專利名稱：用于診斷和治療異常細(xì)胞增殖的鈷胺素衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在多細(xì)胞生物體內(nèi)成像并快速摧毀不良增殖的細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
異常的細(xì)胞增殖，尤其是過度增殖，是許多疾病的起源，最嚴(yán)重的是癌癥。僅在美國就有約150萬人被診斷為癌癥且每年有50萬人因此死亡。對癌癥的抵抗已有些許成功，但還有許多障礙?？拱┧幍膰?yán)重副作用和耐藥子代癌細(xì)胞的發(fā)育是主要的問題，同樣是腫瘤及轉(zhuǎn)移的最早且精確的定位。
過度增殖的細(xì)胞，例如許多癌細(xì)胞，依賴于營養(yǎng)物供應(yīng)的增加、生長因子、能量和維生素。使用維生素供給途徑，其是細(xì)胞生長所必須的并時常供應(yīng)短缺，就可能使藥物被運(yùn)送到這些不必要的細(xì)胞中。
鈷胺素(Cbl)，也就是已知的維生素B12并作為氰基-鈷胺素(CN-Cbl)、羥基-鈷胺素(HO-Cbl)或水合-鈷胺素(H2O-Cbl)存在，是生命所必須的，并且其在體內(nèi)的濃度非常低。高等生物體包括人在內(nèi)不得不從其食物中獲取維生素。鈷胺素的生物合成限于一些原核生物內(nèi)，例如厭氧菌。鈷胺素對于神經(jīng)系統(tǒng)的固有功能很重要并且是碳水化合物正確代謝所必需的。對于甲基-鈷胺素(Me-Cbl)，其作用是作為蛋氨酸合酶的輔助因子。對于5′-脫氧腺苷基-鈷胺素(Ado-Cbl)，其在甲基丙二酰輔酶A重排成琥珀酰-CoA中與甲基丙二酰輔酶A變位酶作用。鈷胺素缺乏能導(dǎo)致惡性貧血。鈷胺素還涉及核苷酸還原轉(zhuǎn)化為脫氧核苷酸以生成DNA。
在哺乳動物中，多數(shù)鈷胺素的細(xì)胞攝取都通過血清轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和細(xì)胞膜受體的調(diào)節(jié)。血漿中有兩類鈷胺素結(jié)合蛋白非糖基化蛋白鈷胺傳遞蛋白II(TCII)和糖基化蛋白鈷胺傳遞蛋白I和III(TCI和TCIII)，也稱為R-結(jié)合蛋白或結(jié)合咕啉(haptocorrin)。TCI和TCIII是免疫可交叉反應(yīng)的并僅在其碳水化合物組成中有區(qū)別。TCI是循環(huán)中發(fā)現(xiàn)主要的R-結(jié)合劑。出于簡單性的原因，當(dāng)指R-結(jié)合蛋白TCI和TCIII時，將使用術(shù)語TCI。兩種類型的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(載體)TCI和TCII在哺乳動物的血液中循環(huán)，其被鈷胺素部分飽和(全)或部分不飽和的(apo)。較少載體的鈷胺素攝取系統(tǒng)，其在正常細(xì)胞中的效率相當(dāng)?shù)?，也存在于哺乳動物?xì)胞中(參見Sennet，C.和Rosenberg，L.E.，Ann.Rev.Biochem.50，1053-86(1981))。
TCII在通過介導(dǎo)內(nèi)吞作用的受體而將血漿鈷胺素輸送到所有的代謝活性細(xì)胞中發(fā)揮了作用。已知瘤形成初期中的細(xì)胞加速增殖必然增加通過介導(dǎo)內(nèi)吞作用攝取的受體而從循環(huán)中載入TCII的鈷胺素的消耗。上調(diào)TCII受體的數(shù)量已經(jīng)在惡性細(xì)胞系中被廣泛地證明能適合增加胸苷的代謝需求和甲硫氨酸生成、DNA合成的甲基化反應(yīng)以及通過線粒體代謝的細(xì)胞能量學(xué)。
一般的TCII受體存在于所有的組織中，而第二個和更多的器官特異性TCII受體，稱為megalin，在腎近曲小管和一些其它的吸收性上皮中大量表達(dá)。內(nèi)吞作用的細(xì)胞內(nèi)攝作用完成后，TCII就在溶酶體中降解，游離的鈷胺素轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中和核膜內(nèi)部，在其中轉(zhuǎn)化為Me-Cbl和Ado-Cbl。這兩個形式能用作維生素B12的活性輔酶。TCII的基本作用能通過以下觀察而被很好地確定TCII的遺傳先天缺乏能導(dǎo)致巨紅細(xì)胞性貧血、有害的神經(jīng)障礙和死亡，如果不用過量鈷胺素處理的話。
幾乎所有的細(xì)胞都能生成TCII。許多細(xì)胞例如肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、腸細(xì)胞和巨噬細(xì)胞能合成增加量的TCII。假設(shè)血管內(nèi)皮是TCII的原始來源。有約20-30％的循環(huán)鈷胺素結(jié)合到TCII上作為全-TCII。這是保證所有組織中谷氨酸細(xì)胞內(nèi)攝作用的代謝有效形式(參見Rothenberg，E.etal.，inChemistry and Biochemistry ofB12，ed.R.Banerjee，New York，NY，1999，第441-473頁)。
TCI存在與血和血漿以及大部分外分泌的分泌物和其它液體中。它主要在前腸組織、胃粘膜、唾液和淚腺以及內(nèi)耳的分泌上皮中產(chǎn)生。TCI，不同于TCII，似乎不能輸送其主要由細(xì)胞攝取的鈷胺素，其在血中具有較長的半衰期并由此在任何給定的時刻都保持大于75％的循環(huán)鈷胺素(和咕啉)。幾乎所有的TCI都以全-TCI而循環(huán)。其作還不完全清楚。已有建議認(rèn)為其功能是通過防止供給微生物所有類別的鈷胺素和咕啉而作為抑菌劑。它還可以穩(wěn)定腺苷-鈷胺素并對保護(hù)其不被光解。與TCI相反，其中TCI在循環(huán)中的濃度比TCII高，TCII的水平能通過響應(yīng)引入的谷氨酸重新合成apo-TCII而被快速提高。TCI的生成相當(dāng)緩慢并不能響應(yīng)于任何的觸發(fā)影響而被實(shí)質(zhì)刺激(參見Alpers，D.和Russell，G.，在Chemistry and Biochemistry of B12，supra，第411-441頁)。
直到目前，哺乳細(xì)胞中的較少載體鈷胺素攝取系統(tǒng)已經(jīng)不被認(rèn)為是向過度增殖的細(xì)胞提供鈷胺素衍生物的另一個途徑。無可置辯的是，通過良性哺乳細(xì)胞攝取鈷胺素的重要生理學(xué)機(jī)制需要載體TCII和TCI(和消化道的內(nèi)因子)。然而，體內(nèi)和體外數(shù)據(jù)顯示，游離的鈷胺素還能穿過質(zhì)膜而不累及載體蛋白。吸收游離鈷胺素的其它能力的直接證據(jù)來自對于先天并完全缺乏TCII的兒童的研究，在這種兒童中胃腸外給予游離的鈷胺素能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈷胺素缺乏的臨床和化學(xué)體征的顯著減輕(參見Hall，C.E.etal.，Blood，53，251-263(1979))。體外研究顯示，在海拉細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中攝取游離的鈷胺素。在海拉細(xì)胞中，游離鈷胺素的攝取為1％到2％，參見(seen for)TCII-結(jié)合的鈷胺素。在人成纖維細(xì)胞中，在兩小時間隔內(nèi)積聚了約20％的游離鈷胺素，以TCII-結(jié)合的維生素形式被注意到。人成纖維細(xì)胞中的游離維生素攝取系統(tǒng)已經(jīng)由Berliner和Rosenberg作了一些詳細(xì)研究(Berliner，N.and Rosenberg，L.E.，Metabolism，30，230-236(1981))。游離CN-[57Co]-Cbl的攝取已經(jīng)被建立，作為一個雙相系統(tǒng)最初的成分?jǐn)z取是迅速、飽和的并通過過量的未標(biāo)記CN-Cbl和OH-Cbl而被特定抑制，且在30分鐘內(nèi)完成。第二個成分?jǐn)z取是緩慢的，與時間呈線性并不被過量的未標(biāo)記鈷胺素所抑制，而且甚至在8小時后都不是穩(wěn)定水平，這建議了非特異過程的特征性屬性。攝取的最初模式具有介導(dǎo)較高特異性膜穿越的蛋白質(zhì)的性質(zhì)；它對巰基試劑敏感并通過環(huán)己酰亞胺而被顯著抑制(Sennet，C.和Rosenberg，L.E.，Ann.Rev.Biochem.50，1053-86(1981))。這些性質(zhì)與蛋白介導(dǎo)、促進(jìn)哺乳動物游離鈷胺素攝取的系統(tǒng)的存在相一致。
已經(jīng)很好地確定了許多細(xì)菌和所有的真核原生生物是維生素B12營養(yǎng)缺陷的并能以比哺乳動物內(nèi)因子，TCI和TCII，高的結(jié)合親合力與它結(jié)合。細(xì)菌和原生動物的B12-結(jié)合蛋白是較少載體作用的細(xì)胞表面蛋白，其能以較高的結(jié)合親合力結(jié)合到各類咕啉上(包括真鈷胺素)。因此，在整個身體圖像的內(nèi)容內(nèi)檢測細(xì)菌感染，然后施用放射性標(biāo)記的鈷胺素衍生物，是并不令人驚奇的(Collins，D.A.等，MayoClin.Proc.75，568-580(2000))。研制哺乳動物細(xì)胞的過度增殖形式可以充分地使由已經(jīng)存在的較少載體鈷胺素攝取系統(tǒng)的更有效形式的多步致癌進(jìn)行研制成為必須。
很多方法已經(jīng)被公開并獲取專利，其使用鈷胺素作為各種生物學(xué)活性劑包括放射性金屬同位素在內(nèi)的載體(參見Collins，D.A.，美國專利申請?zhí)?003/0144198)。當(dāng)使用放射性標(biāo)記的鈷胺素衍生物時，從動物和人中獲得的結(jié)果顯示了標(biāo)記的腫瘤組織，而且還有在健康組織例如腎和肝中放射性的濃集。因此，成像和放射治療絕不是最理想的。對一些身體健康部分的主要損傷的潛在性限制了目前為止記載的應(yīng)用。
顯然需要以高于正常細(xì)胞的濃度將診斷和治療性鈷胺素衍生物給予到迅速增殖的細(xì)胞的化合物、組合物和方法。本發(fā)明的目的是提供鑒別、合成、特征化和以對異常高增殖細(xì)胞的較高特異性而施用鈷胺素衍生物，同時避免耐藥細(xì)胞子代發(fā)展的新方法。
發(fā)明概述本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)與鈷胺素本身相反，沒有或較少結(jié)合到轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白鈷胺傳遞蛋白II(TCII)上的鈷胺素衍生物，如果施用正確，那么在血和良性器官例如腎和肝中就具有與在腫瘤組織中的積聚速率相比較低的積聚速率，并能從血中更迅速地清除。通過選擇作為維生素B12替代物的鈷胺素衍生物，能在腫瘤組織中很好地降低形成耐藥子代的危險性。
本發(fā)明涉及鈷胺素衍生物，所述鈷胺素衍生物(a)對鈷胺傳遞蛋白II沒有結(jié)合親合力或具有低的結(jié)合親合力，以及(b)保留作為維生素B12替代物的活性。
特別的是，本發(fā)明涉及鈷胺素衍生物，其中(a)在結(jié)合試驗中，當(dāng)與沒有改性的鈷胺素的結(jié)合親合力比較時，對鈷胺傳遞蛋白II具有低于20％，優(yōu)選低于5％的結(jié)合親合力，以及
(b)在生長測定中保持大于2％的作為維生素B12替代物的活性。
對TCII有較低結(jié)合親合力或沒有結(jié)合親合力的本發(fā)明化合物的實(shí)例是載有治療劑和/或診斷劑例如放射性金屬的特定鈷胺素衍生物。本發(fā)明的化合物基于以下試驗的結(jié)果而被選擇使用純化的TCII進(jìn)行的結(jié)合試驗，和使用德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)作為測試微生物的生長測定。
本發(fā)明還涉及診斷哺乳動物中腫瘤性疾病或微生物感染的方法，包括(a)給疑似遭受腫瘤性疾病或感染的哺乳動物供給不含維生素B12的飲食一段時間，和(b)隨后供給載有診斷劑的本發(fā)明的鈷胺素衍生物。
本發(fā)明同樣涉及治療患有腫瘤性疾病或微生物感染的哺乳動物的方法，包括(a)給需要治療的哺乳動物供給不含維生素B12的飲食一段時間，和(b)隨后供給載有治療劑的本發(fā)明鈷胺素衍生物。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的鈷胺素衍生物在診斷腫瘤性疾病或微生物感染的方法中或在治療患有腫瘤性疾病或微生物感染的哺乳動物的方法中的用途。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明鈷胺素衍生物的藥物組合物，特別是適于診斷用的藥物組合物和適于治療用的藥物組合物，以及這種藥物組合物分別在診斷方法和治療性治療方法中的用途。
本發(fā)明還涉及制備用在根據(jù)本發(fā)明的診斷和治療性治療中的化合物的中間體，尤其是被螯合劑取代結(jié)合放射性金屬，但沒有金屬或非放射性金屬結(jié)合到螯合劑上的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的鈷胺素衍生物對于攻擊性、發(fā)展迅速的腫瘤性疾病例如癌癥的診斷和/或治療和/或病原微生物的局部感染的診斷和/或治療具有特別高的價值。
附圖簡述

圖1是說明了在凝膠移位檢測中，放射性標(biāo)記的實(shí)施例11的氰基鈷胺素-b-丙基-PAMA-OEt，TCII-非結(jié)合劑，與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白間的相互作用的圖。t＝時間，cpm＝每分鐘計數(shù)。
A)在SuperdexTM75柱上對被放射標(biāo)記的衍生物進(jìn)行的凝膠過濾分析(峰洗脫物在1.5kDa)B)對混有TCI的衍生物進(jìn)行的凝膠過濾分析(峰從1.5kDa移動到44kDa)C)對混有TCII的衍生物進(jìn)行的凝膠過濾分析(峰洗脫物在1.5kDa，這表明氰基鈷胺素-b-丙基-PAMA-OEt基本上是TCII-非結(jié)合劑)圖2是說明了在凝膠移位檢測中，放射性標(biāo)記的實(shí)施例5的氰基鈷胺素-b-丁基-PAPAcet，TCII-結(jié)合劑，與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白間的相互作用的圖。t＝時間，cpm＝每分鐘計數(shù)。
A)在SuperdexTM75柱上對被放射標(biāo)記的衍生物進(jìn)行的凝膠過濾分析(峰洗脫物在1.5kDa)B)對混有TCI的衍生物進(jìn)行的凝膠過濾分析(峰從1.5kDa移動到44kDa)C)對混有TCII的衍生物進(jìn)行的凝膠過濾分析(峰從1.5kDa移動到60kDa，這表明氰基鈷胺素-b-丁基-PAPAcet確實(shí)與TCII進(jìn)行了結(jié)合)圖3、4、5和6說明組織分布的條形圖y-軸每克組織被注入放射性的百分比x-軸器官1)血液，2)心臟，3)脾，4)腎，5)胃，6)腸，7)肝，8)肌肉，9)骨，10)腫瘤圖3在飼喂正常食物的小鼠中靜脈注射放射性氰基鈷胺素(57Co-CN-Cbl)后的組織分布。
圖4在飼喂缺乏維生素B12的食物的小鼠中靜脈注射放射性氰基鈷胺素(57Co-CN-Cbl)后的組織分布。
圖5在飼喂正常食物的小鼠中靜脈注射放射性氰基鈷胺素-b-丙基-PAMA-OEt(實(shí)施例11)后的組織分布。
圖6在飼喂缺乏維生素B12的食物的小鼠中靜脈注射放射性氰基鈷胺素-b-丙基-PAMA-OEt(實(shí)施例11)后的組織分布。
發(fā)明詳述對鈷胺素載體蛋白(或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)沒有或有非常低結(jié)合親合力的鈷胺素衍生物，當(dāng)用于被提供維生素B12飲食的哺乳動物中時，能很好地降低在血液和重要器官例如腎和肝中的積聚，而同時在過度增殖的細(xì)胞中保持較高的攝取率，這樣，便能更精確地診斷和治療腫瘤性疾病和微生物的局部感染。
對TCII有較低結(jié)合親合力并保持維生素B12活性的本發(fā)明化合物是例如式(I)的化合物 其中Rb、Rc、Rd和Re彼此獨(dú)立地為間隔基-螯合劑基團(tuán)、抗生素或抗增殖的治療劑、具有4到20個碳原子有空間要求的有機(jī)基團(tuán)或氫；
RR是間隔基-螯合劑基團(tuán)或抗生素或抗增殖的治療劑，其每一個均通過連接基團(tuán)Z連接，或氫；條件是，殘基Rb、Rc、Rd、Re和RR中至少三個是氫，且殘基Rb、Rc、Rd和Re中至少一個不是氫；X是單齒配體；以及中央的鈷(Co)原子任選是放射性同位素的形式。
在特別的實(shí)施方案中，Re是氫。
單齒配體X是例如氰基；鹵素，例如氟、氯、溴或碘、氰氧基、異氰酸根合、硫氰酸根合或異硫氰酸根合；烷基，直鏈或支鏈并包含1到25個碳原子，優(yōu)選1到4個碳原子，例如是甲基、乙基、正丙基、正丁基或異丁基，或還有正己基或正癸基，并任選被羥基、甲氧基或氨基取代，例如是羥基甲基、甲氧基甲基、氨基甲基、羥基乙基或甲氧基乙基；腈R-CN，異腈R-NC，羧酸根合R-COO-或硫醇根合R-S-，其中R是烷基，直鏈或支鏈并含有1到15個碳原子，優(yōu)選1到6個碳原子，或芳基，例如苯基或萘基，例如乙腈、丙腈、芐腈、甲胩、苯胩、乙酸酯、丙酸酯、苯甲酸酯、甲基硫醇鹽、乙基硫醇鹽、正己基硫醇鹽或硫酚鹽；亞磷酸酯(RO)3P，其中取代基R是相同或不同的并表示包含1到6個碳原子的烷基或芳基，例如任選被取代的苯基或萘基，例如三甲基亞磷酸酯、甲基二苯基亞磷酸酯、三苯基亞磷酸酯或三鄰甲苯基亞磷酸酯；羥基或水合基團(tuán)；或5′-脫氧腺苷基團(tuán)或相關(guān)的核苷。
優(yōu)選的是，X是氰基、甲基、羥基、水合基團(tuán)或5′-脫氧腺苷基團(tuán)。最優(yōu)選氰基。
作為取代基Rb、Rc、Rd、Re或RR的間隔基-螯合劑基團(tuán)是用于通過間隔基將金屬原子連接到鈷胺素的NH或O官能團(tuán)上的螯合劑，并任選載有金屬原子，特別是放射性金屬原子。
其中間隔基-螯合劑基團(tuán)不載有金屬原子的式(I)化合物是用于制備用在根據(jù)本發(fā)明診斷和/或治療性治療方法中的化合物的中間體。
作為取代基Rb、Rc、Rd、Re或RR的抗生素或抗增殖治療劑是選自氨基糖苷類抗生素例如慶大霉素、四環(huán)素，抗代謝物例如硒蛋氨酸，大環(huán)內(nèi)酯類例如紅霉素和甲氧芐啶的抗生素，或是選自抗代謝物例如5-氟尿嘧啶，烷化劑例如奧沙利鉑、達(dá)卡巴嗪、環(huán)磷酰胺或卡鉑，細(xì)胞周期抑制劑例如長春堿或多西紫杉醇，DNA斷裂劑(拓補(bǔ)異構(gòu)酶抑制劑、插入劑、鏈斷裂劑)例如多柔比星、博萊霉素或托泊替康的抗增殖劑，干擾信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的化合物例如半胱天冬酶活性修飾劑、細(xì)胞死亡受體的激動劑或拮抗劑，和核酸酶、磷酸酶和激酶的修飾劑例如甲磺酸伊馬替尼、地塞米松、豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯、環(huán)孢素A、槲皮素或他莫昔芬，將與鈷胺素的NH或O官能團(tuán)直接相連或通過間隔基共價連接。
間隔基是2到10個碳原子，優(yōu)選2到6個碳原子，例如2到5個碳原子的脂族鏈，其中一個或兩個碳原子可以被氮和/或氧原子替代，脂族鏈可以被羥基、氧代基或氨基取代。特別的是，兩個相鄰的碳原子可以被酰胺官能團(tuán)-NH-CO-或酯基-O-CO-替代。
連接鈷胺素的NH或O官能團(tuán)與螯合劑的特別間隔基是亞乙基、亞丙基、亞丁基或亞戊基，或是其中一個碳被氧或氮替代的這樣的基團(tuán)，或是其中一個碳原子被氧或氮替代且相鄰碳原子被氧代基取代的這樣的基團(tuán)。
螯合劑是具有兩個、三個或多個供電子原子的化合物，其中原子選自氮、氧和硫，其具有能結(jié)合金屬原子的間距。特別的螯合劑是三齒螯合劑，其具有三個包含N、O和/或S供電子原子的金屬結(jié)合位點(diǎn)，彼此間的間距能允許結(jié)合金屬原子。作為供電子原子的氮原子是例如脂族胺、芳族胺或含氮芳香雜環(huán)的部分。作為供電子原子的氧原子是例如醇、醚、酯或羧基官能團(tuán)。作為供電子原子的硫原子是例如硫醚或硫醇。供體可以通過例如脂肪碳鏈或包含酰胺鍵和/或醚官能團(tuán)的鏈連接，并可以是氨基酸衍生物、聚醚等。
優(yōu)選的螯合劑是式(II)至(IX)的螯合劑。羧基可以作為酯而存在，其斷裂，伴有與金屬原子形成絡(luò)合物以生成配位羧酸根合基團(tuán)。在這種酯化螯合劑中，酯可以是烷基酯，其烷基是直鏈或支鏈并包含1到25個碳原子，任選1到5個碳原子被氮或氧替代，或者一個或兩個碳原子被硫或磷替代，并且其任選被苯基、吡啶基、羥基、鹵素、氰基、氧代基或氨基取代。酯也可以是芳基或雜芳基酯，其中芳基或雜芳基具有3到10個碳原子和0、1或2個氧，0、1、2或3個氮或0或1個硫原子。這種酯殘基可以適宜被取代以便使它們在特定反應(yīng)條件下能斷裂，例如所記載的關(guān)于通常用作羧酸保護(hù)基的酯的條件，參見Green，T.W.，和Wuts，P.G.M.，有機(jī)合成中的保護(hù)基，Wiley1999。
酯化螯合劑，例如被甲基、乙基或氰基乙基酯化的酯化螯合劑，也包含在優(yōu)選的螯合劑的定義內(nèi)。
放射性金屬被認(rèn)為是放射性同位素例如94mTc、99mTc、188Re、186Re、111In、90Y、64Cu、67Cu和177Lu，特別是99mTc、188Re、186Re和111In。
放射性同位素Co被認(rèn)為是57Co和60Co。
具有4到20個碳原子有空間要求的有機(jī)基團(tuán)是例如烷基、環(huán)烷基、芳基、芳基烷基、雜芳基或雜芳基烷基，其任選被羥基、烷氧基、氧、氨基、羧基、氨基甲?；蛲檠豸驶〈７蓟膶?shí)例是苯基、甲基苯基、二甲基苯基、羥基苯基或萘基。雜芳基的實(shí)例是吡啶基、吡咯基、咪唑基或苯并咪唑基。在烷基鏈中，碳原子可以被氮或氧原子替代。例如，在烷基鏈中，一個碳原子可以被氮(或氧)原子替代，并且相鄰碳原子被氧代基取代，由此表示酰胺(或酯官能團(tuán))。有空間要求的有機(jī)基團(tuán)的特別實(shí)例是異丁基、叔丁基、叔戊基、鄰甲苯基、鄰甲基芐基或2，6-二甲基芐基。
連接RR與間隔基-螯合劑基團(tuán)或抗生素或抗增殖治療劑的連接基團(tuán)Z是鍵或選自以下的連接基團(tuán)磷酸酯、膦酸酯、羧酸酯或1到10個碳原子的亞烷基以及它們的組合。這種連接基團(tuán)連接了間隔基-螯合劑基團(tuán)或任選包含如前所定義間隔基的治療劑與鈷胺素的氧原子。
在RR位被衍生化而其中Rb、Rc、Rd和Re都為氫的化合物通過TC得以驗證，并且仍然有酶活性，因此被排除在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
對本化合物的選擇基于的是以下標(biāo)準(zhǔn)(a)當(dāng)與(未修飾的)鈷胺素相比，對TCII沒有或有非常低的結(jié)合親合力，例如小于20％，特別是小于10％，優(yōu)選小于5％，更優(yōu)選小于2％的結(jié)合親合力；以及(b)在使用維生素B12依賴菌或哺乳動物細(xì)胞系的生長試驗中，與(未修飾的)鈷胺素的維生素B12活性相比，有作為維生素B12替代物的活性，例如大于2％的活性，特別是大于10％的活性，優(yōu)選大于20％的活性。
對于鈷胺素(Cbl)衍生物對TCII的結(jié)合親合力試驗來說，體外試驗用具有獲自兔血的部分純化的TCII下進(jìn)行。由大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的重組TCII也能被用作底物。
本發(fā)明的鈷胺素衍生物必須保持其作為維生素B12替代物的功能。結(jié)果，導(dǎo)致具有高增殖率細(xì)胞的耐藥發(fā)展的危險性就將被大大降低。在所有的可能性下，能較長時間攝取對TCII有較低或沒有結(jié)合親合力的鈷胺素衍生物的突變細(xì)胞將失去其母體細(xì)胞達(dá)到較高的增殖率的優(yōu)勢，這是由于高效的不依賴于TCII的維生素B12攝取機(jī)制。
對于鈷胺素衍生物的維生素B12活性測定來說，通過使用德氏乳桿菌，國際推薦的氰基鈷胺素(CN-Cbl)檢測菌種，來進(jìn)行實(shí)驗，向不含氰基鈷胺素的測定培養(yǎng)基中補(bǔ)充氰基鈷胺素能導(dǎo)致氰基鈷胺素-營養(yǎng)缺乏菌株的生長反應(yīng)，這能通過定量固體擴(kuò)散盤試驗來測定。該試驗用于確定鈷胺素衍生物能替代氰基鈷胺素作為生命支持催化劑的程度(％)。
本發(fā)明涉及在哺乳動物中診斷和治療腫瘤性疾病和微生物局部感染的方法，其包含(a)給哺乳動物供給不含維生素B12的飲食一段時間，(b)隨后供給載有診斷或治療劑的本發(fā)明鈷胺素衍生物，以及本發(fā)明鈷胺素衍生物在這種方法中的用途。
在被提供不含維生素的飲食的哺乳動物中使用TCII非結(jié)合氰基鈷胺素衍生物對將生物分布的陽性效果在表1中有所說明。
表1在小鼠中靜脈注射放射性標(biāo)記的衍生物后24小時的組織分布
實(shí)施例5氰基鈷胺素-b-丁基-PAPAcet實(shí)施例6氰基鈷胺素-b-丁基-氨基羧甲基-His-Ome實(shí)施例8氰基鈷胺素-c-丁基-PAPAcet實(shí)施例10氰基鈷胺素-b-乙基-PAMA-OEt實(shí)施例11氰基鈷胺素-b-丙基-PAMA-OEt實(shí)施例12氰基鈷胺素-b-丁基-PAMA-OEt實(shí)施例14氰基鈷胺素-b-己基-PAMA-OEt實(shí)施例18氰基鈷胺素-d-丙基-PAMA-OEt實(shí)施例20氰基鈷胺素-b-丙基-His-Ome實(shí)施例22氰基鈷胺素-b乙基-三胺實(shí)施例25氰基鈷胺素-5′-磷酸膽胺(phosphocolamin)-His-Ome表1匯總的生物分布分析結(jié)果表明，TCII非結(jié)合劑，例如作為實(shí)施例10、11、12、18和22的本發(fā)明化合物，在腫瘤中有比較高的積聚，是在血中的五倍或更高，是在重要器官腎和肝中發(fā)現(xiàn)的量的至少一半。實(shí)施例5、6、8、14、20和25的化合物不落入在本發(fā)明化合物的定義內(nèi)，因為它們與TCII結(jié)合，在此僅作為參考化合物而被描述。
根據(jù)本發(fā)明的鈷胺素衍生物對于攻擊性、發(fā)展迅速的腫瘤性疾病例如癌癥的診斷和/或治療有特別高的價值。本發(fā)明的化合物能用于治療包括惡性腫瘤在內(nèi)的人器官高度增殖的細(xì)胞，例如黑素瘤、纖維肉瘤、卵巢癌、胰腺癌和骨肉瘤和急性白血病，這是提及的幾個實(shí)例，并能繞過TCII介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。本發(fā)明的方法能對良性組織進(jìn)行具體保護(hù)以免于TCII介導(dǎo)的鈷胺素衍生物的有害攝取，其中鈷胺素衍生物載有放射性同位素或/和能摧毀細(xì)胞的非放射性試劑。
本發(fā)明的化合物不僅能用于癌癥成像和癌癥治療，而且還能對依賴于較高和直接攝取鈷胺素的微生物局部感染進(jìn)行顯影和提供潛在的治療。
載有抗增殖劑的本發(fā)明化合物能用于將非活性形式的試劑轉(zhuǎn)運(yùn)到過度增殖的細(xì)胞中，在此它能在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行酰胺分解后發(fā)揮其作用。
在腫瘤性疾病和/或傳染病的治療方法中，載有適宜治療劑的本發(fā)明化合物能被單獨(dú)給予或與一種或多種其它治療劑聯(lián)合給予，以具有確定組合形式的可能的聯(lián)合治療給予，或者本發(fā)明的化合物和一種或多種其它治療劑交錯給予或彼此獨(dú)立地給予，或者聯(lián)合給予確定的組合和一種或多種其它治療劑。本發(fā)明的化合物，除此以外或另外，能被特別給予以用于腫瘤的治療，聯(lián)合化學(xué)療法、免疫治療、外科手術(shù)或這些的組合。長期治療同樣是可能的，如在其它治療方案內(nèi)容中的輔助治療一樣。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明鈷胺素衍生物的藥物組合物，尤其是適于診斷用的藥物組合物和適于治療用的藥物組合物。
優(yōu)選藥物組合物用于非胃腸道給藥，例如靜脈內(nèi)、肌肉或皮下給藥。組合物含有活性成分，其單獨(dú)存在或與藥學(xué)上可接受的載體組合?；钚猿煞值膭┝恳蕾囉谑苤渭膊『头N類，其年齡、體重和個體狀況、個體藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)和給藥方式。
制備方法本發(fā)明的化合物通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法制備。
優(yōu)選的是，將氰基鈷胺素，即其中Rb、Rc、Rd、Re和RR是氫，X是氰基的式(I)化合物，在受控的條件下用例如稀的無機(jī)酸下進(jìn)行水解，并分離出來得到的其中一個氨基甲?；鵆ONH2被轉(zhuǎn)化為COOH的單酸的混合物。類似地可以獲得二酸。
然后，可以將氰基鈷胺素-b、c、d或e-酸，即，其中CONHRb、CONHRC、CONHRd或CONHRe分別被COOH替代，且X是氰基的式(I)化合物與相應(yīng)的胺Rb-NH2、RC-NH2、Rd-NH2和Re-NH2在形成酰胺胺的標(biāo)準(zhǔn)條件下，例如在肽化學(xué)中已知的條件分別反應(yīng)。干擾酰胺形成的殘基Rb、Rc、Rd、Re中的官能團(tuán)優(yōu)選是被保護(hù)的形式，并在酰胺形成后通過標(biāo)準(zhǔn)方法脫保護(hù)。對于其中間隔基含有酰胺官能團(tuán)的化合物的制備來說，還能將氰基鈷胺素-b、c、d或e-酸與二胺H2N(CH2)nNH2在形成酰胺的標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行反應(yīng)，并進(jìn)一步在形成酰胺的標(biāo)準(zhǔn)條件下將得到的H2N(CH2)n-官能化氰基鈷胺素與相應(yīng)的羧酸再次縮合，分別產(chǎn)生取代基Rb、RC、Rd、Re。
對于制備其中RC不是氫的化合物，優(yōu)選的方法是根據(jù)Brown等人，Inorg.Chem.1995，3038的方法，先形成c-內(nèi)酯，然后進(jìn)行還原內(nèi)酯開環(huán)反應(yīng)。
對于制備其中RR不是氫的化合物，將氰基鈷胺素(其中Rb、RC、Rd或Re不是氫的氰基鈷胺素衍生物)與RR-L反應(yīng)，其中L為適宜用于形成酯鍵的活化離去基團(tuán)，例如鹵素、混合酸酐的殘基或另外的活性殘基，所述另外的殘基在肽或核酸合成中通常用于羧酸、磷酸或磷酸酯的形成。
下述的實(shí)施例用于闡述本發(fā)明，而不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例試劑等級化學(xué)藥物購自Merck，Dietikon(CH)，Aldrich or Fluka，Buchs(CH)，直接使用而不需要進(jìn)一步純化。
BOP＝1-苯并三唑基氧基三(二甲氨基)磷六氟磷酸鹽DCC＝二環(huán)己基碳二亞胺DIPEA＝二異丙基乙胺EDC＝1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺Fmoc＝(9H-芴-9-基甲氧基)羰基HOSu＝N-羥基琥珀酰亞胺MES＝2-(4-嗎啉基)乙磺酸RT＝室溫TBTU＝苯并三唑-1-基-N-四甲基脲四氟硼酸鹽TEAP＝磷酸三乙基銨Teoc＝2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基TFA＝三氟乙酸在裝有EG & GBerthold LB 508放射度監(jiān)測器的Merck-HitachiL-7000系統(tǒng)上進(jìn)行HPLC分析，使用Waters XTerra RP8柱(5□m粒度，1×100mm)，流速為1ml/分鐘。在250和360nm記錄色譜圖。溶劑a主要是水緩沖液。乙酸鈉緩沖液是通過在900ml水和100ml甲醇中混合2.9ml乙酸和4.55ml氫氧化鈉2M制備的。氨基丁三醇是通過如下方法制備的將三(羥甲基)-氨基甲烷(605mg)溶解在水中，加入HCl 2M至pH為8.2，調(diào)節(jié)體積為1000ml，加入乙腈(10ml)。溶劑b一直為甲醇。
在裝有兩個Prostar 215泵和Prostar 320UVNis監(jiān)測器的VarianProstar系統(tǒng)上進(jìn)行制備HPLC分離，使用Waters XTerra Prep RP8柱(5Elm粒度，3×100mm和30×100mm)。對于3×100mm柱，流速為4ml/分鐘，對于30×100mm柱，流速為30ml/分鐘。
用VarianCary 50光譜儀上記錄UVNis光譜，用Bio-Rad FTS-45光譜儀記錄IR光譜，IR光譜中樣品被壓制成KBr片。用Merck HitachiM-8000光譜儀記錄電霧化離子質(zhì)譜(ESI-MS)。報告了錸化合物中187Re同位素的值。用Bruker DRX 500MHz光譜儀記錄NMR光譜。報告相對于作為參照的殘留溶劑質(zhì)子的化學(xué)位移。
通過將化合物的水溶液應(yīng)用到Chromafix RP18ce cartridge中，接著用水充分洗滌來對鈷胺素衍生物(mg量)脫鹽。
然后，用甲醇洗脫脫鹽的產(chǎn)品，真空除去溶劑，高真空干燥產(chǎn)物。酚提取除去一定量的Bigger(多于50mg)中鹽分，如描述于Meth.Enzymol.1971，18(3)，p.43中。
如Schibli等人.描述的用于制備戊基類似物的方法(Nucl.Med.Biol.2003，30，465)制備(N-3-氨丙基-N-吡啶-2-基甲基-氨基)乙酸乙酯(丙基-PAMA-OEt)。該化合物在堿性條件下易于環(huán)化。因此，保存Boc保護(hù)的中間體，就在進(jìn)一步功能化之前，在稀釋HCI水溶液中攪拌除去Boc。用類似的方法制備乙基和己基衍生物。
通過將完全脫保護(hù)的([N-3-氨丙基-N-吡啶-2-基甲基-氨基]乙酸)與(NEt4)2[Re(OH2)3(CO)3]反應(yīng)來制備(N-3-氨丙基-N-吡啶-2-基甲基-氨基)乙酸(CO)3。
如Pak等人.描述的方法(Chem.Eur.J.2003，9，2053-2061)制備1-羧甲基-N-Fmoc-組氨酸酯三氟乙酸甲酯。通過在HCl 0.05M攪拌化合物，之后室溫真空脫水完成氯替換抗衡離子。
如van Staveren等人.描述的方法(Organic & MolecularChemistry 2004，2，2593)制備3-氨丙基-N-Teoc-組氨酸甲酯。
如Kunze描述的方法(Dissertation，University of Zurich，2004)制備3-(N-2-氰基乙氧基羰基甲基)-N-吡啶-2-基甲基-氨基)丙酸4-硝基-苯基酯。
實(shí)施例1氰基鈷胺素單羧酸(b、d和e)如Pathare等人.描述的方法(Bioconjugate Chem.1996，217)使維生素B12(1.88g，1.39mmol)在HCl 0.1M(190ml)中水解。以下述的方法實(shí)施純化酚提取物脫鹽后，Dowex column分離出三個組分，一種只包含d-酸，第二種只包含b-酸和d-酸，第三種只包含b-酸和e-酸。通過制備HPLC(柱Waters XTerra Prep RP8，5□m，30×100mm；梯度洗脫a/b 0.5％min-1，起始用100％乙酸緩沖液a)分離b-酸和d-酸的混合物。用同樣的系統(tǒng)分離b-酸和e-酸的混合物，但使用氨基丁三醇作為溶劑。分離得氰基鈷胺素-b-酸，產(chǎn)率280.6mg(14.9％)，氰基-鈷胺素-d-酸產(chǎn)率131.5mg(7.0％)，氰基鈷胺素-e-酸，產(chǎn)率94.26mg(5.0％)。
實(shí)施例2氰基鈷胺素-b-(2-氨基乙基)酰胺[氰基鈷胺素-b-乙氨基]如Pathare等人.描述的用于十二烷類似物的合成方法(Bioconjugate Chem.1996，217)制備氰基鈷胺素-b-(2-氨基乙基)酰胺。將乙烯二胺(132mg；0.147mi；2.2mmol)溶于DMF/H2O混合物(10ml；1/1v/v)。加入1M HCl調(diào)節(jié)pH至5。給溶液中加入氰基鈷胺素-b-酸(60.0mg，44.4□mol)和KCN(57mg；0.87mmol)，然后調(diào)節(jié)pH至5.5。接著，加入EDC(84.2mg；0.43mmol)和HOSu(50.6mg；0.44mmol)。在RT攪拌混合物3天，在24小時的間隔加入另外部分的EDC和HOSu。為了進(jìn)一步使用，真空蒸發(fā)干燥，然后用制備HPLC純化(乙酸系統(tǒng)，梯度洗脫0.5％min-1s，起始為100％緩沖液a)，得到34mg(55％)氰基鈷胺素-b(2-氨基乙基)酰胺。
MS(MeOH；ESI-pos.)m/z＝1398.8[M+H]+，1420.1[M+Na]+，699.4[M+H]2+，711.1[M+H+Na]2+。
實(shí)施例3氰基鈷胺素-b-(4-氨基丁基)酰胺[氰基鈷胺素-b-丁胺]用如上述描述的合成乙基類似物的方法制備。
MS(MeOH，ESI-pos.)m/z＝1427.1[M+1]+，714.5[M+3]2+。
實(shí)施例4氰基鈷胺素-b-乙基-PAPAcet將氰基鈷胺素-b-乙胺(實(shí)施例2；24mg；17.2mol)溶于DMF/DMSO混合物中(5ml；4/1v/v)。給該混合物中加入3-[N-2-氰基乙氧基-羰基甲基-N-吡啶-2-甲基-氨基]-丙酸4-硝基苯酯(14mg，34.1□mol)和DIPEA(5□，29□mol)。在RT攪拌24小時后，真空蒸發(fā)干燥混合物。制備HPLC(乙酸系統(tǒng)，梯度洗脫0.5％min-1，起始為100％緩沖液a)純化，得到20mg(70％)氰基鈷胺素-b-乙基-PAPAcet，紅色固體。
MS(MeOH；ESI-pos.)m/z＝1672.1[M+H]+，836.9[M+H]2+。
實(shí)施例5氰基鈷胺素-b-丁基-PAPAcet將氰基鈷胺素-b-丁胺(實(shí)施例3，5.5mg，3.9mmol)和3-[N-2-氰基乙氧基-羰基甲基-N吡啶-2-基甲基-氨基]丙酸4-硝基苯酯(2.5mg，6.1□mol)溶解于無水DMSO(0.5ml)和DMF(0.5ml)混合物中。加入DIPEA(5□，29□mol)達(dá)到pH為8至9，然后室溫攪拌混合物。5小時后，HPLC分析證實(shí)完成了產(chǎn)物的制備。真空部分蒸發(fā)溶劑產(chǎn)物，加入乙醚，沉淀產(chǎn)物。離心混懸物，傾析3次，得到細(xì)粉末。制備HPLC(乙酸系統(tǒng)，梯度洗脫0.5％min-1，起始為100％緩沖液a)純化，得到純產(chǎn)物，產(chǎn)率為2.7mg(41％)。
ESI-MSm/z＝850.1[M+2]2+UVNis□/nm(□moll-1cm-1)＝279.1(17300)，361.0(31200)，519.9(8700)，552.0(9700)。
實(shí)施例6氰基鈷胺素-b-丁基-氨基羧甲基-組氨酸-OMe給氰基鈷胺素-b-丁胺(49.6mg，34.8mmol)的無水DMSO(2ml)溶液中加入甲基1-羧甲基-N-Fmoc-組氨酸鹽酸化物(35.5□mol)和BOP(46.2mg，104.4□mol)。加入DIPEA(12□，70.0□mol)，在RT攪拌溶液16小時。HPLC分析證實(shí)鈷胺素起始原料完全轉(zhuǎn)化為Fmoc保護(hù)的中間體。加入二乙醚沉淀中間體，離心混懸液，傾析兩次得到細(xì)粉末。將中間體溶于DMF(5ml)中，加入哌啶(225□l)。在RT攪拌1.5小時，加入二乙醚沉淀產(chǎn)物，離心混懸液，傾析三次得到細(xì)粉末。制備HPLC(乙酸系統(tǒng)，梯度洗脫1％min-1，起始為100％緩沖液a)純化，得到純產(chǎn)物，產(chǎn)率17.1mg(32.1％)。
UVNis□nm(□molI-1cm-1)＝279.1(19200)，361.0(24700)，521.0(9600)，551.1(10700)。
實(shí)施例7氰基鈷胺素-c-(4-氨丁基)-酰胺如Brown等人.描述的方法(Inorg.Chem.1995，3038)制備氰基鈷胺素-c-酸。將1，4-二氨基丁烷(0.059ml；0.59mmol)溶于DMF/H2O混合物(10ml；1/1v/v)中。加入1M HCl調(diào)節(jié)pH至5.2。給溶液中加入氰基鈷胺素-o-酸(16.0mg，11.8□mol)、KCN(15.3mg；0.236mmol)、EDC(9.0mg；47.2□mol)和HOSu(5.4mg；47.2□mol)。在RT攪拌混合物4天，加入另一部分的EDC和HOSu。一天后，再加入另一部分的EDC和HOSu?？偣?天后，HPLC分析證實(shí)鈷胺素衍生物已完全轉(zhuǎn)化。為了進(jìn)一步使用，真空蒸發(fā)干燥混合物，然后用制備HPLC純化(RP C18柱，HCl 1mM作為緩沖液a，梯度洗脫30分鐘內(nèi)從20％甲醇至50％甲醇)，得到9.8mg(58％)氰基鈷胺素-c-丁胺。
MS(MeOH；ESI-pos.)m/z＝1427.7[M+2]+，713.5[M+1]2+。
實(shí)施例8氰基鈷胺素-c-丁基-PAPAcet如在氰基鈷胺素-b-丁基-PAPAcet(實(shí)施例5)的合成中描述的方法，氰基鈷胺素-c-丁胺(7.0mg，4.9□mol)和3-[N-2-氰基乙氧基羰基甲基-N-吡啶-2-基甲基-氨基]丙酸4-硝基苯酯(3.8mg，9.2□mol)反應(yīng)并純化，得到純產(chǎn)物，產(chǎn)率3.8mg(78％)。
ESI-MSm/z＝1701.0[M+1]+，850.1[M+1]2+UVNis□m(□mol I-1cm-1)＝278.1(14500)，362.1(25400)，550.0(7900)。
實(shí)施例9氰基鈷胺素-b-丁基-PAPA-Re(CO)3將氰基鈷胺素-b-丁胺(實(shí)施例3，24.6mg，17.2□mol)和Re(CO)3(3-[N-羧甲基-N-吡啶-2-基甲基-氨基]丙酸)(9.1mg，17.2□mol)溶于DMSO.BOP(22.9mg，51.7□mol)中，加入DIPEA(2.94□，17.2□mol)，室溫攪拌混合物。連續(xù)4天每天都加入DIPEA和BOP。HPLC分析證實(shí)形成了兩種產(chǎn)物。加入乙醚沉淀產(chǎn)物。離心混懸物，傾析3次，得到細(xì)粉末。制備HPLC純化(乙酸系統(tǒng)，梯度洗脫0.5％min-1，起始為100％緩沖液)分離主要峰產(chǎn)物，產(chǎn)率2.3mg(7.0％)。
ESI-MSm/z＝1917.5[M+2]+，959.9[M+4]4+實(shí)施例10氰基鈷胺素-b-乙基-PAMA-Oet將氰基鈷胺素-b-酸(20.0mg，14.8□mol)溶于DMSO(0.8ml)中，隨后加入DMF(2ml)和NEt3(0.1ml)。在不同的燒瓶中，將約5當(dāng)量的(N-2-氨基乙基-N-吡啶-2-基甲基-氨基)乙酸乙基酯(乙基-PAMA-OEt)鹽酸化物(通過在絕對EtOH/2M HCl混合物中(7.5ml 4/1v/v)攪拌過夜裂解Boc-保護(hù)的衍生物，隨后真空除去揮發(fā)物而制備)溶于DMF/NEt3混合物中(4.5ml；8/1v/v)。混合兩種溶液，隨后加入TBTU(32.1mg，0.1mmol)。在RT攪拌45分鐘后，真空除去溶劑。用制備HPLC(乙酸系統(tǒng)，梯度洗脫1.0％min-1，起始為100％緩沖液a)純化殘余物，得到12mg(51％)的氰基鈷胺素-b-乙基-PAMA-Oet，紅色固體。
MS(MeOH；ESI-pos.)m/z＝1575.8[M+H]+，788.7[M+H]2+，799.3[M+H+Na]2+。
實(shí)施例11氰基鈷胺素-b-丙基-PAMA-Oet將新制備的(N-3-氨丙基-N-吡啶-2-基甲基-氨基)乙酸乙基酯(361□mol)的水溶液(1ml)加入到氰基鈷胺素b-酸(65.0mg，48.1□mol)中。加入EDC(46.1mg，240□mol)，用NaOH 0.1M調(diào)節(jié)pH為5.5。在RT攪拌15小時后，HPLC分析(乙酸鈉緩沖液)表明形成約50％的產(chǎn)物。再次加入EDC(46.1mg，240□mol)，但是室溫延長攪拌沒有導(dǎo)致進(jìn)一步形成產(chǎn)物。真空除去溶劑，制備HPLC(梯度a/b 0.5％min-1，起始為100％乙酸緩沖液a)純化殘余物。收集主成分，真空除去溶劑，產(chǎn)物脫鹽，得到氰基鈷胺素-b-丙基-PAMA-Oet，產(chǎn)率25.8mg(16.2mmol，33.3％)。
ESI-MSm/z＝806.5[M+l+Na]2+，795.6[M+2]2+。
UVNis□nm(□mol I-1cm-1)＝278.0(8500)，361.1(26500)，549.1(8000)。
實(shí)施例12氰基鈷胺素-b-丁基-PAMA-Oet將氰基鈷胺素-b-酸(20.0mg，14.8□mol)溶于DMSO(0.8ml)中。隨后，加入DMF(2ml)和NEt3(0.1ml)。在不同的燒瓶中，將約5當(dāng)量的(N-4-氨基丁基-N-吡啶-2-基甲基-氨基)乙酸乙基酯(丁基-PAMA-OEt)鹽酸化物(通過在絕對EtOH/2M HCl混合物中(7.5ml 4/1 v/v)攪拌過夜裂解Boc-保護(hù)的衍生物，隨后真空除去揮發(fā)物而制備)溶于DMF/NEt3混合物中(4.5ml；8/1 v/v)?；旌蟽煞N溶液，隨后加入TBTU(32.1mg，0.1mmol)。在RT攪拌45分鐘后，真空除去溶劑。用制備HPLC(乙酸系統(tǒng)，梯度洗脫1.0％min-1，起始為100％緩沖液a)純化殘余物，得到15mg(63％)的氰基鈷胺素-b-丁基-PAMA-Oet，紅色固體。
實(shí)施例13氰基鈷胺素-b-丁基-PAMA-OH于0℃下在無水THF中由溴乙酰溴和9H-芴基甲醇中制備溴乙酸9H-芴-9-基甲基酯。根據(jù)Schibli等人.使用用于合成Boc-pentyl-PAMA-OMe的方法(Nucl.Med.Biol.2003，30，465)從Boc-NH-(CH2)4NH2、吡啶-2-醛和溴乙酸9H-芴-9-基甲基酯制備Boc-丁基-PAMA-OFm([(4-叔-丁氧基-羰基氨基-丁基)-吡啶-2-基甲基-氨基]-乙酸9H-芴-9-基甲基酯)。
將氰基鈷胺素-b-酸(20.0mg，14.8□mol)溶于DMSO(0.8ml)中。隨后，加入DMF(2ml)和NEt3(0.1ml)。
在不同的燒瓶中，將約5當(dāng)量的[(4-氨基-丁基)-吡啶-2-基甲基-氨基]-乙酸9H-芴-9-基甲基酯(丁基-PAMA-OFm)(通過在三氟乙酸/CH2Cl2混合物中(4ml 1/2v/v)攪拌1小時裂解Boc-保護(hù)的衍生物，隨后真空除去揮發(fā)物而制備)溶于DMF/NEt3混合物中(4.5ml；8/1v/v)?；旌蟽煞N溶液，隨后加入TBTU(32.1mg，0.1mmol)。在RT攪拌45分鐘后，真空除去溶劑。用制備HPLC(乙酸系統(tǒng)，梯度洗脫1.5％min-1，起始為100％緩沖液a)純化殘余物，得到15mg的氰基鈷胺素-b-丁基-PAMA-Ofm，紅色固體。
將氰基鈷胺素-b-丁基-PAMA-OFm(15mg)溶于3ml的HNEt2/DMF混合物(2/1v/v)中，在RT攪拌2小時。真空除去溶劑，制備HPLC(乙酸系統(tǒng)，梯度洗脫1.0％min-1，起始為100％緩沖液a)純化殘余物，得到9mg的氰基鈷胺素-b-丁基-PAMA-OH，紅色固體。
實(shí)施例14氰基鈷胺素-b-己基-PAMA-Oet將氰基鈷胺素-b-酸(20.0mg，14.8□mol)溶于DMSO(0.8ml)中。隨后，加入DMF(2ml)和NEt3(0.1ml)。
在不同的燒瓶中，將約5當(dāng)量的(6-氨基己基-N-吡啶-2-甲基-氨基)乙酸乙基酯(己基-PAMA-OEt)氫氧化物(通過在絕對乙醇/2M HCl混合物中(7.5ml 4/1v/v)攪拌過夜裂解Boc-保護(hù)的衍生物，隨后真空除去揮發(fā)物而制備)溶于DMF/NEt3混合物中(4.5ml；8/1v/v)。混合兩種溶液，隨后加入TBTU(32.1mg，0.1mmol)。在RT攪拌45分鐘后，真空除去溶劑。用制備HPLC(乙酸系統(tǒng)，梯度洗脫1.0％min-1，起始為100％緩沖液a)純化殘余物，得到10mg(41％)的氰基鈷胺素-b-丁基-PAMA-OEt，紅色固體。
MS(MeOH，ESI-pos.)m/z＝816.9[M+2H]+，1632[M+H]+實(shí)施例15氰基鈷胺素-b-乙基-PAMA-Re(CO)3將氰基鈷胺素-b-乙基-PAMA-OEt(實(shí)施例10，11mg；7.0μmol)溶于4ml的2M NaHCO3溶液中。加入11mg的(NEt4)2[ReBr3(CO)3](14.2mol)的1.5ml MeOH溶液。在85℃加熱混合物1小時。使混合物達(dá)到RT后，用制備HPLC(乙酸系統(tǒng)，梯度洗脫2.0％每分鐘，起始緩沖液a)純化。產(chǎn)率11mg(86％)。
實(shí)施例16氰基鈷胺素-b-丙基-PAMA-Re(CO)3將氰基鈷胺素-b-酸(26.7mg，19.8□mol)、Re([N-3-氨丙基-N-吡啶-2-基甲基-氨基]乙酸)(CO)3(29.2mg，60□mol)、EDC(11.5mg，60□mol)和HOSu(6.9mg，60□mol)溶于水(5ml)和DMSO(0.5ml)的混合物中，用稀釋HCl和NaOH調(diào)節(jié)pH至5.5。在RT攪拌5小時后，HPLC分析(乙酸緩沖液)表明約33％的產(chǎn)物生成。再次加入EDC和HOSu。在室溫攪拌混合物3天，在24小時間隔加入EDC和HOSu。真空除去水，加入二乙醚沉淀產(chǎn)物。離心油狀混懸液并脫鹽。用二乙醚洗滌兩次，直到形成細(xì)沉淀。高真空干燥粗產(chǎn)物，制備HPLC(梯度洗脫a/b 1％min-1，起始為100％乙酸緩沖液a)純化，脫鹽，得到氰基鈷胺素-b-丙基-PAMA-Re(CO)3，產(chǎn)率9.1mg(23％)。
ESI-MSm/z＝1831.7[M+1]+，916.1[M+1]2+。
UVNis□nm(□mol I-1cm-1)＝278.0，361.1，519.9，551.1。
實(shí)施例17氰基鈷胺素-b-己基-PAMA-Re(CO)3將氰基鈷胺素-b-酸(20.0mg，14.8□mol)溶于DMSO(0.8ml)中。隨后加入DMF(2ml)和NEt3(0.1ml)。在不同的燒瓶中，將約5當(dāng)量的[Re([N-3-氨丙基-N-吡啶-2-基甲基-氨基]乙酸)(CO)3]-CF3COOH(通過于0℃在CH2Cl2和TFA(2/1 v/v)中對保護(hù)的合成物進(jìn)行Boc裂解，隨后在RT真空除去揮發(fā)物而制備)溶于DMF/NEt3混合物中(4.5ml；8/1v/v)。
混合兩種溶液，隨后加入TBTU(32.1mg，0.1mmol)。在RT攪拌45分鐘后，真空除去溶劑。用制備HPLC(乙酸系統(tǒng)，梯度洗脫2.0％min-1，起始為100％緩沖液a)純化殘余物，得到11mg(40％)的氰基鈷胺素-b-己基-PAMA-Re(CO)3。
MS(MeOH，ESI-pos.)m/z＝936.5[M+2H]2+，948.3[M+H+Na]2+，1873.8[M+H]+。
實(shí)施例18氰基鈷胺素-d-丙基-PAMA-OEt如合成氰基鈷胺素-b-丙基-PAMA-OEt(實(shí)施例11)的方法用N-3-氨丙基-N-吡啶-2-基甲基-氨基)乙酸乙基酯(7□mol)和EDC(6.6mg，34□mol)反應(yīng)制備氰基鈷胺素-d-酸(9.3mg，6.9□mol)。分離產(chǎn)物，產(chǎn)率為3.6mg(33％)ESI-MSm/z＝1612[M+Na]+，1590[M+1]+，806[M+1+Na]2+，795.1[M+2]2+UWVis□nm(□mol I-1cm-1)＝279.0(13400)，361.1(23300)，549.1(7200)。
實(shí)施例19氰基鈷胺素-d-丙基-PAMA-Re(CO)3將氰基鈷胺素-d-酸(20.0mg，14.8□mol)溶于DMSO(1.5ml)中。隨后，加入DMF(2ml)和NEt3(0.1ml)。
在不同的燒瓶中，將約5當(dāng)量的Re([N-3-氨丙基-N-吡啶-2-基甲基-氨基]乙酸)(CO)3溶于DMF/NEt3混合物中(4.5ml；8/1v/v)。混合兩種溶液，隨后加入TBTU(32.1mg，0.1mmol)。在RT攪拌45分鐘后，真空除去溶劑。用制備HPLC(乙酸系統(tǒng)，梯度洗脫2.0％min-1，起始為100％緩沖液a)純化殘余物，得到20mg(73％)的氰基鈷胺素-d-丙基-PAMA-Re(CO)3。
實(shí)施例20氰基鈷胺素-b-丙基-組氨酸-OMe將氰基鈷胺素-b-酸(20.0mg，14.8□mol)溶于DMSO(0.8ml)中。隨后加入DMF(2ml)和NEt3(1ml)。
在不同的燒瓶中，將約4當(dāng)量的3-氨丙基-N-Teoc-組氨酸甲酯溶于DM中?；旌蟽煞N溶液，隨后加入TBTU(32.1mg，0.1mmol)。攪拌45分鐘后，隨后真空蒸發(fā)干燥。用制備HPLC(乙酸系統(tǒng)，梯度洗脫2.0％min-1，起始為緩沖液a)純化殘余物，得到16mg的紅色固體。(67％)MS(MeOH；ESI-pos.)m/z＝1710.4[M+H]+，855.0[M+2H]2+，866.7[M+Na+H]2+。
在0℃，將19mg這種Teoc-保護(hù)的化合物樣品溶于TFA/CH2Cl2混合物(4/1 v/v)。在該溫度攪拌4小時后，分析HPLC表明起始原料完全轉(zhuǎn)化。在RT真空除去溶劑。給殘余物中加入無水Et2O，隨后真空除去溶劑?？偣策M(jìn)行該步驟3次，以便除去微量的TFA。制備HPLC純化(乙酸系統(tǒng)，梯度洗脫0.5％每分鐘，起始為100％緩沖液a)，產(chǎn)物為11mg的標(biāo)題化合物。
MS(MeOH；ESI-pos.)m/z＝1565.2[M+H]+，1587.2[M+Na]+，783.4[M+2H]2+，794.1[M+Na+H]2+實(shí)施例21氰基鈷胺素-b-丙基-組氨酸-Re(CO)3將氰基鈷胺素-b-酸(20.0mg，14.8□mol)溶于DMSO(0.8ml)中。隨后加入DMF(2ml)和NEt3(0.1ml)。
在不同的燒瓶中，將約5當(dāng)量的[Re(3-氨丙基-N-Teoc-組氨酸甲酯)(CO)3]CF3COOH(通過于0℃在CH2Cl2和TFA(2/1 v/v)中對保護(hù)的合成物進(jìn)行Boc裂解，隨后在RT真空除去揮發(fā)物而制備)溶于DMF/NEt3混合物中(4.5ml；8/1 v/v)。
混合兩種溶液，隨后加入TBTU(32.1mg，0.1mmol)。在RT攪拌45分鐘后，真空除去溶劑。用制備HPLC(乙酸系統(tǒng)，梯度洗脫2.0％min-1，起始為100％緩沖液a)純化殘余物，得到7mg(73％)的氰基鈷胺素-b-丙基-組氨酸-Re(CO)3。
MS(MeOH；ESI-pos.)911.6[M+2H]2+，923.2[M+H+Na]2+，933.9[M+2Na]2+，1822.1[M+H]+，1845.6[M+Na]+實(shí)施例22氰基鈷胺素-b-乙基-三胺將三亞乙基四胺(55.4□，369□mol)溶于DMF(2.5ml)和水(2.5ml)的混合物中。加入KCN(9.6mg，147□mol)，加入HCl水溶液調(diào)節(jié)pH至6。加入氰基鈷胺素-b-酸(10.0mg，7.4□mol)、EDC(5.7mg，29□mol)和HOSu(3.4mg，29□mol)。6小時、24小時、48小時和120小時后加入相同量的EDC和HOSu。HPLC分析(乙酸緩沖液)表明緩慢生成產(chǎn)物，48小時后達(dá)到75％的轉(zhuǎn)化率，延長攪拌時間該轉(zhuǎn)化率不再提高。攪拌144小時后，真空除去溶劑，用制備HPLC純化產(chǎn)物，使用TFA 0.1％水溶液作為緩沖液a，用甲醇作為溶劑b，梯度洗脫1％min-1，起始為80％緩沖液a。分離產(chǎn)物，得到氰基鈷胺素-b-乙基-三胺x 3TFA，產(chǎn)率為7.5mg(55％)。
ESI-MSm/z＝743.1[M+2]2+。
UVNis□nm(□mol I-1cm-1)＝278.0(13000)，316.0(23100)，519.0(6500)，549.0(7200)。
實(shí)施例23氰基鈷胺素-b-乙基-三胺-Re(CO)3在50℃下pH 7.4(0.1M，0.33ml)的磷酸緩沖液中攪拌氰基鈷胺素-b-乙基-三胺(5mg，2.7□mol)和(Et4N)2[ReBr3(CO)3](2.2mg，2.9□mol)。1小時后，HPLC分析表明起始原料完全轉(zhuǎn)化成一個產(chǎn)物。4小時后，反應(yīng)混合物脫鹽，得到產(chǎn)物，根據(jù)HPLC分析，該產(chǎn)物為約2/1比例的兩種立體異構(gòu)體的混合物。用99mTc標(biāo)記氰基鈷胺素-b-乙基-三胺發(fā)現(xiàn)相同結(jié)構(gòu)的兩種立體異構(gòu)體。
ESI-MSm/z＝1755.9[M+1]+，878.5[M+2]2+。
實(shí)施例24氰基鈷胺素-5′-磷酸膽胺在室溫和通入N2氣下，攪拌氰基鈷胺素(30mg，22.14μmol)、DCC(457mg，2.214mmol)和N-Fmoc-磷酸膽胺(78.9mg，217.2μmol)的無水DMF(2ml)和無水吡啶(1ml)溶液24小時。加入2ml水后，濾出沉淀的二環(huán)己基脲，在60℃下，減壓蒸除水和吡啶。用5％哌啶的DMF溶液將殘余溶液稀釋成8ml的體積，室溫攪拌2.5小時。二乙醚沉淀產(chǎn)物，離心并洗滌多次。用制備HPLC(梯度洗脫30分鐘100％→20％a，0％→80％MeOH；a＝0.1％AcOH，10％乙腈水溶液；流速10ml/分鐘；柱M&N VP 250/21Nucleosil 100-7C18)純化產(chǎn)物。產(chǎn)率82％，紅色固體。
31P-NMR(500，CD3OD)δ0.00(s，1P)，0.53(s，1P)MS(ESI+，MeOH)m/z＝1478[M+1]+，762[M+2+2+Na]2+實(shí)施例25氰基鈷胺素-5′-磷酸膽胺-組氨酸-OMe將氰基鈷胺素-5′-磷酸膽胺(50mg，33.8μmol)和1-(羧甲基)-N Fmoc-組氨酸甲酯鹽酸化物(25mg，50.7μmol)溶于無水DMSO(4ml)中，用24μl的DIPEA調(diào)節(jié)pH至6-7。給溶液中加入固體BOP(45mg，101.5μmol)，在RT攪拌。1小時后，反應(yīng)混合物的pH變成酸性，再次調(diào)節(jié)至中性。5小時后，通過分析HPLC沒有檢測到任何起始原料。用二乙醚沉淀后，在1∶1的DMF和哌啶(10ml)混合物中脫保護(hù)1.5小時。沉淀后，如描述的純化氰基鈷胺素-5′-磷酸膽胺方法(實(shí)施例24)用制備HPLC純化，得到產(chǎn)物，產(chǎn)率為46％。
31P-NMR(500，D2O)δ-2.16，-0.37；MS(ESI+，MeOH)m/z＝1690(M+1)+，845.6(M+2)+實(shí)施例26氰基鈷胺素-5′-磷酸膽胺-磷酸膽胺-Re(CO)3使用如制備氰基鈷胺素-5′-磷酸膽胺-OMe(實(shí)施例25)的方法，用1-(羧甲基)組氨酸酯的Re(CO)3絡(luò)合物代替1-(羧甲基)-N-Fmoc-組氨酸甲酯鹽酸化物。純產(chǎn)物的產(chǎn)率為37％。
31P-NMR(500，D2O，333K)δ50.97，2.23
MS(ESI+，MeOH)m/z＝[M+1]+1945，929(片段)IR(KBr，cm-1)3400，2128，2020，1901，1902，1664，1499，1399，1219，1073
表2實(shí)施例的式(I)的鈷胺素衍生物結(jié)構(gòu)，X＝CN
實(shí)施例27常用標(biāo)記方法如Alberto等人.描述的方法(J.Am.Chem.Soc.123，3135-3136)使用碳酸硼試劑盒從前體[99mTc(OH2)3(CO)3]+的溶液制備得到[99mTcO4]。
10ml的有橡皮塞的玻璃瓶用N2吹掃。加入20□的氰基-鈷胺素衍生物(0.01M的水溶液)溶液、20□的MES緩沖液(1.0M)和200□的[99mTc(OH2)3(CO)3]+溶液，反應(yīng)混合物保存在75℃下1至2小時。進(jìn)行具有-detection的HPLC分析，證實(shí)99mTc種類的完全轉(zhuǎn)化。在這些條件下，斷開螯合劑中的酯保護(hù)基，得到羧基化(carboxylato)復(fù)合物。
對于體內(nèi)研究和結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)載體的研究，需要非常高的比活性。因此，將100□的標(biāo)記溶液注入分析HPLC系統(tǒng)中來分析有放射性和無放射性衍生物。在靜脈注射前，用濃度為10gCi每只動物濃度的生理鹽水洗脫具有最高γ活性(約300□)的洗脫組分。分離條件為乙酸緩沖液，XTerra RP8柱子，對于b-和d-衍生物使用梯度洗脫0％甲醇(0分鐘)，30％甲醇(15分鐘)，100％甲醇(25分鐘)，對于其它化合物使用如Schibli等人.描述的TEAP系統(tǒng)(Bioconjugate Chem.2000，343-351)。
實(shí)施例28從兔全血中制備鈷胺傳遞蛋白II(TC II)通過對氰基鈷胺素-瓊脂糖基質(zhì)(Sigma)的親合色譜法純化TCII。
首先用200ml 50mM Tris/1M NaCl pH 8.0洗滌凝膠(5ml)，之后用200ml 0.1M甘氨酸/0.1M葡萄糖/1M NaCl pH 10洗滌，再用200ml 50mM Tris/1M NaCl洗滌。將200ml兩次的離心的全血(在4℃下，第一次5000rpm 15分鐘，第二次20′000rpm 20分鐘)應(yīng)用到親和層析柱，如前述順次洗滌該柱。先用20ml 4.0M胍HCl/50mM Tris pH 8.0洗脫Bound TC II，第二步中再用7.5M胍HCl/50mMTris pH 8.0洗脫。大部分bound TC II已經(jīng)用4M胍HCl洗脫。在4℃透析探針的大量抗H2O性。典型地，產(chǎn)率為5-30nmol/l，轉(zhuǎn)化成7.5-10□g的TC II(MW50kDa)每只兔。
實(shí)施例29從細(xì)菌中制備鈷胺傳遞蛋白II(重組TCII)鈷胺傳遞蛋白IIcDNA表達(dá)于E.Coli系FA113，具有雙摘除蛋白的K12衍生物表達(dá)于trxB和gor基因，其中細(xì)胞質(zhì)形成氧化環(huán)境，并允許二硫化物形成。鈷胺傳遞蛋白II蛋白包含PreScission蛋白酶位點(diǎn)，其已經(jīng)被N-末端組氨酸標(biāo)記。使用鎳螯合瓊脂糖從E.Coli提取物的可溶性組分中分離蛋白。用8M尿素從結(jié)合到螯合柱的鈷胺傳遞蛋白II中除去氰基鈷胺素，之后用咪唑釋放鈷胺傳遞蛋白II。在某些制備中，用特定的蛋白酶除去組氨酸-標(biāo)記。
實(shí)施例30制備鈷胺傳遞蛋白I(TC I；HaDtocorrin)使用的原料為鈷胺傳遞蛋白1、素食的人類受試者的唾液。在4℃以20′000rpm離心唾液20分鐘，與PBS 1∶1混合，無菌過濾。鈷胺傳遞蛋白I的結(jié)合能力通常為10ng/ml。
實(shí)施例31氰基鈷胺素衍生物與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TC I和TC II)的相互作用(圖1和圖2)通過凝膠移位檢測測定放射性標(biāo)記的(57Co、99mTc、188Re、111In)氰基鈷胺素衍生物的相互作用。在室溫下，使放射性標(biāo)記的氰基鈷胺素(0.05ng至1ng)與過量的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白反應(yīng)15分鐘。將混合物應(yīng)用到凝膠過濾柱(Superdex75，Amersham Biosciencies)，流動緩沖液為PBS和0.1％Tween 20。生物活性氰基鈷胺素，其粘合到轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，分子重量遷移為約1.4kDa至40-70kDa，取決于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。用57Co-氰基鈷胺素(ICNBiomedicals GmbH，Germany；10μCi/50ng)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合能力的滴定。
實(shí)施例32用188Re-三羰基標(biāo)記氰基鈷胺素衍生物在一鍋中進(jìn)行188Re-三羰基的制備和氰基鈷胺素衍生物的標(biāo)記。7.5mg BH3NH3與20mg的維生素C鈉、100μl的氰基-鈷胺素衍生物(10-3M)、900μl的[188ReO4]-發(fā)生器洗脫物(0.9％鹽水；40mCi至270mCi)、20mg的H3PO4(85％)混合，通入一氧化碳(CO)20分鐘。在60℃加熱混合物1/2至2小時，在90℃加熱1/2至2小時。用反相HPLC柱(Waters Xterra RP8)，在磷酸緩沖液，用線性甲醇梯度洗脫，分離標(biāo)記的氰基鈷胺素與未標(biāo)記的氰基鈷胺素。生理鹽水洗脫活性級分，靜脈注射，用于成像目的為10pCi每動物的濃度，用于治療目的為高達(dá)2mCi每動物濃度。
實(shí)施例33腫瘤細(xì)胞球?qū)﹄婋x放射的敏感性在放射生物學(xué)中，患有腫瘤細(xì)胞球和腫瘤異種移植物的小鼠對放射反應(yīng)的類似性使細(xì)胞球成為體內(nèi)研究的良好可選擇的模型。在37℃下多細(xì)胞腫瘤球在旋轉(zhuǎn)燒瓶中連續(xù)攪拌生長至平均直徑為400Fm。收集細(xì)胞球，在新鮮介質(zhì)中洗滌，然后在24孔平底組織培養(yǎng)板中用無放射性或188Re-標(biāo)記的氰基鈷胺素衍生物。劑量范圍為1μCi至20μCi每孔。用可見熒光標(biāo)記物、所有球直徑的測定，半固體凝膠中測定分散球的克隆源性測定來測定細(xì)胞毒性。
實(shí)施例34小鼠中放射性標(biāo)記的氰基鈷胺素衍生物的生物分配(圖3、4、5、6)對于使用57Co-氰基鈷胺素的生物分配研究，將0.2μCi/1ng的放射性標(biāo)記的氰基鈷胺素與180μl的生理鹽水混合，并靜脈注射給患腫瘤的balb/c小鼠(同源小鼠黑素瘤B16-F10)。在指定的時間后(5分鐘至24小時)，處死動物，稱重器官，用γ計數(shù)器計數(shù)。對于使用99mTc-標(biāo)記的氰基鈷胺素的生物分配研究，將10μCi/0.5ng的放射性氰基鈷胺素與生理鹽水混合，用法如前。對于使用111In-標(biāo)記的氰基鈷胺素的生物分配研究，將2□Ci/5ng的放射性氰基鈷胺素與正常鹽水，用法如前。為了研究缺乏維生素食物的影響，比較用正常食物飼喂的小鼠中標(biāo)記的氰基鈷胺素的分配與在維生素B12缺乏的食物中的生物分配，時間為2周。
實(shí)施例35患腫瘤的小鼠中188Re-標(biāo)記的氰基鈷胺素衍生物的治療研究在balb/c小鼠中，同源黑素瘤生長至于約200mg(用管徑測量)的大小。靜脈注射增加劑量(0.1至2mCi)的放射性標(biāo)記的氰基-鈷胺素結(jié)構(gòu)物和無放射性的結(jié)構(gòu)物。用用管徑測量評價腫瘤體積。當(dāng)腫瘤達(dá)到800mg大小時，處死動物。在一系列試驗中，用分級方案(regiment)處理動物每周分次給予放射性氰基鈷胺素3次。觀察動物再生的腫瘤60天。
權(quán)利要求
1.鈷胺素衍生物，所述鈷胺素衍生物(a)對鈷胺傳遞蛋白II沒有結(jié)合親合力或具有低的結(jié)合親合力，以及(b)保留作為維生素B12替代物的活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的鈷胺素衍生物，其中所述鈷胺素衍生物(a)在結(jié)合試驗中，當(dāng)與沒有改性的鈷胺素的結(jié)合親合力比較時，對鈷胺傳遞蛋白II具有低于20％的結(jié)合親合力，以及(b)在生長測定中保持大于2％的作為維生素B12替代物的活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的鈷胺素衍生物，其中所述鈷胺素衍生物(a)在結(jié)合試驗中，當(dāng)與沒有改性的鈷胺素的結(jié)合親合力比較時，對鈷胺傳遞蛋白II具有低于10％的結(jié)合親合力，以及(b)在生長測定中保持大于10％的作為維生素B12替代物的活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的鈷胺素衍生物，其中所述鈷胺素衍生物(a)在結(jié)合試驗中，當(dāng)與沒有改性的鈷胺素的結(jié)合親合力比較時，對鈷胺傳遞蛋白II具有低于5％的結(jié)合親合力，以及(b)在生長測定中保持大于10％的作為維生素B12替代物的活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項的鈷胺素衍生物，所述鈷胺素衍生物載有治療劑和/或診斷劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項的鈷胺素衍生物，鈷胺素衍生物載有放射性金屬。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項的鈷胺素衍生物，鈷胺素衍生物為式(I)的化合物 其中Rb、Rc、Rd和Re彼此獨(dú)立地為間隔基-螯合劑基團(tuán)、抗生素或抗增殖的治療劑、具有4到20個碳原子有空間要求的有機(jī)基團(tuán)或氫；RR是間隔基-螯合劑基團(tuán)或抗生素或抗增殖的治療劑，其每一個均通過連接基團(tuán)Z連接，或氫；條件是，殘基Rb、Rc、Rd、Re和RR中至少三個是氫，且殘基Rb、Rc、Rd和Re中至少一個不是氫；X是單齒配體；以及中央的鈷(Co)原子任選是放射性同位素的形式。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的鈷胺素衍生物，其中Re為氫。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8的鈷胺素衍生物，其中間隔基-螯合劑基團(tuán)包含間隔基，其是2到10個碳原子的脂族鏈，其中一個或兩個碳原子可以被氮和/或氧原子替代，并且該脂族鏈可以被羥基、氧代基或氨基取代，和螯合劑，其是具有兩個、三個或更多個選自氮、氧和硫的供電子原子的化合物，其具有能結(jié)合金屬原子的間距，和任選的金屬原子。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的鈷胺素衍生物，其中所述螯合劑選式(II)至式(IX)的螯合劑， 其中，羧基可以作為酯存在。
11.根據(jù)權(quán)利要求6至10中任一項的鈷胺素衍生物，其中放射性金屬為94mTC、99mTc、188Re、186Re、111In、90Y、64Cu、67Cu或177Lu。
12.根據(jù)權(quán)利要求7至11中任一項的鈷胺素衍生物，其中X為氰基、甲基、羥基、水合基團(tuán)或5′-脫氧腺苷基。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的鈷胺素衍生物，其中X為氰基。
14.根據(jù)權(quán)利要求7至12中任一項的鈷胺素衍生物，其中中央的鈷原子為放射性同位素57Co或60Co。
15.根據(jù)權(quán)利要求10的鈷胺素衍生物，其中Rb為任選地載有金屬原子的間隔基-螯合劑基團(tuán)，間隔基為2至4個碳原子的脂族鏈，并且螯合劑為式(II)的螯合劑，其中基團(tuán)COOH任選地為酯形式；Rc、Rd、Re和RR為氫；且X為氰基。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的鈷胺素衍生物，其中Rb為任選地載有金屬原子的間隔基-螯合劑基團(tuán)，間隔基為4個碳原子的脂族鏈，并且螯合劑為式(II)的螯合劑，其中基團(tuán)COOH任選地為乙基酯形式；Rc、Rd、Re和RR為氫；且X為氰基。
17.根據(jù)權(quán)利要求10的鈷胺素衍生物，其中Rd為任選地載有金屬原子的間隔基-螯合劑基團(tuán)，間隔基為3個碳原子的脂族鏈，并且螯合劑為式(II)的螯合劑，其中基團(tuán)COOH任選地為酯形式；Rb、Rc、Re和RR為氫；且X為氰基。
18.根據(jù)權(quán)利要求10的鈷胺素衍生物，其中Rb為任選地載有金屬原子的間隔基-螯合劑基團(tuán)，間隔基為2個碳原子的脂族鏈，并且螯合劑為式(III)的螯合劑；Rc、Rd、Re和RR為氫；且X為氰基。
19.藥物組合物，所述組合物包含根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項的鈷胺素衍生物。
20.診斷哺乳動物中腫瘤性疾病或微生物感染的方法，包括(a)給疑似遭受腫瘤性疾病或感染的哺乳動物供給不含維生素B12的飲食一段時間，和(b)隨后供給載有診斷劑的權(quán)利要求1至18中任一項的鈷胺素衍生物。
21.治療患有腫瘤性疾病或微生物感染的哺乳動物的方法，包括(a)給需要治療的哺乳動物供給不含維生素B12的飲食一段時間，和(b)隨后供給載有治療劑的權(quán)利要求1至18中任一項的鈷胺素衍生物。
22.根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項的鈷胺素衍生物在診斷腫瘤性疾病或微生物感染的方法中或在治療患有腫瘤性疾病或微生物感染的哺乳動物的方法中的用途。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的用途，其是用于癌癥成像。
24.根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項的鈷胺素衍生物在制備用于在診斷腫瘤性疾病或微生物感染的方法中或在治療患有腫瘤性疾病或微生物感染的哺乳動物的方法中使用的藥物組合物中的用途。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的用途，其中所述用途是鈷胺素衍生物在制備用于癌癥成像的藥物組合物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及鈷胺素衍生物，所述衍生物(a)與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白鈷胺傳遞蛋白II(TCII)沒有結(jié)合親合力或具有低的結(jié)合親合力，以及(b)保留作為維生素B12替代物的活性，任選地載有治療劑和/或診斷劑，例如放射性金屬。與在腫瘤組織中的積聚速度相比，這些化合物在血液和良性器官例如腎和肝中具有低很多的積聚速率，并能從血液中更迅速地清除。本發(fā)明還涉及在哺乳動物中診斷和治療腫瘤性疾病或微生物感染的方法，包含(a)給哺乳動物供給不含維生素B12的飲食一段時間，以及(b)隨后供給載有診斷劑和/或治療劑的本發(fā)明鈷胺素衍生物。通過選擇起維生素B12替代物作用的鈷胺素衍生物，能大大降低在腫瘤組織中形成耐藥子代的危險性。
文檔編號A61P35/00GK1902214SQ200480038278
公開日2007年1月24日 申請日期2004年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月22日
發(fā)明者H·－J·特賴希勒, R·阿爾伯托, R·維貝爾, M·T·屈恩茨, J·呂施, S·蒙維勒, D·R·范施塔夫倫 申請人:索里達(dá)哥股份有限公司, 蘇黎世大學(xué), 保羅·謝勒學(xué)院