter及其同事的方法(Jonesetal.，Nature，321522-525(1986)；Riechmannetal.，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyenetal.，Science，2391534-1536(1988))，用嚙齒類動(dòng)物的CDR或CDR序列置換人類抗體的相應(yīng)序列的方法生產(chǎn)。產(chǎn)生人源化抗體的方法也被描述于下列美國專利中No.4,816,567(Cabillyetal.)、No.5,565,332(Hoogenboometal.)、No.5,721,367(Kayetal.)、No.5,837,243(Deoetal.)、No.5,939,598(Kucherlapatietal.)、No.6,130,364(Jakobovitsetal.)、和No.6,180,377(Morganetal.)?？贵w的給藥可按照在此公開的方法進(jìn)行。也存在抗體給藥的核酸手段。抗體和抗體片段也可以用編碼該抗體或抗體片段的核酸制品(例如DNA或RNA)的方式給藥至患者或受試者，以使受試者自身的細(xì)胞攝取這些核酸并產(chǎn)生和分泌所編碼的抗體或抗體片段。核酸的給藥可以用本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行。在此還公開了包括在此教導(dǎo)的試劑和組合物的容器。特別地，該容器可以是鼻腔噴霧器(nasalspayer)、霧化器(nebulizer)、吸入器(inhaler)、瓶子或其他任何包括給藥至粘膜表面的形式的組合物的裝置。任選地，該容器可以運(yùn)送確定劑量的組合物。實(shí)施例以下的實(shí)施例為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供了如何制備和評(píng)測(cè)在此描述和要求保護(hù)的化合物、組合物、物品、裝置和/或方法的完整公開和描述，其意圖完全是為了示例而非意在限制發(fā)明人認(rèn)為的本發(fā)明的范圍。已經(jīng)努力確保數(shù)字方面(例如數(shù)量、溫度等)的準(zhǔn)確性，但應(yīng)該考慮到會(huì)存在一些誤差和偏差。除非另有說明，份數(shù)為重量份數(shù)，溫度以℃為單位或者為環(huán)境溫度，壓力等于或接近大氣壓。為了優(yōu)化從所述方法中所得產(chǎn)品的純度和產(chǎn)量，可在反應(yīng)條件上有很多變更和組合，例如組分濃度、所需溶劑、溶劑混合物、溫度、壓力和其他反應(yīng)范圍和條件。只有合理和常規(guī)的方法才被用來優(yōu)化上述過程條件。實(shí)施例1鼻部肺炎球菌通過鼻攜帶穿透嗅覺組織材料和方法肺炎球菌菌株本研究使用了兩個(gè)有莢膜的肺炎鏈球菌菌株血清型為19F的EF3030菌株和血清型為4的TIGR4菌株，以及一個(gè)無致病性無莢膜的菌株由血清型為2的親代菌株D39得來的R36A菌株。Averyetal.，(1944)J.Exp.Med.79137-158。之所以選擇EF3030菌株是因?yàn)樗梢栽跊]有菌血癥的情況下容易地在呼吸道內(nèi)建群(Brilesetal.，(1992)Infect.Immun.60111-116)，而且在靜脈接種后不會(huì)引起持續(xù)的菌血癥。TIGR4菌株雖然致病性強(qiáng)一些，但是其鼻接種物建群溫和并不會(huì)引起菌血癥。小鼠從杰克遜實(shí)驗(yàn)室(JacksonLaboratory(BarHarbor，ME))得到了CBA/CAHN/xid(xid)小鼠。這些小鼠Bruton酪氨酸激酶基因的突變使得它們對(duì)非胸腺依賴的II型抗原沒有反應(yīng)(Amsbaughetal.，(1972)J.Exp.Med.136931-949；Berningetal.，(1980)J.Immunol.46506-513)，但是有相對(duì)正常的T細(xì)胞依賴的免疫反應(yīng)。這些小鼠對(duì)莢膜多糖沒有反應(yīng)而對(duì)肺炎球菌感染有可重復(fù)的易感性。xid小鼠在無病原體條件下飼養(yǎng)，并在7至12周齡時(shí)使用。組織采集從眶后網(wǎng)狀組織中采血至肝素化的毛細(xì)管中。在采集小鼠的鼻洗出物(NW)、腎臟、脾臟和肺之前將小鼠用70％乙醇消毒。為防止NW的血液污染，在氣管上切口并將一支長(zhǎng)2.0cm，外徑0.075cm的聚乙烯(Tygon)管(Cole-Parmer，VernonHills，IL)插入鼻咽部，該管附帶有裝滿林格氏液的注射器。注射器中的液體通過鼻腔排出，收集三滴。鼻咽關(guān)聯(lián)淋巴網(wǎng)狀組織(NALT)、ON/E、OB及腦部殘留物依照下列文獻(xiàn)描述獲得vanGinkeletal.，(2000)J.Immunol.1654778-4782；Wuetal.，(1997)Scand.J.Immunol46506-513。在解剖顯微鏡下小心地從腦部切除三叉神經(jīng)節(jié)。ON/E、OB、三叉神經(jīng)節(jié)、NALT和頸部淋巴結(jié)CLN各自在0.5ml林格氏液中勻漿，腦部和腎臟各自在1.0ml林格氏液中勻漿。在組織糜/血液/外部排泄物中的肺炎球菌數(shù)量將組織和體液用無菌的林格氏液制備成八份連續(xù)三倍稀釋液并涂布于含4μg/ml硫酸慶大霉素的血液瓊脂平皿上。涂布并在燭罐中培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行CFU計(jì)數(shù)。結(jié)果表示為CFU/器官或每NW或每毫升血液。肺炎鏈球菌EF3030菌株的GLS預(yù)培養(yǎng)為封閉GLS的結(jié)合位點(diǎn)，使用3×107CFU的肺炎鏈球菌EF3030菌株在冰上與20μg來自人腦的無唾液酸基GM1或與來自牛腦的125μg混合GLS(18％GM1、55％GD1a、15％GD1b、10％GT1b、2％其他GLS)(Calbiochem-NovabiochemCorporation，Inc.，LaJolla，CA)培養(yǎng)30分鐘。GLS在使用前一天溶于PBS并充分混合。兩性的GLS在PBS中形成微團(tuán)使肺炎球菌可與其碳水化物部分相互作用。培養(yǎng)后，以每鼻孔5μl向xid小鼠鼻部給藥，并不再進(jìn)行洗滌。四天后分析組織的CFU。用PCR進(jìn)行肺炎鏈球菌溶血素基因檢測(cè)為進(jìn)行肺炎鏈球菌的PCR檢測(cè)，將組織在含0.1％脫氧膽酸的1％SDS中凍融裂解，37℃培養(yǎng)1小時(shí)。蛋白質(zhì)以溴化十六烷基三甲銨/NaCl沉淀法除去(Ausubeletal.，(1987)，CurrentProtocolsinMolecularBiology，2nd2.4.4，其教導(dǎo)的溴化十六烷基三甲銨/NaCl沉淀法作為參考文獻(xiàn)在此納入本文)。使用10μgDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將肺炎鏈球菌溶血素(ply)的特異性引物Ply15’-ATTTCTGTAACAGCTACCAACGA-3’(SEQIDNO1)和Ply25’-GAATTCCCTGTCTTTTCAAAGTC-3’(SEQIDNO2)加入PCR混合物中，以擴(kuò)增400bp的片段。PCR反應(yīng)包括94℃下5分鐘的變性步驟，接著是擴(kuò)增循環(huán)94℃(1分鐘)、55℃(1分鐘)和72℃(1分鐘)，30個(gè)循環(huán)。PCR片段的溴化乙錠染色圖像由AlphaImagerTMIS-3400(AlphaInnotechCorporation，SanLeandro，CA)儀器采集。使用PspA特異性抗體對(duì)OB的免疫熒光染色以5×105CFU的TIGR4菌株對(duì)小鼠的鼻部進(jìn)行攻擊。OB在10％甲醛緩沖溶液中固定。對(duì)PspA家族2抗體(1∶100)的4μm石蠟切片(vanGinkel(2000)J.Immunol.1654778-4782)在濕室中室溫培養(yǎng)4小時(shí)進(jìn)行染色。切片用PBS洗滌，用生物素化山羊F(ab’)2抗兔IgG(1∶200)(SouthernBiotechnologyAssociates，Inc.，Birmingham，AL)染色，洗滌后用鏈霉親和素-FITC(1∶100)(BD-PharMingen，SanDiego，CA)染色。熒光圖像由配有DEI-750CE數(shù)碼彩色攝像機(jī)(Optronics，Goleta，CA)的Nikon顯微鏡采集，由ScionImage軟件(ScionCorporation，F(xiàn)rederick，MD)進(jìn)行處理。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表示為平均值±一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)誤差，結(jié)果運(yùn)用不成對(duì)MannWhitney雙樣本秩檢驗(yàn)或studentt-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以確定CFU顯著差異來進(jìn)行比較。結(jié)果肺炎球菌莢膜在鼻建群和CNS侵害中的作用為檢驗(yàn)肺炎球菌通過初級(jí)感官嗅覺神經(jīng)的吸收，測(cè)定了1天和4天時(shí)EF3030和無莢膜菌株R36A在鼻道建群和進(jìn)入CNS的能力(圖1)。在1天時(shí)在ON/E中兩個(gè)菌株都可被觀察到高的CFU，但在4天時(shí)R36A在ON/E和所有其他組織中大大減少，這與早先顯示持續(xù)的建群需要一些莢膜的結(jié)果相一致。MageeandYother(2001)Infect.Immun.693755-3761。EF3030在1天和4天時(shí)都顯示在OB和腦中的清晰存在，并且在4天時(shí)在NW和NALT中大量存在。這些發(fā)現(xiàn)與EF3030在鼻攻擊后由軸突運(yùn)輸進(jìn)入OB和腦相一致。鼻建群和CNS侵害的動(dòng)力學(xué)在39天的觀察中，EF3030在所有時(shí)間點(diǎn)在ON/E、OB、NW和NALT中持續(xù)存在(圖2)。在腦和CLN中看到的CFU數(shù)目要低得多，上述CFU通常見于18和25天。值得關(guān)注的是，除了1(圖1)、18、25和39天(圖2)外，肺部不出現(xiàn)肺炎球菌。由于在用鼻部給藥的EF3030菌株進(jìn)行的所有實(shí)驗(yàn)中均沒有檢出小鼠血液中的CFU，所以菌血癥不會(huì)有助于神經(jīng)組織的分布(圖2)。在鼻部施用后1、3、6、12、24小時(shí)和隨后一周內(nèi)每一天針對(duì)菌血癥進(jìn)行了血液監(jiān)測(cè)。在血中沒有檢出細(xì)菌。三叉神經(jīng)節(jié)的肺炎鏈球菌感染三叉神經(jīng)元支配鼻咽，因此預(yù)料肺炎鏈球菌在感染鼻粘膜之后到可能在三叉神經(jīng)節(jié)中出現(xiàn)。為測(cè)試上述可能，在新的實(shí)驗(yàn)中分離了接種四天后的不同組織和血液并測(cè)定其中的EF3030。在ON/E和OB及三叉神經(jīng)節(jié)中檢出了EF3030菌株(表3)。這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步支持了無唾液酸基GM1作為肺炎鏈球菌神經(jīng)靶向受體的結(jié)論。其他的GLS可能也起作用。表3顯示了肺炎鏈球菌EF3030菌株在鼻部給藥后在不同組織中的分布。在鼻部施用1×107CFU的EF3030菌株4天后分離組織。血液(50μl)、ON/E、OB和腦的組織糜被稀釋，然后涂布于血瓊脂培養(yǎng)基上。三叉神經(jīng)節(jié)被混合勻漿后也涂布于該培養(yǎng)基。示出的是代表三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的5只小鼠的肺炎球菌CFU的平均值±SE。在腦和血液中沒有肺炎球菌檢出。表3神經(jīng)節(jié)苷脂抑制肺炎球菌建群在鼻部施用之前，EF3030菌株與無唾液酸基GM1或混合的GLS微團(tuán)在PBS中培養(yǎng)。在鼻部施用4天后測(cè)定，GLS混合物顯示出最強(qiáng)的抑制效果并在NW中使CFU減少了10倍(P＝0.0365)?；旌系腉LS預(yù)培養(yǎng)導(dǎo)致的CFU最多的下降見于ON/E中(下降617倍；P＝0.0134)。在肺(P＝0.0320)(圖3B)中和CNS組織(P＝0.0078)(圖3A)中也有同樣顯著的差異，在對(duì)照組中平均存在204和166CFU，而在與GLS培養(yǎng)后則檢測(cè)不到(檢出限＝3CFU)肺炎球菌了。無唾液酸基GM1預(yù)培養(yǎng)比混合的GLS的效果差一些，但是也能在CNS(圖3A)和肺(圖3B)中分別降低建群25倍和63倍。肺部被吸入的肺炎球菌感染，GLS可明顯抑制它們附著于在肺中相對(duì)豐富的無唾液酸基GM1上。這說明GLS在初始附著到上皮細(xì)胞的過程中起作用。GLS治療不改變肺炎球菌的存活率。在這些實(shí)驗(yàn)中在血液中沒有肺炎球菌檢出。因此，GLS構(gòu)成了肺炎球菌附著于鼻道神經(jīng)上皮細(xì)胞和感染肺部和CNS的重要靶點(diǎn)。鼻攻擊后肺炎球菌在OB中累積的檢測(cè)OB中的EF3030數(shù)量通常很低以至于無法用顯微鏡觀察到。為使鼻部施用后OB中的肺炎鏈球菌能被觀察到，使用了毒性更大的TIGR4菌株。檢測(cè)了鼻攻擊后1、3、6、12或24小時(shí)和隨后每一天的代表小鼠的血樣。沒有觀察到菌血癥。攻擊一周后殺死小鼠并分析其組織的CFU(圖4A和4B)。僅僅5×105CFU劑量的TIGR4就能導(dǎo)致在OB中的約300CFU(圖3)。OB中的肺炎球菌通過PspA特異性抗體的染色可見(圖4D至F)。在受攻擊小鼠OB中即在嗅球小球?qū)?圖4F)和外叢狀層(圖4E)中檢出了肺炎球菌。在對(duì)照小鼠的OB中沒有肺炎球菌(圖4D)。在鼻部給藥后6天用肺炎球菌溶血素基因的PCR擴(kuò)增也能檢出NW、ON/E和OB中的TIGR4菌株(圖4C)。在這個(gè)區(qū)間內(nèi)的血樣或未感染小鼠的任何樣本中沒有PCR能檢出的肺炎球菌。實(shí)施例2肺炎球菌NanA在鼻咽攜帶和靶向神經(jīng)系統(tǒng)中的作用NanA突變體從三個(gè)NanA的遺傳背景和位置均不相同的肺炎鏈球菌菌株中產(chǎn)生。EF3030(19F型)和D39(2型)菌株均表達(dá)與細(xì)胞壁共價(jià)結(jié)合的NanA，而TIGR4(4型)菌株表達(dá)分泌到環(huán)境的截短的NanA。還評(píng)估了NanB在建群中的作用。菌株和生長(zhǎng)條件本研究中使用的菌株列于表4。表4*Tettelinetal.(2001)Science293498-506。Brilesetal.(2003)JInfectDis188339-348。Averyetal.(1979)J.Exp.Med149297-326；McDanieletal.(1987)Microb.Pathog.3249-260?！霣erryetal.(2000)Infect.Immun.68133-140。所有的肺炎球菌菌株于-80℃的10％甘油中儲(chǔ)存，并轉(zhuǎn)移到血瓊脂平板上在37℃、5％CO2環(huán)境中培養(yǎng)過夜。肺炎球菌培養(yǎng)物在含0.5％酵母提取物的Todd-Hewitt培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至OD660達(dá)到0.5，將培養(yǎng)物等份于含10％無菌甘油的相同肉湯培養(yǎng)基中并在-80℃凍存。攜帶抗生素抗性插入物的突變體在適當(dāng)?shù)目股刂猩L(zhǎng)以確保突變的穩(wěn)定性。NanA突變體的構(gòu)建分別由親代背景TIGR4、EF3030和D39通過插入復(fù)制誘變技術(shù)(Yotheretal.(1992)J.Bact.174610-618，其中教導(dǎo)的技術(shù)全部作為參考文獻(xiàn)在此納入本文)產(chǎn)生NanA突變體菌株JW001、SAM001和JCP001(表4)。使用TIGR4和EF3030菌株作為從等基因nanA菌株D39中制備的供體染色體DNA的轉(zhuǎn)化受體(Berryetal.(2000)Infect.Immun.68133-140)。每一例的突變體回交至親本三次。D39突變體也回交D39親本三次以保證其與用于此研究的親代菌株等基因。D39的突變由插入復(fù)制誘變制得，以使成熟蛋白的大約650個(gè)氨基酸除N末端片段外全部缺失(Berryetal.(2000)Infect.Immun.68133-140)。TIGR4/nanB等基因突變體用插入復(fù)制誘變技術(shù)(Balachandranetal(2002)Infect.Immun.702536-2534；Yotheretal.(1992)J.Bact.174610-618)構(gòu)建。使用下述方法擴(kuò)增nanB的一段461bp的內(nèi)部片段以nanBF和nanBR為引物(表1)，用TaqPCRMastermix(Invitrogen)進(jìn)行PCR，于95℃1分鐘、45℃1分鐘、72℃1分鐘進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。將片段克隆至pSF152。如前述轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA到TIGR4菌株中(Balachandranetal.(2002)Infect.Immun.702526-2534)。nanA/nanB-TIGR4雙突變體通過將從JW001菌株中制得的染色體DNA轉(zhuǎn)化到nanB/TIGR4突變體中生成。小鼠毒性分析6-12周齡的CBA/CaHN-XID/J(CBA/N)雌性小鼠從杰克遜實(shí)驗(yàn)室(TheJacksonLaboratory(BarHarbor，MA))獲得。這些小鼠的Bruton酪氨酸激酶基因突變使得它們對(duì)非胸腺依賴的II型抗原沒有反應(yīng)，但還有相對(duì)正常的T細(xì)胞依賴免疫反應(yīng)(Amsbaughetal.1972J.Exp.Med.136931-949；Brilesetal.1986Curr.Top.Microbiol.Immunol.124103-120；Potteretal.1999Int.Immunol.111059-64；WickerandScher1986Curr.Top.Microbiol.Immunol.124)。這些小鼠對(duì)莢膜多糖沒有反應(yīng)而對(duì)肺炎球菌感染有可重復(fù)的易感性(Brilesetal.1986CurrTop.Microbiol.Immunol.124103-120；Brielsetal.1981j.Exp.Med.153694-705)。所述x連鎖免疫缺陷(xid)小鼠在無病原體條件下飼養(yǎng)，并在7至12周齡時(shí)使用。含有已知濃度活細(xì)胞的冰凍感染株在乳酸林格氏溶液中稀釋。以10μl約5×105-1×106個(gè)細(xì)胞鼻內(nèi)(I.N.)感染小鼠(Wuetal.1997bMicrob.Pathog23127-137)。組織采集在實(shí)行鼻洗出和組織采集前對(duì)所有小鼠無痛致死。從眶后網(wǎng)狀組織中取血至肝素化的毛細(xì)管中。在采集鼻洗出物(NW)、鼻部組織(包括嗅上皮(NT)、嗅球(OB))和腦之前將小鼠用70％乙醇消毒。液體和組織的獲得如上所述。為防止NW的血液污染，在氣管上切口并將一支長(zhǎng)2.0cm，外徑0.075cm的聚乙烯(Tygon)管(Cole-Parmer)插入鼻咽部，該管附帶有裝滿林格氏液的注射器。注射器中的液體通過鼻腔排出，收集三滴。ON/E和OB在0.5ml林格氏液中勻漿，腦殘留物在1.0ml林格氏注射液中勻漿。存活肺炎球菌計(jì)數(shù)將組織和體液用無菌的林格氏液制備成八份連續(xù)三倍稀釋液并涂布于含4μg/ml硫酸慶大霉素的血液瓊脂平皿上。涂布并在燭罐中37℃培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行菌落形成單位(CFU)計(jì)數(shù)。用于分析神經(jīng)氨酸酶活性的方法在前已述(Locketal1988MicrobPathog433-43，其分析方法全部作為參考文獻(xiàn)在此納入本文)。結(jié)果的顯著性由雙樣本Mann-Whitney秩檢驗(yàn)通過比較野生型肺炎球菌和突變型肺炎球菌來評(píng)估。體外研究測(cè)定了TIGR4及其nanA和nanB突變體結(jié)合特異性神經(jīng)節(jié)苷脂的能力。使用的神經(jīng)節(jié)苷脂包括混合神經(jīng)節(jié)苷脂、無唾液酸基GM1、GM1、GD1a、GD1b、GT1(Calbiochem)和GM3神經(jīng)節(jié)苷脂(Sigma)。GM3神經(jīng)節(jié)苷脂缺少能使肺炎球菌結(jié)合的末端或內(nèi)部的GalNAcβ1-4Gal序列而用作陰性對(duì)照。這些混合的、含有一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)唾液酸的神經(jīng)節(jié)苷脂很容易結(jié)合到ELISA平板上。在與TIGR4菌株短期培養(yǎng)之后的原始數(shù)據(jù)顯示肺炎球菌與無唾液酸基GM1包被的平板結(jié)合，但不與BSA-、GM-3或GM1包被的平板結(jié)合。使用神經(jīng)節(jié)苷脂包被的平板比較了野生型TIGR4菌株和TIGR4菌株、nanA、nanB和nanA/nanB突變體菌株的穩(wěn)定不透明和透明相變種與平板附著的能力。這些分析包括了在神經(jīng)節(jié)苷脂平板上的短期培養(yǎng)(1小時(shí))和延長(zhǎng)培養(yǎng)(24小時(shí))。通過在含0.5％酵母提取物的ToddHewitt培養(yǎng)基中短暫培養(yǎng)(10-15分鐘)然后反復(fù)地移液并將脫落的細(xì)菌接種到血瓊脂平板上的方法將附著的肺炎球菌從神經(jīng)節(jié)苷脂平板上移除?；蛘哂?1℃的含0.5％酵母提取物的ToddHewitt肉湯瓊脂倒于附著的肺炎球菌上方并于平板底部計(jì)算菌落數(shù)目。對(duì)照包括不含肺炎球菌的平板和不含神經(jīng)節(jié)苷脂但含有肺炎球菌的平板。在測(cè)定了神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合力之后，使用不同的細(xì)胞系來測(cè)定它們將肺炎球菌附著于其細(xì)胞表面并攝入其中的能力。該研究著重于大鼠神經(jīng)嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系PC12(ATCC)和巨噬細(xì)胞系P388D1。因?yàn)檫@兩種細(xì)胞系的特性而選擇它們。P388D1細(xì)胞系表達(dá)高親和力的PAF-R(Valone(1988)J.Immunol.1402389-2394)，其被報(bào)道存在于小膠質(zhì)細(xì)胞。PC12細(xì)胞系不表達(dá)可檢出的PAF-R。Breweretal.，(2002)J.NeuroChem821502-1511。將102-105CFU的肺炎球菌加入這些細(xì)胞系中，在6孔或24孔組織培養(yǎng)板上37℃培養(yǎng)15分鐘到6小時(shí)之間，然后廣泛洗滌細(xì)胞并分析附著的肺炎球菌。為測(cè)定細(xì)胞的內(nèi)攝作用，用青霉素和慶大霉素洗滌細(xì)胞2小時(shí)，然后接種至血瓊脂平板或?qū)愉佊?1℃含0.5％酵母提取物的ToddHewitt肉湯瓊脂。使用的這兩種細(xì)胞系反映了通常見于CNS的PAF-R的體內(nèi)表達(dá)。活化的小膠質(zhì)細(xì)胞和P388D1細(xì)胞系一樣均大量表達(dá)PAF-R受體，而神經(jīng)細(xì)胞如PC12細(xì)胞系不表達(dá)或僅由個(gè)別的神經(jīng)亞群表達(dá)低水平的該受體。Morietal.，(1996)J.Neurosci163590-3600；Bennettetal.，(1998)CellDathDiffer.5867-875。兩種細(xì)胞系均有肺炎球菌附著說明PAF-R對(duì)于附著是非必需的，還有其它受體。還測(cè)試了TIGR4的不透明和透明的變種及nanA-、nanB-突變體和nanA/nanB雙突變體相對(duì)于觀察到的野生型TIGR4菌株對(duì)這些細(xì)胞系的附著力。為進(jìn)一步分析PAF-R與神經(jīng)節(jié)苷脂在肺炎球菌附著中的作用，將1029bp的人PAFR的開放閱讀框轉(zhuǎn)染到缺少PAF-R的COS-7細(xì)胞系(GerardandGerard(1994)J.Immunol.152793-800；Hondaetal.，(1992)J.LipidMed.5105-107)中，該轉(zhuǎn)染使用如早先報(bào)道的pcDNA3.1/GS質(zhì)粒(Breweretal.，(2002)J.NeuroChem821502-1511，其中教導(dǎo)的方法全部作為參考文獻(xiàn)在此納入本文)和Tranfast試劑(Promega)。只使用該質(zhì)粒作為對(duì)照并在存在或缺少PAF-R的條件下對(duì)影響肺炎球菌附著的參數(shù)進(jìn)行了分析。此實(shí)驗(yàn)提供了明確的關(guān)于PAF-R對(duì)附著的重要性的數(shù)據(jù)。在缺少PAF-R的細(xì)胞系上的附著都通過神經(jīng)節(jié)苷脂介導(dǎo)而后被與神經(jīng)節(jié)苷脂的預(yù)培養(yǎng)所阻礙。為進(jìn)一步確定肺炎球菌附著和穿透上皮細(xì)胞的能力，使用了Detroit562人咽部上皮細(xì)胞系(ATCC)和A549人肺部上皮細(xì)胞系(ATCC)并使用transwell系統(tǒng)。使用Millicell-PCF培養(yǎng)(Millipore，Billerica，Mass.)嵌入平板使上皮細(xì)胞系生長(zhǎng)融合。融合通過使用MilliporeMillicell電阻抗系統(tǒng)測(cè)量經(jīng)上皮電阻而測(cè)定。阻抗達(dá)到至少500Ω/cm2表明獲得完全融合的單層上皮細(xì)胞。這些上皮細(xì)胞暴露于肺炎球菌以測(cè)試肺炎球菌附著、進(jìn)入和穿透上皮細(xì)胞層的能力。為區(qū)分附著和攝入，洗滌該上皮細(xì)胞并用含青霉素和慶大霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)2小時(shí)。初始的重點(diǎn)在于TIGR4菌株、其nanA和nanB突變體及其雙突變體。通過連續(xù)傳代，直到獲得體內(nèi)攻擊后也不逆轉(zhuǎn)的穩(wěn)定變種，用此方法已經(jīng)獲得了TIGR4菌株的透明和不透明的穩(wěn)定變種。比較了這些TIGR4變種附著、進(jìn)入和穿過上皮細(xì)胞的能力。以EMEM培養(yǎng)基以每孔103-106CFU的數(shù)量鋪板。在0.5、1、2、4、8和24小時(shí)時(shí)收集上皮細(xì)胞層上方和下方的培養(yǎng)物并分析CFU。洗滌細(xì)胞層5-6次，然后在細(xì)胞層上鋪含0.5％酵母提取物和0.5％瓊脂并冷卻至41℃的ToddHewitt肉湯培養(yǎng)基來測(cè)定結(jié)合于單細(xì)胞層的肺炎球菌CFU。將其置于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)過夜，然后進(jìn)行CFU計(jì)數(shù)。分析細(xì)胞系PAF-R的表達(dá)。這些細(xì)胞系的總RNA用如下兩個(gè)引物通過RT-PCR進(jìn)行分析PAF-1(5′-CCGATACACTCTCTTCCCGA-3′(SEQIDNO3)；151到170核苷酸)和PAF-2(5′-ACAGTTGGTGCTAAGGAGGC-3′(SEQIDNO4)；970到951核苷酸)，得到838bp的PCR產(chǎn)物(Stengeletal.，(1997)Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.17954-962，其中教導(dǎo)的方法全部在此納入本文)。如果存在PAF受體，則在培養(yǎng)物中加入例如奧替溴胺(octyloniumbromide)(BiomolResearcbLaboratories，Inc.Plymouthmeeting，PA)或PAF(Biomol)等PAF受體抑制劑來測(cè)定PAF-R在上皮細(xì)胞附著和穿透過程中的作用。奧替溴胺以高親和力結(jié)合PAF-R?；蛘呤褂蒙鲜龅腃OS7細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)此目的，比較存在和不存在PAF-R時(shí)肺炎球菌的附著。不同肺炎球菌菌株的侵害程度與Transwell系統(tǒng)中頂端和底外側(cè)區(qū)室的炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)量相關(guān)。收集不同時(shí)間點(diǎn)的上層和下層區(qū)室培養(yǎng)上清液并用ELISA(BDPharMingen)分析測(cè)定炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α的濃度。上皮單細(xì)胞層用乙醛固定，并使用PspA特異性免疫熒光染色法分析細(xì)胞內(nèi)的肺炎球菌的存在，該方法與前述的使OB中的肺炎球菌可見的方法相似。熒光圖像通過裝有合適的濾光立方體(Chromtechnology，Battleboro，VT)的Leica/LeitzDMRB顯微鏡可見，其方法如前所述(Martinetal.，(1998)J.Immunol.1603748-3758，其中教導(dǎo)的方法作為參考文獻(xiàn)在此處納入本文)。圖像由C5810數(shù)碼彩色相機(jī)(MamamatsuPhotonicSystem)采集并由Adobephotoshop和IPLABSpectrum軟件進(jìn)行處理。結(jié)果NanA和NanB突變體的建群通過鼻內(nèi)(i.n.)感染的小鼠和被NanA突變體菌株感染的小鼠的鼻洗出物中分離的肺炎球菌細(xì)胞數(shù)量的比較來評(píng)估NanA突變體對(duì)肺炎鏈球菌在CBA/N小鼠鼻咽建群能力的影響。實(shí)驗(yàn)包括三個(gè)不同的肺炎球菌菌株以研究NanA突變對(duì)不同的莢膜血清型和遺傳背景的菌株的影響。TIGR4/NanA-(JW001)、EF3030/NanA-(SAM001)和D39/NanA-(JCP001)的莢膜型分別為4、19F和2(表4)。在莢膜型為4的臨床分離株即TIGR4的情況下，編碼LPETG(SEQIDNO13)基序的序列前有一個(gè)終止密碼子。如果沒有該基序，NanA可預(yù)期被TIGR4分泌到環(huán)境中。檢查另外4個(gè)目前可用的肺炎球菌NanA序列G54(19F型)、R6(2型)、西班牙23F和670(6B型)(Berryetal.Gene71299-305；Hoskinsetal.2001J.Bacteriol.1835709-17；Tettelinetal.2001Science293498-506)，顯示它們具有用于共價(jià)結(jié)合于細(xì)胞壁的LPXTG(SEQIDNO14)基序(圖5)。所以，這里包括的菌株提供了NanA為分泌型和表面結(jié)合型的菌株突變的比較。在TIGR4和EF3030的NanA突變體中都觀察到了建群的顯著減少(圖6和7)。肺炎鏈球菌還表達(dá)另一種神經(jīng)氨酸酶NanB。相對(duì)于NanA來說，NanB之間具有類似程度的同源性。NanB與NanA有43％的同源性(24％相同)。兩種蛋白共有的殘基顯示為唾液酸酶(Berryetal.1996J.Bacteriol.1784854-4860)。發(fā)現(xiàn)NanB的最適pH值為4.5，而NanA的最適pH值為6.5和7之間。但即使在其最適的pH值下，NanB作為唾液酸酶的活性也只有NanA在其最適pH值下活性的1％。即便如此，為觀察NanB對(duì)于建群和CNS的直接侵害的必要性，從TIGR4遺傳背景中構(gòu)建了NanB缺陷的突變體菌株TIGR4/NanB-(JW002)和缺乏NanA和NanB表達(dá)的菌株TIGR4/NanAB-(JW003)。用JW002感染小鼠導(dǎo)致與TIGR4菌株幾乎相同水平的建群(圖8)。而且雙突變體與NanA突變體相比，其建群也沒有顯著的減少(圖9)。肺炎球菌進(jìn)入CNS為跟蹤肺炎鏈球菌向鼻組織(包括嗅神經(jīng))的移動(dòng)，檢測(cè)了嗅球和腦殘留物中肺炎鏈球菌的存在。不論其遺傳背景如何，NanA突變體相對(duì)于野生型菌株在鼻組織和嗅球中的數(shù)量顯著下降。在殺死小鼠時(shí)，所有小鼠都經(jīng)過放血而且在血液中沒有發(fā)現(xiàn)可檢出的肺炎球菌(＜12CFU/毫升血液)，這表明肺炎球菌是從鼻腔直接進(jìn)入CNS組織的。NanB突變體對(duì)肺炎球菌進(jìn)入鼻部組織或嗅球沒有影響(圖8)。NanA突變體在鼻咽和CNS中建群和存留的能力明顯減弱。這可在莢膜血清型和表面NanA附著情況均不同的菌株中觀察到。雖然NanA僅是影響細(xì)菌細(xì)胞表面和宿主之間結(jié)合的眾多表面結(jié)構(gòu)中的一個(gè)，但是它卻是鼻攜帶和肺炎球菌靶向至CNS關(guān)鍵的因素。破壞NanA會(huì)顯著減少建群和靶向至CNS。在TIGR4和EF3030中都觀察到了所述結(jié)果。EF3030(19F型)菌株在鼻咽中可高效地建群一個(gè)月以上。然而，盡管EF3030的存留能力很強(qiáng)，在NanA的突變也可顯著減少鼻中肺炎球菌細(xì)胞的數(shù)量。這種衰減在TIGR4/NanA-菌株中更為明顯，該菌株從鼻洗出液中分離的細(xì)胞的數(shù)量在14天后下降至接近檢出限的水平。在天然的環(huán)境中肺炎球菌與其他菌種共存。因此NanA的其它功能可能包括改變宿主蛋白質(zhì)的功能和增加攜帶的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。NanA還可能增強(qiáng)肺炎球菌與包括腦膜炎雙球菌(N.meningitidis)和流感桿菌(H.influenzae)的其他口腔微生物的競(jìng)爭(zhēng)能力或?qū)⑺拗鞯奶堑鞍鬃鳛樘荚词褂?。雖然這些研究的主要結(jié)果顯示NanA的表達(dá)是在小鼠中最適攜帶的必要條件，但是這些數(shù)據(jù)也顯示缺少NanA的肺炎球菌在嗅球中也有很少量的存在。從這點(diǎn)上很難得知活性的NanA對(duì)于肺炎鏈球菌在CNS組織中的存活是否重要。雖然從這些組織中收回的NanA突變體的數(shù)量比其親本少得多，但是它們確實(shí)在神經(jīng)組織中的存在證明了當(dāng)肺炎球菌進(jìn)入腦時(shí)NanA的額外的致病力。在OB中神經(jīng)氨酸酶突變體水平的下降極有可能是由下降的攜帶導(dǎo)致。這個(gè)發(fā)現(xiàn)指出了這樣一個(gè)原理攜帶是更多侵害性疾病的前提條件，例如NanA免疫這樣可以減少攜帶的干預(yù)可以保護(hù)，防止肺炎、腦膜炎、中耳炎和敗血癥。在已知的nanA序列中，TIGR是唯一不含表面錨定序列的。在這個(gè)菌株中，移碼突變?cè)斐闪嗽摲肿釉贚PETG(SEQIDNO13)基序前被截短(Tettelinetal.2001Science293498-506)。對(duì)于大部分菌株而言，NanA的很重要的一部分預(yù)期可通過分選酶(sortase)共價(jià)附著于細(xì)胞壁(Mazmanianetal.1999Science285760-63)，這可在電子顯微鏡照片中檢出(Camaraetal.Infect.Immun.623688-95)。在這些研究中，TIGR4和EF3030一樣表現(xiàn)出在嗅球中的NanA依賴性攜帶和存在。從NanA活性定位于上清液或是細(xì)菌沉淀的研究中顯示，與TIGR4不同，EF3030的NanA活性是細(xì)胞關(guān)聯(lián)的。因此，NanA不論其為表面結(jié)合型還是分泌型均可以利于建群。實(shí)施例3神經(jīng)節(jié)苷脂在肺炎鏈球菌病理學(xué)中的作用在分離ON/E之前的15、30和60分鐘，將純化的神經(jīng)氨酸酶NanA(Calbiochem)以1、10和50μg的藥量在10μlPBS中鼻部給藥。組織以4％多聚甲醛固定并做石蠟切片。先用生物素化-CT-B其后用鏈霉親和素-FITC對(duì)GM1染色并分析了染色密度。還使用了羅丹明(rodamine)偶聯(lián)的無唾液酸基GM1特異性抗體對(duì)切片染色以確定在這些組織中GM1染色的減少與無唾液酸基GM1染色增加是同時(shí)發(fā)生的。用相同手段處理平行組的小鼠，并分析了1天和4天的肺炎鏈球菌TIGR4和EF3030菌株的建群以確認(rèn)神經(jīng)氨酸酶處理會(huì)導(dǎo)致鼻建群水平的提高。由鼻部給予小鼠高劑量的EF3030菌株(1×108CFU)，在鼻部攻擊后下列時(shí)間間隔分離ON/E1、3、6和12小時(shí)、1和4天。ON/E以上述方法染色并分析GM1和無唾液酸基GM1的表達(dá)。如果在鼻組織中觀察到GM1的減少和無唾液酸基GM1的增加，則還要測(cè)試NanA-和NanB-缺陷型菌株，因?yàn)樗鼈冾A(yù)期不會(huì)改變GM1在鼻道中的表達(dá)。唾液酸殘基的移除暴露出了近末端的二糖β-D-吡喃半乳糖基-(1-3)N-乙酰-D-半乳糖胺，其表現(xiàn)為PNA高親和力的Thompson-Friedenreich抗原的免疫顯性簇。因此，ON/E中PNA結(jié)合位點(diǎn)的變化是神經(jīng)氨酸酶活性的另一種量度。這些組織制成的冷凍切片可以容易的被PNA-FITC或PNA-HRP(Medac，Hamburg，Germany)染色，就可基于顯微鏡測(cè)定PNA結(jié)合位點(diǎn)中是否有提高(Blacketal.，(2000)Pediatr.Infect.DisJ.19187-195；Kleinetal.(1978)Klin.Wochenschr.56761-765，其中教導(dǎo)的方法全部?jī)?nèi)容作為參考文獻(xiàn)在此納入本文)。在以TIGR4或EF3030菌株鼻部給藥前將GM1位點(diǎn)特異性地阻斷。上述目的可通過以下三種方式達(dá)到，使用1)CT-B對(duì)非神經(jīng)節(jié)苷脂對(duì)照蛋白如卵清蛋白，2)GM1的抗體(Calbiochem)對(duì)正常的兔免疫球蛋白，或3)在UABProteinAnalysisandPeptideSynthesisCoreFacility中合成的GM1特異性肽。使用GM1特異性肽進(jìn)行抑制是最佳手段，因?yàn)镃T-B以及有可能GM1的抗體預(yù)計(jì)會(huì)引起并發(fā)炎癥。在這些實(shí)驗(yàn)中，在肺炎球菌CFU施用后1天和4天時(shí)分析ON/E和OB。一個(gè)阻斷GM1的備選方案是使用由噬菌體展示十五肽文庫篩選GM1結(jié)合肽而發(fā)現(xiàn)的GM1結(jié)合肽。該GM1結(jié)合肽VWRLLAPPFSNRLLP(SEQIDNO5)對(duì)GM1具有高親和力(1010M-1)，并且其IC50為1.0μM.Matsuburaetal.，(1999)FEBSLetters456253-256。使用與其相同長(zhǎng)度和氨基酸構(gòu)成的隨機(jī)選擇序列的肽作為對(duì)照。在體內(nèi)使用以前用ELISA確定了兩種多肽的GM1結(jié)合能力。最初，將100μg的兩種多肽置于10μl林格氏液或PBS中鼻部給藥，10分鐘后施用3×106CFU的EF3030菌株。分析施用后1天和4天的ON/E中相對(duì)于未處理的CBA/N小鼠的CFU數(shù)量。使用PAF(BiomolResearchLaboratories，Inc.Plymouthmeeting，PA)和PAF-R拮抗劑奧替溴胺(Biomol)進(jìn)行阻斷實(shí)驗(yàn)。該化合物以高親和力結(jié)合PAF-R。分別測(cè)試了每一個(gè)神經(jīng)節(jié)苷脂。在攻擊后1和4天測(cè)試了混合的神經(jīng)節(jié)苷脂、無唾液酸基GM1、GM1、GD1a、GD1b、GT1(Calbiochem)和GM3(Sigma)抑制鼻部建群的能力。多種神經(jīng)節(jié)苷脂能夠阻斷這一過程。由于GM3神經(jīng)節(jié)苷脂缺少公布的C-多糖結(jié)合基序，所以它被用作陰性對(duì)照。從神經(jīng)節(jié)苷脂預(yù)培養(yǎng)的EF3030建群的數(shù)據(jù)來看，混合的神經(jīng)節(jié)苷脂對(duì)建群的阻斷比無唾液酸基GM1更有效。這說明不只是無唾液酸基GM1，其他神經(jīng)節(jié)苷脂也與肺炎球菌在鼻道、肺部和腦中的建群過程有關(guān)。這些神經(jīng)節(jié)苷脂抑制研究著重于TIGR4菌株及其神經(jīng)氨酸酶突變體。在神經(jīng)節(jié)苷脂包被的ELISA平板上TIGR4菌株的體外短期培養(yǎng)證明TIGR4菌株與無唾液酸基GM1有附著作用。腸毒素提供了另一種有差異地阻斷鼻道中肺炎球菌-神經(jīng)節(jié)苷脂相互作用的手段。CT和LTh-1均為血清群I不耐熱腸毒素(Pickettetal.，(1986)J.Bacteriol165348-352)，并且顯示類似但稍有差異的神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合特性。Fukutaetal.，(1988)InfectImmun.561748-1753。CT(ListBiologicalLaboratories，Inc.，Campbell，CA)結(jié)合GM1并且較少程度的結(jié)合GD1b。LTh-1優(yōu)先結(jié)合GM1和GD1b并且較弱地結(jié)合GM2和無唾液酸基GM1。Fukutaetal.，(1988)InfectImmun.561748-1753。如果GM1是與肺炎鏈球菌相互作用的主要的神經(jīng)節(jié)苷脂，使用LTh-1不僅能阻斷GM1神經(jīng)節(jié)苷脂，也能阻斷代表不需要神經(jīng)氨酸酶活性的天然低頻率結(jié)合位點(diǎn)的無唾液酸基GM1。來自血清群II的不耐熱腸毒素顯示了不同的神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合特異性，尤其是不耐熱腸毒素LT-IIb。這種毒素結(jié)合GD1a并且較少程度地結(jié)合GT1b，而且顯示對(duì)GM1沒有親和力。Fukutaetal.，(1988)InfectImmun.561748-1753。LT-IIa以高親和力結(jié)合GD1b，并以較低的親和力結(jié)合GM1、GT1b、GQ1b、GD2、GD1a和GM2。Fukutaetal.，(1988)InfectImmun.561748-1753。LT-II毒素由T.D.Connell博士友情提供。為研究最佳的鼻部藥劑量和最佳的觀察對(duì)肺炎球菌附著于ON/E的抑制的時(shí)間段，首先對(duì)在鼻部施用肺炎鏈球菌過程中給予的所選腸毒素進(jìn)行劑量響應(yīng)試驗(yàn)(1.0或10μg)。如果在4天時(shí)觀察到了對(duì)鼻建群的抑制，則觀察持續(xù)至11天，在這過程中每?jī)商旖o予一次腸毒素。測(cè)定CBA/N小鼠的ON/E和OB中的CFU。實(shí)施例4C-多糖特異性抗體在肺炎球菌病理學(xué)中的作用肺炎球菌C-多糖，也被稱為磷壁酸，在結(jié)構(gòu)上與亦被稱為脂磷壁酸質(zhì)的肺炎球菌F-抗原相同。Fischeretal.(1993)Eur.J.Biochem215851-857。這是肺炎鏈球菌區(qū)別于其它革蘭氏陽性菌的獨(dú)特特征。這些分子上的免疫顯性決定子是磷酸膽堿(PC)殘基，PC的抗體對(duì)于腹腔內(nèi)或鼻部的肺炎球菌的攻擊有保護(hù)作用。Brilesetal.，(1984)Eur.J.Immunol.141027-1030；Brilesetal.，(1981)Nature29488-90；Yotheretal.，(1982)Infect.Immun.36184-188；Brilesetal.，(1984)J.Mol.Cell.Immunol.1305-309。因此，研究了由被動(dòng)轉(zhuǎn)移或主動(dòng)鼻部免疫而得到的PC特異性抗體的作用。對(duì)于保護(hù)性PC特異性抗體的被動(dòng)轉(zhuǎn)移，即使用了IgG3(59.6C5)和同種型IgM(22.1A4)的T15個(gè)體基因型單克隆抗體。Brilesetal.，(1981)Nature29488-90。T15個(gè)體基因型對(duì)于肺炎球菌在小鼠中的感染顯示出比M603或M511個(gè)體基因型更強(qiáng)的保護(hù)作用(Brilesetal.，(1984)Eur.J.Immunol.141027-1030)，推測(cè)和它與C-多糖更高效的結(jié)合相關(guān)。被動(dòng)抗體轉(zhuǎn)移包括與鼻部施用肺炎球菌一起直接施用T15抗體(100μg)和對(duì)比于靜脈內(nèi)或腹腔內(nèi)給予抗體的鼻建群的減少。隨時(shí)間(4、11、18天)觀測(cè)建群，如果在這些實(shí)驗(yàn)中不同組之間沒有觀察到顯著差異，則每?jī)商毂遣渴┯脝慰寺】贵w(20μg)一次。CBA/N小鼠不產(chǎn)生T15個(gè)體基因型抗PC抗體。被動(dòng)轉(zhuǎn)移抗PC抗體預(yù)期不會(huì)誘導(dǎo)鼻道內(nèi)的粘膜IgA或其他同種型的PC特異性抗體。為誘導(dǎo)鼻內(nèi)抗體使用了兩種不同的手段。一種是直接在鼻部施用經(jīng)蛋白酶處理的R36A菌株，已知它可以誘導(dǎo)針對(duì)C-多糖的抗體反應(yīng)。雖然研究了抗PC抗體的保護(hù)性免疫，但沒有得到關(guān)于它在例如鼻道的粘膜表面的作用的結(jié)果。CBA/N小鼠的X染色體聯(lián)鎖的免疫缺陷導(dǎo)致其不能產(chǎn)生T15個(gè)體基因型的抗PC抗體。為研究不能產(chǎn)生該抗體的重要性，將CBA/N小鼠與其相應(yīng)的野生型CBA/J小鼠(JacksonLaboratories)相比較。為誘導(dǎo)抗PC抗體的R36A菌株的免疫包括表面蛋白的蛋白水解移除。Krause(1970)Adv.Immunol.121-56。另一備選的鼻部免疫手段為將PC與鑰孔蟲血藍(lán)蛋白(keyholelimpethemocyanin，KLH)相耦合，其方法已有敘述(Krause(1970)Adv.Immunol121-56；ChesebroandMetzger(1972)Biochemistry11766-771，其中教導(dǎo)的方法作為參考文獻(xiàn)在此納入本文)。將PC-KLH與粘膜佐劑CT一起進(jìn)行鼻部免疫以獲得最佳的粘膜免疫反應(yīng)。小鼠在末次免疫的2-3周后接受攻擊以避免CT對(duì)建群的影響。一周的時(shí)間間隔內(nèi)進(jìn)行三次鼻部免疫。使用C-多糖和PC特異性ELISA以本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的方法測(cè)定血清抗體的效價(jià)。在PC特異性ELISA中，PC與BSA按先前敘述的方法相配對(duì)(ChesebroandMetzger(1972)Biochemistry11766-771，其中教導(dǎo)的方法作為參考文獻(xiàn)在此納入本文)。測(cè)量了不僅是血清中，還有鼻洗出物、唾液、支氣管洗出物中的抗體效價(jià)。這些分析包括IgA、IgM、IgG和IgG亞類在粘膜分泌物和血清中的分布。誘導(dǎo)最佳粘膜抗體效價(jià)的實(shí)驗(yàn)步驟被用來進(jìn)行TIGR4菌株的粘膜攻擊研究，對(duì)小鼠鼻部給藥約5×106CFU然后在4天和11天監(jiān)測(cè)建群。在免疫研究中正常的、具有完全免疫能力的小鼠(CBA/J系)同CBA/N小鼠一起用于前述研究。Wallicketal.，(1983)J.Immunol.1302871-2875。實(shí)施例5神經(jīng)氨酸酶特異性抗體在肺炎鏈球菌病理學(xué)中的作用為在鼻攻擊前鼻部免疫小鼠，使用了市售的肺炎鏈球菌產(chǎn)生的神經(jīng)氨酸酶(Calbiochem)。然而，為獲得足量的用于計(jì)劃研究的蛋白質(zhì)，使用含有組氨酸標(biāo)記的表達(dá)載體(Invitrogen)在大腸桿菌中克隆和表達(dá)NanA基因。在CT存在或不存在的條件下使用經(jīng)3.4％甲醛處理過的神經(jīng)氨酸酶和未經(jīng)處理的神經(jīng)氨酸酶進(jìn)行鼻部免疫并進(jìn)行對(duì)比，以便獲得最佳的粘膜免疫反應(yīng)。在CBA/N和CBA/J小鼠中都進(jìn)行了上述免疫。進(jìn)行三次鼻部免疫，每?jī)纱沃g相隔一周，其間用ELISA監(jiān)測(cè)血清和唾液的抗體效價(jià)。免疫過的小鼠用TIGR4菌株攻擊并在4天和11天比較其ON/E、OB、腦、血液、脾臟和肺部的建群。為阻斷宿主的相互作用，還同時(shí)誘導(dǎo)了神經(jīng)氨酸酶和C-多糖特異性抗體。使用了神經(jīng)氨酸酶鼻部免疫和T15個(gè)體基因型單克隆抗體轉(zhuǎn)移的被動(dòng)免疫保護(hù)的組合療法。實(shí)施例6神經(jīng)氨酸酶-PC結(jié)合物對(duì)肺炎鏈球菌鼻部攻擊的保護(hù)效力以CT作為鼻部佐劑，使用神經(jīng)氨酸酶和PC-KLH免疫小鼠，在11天時(shí)評(píng)估其對(duì)比于每個(gè)抗原單獨(dú)免疫時(shí)的保護(hù)作用的增加和EF3030與TIGR4菌株鼻建群的減少。另外，用前述方法分析了鼻洗出物、唾液和血清中的抗體效價(jià)以找出免疫參數(shù)和在鼻道中針對(duì)肺炎球菌的保護(hù)程度的關(guān)聯(lián)。為產(chǎn)生最佳的免疫反應(yīng)，將磷酸膽堿直接與神經(jīng)氨酸酶相配對(duì)。在鼻部和全身性免疫后的CBA/N和CBA/J小鼠中，使用或不使用CT作為佐劑運(yùn)送該構(gòu)建體測(cè)試了其免疫原性。用ELISA測(cè)定了鼻洗出物、唾液和血漿中的抗體效價(jià)。使用107CFU的EF3030菌株或106CFU的TIGR4進(jìn)行了攻擊研究。小鼠在攻擊后11天被處死并分析其血液、鼻洗出物、ON/E、OB和腦中觀察到的CFU。神經(jīng)氨酸酶與PC的配對(duì)免疫通過提高粘膜和全身的針對(duì)這兩種致病組分的抗體的水平來增強(qiáng)保護(hù)作用。使用其他的粘膜佐劑會(huì)改變抗原特異性IgG的亞類分布。CT產(chǎn)生Th2-、LT、混合的Th2/Th1-和例如DNA寡核苷酸(ODN)1826的CpG基序Th1-型反應(yīng)并有相關(guān)的IgG亞類分布的改變。不同的佐劑進(jìn)一步提高神經(jīng)氨酸酶-C-多糖特異性免疫針對(duì)肺炎鏈球菌的鼻建群的保護(hù)能力，并可能產(chǎn)生新的肺炎球菌疫苗的配方。實(shí)施例7抗磷酸膽堿特異性單克隆抗體對(duì)鼻部攻擊后肺炎鏈球菌鼻建群的抑制將總共1×106CFU的TIGR4菌株與5μg抗磷酸膽堿單克隆抗體的IgG3亞類或IgM同種型共培養(yǎng)。每鼻孔共給藥5μl。示出的是施用后分別在9和12小時(shí)的500ml鼻洗出物中的CFU。對(duì)兩種單克隆抗體都觀察到了顯著的80％以上的下降。示出的是每組五只小鼠的平均值+SD。數(shù)據(jù)示于圖10。實(shí)施例8肺炎鏈球菌鼻部施用后的神經(jīng)損傷和炎癥分離了在鼻部施用肺炎鏈球菌EF3030菌株后1、3、7和14天的小鼠的ON/E、OB和腦，并用組織學(xué)方法分析了炎癥反應(yīng)。比較了D39或TIGR4菌株與其nanA突變體菌株產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的能力。在處死小鼠時(shí)，在25℃用PBS灌注小鼠，然后再用10mlZamboni固定劑(4％多聚甲醛、15％苦味酸溶于0.1M磷酸緩沖液)灌注。取出OB和ON/E并置于新制的4％多聚甲醛(PFA)中于4℃過夜。將組織轉(zhuǎn)移至30％蔗糖溶液中置于4℃48小時(shí)，以使其在切片之前受到冷凍保護(hù)。將組織在OCT中冷凍，并將切片(6μm)置于預(yù)先包被好的顯微載玻片上(10％BSA的鹽溶液)。首先，使用蘇木精和伊紅(H&E)染色來檢出在這一過程中OB、三叉神經(jīng)節(jié)和ON/E中任何滲入的炎性細(xì)胞。對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)因子β1(NGF-β1)染色來評(píng)估神經(jīng)損傷。在神經(jīng)損傷后會(huì)產(chǎn)生NGF-β1，其功能是阻止細(xì)胞凋亡和刺激神經(jīng)細(xì)胞的新生長(zhǎng)。三叉神經(jīng)節(jié)和OB切片用0.2μg/ml濃度的生物素化兔抗人NGF-β1抗體染色。抗體染色的切片在4℃培養(yǎng)過夜。用PBS洗滌載玻片并用親和素-生物素-復(fù)合物(ABC)Vectastain試劑盒(VectorLaboratories，Burlingame，CA)在25℃反應(yīng)30分鐘。再用PBS洗滌組織三次，如前所述與二氨基聯(lián)苯(DAB)反應(yīng)5-10分鐘。再洗滌載玻片三次，并用C.S.蘇木精復(fù)染色30秒。在用H2O洗滌后，將載玻片用100％乙醇和二甲苯脫水。NGF-β1的增多表示了神經(jīng)組織損傷的程度。涉及神經(jīng)的另一個(gè)標(biāo)志是小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。激活的小膠質(zhì)細(xì)胞顯示為變形蟲樣、球形，而休眠的細(xì)胞(處于G0/G1期)顯示為樹枝狀分枝形。這種活化引起的改變使人能夠分辨休眠的和活化的小膠質(zhì)細(xì)胞。對(duì)于小膠質(zhì)細(xì)胞，使用F4/80抗體或抗MAC-1(MI/70)抗體來確定肺炎鏈球菌攻擊后的活化狀態(tài)。除神經(jīng)損傷和小膠質(zhì)細(xì)胞活化之外，還評(píng)估了OB中細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。為此，分析了Asp-Glu-Val-Asp特異性蛋白酶——活性半胱天冬酶3的誘導(dǎo)，因?yàn)樵撁冈诩?xì)胞凋亡途徑的啟動(dòng)中很重要。在免疫組織化學(xué)分析中可使用特異性針對(duì)活性半胱天冬酶3的抗體(CellSignalingTechnology，Inc.，Beverly，MA)來檢測(cè)細(xì)胞凋亡。如果用免疫組織化學(xué)方法檢出了神經(jīng)組織中的半胱天冬酶3的活性，則使用半胱天冬酶3分析試劑盒(Molecularprobes，Eugene，OR)基于底物蛋白水解后誘導(dǎo)的熒光信號(hào)來定量分析其活性。實(shí)施例9肺炎鏈球菌通過逆向軸突運(yùn)輸靶向嗅球的能力首先，評(píng)估了鼻部和靜脈內(nèi)接種的小鼠的神經(jīng)組織、OB和腦中肺炎球菌的積累。靜脈內(nèi)接種后，神經(jīng)組織中的任何肺炎球菌都是通過血液進(jìn)入的。收集了鼻部攻擊后1、4、11和18天的組織。在這種情況下腦和OB的每克組織中的細(xì)菌數(shù)量應(yīng)該在注入后所有的時(shí)間點(diǎn)都相近。但是與之相反，鼻內(nèi)接種后通過鼻道進(jìn)入的細(xì)菌在OB中的累積(以每份組織重量表示)先于并保持領(lǐng)先于腦中觀察到的累積。其次，進(jìn)行了鼻部攻擊后肺炎球菌的體內(nèi)成像。用锝-99(Tc-99m)標(biāo)記的TIGR4的穩(wěn)定的不透明和透明變種、EF3030和缺少nanA和/或nanB的TIGR4突變體，按照最初由Waibeletal.(1999)NatureBiotechnol.17897-901描述的腺病毒的方案，用前述的伽瑪照相機(jī)成像使這些菌株在小鼠中的存在顯像。通過這種手段，由于這種同位素的半衰期很短(6小時(shí))，可以獲得鼻部施用后大約前24小時(shí)的圖像，還可以分析在鼻道內(nèi)發(fā)生的早期事件。為獲得肺炎球菌的長(zhǎng)期成像，使用了表達(dá)熒光素酶或GFP的肺炎球菌EF3030(或TIGR4)菌株來使生物發(fā)光在體內(nèi)顯像。使用了Xenogen公司(Alameda，California)市售的表達(dá)熒光素酶的肺炎球菌EF3030菌株。以前就報(bào)道過這種肺炎球菌菌株的成功的體內(nèi)成像。使用生物發(fā)光成像系統(tǒng)(IVISsystem，Xenogen，Inc.)對(duì)小鼠成像來檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)?？偸窃诟骨粌?nèi)注射2.5mg熒光素后10分鐘，采集定位于相同位置的小鼠的圖像。在成像過程中，小鼠保持在37℃并被安氟醚麻醉。從小鼠在被表達(dá)熒光素酶的肺炎球菌鼻部攻擊后2天開始至18天，每只小鼠進(jìn)行數(shù)次成像。成像的圖像采集時(shí)間為20秒至10分鐘之間。數(shù)據(jù)采集軟件確保在圖像采集過程中沒有像素點(diǎn)是飽和的。用Xenogen提供的軟件定量分析感興趣的區(qū)域的光發(fā)射(相對(duì)光子/秒)。光發(fā)射的強(qiáng)度由生物發(fā)光圖像的假色比例(pseudocolorscaling)代表。生物發(fā)光圖像通常層疊于同時(shí)采集的小鼠的黑白照片上。所述的體內(nèi)成像研究著重于分析肺炎球菌從鼻道進(jìn)入OB的能力。該生物發(fā)光研究還擴(kuò)展到轉(zhuǎn)熒光素酶基因成功的nanATIGR4突變體中。貫穿于本申請(qǐng)引用了多種出版物。這些出版物的公開全文作為參考文獻(xiàn)納入本申請(qǐng)中，以便完整的描述本發(fā)明所述的化合物、組合物和方法。可對(duì)本發(fā)明所述的化合物、組合物和方法進(jìn)行各種修改和變動(dòng)。通過考慮本發(fā)明在此所公開的化合物、組合物和方法的說明書和實(shí)施，本發(fā)明所述的化合物、組合物和方法的其他方面是顯而易見的。本說明書和實(shí)施例的意圖應(yīng)僅看作示例性用途。參考文獻(xiàn)Amsbaugh，D.F.，Hansen，C.T.，Prescott，B.，Stashak，P.W.，Barthold，D.R.，andBaker，P.J.(1972)GeneticcontroloftheantibodyresponsetotypeIIIpneumococcalpolysaccharideinmice.I.EvidencethatanX-linkedgeneplaysadecisiveroleindeterminingresponsiveness.J.Exp.Med.136931-949.Anon.2000.Surveillanceofpreliminaryreportsfrom18countriesandtheUSA.CDSCEuropeanBacterialMeningitisSurveillanceProject.PHLS，London.Avery，O.T.，C.M.MacLeod，andM.McCarty.1979.Studiesonthechemicalnatureofthesubstanceinducingtransformationofpneumococcaltypes.InductionoftransformationbyadesoxyribonucleicacidfractionisolatedfrompneumococcustypeIII.J.Exp.Med149297-326.Balachandran，P.，Brooks-Walters，A.，Virolainen-Julkunen，A.，Hollingshead，andBriles，D.E.2002.RoleofpneumococcalsurfaceproteinCinnasopharyngealcarriageandpneumoniaanditsabilitytoelicitprotectionagainstcarriageofStreptococcuspneumoniae.Infect.Immun.702526-2534.Bennett，S.A.L.，Chen，J.，Pappas，B.A.，Roberts，D.C.S.andTenniswood，M.1998.Alterationsinplateletactivatingfactorreceptorexpressionassociatedwithneuronalapoptosisinaninvivomodelofexcitotoxicity.CellDeathDiffer.5867-875.Berning，A.K.，Eicher，E.M.，Paul，W.E.，andScher，I.(1980)J.Immunol.1241875-1877.Berry，A.M.，andJ.Paton，C.2000.AdditiveattenuationofvirulenceofStreptococcuspneumoniaebymutationofthegenesencodingpneumolysinandotherputativepneumococcalvirulenceproteins.Infect.Immun.68133-140.Berry，A.M.，Lock，R.A.，andPaton，J.C.1996.C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eGlyGlnGlnGlySerAsnProSerIle805810815GlyLysTrpAsnAsnSerAspAsnProAsnProValAsnAsnGlnAsp820825830LeuValValCysSerArgAsnGlyArgTyrArgThrGlyAsnTyrTrp835840845TyrSerAsnArgLysHisArgLysTyrAlaAsnSerSerCysLysSer850855860SerArgCysGlnSerSerTrpArgSerLysTrpAsnGlnSerSerGly865870875880AlaAsnSerSerArgIleTyrArgGlySerAsnTrpTyrArgAlaSer885890895CysSerAsnAsnArgArgValAsnGlyIleAsnPheAlaCysAsnSer900905910TyrTyrLysLysArgLeuTyrLeuGlnSerSerSerCysSerAlaGly915920925ThrSerAsnAsnArgLysGlnGlyGluAsnProProSerPheThrArg930935940ThrAsnSerAsnLeuProTrpSerValTyrAlaArgGluLysGluArg945950955960ThrIle<210>17<211>382<212>PRT<213>鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimirium)<400>17MetThrValGluLysSerValValPheLysAlaGluGlyGluHisPhe151015ThrAspGlnLysGlyAsnThrIleValGlySerGlySerGlyGlyThr202530ThrLysTyrPheArgIleProAlaMetCysThrThrSerLysGlyThr354045IleValValPheAlaAspAlaArgHisAsnThrAlaSerAspGlnSer505560PheIleAspThrAlaAlaAlaArgSerThrAspGlyGlyLysThrTrp65707580AsnLysLysIleAlaIleTyrAsnAspArgValAsnSerLysLeuSer859095ArgValMetAspProThrCysIleValAlaAsnIleGlnGlyArgGlu100105110ThrIleLeuValMetValGlyLysTrpAsnAsnAsnAspLysThrTrp115120125GlyAlaTyrArgAspLysAlaProAspThrAspTrpAspLeuValLeu130135140TyrLysSerThrAspAspGlyValThrPheSerLysValGluThrAsn145150155160IleHisAspIleValThrLysAsnGlyThrIleSerAlaMetLeuGly165170175GlyValGlySerGlyLeuGlnLeuAsnAspGlyLysLeuValPhePro180185190ValGlnMetValArgThrLysAsnIleThrThrValLeuAsnThrSer195200205PheIleTyrSerThrAspGlyIleThrTrpSerLeuProSerGlyTyr210215220CysGluGlyPheGlySerGluAsnAsnIleIleGluPheAsnAlaSer225230235240LeuValAsnAsnIleArgAsnSerGlyLeuArgArgSerPheGluThr245250255LysAspPheGlyLysThrTrpThrGluPheProProMetAspLysLys260265270ValAspAsnArgAsnHisGlyValGlnGlySerThrIleThrIlePro275280285SerGlyAsnLysLeuValAlaAlaHisSerSerAlaGlnAsnLysAsn290295300AsnAspTyrThrArgSerAspIleSerLeuTyrAlaHisAsnLeuTyr305310315320SerGlyGluValLysLeuIleAspAspPheTyrProLysValGlyAsn325330335AlaSerGlyAlaGlyTyrSerCysLeuSerTyrArgLysAsnValAsp340345350LysGluThrLeuTyrValValTyrGluAlaAsnGlySerIleGluPhe355360365GlnAspLeuSerArgHisLeuProValIleLysSerTyrAsn370375380權(quán)利要求1.一種去毒的肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶或其抗原性部分。2.一種去毒的肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶或其抗原性部分，其中該神經(jīng)氨酸酶具有非去毒神經(jīng)氨酸酶的大約60％的活性。3.一種去毒的肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶或其抗原性部分，其中該神經(jīng)氨酸酶具有非去毒神經(jīng)氨酸酶的大約70％的活性。4.一種去毒的肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶或其抗原性部分，其中該神經(jīng)氨酸酶具有非去毒神經(jīng)氨酸酶的大約80％的活性。5.一種去毒的肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶或其抗原性部分，其中該神經(jīng)氨酸酶具有非去毒神經(jīng)氨酸酶的大約90％的活性。6.一種去毒的肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶或其抗原性部分，其中該神經(jīng)氨酸酶包括至少7％的非去毒神經(jīng)氨酸酶的天然存在氨基酸的缺失。7.一種去毒的肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶或其抗原性部分，其中該神經(jīng)氨酸酶包括至少7％的非去毒神經(jīng)氨酸酶的天然存在氨基酸的缺失，并且呈現(xiàn)出非去毒神經(jīng)氨酸酶的大約60％的活性。8.一種去毒的肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶或其抗原性部分，其中該神經(jīng)氨酸酶包括至少7％的非去毒神經(jīng)氨酸酶的天然存在氨基酸的缺失，并且呈現(xiàn)出非去毒神經(jīng)氨酸酶的大約70％的活性。9.一種去毒的肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶或其抗原性部分，其中該神經(jīng)氨酸酶包括至少7％的非去毒神經(jīng)氨酸酶的天然存在氨基酸的缺失，并且呈現(xiàn)出非去毒神經(jīng)氨酸酶的大約80％的活性。10.一種去毒的肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶或其抗原性部分，其中該神經(jīng)氨酸酶包括至少7％的非去毒神經(jīng)氨酸酶的天然存在氨基酸的缺失，并且呈現(xiàn)出非去毒神經(jīng)氨酸酶的大約90％的活性。11.一種去毒的肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶或其抗原性部分，其中該神經(jīng)氨酸酶包括至少5個(gè)非去毒神經(jīng)氨酸酶的N端氨基酸的缺失。12.一種去毒的肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶或其抗原性部分，其中該神經(jīng)氨酸酶包括至少10個(gè)非去毒神經(jīng)氨酸酶的N端氨基酸的缺失。13.一種去毒的肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶或其抗原性部分，其中該神經(jīng)氨酸酶包括至少15個(gè)非去毒神經(jīng)氨酸酶的N端氨基酸的缺失。14.一種去毒的肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶或其抗原性部分，其中該神經(jīng)氨酸酶包括至少10％的非去毒神經(jīng)氨酸酶的C端氨基酸的缺失。15.一種去毒的肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶或其抗原性部分，其中該神經(jīng)氨酸酶包括至少20％的非去毒神經(jīng)氨酸酶的C端氨基酸的缺失。16.一種去毒的肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶或其抗原性部分，其中該神經(jīng)氨酸酶包括至少30％的非去毒神經(jīng)氨酸酶的C端氨基酸的缺失。17.一種去毒的肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶或其抗原性部分，其中該神經(jīng)氨酸酶包括至少35％的非去毒神經(jīng)氨酸酶的C端氨基酸的缺失。18.一種組合物，包括去毒的肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶或其抗原性部分和可藥用的載體。19.權(quán)利要求18的組合物，還包括佐劑。20.一種在受試者體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶的特異性抗體的方法，包括將去毒的肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶或其抗原性部分給藥至受試者。21.一種減少受試者體內(nèi)肺炎球菌鼻攜帶的方法，包括將去毒的肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶或其抗原性部分給藥至受試者。22.一種防止受試者體內(nèi)肺炎球菌感染的方法，包括將去毒的肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶或其抗原性部分給藥至受試者。23.權(quán)利要求22的方法，其中該肺炎球菌感染為腦膜炎。24.權(quán)利要求22的方法，其中該肺炎球菌感染為中耳炎。25.權(quán)利要求22的方法，其中該肺炎球菌感染為肺炎。26.權(quán)利要求22的方法，其中該肺炎球菌感染為溶血性尿毒癥。27.一種減少或防止受試者體內(nèi)肺炎球菌鼻攜帶的方法，包括在減少或防止鼻攜帶的條件下將去毒的肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶或其抗原性片段給藥至受試者。28.一種減少或防止受試者體內(nèi)肺炎球菌感染的方法，包括在減少或防止所述感染的條件下將肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶或其抗原性片段給藥至受試者。29.權(quán)利要求28的方法，其中該肺炎球菌感染為腦膜炎。30.權(quán)利要求28的方法，其中該肺炎球菌感染為中耳炎。31.權(quán)利要求28的方法，其中該肺炎球菌感染為肺炎。32.權(quán)利要求28的方法，其中該肺炎球菌感染為溶血性尿毒癥。33.一種減少或防止受試者體內(nèi)肺炎球菌感染的方法，包括在減少或防止所述感染的條件下將肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶抗體或其片段給藥至受試者，其中該給藥步驟包括使受試者的粘膜表面與所述抗體相接觸。34.權(quán)利要求33的方法，其中該肺炎球菌感染為腦膜炎。35.權(quán)利要求33的方法，其中該肺炎球菌感染為中耳炎。36.權(quán)利要求33的方法，其中該肺炎球菌感染為肺炎。37.權(quán)利要求33的方法，其中該肺炎球菌感染為溶血性尿毒癥。38.一種組合物，包括肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶或其抗原性部分和可藥用的載體，其中該組合物適用于給藥至粘膜表面。39.權(quán)利要求38的組合物，其中該組合物為鼻腔噴劑。40.權(quán)利要求38的組合物，其中該組合物為噴霧溶液。41.權(quán)利要求38的組合物，其中該組合物為氣霧吸入劑。42.一種容器，包括權(quán)利要求38的組合物。43.權(quán)利要求42的容器，其中該容器為鼻腔噴霧器。44.權(quán)利要求42的容器，其中該容器為霧化器。45.權(quán)利要求42的容器，其中該容器為吸入器。46.一種在受試者體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶的特異性抗體的方法，包括使受試者的鼻粘膜與去毒的肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶或其抗原性部分相接觸。47.一種減少受試者體內(nèi)肺炎球菌鼻攜帶的方法，包括使受試者的鼻粘膜與去毒的肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶或其抗原性部分相接觸。48.一種防止受試者體內(nèi)肺炎球菌感染的方法，包括使受試者的粘膜表面與去毒的肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶或其抗原性部分相接觸。49.權(quán)利要求48的方法，其中該肺炎球菌感染為腦膜炎。50.權(quán)利要求48的方法，其中該肺炎球菌感染為中耳炎。51.權(quán)利要求48的方法，其中該肺炎球菌感染為肺炎。52.權(quán)利要求48的方法，其中該肺炎球菌感染為溶血性尿毒癥。53.一種組合物，包括肺炎球菌磷壁酸或肺炎球菌脂磷壁酸質(zhì)的磷酸膽堿或其抗原性部分和可藥用載體，其中該組合物適用于給藥至粘膜表面。54.權(quán)利要求53的組合物，其中該組合物為鼻腔噴劑。55.權(quán)利要求53的組合物，其中該組合物為噴霧溶液。56.權(quán)利要求53的組合物，其中該組合物為氣霧吸入劑。57.一種容器，包括權(quán)利要求53的組合物。58.權(quán)利要求57的容器，其中該容器為鼻腔噴霧器。59.權(quán)利要求57的容器，其中該容器為霧化器。60.權(quán)利要求57的容器，其中該容器為吸入器。61.一種在受試者體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶的特異性抗體的方法，包括使受試者的鼻粘膜與權(quán)利要求53的組合物相接觸。62.一種減少受試者體內(nèi)肺炎球菌鼻攜帶的方法，包括使受試者的鼻粘膜與權(quán)利要求53的組合物相接觸。63.一種減少或防止受試者體內(nèi)肺炎球菌感染的方法，包括使受試者的粘膜表面與權(quán)利要求53的組合物相接觸。64.權(quán)利要求63的方法，其中該肺炎球菌感染為腦膜炎。65.權(quán)利要求63的方法，其中該肺炎球菌感染為中耳炎。66.權(quán)利要求63的方法，其中該肺炎球菌感染為肺炎。67.權(quán)利要求63的方法，其中該肺炎球菌感染為溶血性尿毒癥。68.一種組合物，包括肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶或其抗原性部分、肺炎球菌磷壁酸或肺炎球菌脂磷壁酸質(zhì)的磷酸膽堿或其抗原性部分和可藥用載體，其中該組合物適用于給藥至粘膜表面。69.權(quán)利要求68的組合物，其中該組合物為鼻腔噴劑。70.權(quán)利要求68的組合物，其中該組合物為噴霧溶液。71.權(quán)利要求68的組合物，其中該組合物為氣霧吸入劑。72.一種容器，包括權(quán)利要求68的組合物。73.權(quán)利要求72的容器，其中該容器為鼻腔噴霧器。74.權(quán)利要求72的容器，其中該容器為霧化器。75.權(quán)利要求72的容器，其中該容器為吸入器。76.一種在受試者體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶的特異性抗體的方法，包括使受試者的鼻粘膜與權(quán)利要求68的組合物相接觸。77.一種減少受試者體內(nèi)肺炎球菌鼻攜帶的方法，包括使受試者的鼻粘膜與權(quán)利要求68的組合物相接觸。78.一種防止受試者體內(nèi)肺炎球菌感染的方法，包括使受試者的粘膜表面與權(quán)利要求68的組合物相接觸。79.權(quán)利要求78的方法，其中該肺炎球菌感染為腦膜炎。80.權(quán)利要求78的方法，其中該肺炎球菌感染為中耳炎。81.權(quán)利要求78的方法，其中該肺炎球菌感染為肺炎。82.權(quán)利要求78的方法，其中該肺炎球菌感染為溶血性尿毒癥。83.一種組合物，包括肺炎球菌磷壁酸或肺炎球菌脂磷壁酸質(zhì)的非磷酸膽堿抗原性部分和可藥用載體，其中該組合物適用于給藥至粘膜表面。84.權(quán)利要求83的組合物，其中該組合物為鼻腔噴劑。85.權(quán)利要求83的組合物，其中該組合物為噴霧溶液。86.權(quán)利要求83的組合物，其中該組合物為氣霧吸入劑。87.一種容器，包括權(quán)利要求83的組合物。88.權(quán)利要求87的容器，其中該容器為鼻腔噴霧器。89.權(quán)利要求87的容器，其中該容器為霧化器。90.權(quán)利要求87的容器，其中該容器為吸入器。91.一種在受試者體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶的特異性抗體的方法，包括使受試者的鼻粘膜與權(quán)利要求83的組合物相接觸。92.一種減少受試者體內(nèi)肺炎球菌鼻攜帶的方法，包括使受試者的鼻粘膜與權(quán)利要求83的組合物相接觸。93.一種防止受試者體內(nèi)肺炎球菌感染的方法，包括使受試者的粘膜表面與權(quán)利要求83的組合物相接觸。94.權(quán)利要求93的方法，其中該肺炎球菌感染為腦膜炎。95.權(quán)利要求93的方法，其中該肺炎球菌感染為中耳炎。96.權(quán)利要求93的方法，其中該肺炎球菌感染為肺炎。97.權(quán)利要求93的方法，其中該肺炎球菌感染為溶血性尿毒癥。98.一種組合物，包括肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶或其抗原性部分、肺炎球菌磷壁酸或肺炎球菌脂磷壁酸質(zhì)的非磷酸膽堿抗原性部分和可藥用載體，其中該組合物適用于給藥至粘膜表面。99.權(quán)利要求98的組合物，其中該組合物為鼻腔噴劑。100.權(quán)利要求98的組合物，其中該組合物為噴霧溶液。101.權(quán)利要求98的組合物，其中該組合物為氣霧吸入劑。102.一種容器，包括權(quán)利要求98的組合物。103.權(quán)利要求102的容器，其中該容器為鼻腔噴霧器。104.權(quán)利要求102的容器，其中該容器為霧化器。105.權(quán)利要求102的容器，其中該容器為吸入器。106.一種在受試者體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶的特異性抗體的方法，包括使受試者的鼻粘膜與權(quán)利要求98的組合物相接觸。107.一種減少受試者體內(nèi)肺炎球菌鼻攜帶的方法，包括使受試者的鼻粘膜與權(quán)利要求98的組合物相接觸。108.一種防止受試者體內(nèi)肺炎球菌感染的方法，包括使受試者的粘膜表面與權(quán)利要求98的組合物相接觸。109.權(quán)利要求108的方法，其中該肺炎球菌感染為腦膜炎。110.權(quán)利要求108的方法，其中該肺炎球菌感染為中耳炎。111.權(quán)利要求108的方法，其中該肺炎球菌感染為肺炎。112.權(quán)利要求108的方法，其中該肺炎球菌感染為溶血性尿毒癥。113.一種組合物，包括磷酸膽堿抗體或其片段和可藥用載體。114.權(quán)利要求113的組合物，其中該組合物適用于給藥至粘膜表面。115.權(quán)利要求113的組合物，其中該組合物為鼻腔噴劑。116.權(quán)利要求113的組合物，其中該組合物為噴霧溶液。117.權(quán)利要求113的組合物，其中該組合物為氣霧吸入劑。118.一種容器，包括權(quán)利要求113的組合物。119.權(quán)利要求118的容器，其中該容器為鼻腔噴霧器。120.權(quán)利要求118的容器，其中該容器為霧化器。121.權(quán)利要求118的容器，其中該容器為吸入器。122.一種減少受試者體內(nèi)肺炎球菌鼻攜帶的方法，包括將磷酸膽堿抗體或其片段給藥至受試者。123.權(quán)利要求122的方法，其中該給藥包括使受試者的鼻粘膜與該抗體或其片段相接觸。124.一種防止受試者體內(nèi)肺炎球菌感染的方法，包括將磷酸膽堿抗體或其片段給藥至受試者。125.權(quán)利要求124的方法，其中該給藥包括使受試者的鼻粘膜與該抗體或其片段相接觸。全文摘要本發(fā)明提供一種用于減少或防止細(xì)菌感染(如肺炎球菌感染)、鼻攜帶、鼻建群和中樞神經(jīng)系統(tǒng)侵害的組合物。提供的組合物包括肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶、磷酸膽堿、肺炎球菌磷壁酸、肺炎球菌脂磷壁酸質(zhì)或者神經(jīng)氨酸酶、磷酸膽堿、肺炎球菌磷壁酸、肺炎球菌脂磷壁酸質(zhì)的抗原性部分。任選地，該組合物可包括肺炎球菌神經(jīng)氨酸酶、磷酸膽堿、肺炎球菌磷壁酸、肺炎球菌脂磷壁酸質(zhì)或其中任意一個(gè)的抗原性部分的任意組合。任選地，該試劑是去毒性的。還提供制備和使用在此公開的組合物的方法。具體提供在受試者中產(chǎn)生抗體的方法，包括給予受試者在此教導(dǎo)的試劑或組合物。還提供了減少或防止受試者中鼻攜帶或肺炎球菌感染的方法，包括給予受試者在此教導(dǎo)的組合物。文檔編號(hào)A61P11/02GK1909921SQ200480040200公開日2007年2月7日申請(qǐng)日期2004年11月10日優(yōu)先權(quán)日2003年11月10日發(fā)明者F·W·范金克爾,D·E·布里利斯,J·M·瓦特申請(qǐng)人:Uab研究基金會(huì)