專利名稱：羅可嘌呤用于治療淋巴細胞白血病的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及化合物2-[(1-乙基-2-羥乙基)氨基]-6-芐胺-9-異丙基嘌呤(羅可嘌呤，Roscovitine)和其可藥用鹽的治療用途。
背景技術：
細胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)是在細胞周期中起重要調(diào)節(jié)作用的絲氨酸/蘇氨酸激酶。CDKs通過DNA復制和細胞分裂的相關的多種蛋白質(zhì)的磷酸化調(diào)節(jié)細胞周期進程，所述蛋白包括轉(zhuǎn)錄因子和腫瘤抑制蛋白5。一些CDKs也通過它們與RNA聚合酶II(pol II)的大亞基的羧基末端區(qū)域(CTD)的磷酸化相關在RNA合成的調(diào)節(jié)中起作用。因此CDKs成為有吸引力的治療靶并不奇怪。因此，能通過競爭它們的ATP結合位點干擾CDKs的活性的多種新藥物目前正在進行臨床試驗6。
現(xiàn)有技術已經(jīng)描述了能通過抑制細胞周期蛋白依賴性激酶調(diào)節(jié)細胞周期的幾個化合物。這些化合物包括丁內(nèi)酯、flavopiridol和2-(2-羥乙基氨基)-6-芐基氨基-9-甲基嘌呤(奧羅莫星)。奧羅莫星和相關的化合物已經(jīng)被證明是cdc2的抑制劑。Cdc2(亦稱Cdk1)是與細胞周期調(diào)節(jié)相關的細胞周期蛋白依賴性激酶的催化亞基。
這些激酶包括至少兩個亞基，即催化亞基(其中cdc2是原型)和調(diào)節(jié)亞基(細胞周期蛋白)。通過與下述細胞周期蛋白家族的成員短時間的結合調(diào)節(jié)Cdks細胞周期蛋白A(cdc2、CDK2)、細胞周期蛋白B1-B3(cdc2)、細胞周期蛋白C(CDK8)、細胞周期蛋白D1-D3(CDK2-CDK4-CDK5-CDK6)、細胞周期蛋白E(CDK2)、細胞周期蛋白H(CDK7)。
這些復合物中的每一個與細胞周期的階段有關。CDK活性被翻譯后修飾、與其它的蛋白質(zhì)短時間的結合和它們的細胞內(nèi)定位修飾調(diào)節(jié)。CDK調(diào)節(jié)物包括活化劑(細胞周期蛋白、CDK7/細胞周期蛋白H、cdc25磷酸酶)、p9CKS和p15CDK-BP亞基以及抑制蛋白(p16INK4A、p15INK4B、p21Cip1、p18、p27Kip1)。
目前有相當多的文獻支持CDKs及其調(diào)節(jié)蛋白在人腫瘤發(fā)展過程中起重要作用的假設。因此，在許多的腫瘤中已經(jīng)觀察到細胞周期蛋白依賴性激酶的暫時的異常表達和蛋白抑制劑的主要失調(diào)(突變、缺失)。
羅可嘌呤已經(jīng)證明是有效的細胞周期蛋白依賴性激酶，尤其是CDK2的抑制劑。CDK抑制劑被認為是阻滯細胞從細胞周期的G1/S和G2/M期的傳代。最近，羅可嘌呤的純化的R-對映異構體，CYC202(R-羅可嘌呤)在多種的腫瘤細胞中表現(xiàn)為凋亡的有效的誘導劑7并已經(jīng)在臨床試驗中治療乳癌和非小細胞肺癌6。羅可嘌呤也已經(jīng)顯示成視網(wǎng)膜母細胞瘤磷酸化作用的抑制劑并因此提示對Rb陽性的腫瘤更有效。
目前觀察到羅可嘌呤在一些至今尤其難以治療的增生疾病治療中具有治療的應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一方面涉及羅可嘌呤或其可藥用鹽在制備用于治療慢性淋巴細胞白血病藥物中的用途。
本發(fā)明的第二方面涉及治療患有慢性淋巴細胞白血病患者的方法，該方法包括給藥治療有效量的羅可嘌呤或其藥學上有效的鹽。
本發(fā)明的第三方面涉及在慢性淋巴細胞白血病細胞中下調(diào)抗凋亡基因表達的方法，該方法包括使細胞接觸羅可嘌呤或其可藥用鹽。
本發(fā)明的第四方面涉及治療患者的慢性淋巴細胞白血病的方法，該方法包括以足夠下調(diào)患者中抗凋亡基因的表達的量給藥羅可嘌呤或其可藥用鹽于患者。
本發(fā)明的第五方面涉及下調(diào)慢性淋巴細胞白血病細胞中DNA修復基因的表達的方法，該方法包括使細胞接觸羅可嘌呤或其可藥用鹽。
本發(fā)明的第六方面涉及治療患者中慢性淋巴細胞白血病的方法，該方法包括以足夠下調(diào)患者的DNA修復基因的表達的量給藥羅可嘌呤或其可藥用鹽于患者。
本發(fā)明的第七方面涉及下調(diào)慢性淋巴細胞白血病細胞中與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關的基因的表達的方法，該方法包括使細胞接觸羅可嘌呤或其可藥用鹽。
本發(fā)明的第八方面涉及治療患者中慢性淋巴細胞白血病的方法，該方法包括以足夠下調(diào)患者的與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關的基因的表達的量給藥羅可嘌呤或其可藥用鹽于患者。
本發(fā)明的第九方面涉及用于慢性淋巴細胞白血病治療的藥物組合物，該組合物包括(i)羅可嘌呤或其可藥用鹽；和任選(ii)可藥用的載體、稀釋劑或賦形劑。
發(fā)明詳述如上所述，本發(fā)明涉及羅可嘌呤在慢性淋巴細胞白血病(CLL)的治療中的用途。
羅可嘌呤(Roscovitine)或2-[(1-乙基-2-羥乙基)氨基]-6-芐胺-9-異丙基嘌呤，也被描述為2-(1-D，L-羥甲基丙基氨基)-6-芐胺-9-異丙基-嘌呤。如在此所用，術語“羅可嘌呤”包括已拆分的R和S對映異構體、其混合物及其消旋體。
如在此所用，術語“CYC202”指羅可嘌呤的R對映異構體，即2-(1-R-羥基甲基丙基氨基)-6-芐基氨基-9-異丙基嘌呤，結構顯示如下。

羅可嘌呤的體內(nèi)活性如下

盡管在本領域中已知羅可嘌呤作為抗增殖劑的用途，但至今沒有提示它可能在CLL的治療中有效，已知CLL尤其難以治療并且常常耐受常規(guī)治療。
治療活性對于本發(fā)明的所有的實施方案，優(yōu)選羅可嘌呤為R對映異構體的形式，即2-(1-R-羥基甲基丙基氨基)-6-芐基氨基-9-異丙基-嘌呤，以下簡稱“CYC202”。
慢性淋巴細胞白血病(CLL)慢性淋巴細胞白血病(CLL)是一組不同種類的疾病，特征在于B細胞和T細胞不同的成熟狀態(tài)，其與病癥侵占性相關。該病癥特征在于免疫不成熟的和功能不全的小淋巴細胞的克隆增殖。CLL通常區(qū)分為單獨的種類，包括典型的和混合型的B細胞慢性淋巴細胞白血病、B細胞和T細胞幼稚淋巴細胞白血病、多毛細胞白血病和多毛細胞變體、循環(huán)絨毛淋巴細胞的脾淋巴瘤(splenic lymphoma with circulating villous lymphocytes)、大顆粒淋巴細胞白血病、成人T-細胞白血病/淋巴瘤綜合癥和B細胞和T細胞類型的惡性淋巴瘤的白血病階段。
CLL的治療通常是個體化的。對具有無痛性疾病的年長的患者不需要特別療法。然而，患有更晚期疾病或患有更快速病程的疾病其它的患者可能有小于兩年的半數(shù)存活期。因此，應該尋求一些治療。大部分患者具有居中的預后，并且盡管他們幾年不治療改善相當好，最終他們將需要某種治療形式。
至今，CLL的典型的治療包括化療劑苯丁酸氮芥的給藥。聯(lián)合化療通常僅用于晚期病例。放療已經(jīng)有效地使用，尤其如果出現(xiàn)脾的擴大并且較年輕的患者的骨髓移植已經(jīng)成功[Foon等，Leukemia 6(Supp.4)26-32，1992]。美國專利5,455,280提出使用治療有效量的β-胡蘿卜素治療CLL的方法。近年來，核苷氟達拉濱、氟代腺嘌呤類似物及2-氯脫氧腺苷、脫氧腺苷類似物已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)是有效的。兩種類似物都抗脫氨基作用[Keating等，Leukemia 6(Supp.4)140-141，1992]。所有這些治療集中在惡性細胞的消除(在移植情況下，置換)。然而，CLL仍然是尤其難以治療的病癥。
B細胞慢性淋巴細胞白血病(B-CLL)在一種最優(yōu)方案中，本發(fā)明涉及羅可嘌呤或其可藥用鹽在治療B細胞慢性淋巴細胞白血病中的用途。
B細胞慢性淋巴細胞白血病(B-CLL)在西方世界是最常見的白血病并且至今是不可治愈的。病程是易變的，在常見的DNA損傷-應答途徑中起作用的ATM或者TP53基因的突變導致一部分B-CLL腫瘤具有不良的臨床后果。
B-CLL特征在于B-淋巴細胞增殖和蓄積，該B-淋巴細胞呈現(xiàn)形態(tài)學上成熟但生物學上不成熟。BCLL是典型地無痛的腫瘤并且可預期存活多年。B-CLL典型地發(fā)生在年齡超過50歲的人。在西方國家該病癥占白血病的30％，僅在美國每年有10,000例被診斷的新病例。
B-CLL細胞的特征表型包括該疾病的特征標記物CD5的表達，以及至少一個其它的B-cell標記物(CD19、CD20或CD23)和表面免疫球蛋白的低表達1，其在器官上的浸潤導致淋巴結腫大和肝脾腫大。在該疾病的晚期，異常淋巴細胞的骨髓占位導致骨髓衰竭，導致貧血和血小板減少。
CLL的B細胞具有小鼠紅細胞的受體，一種不成熟的B細胞的標記物。在有抑制性T細胞數(shù)增加的病癥中已經(jīng)報道了增加的T細胞數(shù)。典型地，輔助/抑制性T細胞的比例的轉(zhuǎn)化導致增加的抑制性T細胞和減少的輔助性T細胞。自然殺傷細胞的絕對數(shù)也可被增加。除了提供患有B-CLL的患者的臨床資料外，染色體分析提供關于全部存活者的預后信息。
疾病的臨床病程顯著地變化，一些患者在持續(xù)期保持穩(wěn)定的狀態(tài)而在其他患者進展更加迅速。用于B-CLL的標準療法包括苯丁酸氮芥以及近來的嘌呤類似物氟達拉濱。然而，在給與氟達拉濱后，觀察不到全體存活的明顯增加，并幾乎在所有的氟達拉濱治療的患者上最終發(fā)生復發(fā)2。
在本發(fā)明的優(yōu)選方案中，羅可嘌呤對B-CLL細胞的選擇性細胞毒效應超過正常淋巴細胞。
本申請人的研究已揭示用同樣濃度的CYC202處理的正常的淋巴細胞也對藥物的細胞毒效應敏感。然而，這些細胞顯示時間上亦被延遲的更低的細胞毒的應答。因此，與正常B細胞相比，CYC202顯示對B CLL細胞的選擇性細胞毒性。假設在與CYC202培養(yǎng)最少6小時的后能誘導B-CLL細胞的凋亡，體內(nèi)給藥CYC202的劑量和間隔處理還可區(qū)別B-CLL細胞和正常淋巴細胞間的應答。實際上，支持該意見，CYC202的低毒性已經(jīng)在臨床中已經(jīng)被報道7。
T細胞慢性淋巴細胞白血病在另一個優(yōu)選方案中，發(fā)明涉及羅可嘌呤或其可藥用鹽在T細胞慢性淋巴細胞白血病的治療中的用途。
T細胞慢性淋巴細胞白血病(T-CLL)包括CLL的所有病例的小于5％并由兩種實體組成。一種具有免疫表型CD3+、CD4-、CD8+、HNK-1T并被稱為大顆粒狀淋巴細胞增生。T-CLL的第二種形式具有表型CD3+、CD4+、CD8-[Pathology，第二版，Emanual Rubin，John L.Farber，p1067]。
在大顆粒淋巴細胞增生中，贅生性細胞是大的并具有適量的含有豐富的嗜苯胺藍性的顆粒的細胞質(zhì)。這些淋巴細胞被認為與自然殺傷(NK)細胞群相關。在85％的病例中，大顆粒的淋巴細胞增生是無痛和慢性的病癥，而小的未成熟的則具有侵占性的臨床病癥。疾病的表征為持續(xù)增加循環(huán)大顆粒淋巴細胞、脾大和中性白細胞減少(繼發(fā)反復感染)并經(jīng)常地與風濕性關節(jié)炎有關。
CD4+T-CLL常見于年輕的成年人，并且特征在于顯著地提高的外周血液淋巴細胞計數(shù)。盡管核輪廓有時是不規(guī)則的或腦回狀的，腫瘤的輔助T細胞形態(tài)上與B-CLL淋巴細胞不能區(qū)別。皮膚累及是常見的(皮膚趨向性(dermato tropism))，并且通常有突出的肝脾腫大。骨髓和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的浸潤是特征要素。CD4+T-CLL是侵占性的，并且平均存活僅僅1年。
幼稚淋巴細胞白血病在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及羅可嘌呤或其可藥用鹽在治療幼稚淋巴細胞白血病中的用途。
在80％的病例中，幼稚淋巴細胞白血病是B-CLL的特殊的變異體并且在20％的病例中是T-CLL的變異體。腫瘤的B幼稚淋巴細胞比B-CLL細胞表達更豐富的表面膜免疫球蛋白并且似乎是免疫不成熟的。幼稚淋巴細胞白血病的臨床表征是粗大的脾和白細胞計數(shù)的顯著升高(大于50％幼稚淋巴細胞)。
淋巴結病在B細胞幼稚淋巴細胞白血病中是不顯著的，而常常在T細胞變種中觀察到中度淋巴結病。幼稚淋巴細胞白血病在年長男性中最常見(4∶1男性優(yōu)勢)。它是侵占性的疾病，平均存活2至3年[Pathology，第二版，Emanual Rubin，John L Farber，p1067]。
T細胞幼稚淋巴細胞白血病(T-PLL)在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及羅可嘌呤或其可藥用鹽在治療T細胞幼稚淋巴細胞白血病(T-PLL)中的用途。
T-PLL是影響成熟T細胞的罕見的慢性的淋巴增生的病癥。該疾病發(fā)生在老年，典型地在七十或八十歲并且具有輕微的男性優(yōu)勢。盡管患者顯示如B-PLL的類似的最初癥狀，T-PLL目前被認為是有不同的臨床的和實驗室特征的自成一類的惡性腫瘤，表征為起病隱襲并且結果不良。T-PLL僅為成熟B和T細胞白血病的3％，但是約為幼稚淋巴細胞白血病的20％。在20％的T-PLL的病例中細胞是小的且有不顯著的核，其僅通過電子顯微鏡確定。這些病例已經(jīng)被認為是T-PLL小細胞變種。
T-幼稚淋巴細胞具有成熟胸腺后(post thymic)淋巴細胞的表型CDla-、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶-TdT-、CD2+、CD3+、CD5+、CD7+。關于CD4和CDS表達，最常見的表型是CD4+/CD8-。在25％的病例中發(fā)現(xiàn)CD4和CD8(雙陽性表型)的共表達。
該疾病是侵占性的并且進展迅速。臨床實驗表明在T-PLL治療中的有效治療劑的數(shù)目是有限的。存活率從7個月(對于未經(jīng)治療患者)到17.5個月(適應治療患者)不等。至今，治療集中于如苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、多柔比星和長春新堿的藥劑的給藥，其引起部分的成功。盡管用2-脫氧柯福霉素和和CD52抗體(campath-1H)已經(jīng)觀察一些成功，該治療仍是臨床問題并且有待發(fā)現(xiàn)更有效治療方法。
CDK的抑制在一個優(yōu)選方案中，以足夠抑制至少一種CDK酶的量給藥羅可嘌呤。
優(yōu)選地，CDK酶選自CDK1、CDK2、CDK4、CDK7和CDK9。
在一個尤其優(yōu)選的實施方案中，CDK酶是CDK2。
在另一個尤其優(yōu)選的實施方案中，CDK酶選自CDK7和CDK9。
ATM突變型和TP53突變型腫瘤先前的研究表明由于p53途徑的缺陷，高達30％的B-CLL腫瘤具有不良的臨床的結果，該p53途徑涉及由于ATM基因或者TP53基因突變導致的DNA損傷后凋亡的誘導3，4，22。這種突變顯著地導致耐藥性，因為最常見的抗癌治療通過p53依賴性凋亡通路的活化發(fā)揮它們的效應3，4，22。因此，對能繞過該關鍵的遺傳缺陷的治療明顯感興趣，即迫切需要抗ATM和TP53突變型的B-CLL腫瘤的新的治療。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，慢性淋巴細胞白血病與ATM突變型相關。
更優(yōu)選地，慢性淋巴細胞白血病是與突變型ATM相關的B-CLL。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的方案中，慢性淋巴細胞白血病與突變型TP53相關。
更優(yōu)選地，慢性淋巴細胞白血病是與突變型TP53相關的B-CLL。
本申請人的研究探討了CYC202抗包括ATM和TP53突變型腫瘤亞型的總26個B-CLLs的體內(nèi)活性。結果與電離輻照(IR)和氟達拉濱誘導的細胞毒活性具有可比性。
將B-CLL細胞用5μg/ml以及以上濃度的CYC202處理并且不管ATM或TP53基因的狀態(tài)如何，在處理的24小時內(nèi)顯示高水平的凋亡。因此，令人驚訝地，ATM突變型、TP53和野生型B-CLL腫瘤對CYC202的應答是相當?shù)摹?br> 這與氟達拉濱的處理相反，其中應答被延遲并且顯著地下降，并且包括一部分似乎非應答的ATM突變型腫瘤，即提示顯著地體內(nèi)抗氟達拉濱誘導的凋亡。結果也與IR誘導的凋亡相反，其中ATM和TP53突變型都顯示明顯的細胞的殺傷缺陷8。因此CYC202在24小時內(nèi)外在B CLL腫瘤細胞樣品中能有效地誘導凋亡，不管p53途徑是否完整。
作用方式在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，羅可嘌呤下調(diào)抗凋亡基因的表達。
優(yōu)選地，抗凋亡基因包括至少一種選自Mcl-1、Bcl-2和Mad3的基因。
在另一個本發(fā)明的優(yōu)選方案中，羅可嘌呤下調(diào)DNA修復基因的表達。
優(yōu)選地，DNA修復基因包括PCNA或XPA。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，羅可嘌呤下調(diào)與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關的基因的表達。
優(yōu)選地，與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關的基因包括至少一個選自Pol II、eIF-2，4e和E2F的基因。
在本發(fā)明的一個具體優(yōu)選實施方案中，羅可嘌呤或其可藥用鹽的量足夠下調(diào)Mcl-1表達。
本發(fā)明的一個方面涉及在B細胞慢性淋巴細胞白血病細胞中下調(diào)Mcl-1基因表達的方法，所述方法包括用羅可嘌呤或其可藥用鹽接觸所述細胞。
本發(fā)明的另一個方面涉及治療對象的B細胞慢性淋巴細胞白血病的方法，所述方法包括以足夠下調(diào)所述對象的Mcl-1的表達的量給藥羅可嘌呤或其可藥用鹽至所述患者。
本發(fā)明的另一個方面涉及羅可嘌呤或其可藥用鹽在制備用于的治療B細胞慢性淋巴細胞白血病的藥物中的用途，其中羅可嘌呤或其可藥用鹽的量足夠下調(diào)所述患者的Mcl-1的表達。
本申請人的研究證明在至少24小時，CYC202在B-CLL細胞上效應優(yōu)于氟達拉濱誘導的效應并且是更顯著的。氟達拉濱被認為通過DNA損傷誘導p53的上調(diào)并活化p53的途徑誘導細胞死亡。然而，在本研究中p53突變B-CLL腫瘤體外對氟達拉濱敏感的事實支持氟達拉濱能顯示非p53依賴的殺傷(killing)的觀點。實際上，Pettitt等15報告了在有p53功能障礙的B-CLLs中對氟達拉濱的應答。此外，可能一些氟達拉濱作用機理是ATM依賴性的，因為發(fā)現(xiàn)體外耐氟達拉濱的6種腫瘤中的4種在是ATM突變型。與此相反，CYC202顯示對ATM和TP53突變型B-CLL腫瘤都有強大的殺傷效應，意味殺傷機制不依賴ATM和p53功能。
以前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CYC202對CDK2-細胞周期蛋白E顯示有效的抑制效果，該蛋白是細胞傳代至S期所需的7。然而，B-CLL細胞的基本上非循環(huán)性質(zhì)明顯提示該藥物活性的另外的機理。本申請人的研究發(fā)現(xiàn)應答于CYC202的處理多種基因下調(diào)，所述基因包括轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)相關基因(RNA pol II、RNA pol III)、抗凋亡蛋白(Mcl-1、Bcl-2)以及DNA修復蛋白(XPA)。因此，轉(zhuǎn)錄的下調(diào)形成CYC202殺傷B-CLL的可能機制。
在轉(zhuǎn)綠期間，PTEF-b(CDK9/細胞周期蛋白T1)和TFIIH(CDK7/細胞周期蛋白H)在包括絲氨酸2的特異的目標殘基上16磷酸化RNA聚合酶II的碳末端域(CTD)，并且該磷酸化作用發(fā)生在開始轉(zhuǎn)錄延伸前17。已經(jīng)提示抑制CDK9和CDK7激酶以及RNA pol II CTD的磷酸化作用的藥物充當轉(zhuǎn)錄阻抑物18。和CYC202的作為轉(zhuǎn)錄阻遏物的作用一致，在該藥物處理的B-CLL細胞中觀察到RNA pol II的絲氨酸2磷酸化作用的迅速減少。此外，發(fā)現(xiàn)該修飾與所有轉(zhuǎn)錄下調(diào)一起先于所有B-CLL腫瘤細胞中凋亡的誘導。
CYC202介導的減少的轉(zhuǎn)錄的一個結果包括Bcl-2家族成員即Mcl-1的下調(diào)。本申請人的研究發(fā)現(xiàn)Mcl-1而不是Bcl-2蛋白的水平降低與CYC202處理后凋亡的啟動一致。此外，CYC202-誘導的Mcl-1的消失剛好在胱冬酶-3和-7活化之前，提示Mcl-1下調(diào)可能為在B-CLL細胞經(jīng)線粒體途徑誘導凋亡的重要事件。因此，聯(lián)系在一起，B-CLL細胞用CYC202培養(yǎng)后的事件的可能順序可包括a)通過下調(diào)RNA pol II磷酸化作用和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄抑制，b)短壽命蛋白如Mcl-1和或者其它的前存活因子(pro-survivalfactor)的消失，c)線粒體的活化和細胞色素C釋放，d)效應器胱冬酶的活化和凋亡的啟動。
總之，以前已經(jīng)表明ATM和TP53-突變的B-CLL腫瘤與通常比較不良的預后以及體外DNA損傷誘導的凋亡缺乏有關，后者在TP53突變型腫瘤的情況下，似乎是凋亡信號的減少以及損傷誘導的前存活應答增加二者的結果8。此處描述的本研究表明CYC202是包括有ATM或TP53突變型的B-CLL細胞中有效的凋亡誘導劑，并作為轉(zhuǎn)錄的阻遏物和存活信號。此外，B-CLL細胞上的全基因表達分析顯示轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)和凋亡抑制以及DNA修復的相關基因顯著的下調(diào)。此外，在誘導凋亡以前，CYC202在RNA和蛋白水平上都導致RNA聚合酶II磷酸化作用的抑制并導致前存活因子Mcl-1的迅速消失。
因此能推斷CYC202是B-CLL細胞的有效的凋亡誘導劑，無論p53途徑的功能狀態(tài)如何。由此，并根據(jù)它的低毒性，其可用作有效的治療劑以改善耐藥B-CLLs的結果并在治療進攻性的腫瘤中提供顯著的改善。
藥物組合物盡管羅可嘌呤(或其可藥用鹽、酯或可藥用的溶劑合物)能單獨給藥，對于人治療通常將其與藥物載體、賦形劑或稀釋劑混合給藥。
因此，本發(fā)明的優(yōu)選實施方案涉及羅可嘌呤與可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體結合給藥。
用于多種不同形式的此處描述的藥物組合物的這種適合的賦形劑的實施例可見“Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第二版，(1994)，由Wade和PJ Weller編輯。
用于治療用途的可接受的載體或稀釋劑在制藥領域中眾所周知，例如描述于Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro編輯，1985)。適合的載體的實例包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、甘露醇、山梨醇等等。適合的稀釋劑的實施例包括乙醇、甘油和水。
藥物載體、賦形劑或稀釋劑的選擇能根據(jù)預定給藥途徑和標準藥物實踐選擇。藥物組合物可包括如載體、賦形劑或稀釋劑任何適合的粘合劑、潤滑劑、懸浮劑、包衣劑或增溶劑作為載體、賦形劑或稀釋劑，或作為其補充。
適合的粘合劑的實例包括淀粉、明膠、天然糖如葡萄糖、無水的乳糖、自流乳糖(free-flow lactose)、β-乳糖、玉米甜味劑、天然的和合成的樹膠，如阿拉伯膠、黃耆膠或海藻酸鈉、羧甲基纖維素和聚乙二醇。
適合的潤滑劑的實例包括油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、醋酸鈉、氯化鈉等等。
在藥物組合物中可提供防腐劑、穩(wěn)定劑、著色劑和甚至調(diào)味劑。防腐劑的實例包括苯甲酸鈉、山梨酸和對-羥基苯甲酸酯?？寡趸瘎┖蛻腋┮部墒褂谩?br> 鹽/酯本發(fā)明的藥劑可以鹽或酯尤其是藥物可接受的鹽或酯的形式提供。
本發(fā)明藥劑的藥物可接受鹽包括它們合適的酸加成鹽或堿加成鹽。合適藥物鹽的綜述可見Berge等人的J.Pharm Sci，66，1-19(1977)。鹽為與例如以下酸形成的鹽強無機酸，如礦物酸，例如硫酸、磷酸或氫鹵酸；強有機羧酸，如未取代或取代(如被鹵代)的1至4個碳原子的鏈烷羧酸，例如乙酸；飽和或不飽和的二元羧酸，例如草酸、丙二酸、丁二酸、馬來酸、富馬酸、鄰苯二甲酸或四鄰苯二甲酸(tetraphthalic)；羥基羧酸，例如抗壞血酸、羥基乙酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸或檸檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或與有機磺酸，如未取代或取代(如被鹵代)的(C1-C4)烷基磺酸或芳基磺酸，如甲磺酸或?qū)妆交撬帷?br> 取決于被酯化的官能團，使用有機酸或醇/氫氧化物形成酯。有機酸包括羧酸，如未取代或取代(如被鹵代)的1至12個碳原子的鏈烷羧酸，例如乙酸；飽和或不飽和的二元羧酸，例如草酸、丙二酸、丁二酸、馬來酸、富馬酸、鄰苯二甲酸或四鄰苯二甲酸；羥基羧酸，例如抗壞血酸、羥基乙酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸或檸檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或與有機磺酸，如未取代或取代(如被鹵代)的(C1-C4)烷基磺酸或芳基磺酸，如甲磺酸或?qū)妆交撬?。合適的氫氧化物包括無機氫氧化物，如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化鋁。醇包括未取代或取代(如被鹵代)的1至12個碳原子的鏈烷醇。
對映異構體/互變異構體本發(fā)明還適當?shù)匕ㄋ巹┑娜繉τ钞悩嬻w和互變異構體。本領域的技術人員能認識到具有光學性質(zhì)(一個或多個手性碳原子)或互變異構特征的化合物?？赏ㄟ^本領域中已知的方法分離/制備相應的對映異構體和/或互變異構體。
立體異構體和幾何異構體本發(fā)明的活性成分可以立體異構體和/或幾何異構體的形式存在，例如其可具有一個或多個不對稱和/或幾何中心，并因此可以二種或多種立體異構和/或幾何形式存在。本發(fā)明包括該活性成分所有的單獨立體異構體和幾何異構體及其混合物的使用。權利要求中使用的術語包括這些形式，只要所述形式保留適當?shù)墓δ芑钚?但不必到相同程度)。
本發(fā)明還包括活性成分或其藥物可接受鹽的所有合適的同位素變體。本發(fā)明藥劑或其藥物可接受鹽的同位素變體定義為其中至少一個原子被具有相同原子序數(shù)但原子質(zhì)量與自然界中通常發(fā)現(xiàn)的原子質(zhì)量不同的原子取代的物質(zhì)?？杀粨饺氲剿巹┖推渌幬锟山邮茺}的同位素的例子包括氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，分別如2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18F和36Cl。本發(fā)明的活性成分和其藥物可接受鹽的一些同位素變體，例如結合放射性同位素如3H或14C的那些化合物，在藥物和/或底物組織分布研究中是有用的。含氚的即3H和碳-14即14C同位素因其容易制備和可檢測性而特別優(yōu)選。此外，用同位素如氘即2H的取代可因較大的代謝穩(wěn)定性而提供特定的治療益處，例如體內(nèi)半衰期增加或劑量要求降低，并因此可在一些情況下被優(yōu)選。通?？墒褂煤线m試劑的適當同位素變體通過常規(guī)過程制備本發(fā)明藥劑和其藥物可接受鹽的同位素變體。
溶劑合物本發(fā)明還包括本發(fā)明藥劑的溶劑合物形式。權利要求中使用的術語包括這些形式。
多晶型物本發(fā)明還涉及各種結晶形式、多晶型形式和無水/水合形式的本發(fā)明的藥劑。眾所周知，在藥物工業(yè)中可通過稍微改變這種化合物合成制備中所用溶劑的純化方法和或分離形式來分離得到化合物的任意這類形式。
前藥本發(fā)明還包括前體藥物形式的本發(fā)明的藥劑。這種前體藥物通常為一個或多個適當基團已被修飾以使在對人或哺乳動物對象給藥后所述的修飾可被逆轉(zhuǎn)的化合物。雖然為了實現(xiàn)體內(nèi)逆轉(zhuǎn)可與這種前體藥物一起給藥第二種藥劑，但通常通過在這類對象中天然存在的酶實現(xiàn)這種逆轉(zhuǎn)。這類修飾的例子包括酯(例如上述那些中的任一種)，其中可通過酯酶等進行逆轉(zhuǎn)。其它這類系統(tǒng)為本領域中那些技術人員所熟知。
給藥可使本發(fā)明的藥物組合物適于口服、直腸、陰道、腸胃外、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、支氣管內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、膀胱內(nèi)、鼻、口腔或舌下給藥途徑。
對于口服給藥，特別利用壓縮片劑、藥丸、片劑、凝膠(gellules)、滴劑和膠囊。優(yōu)選地，這些組合物每劑包含1-2000mg和更優(yōu)選50-1000mg的有效成分。
其它的給藥形式包括溶液或乳劑，其可靜脈注射、動脈內(nèi)注射、鞘內(nèi)注射、皮下注射、真皮內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射或肌內(nèi)注射，并且其從無菌的或滅菌溶液制備。本發(fā)明的藥物組合物也可以以栓劑、陰道栓、混懸液、乳劑、洗劑、軟膏、乳膏劑、凝膠劑、噴霧、溶液或散粉劑(dusting powders)的形式。
透皮吸收給藥的可選擇的裝置是通過使用皮膚貼劑。例如，活性成分能被包含進由聚乙二醇或液體石蠟的含水乳化液組成的乳膏劑?；钚猿煞忠材芤?-10％重量的濃度被包含到由白蠟或白色軟石蠟基質(zhì)與需要的這種穩(wěn)定劑和防腐劑組成的軟膏中。
可注射形式的每劑量可包含10-1000mg，優(yōu)選10-500mg的活性成分。
組合物可以單位劑量的形式配制，即包含單位劑量的分部分，或多次或次單位(sub-unit)的單位劑量的形式。
在尤其優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的組合或藥物組合物靜脈內(nèi)給藥。
劑量本領域的一般技術人員不經(jīng)過過度的試驗就能容易地確定給藥患者即時組合物合適的劑量。典型地，醫(yī)生將確定最適合于個體患者的實際劑量，并且將根據(jù)多種的因素包括活性劑的活性、代謝的穩(wěn)定性和藥劑的作用時間長短、年齡、體重、常規(guī)健康情況、性別、飲食、給藥方式和時間、排泄率、藥物聯(lián)用、具體的病癥的嚴重性和個體正接受的治療。施用的劑量和頻率典型地適合于患者的常規(guī)醫(yī)學病癥和引起副作用的嚴重程度，尤其是對造血、肝和腎系統(tǒng)引起的副作用。此處公開的劑量是平均病例的示范。當然能有其中較高的或較低的劑量范圍是有利的個體情況，并且這在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
根據(jù)需要，藥劑可以以0.1～30mg/kg體重或2-20mg/kg體重的劑量給藥。更優(yōu)選地藥劑可以以0.1～1mg/kg體重的劑量給藥。
如上所述，羅可嘌呤優(yōu)選以治療有效量給藥，優(yōu)選以可藥用量的形式。該量將為本領域技術人員所熟知。指導性地，羅可嘌呤典型地以大約0.05-5g/天的劑量經(jīng)口服或靜脈內(nèi)給藥，優(yōu)選大約0.5-大約5g/天或1-大約5g/天劑量給藥，并且甚至更優(yōu)選大約1-大約3g/天劑量給藥。羅可嘌呤優(yōu)選以片劑或膠囊劑形式口服給藥。羅可嘌呤的總日劑量能以單劑量給藥或或被分成分劑量，一天給藥2、3或4次。
聯(lián)合給藥在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，羅可嘌呤與一種或多種其它的抗增殖藥聯(lián)合給藥。在此情況下，本發(fā)明的化合物可與一種或多種其它的抗增殖藥劑連續(xù)地、同時地或順序地給藥。
在本領域中已知在多種藥物聯(lián)合使用時更有效。尤其，為避免主要毒性、作用機制和耐藥機制的重疊，聯(lián)合治療是理想的。此外，以它們的最大耐受量以在這些劑量之間的最小時間間隔內(nèi)給藥最多藥物也是理想的。聯(lián)用藥物的主要優(yōu)點是可通過生物化學的相互作用促進相加或可能的協(xié)同效應并也可減少耐藥性的出現(xiàn)，耐藥性將對單個藥物初始治療有其他的反應。
通過研究測試化合物聯(lián)用已知的或認為在治療具體的病癥中有用的藥劑的活性可得到有益的聯(lián)合。該步驟也可以用來確定藥劑的給藥順序，即在遞送之前、同時或之后。
本發(fā)明進一步地以實施例的方式說明，并參考下列圖。附圖的詳細說明可見實施例部分。


圖1顯示TPLL-1細胞(A)的CD8+/CD4+雙陽性免疫表型和HLA-B27的直方圖(B)。
圖2顯示顯示比較基因組雜交(CGH)。腫瘤DNA的雜交用FITC檢測并且參比DNA雜交用TRITC檢測。
圖3顯示TPLL-1細胞中的c-myc的熒光原位雜交(FISH)分析。
圖4顯示通過雙色FISH檢測c-myc的3個拷貝。
圖5表明用羅可嘌呤(CYC-202)培養(yǎng)5小時導致96％的TPLL-細胞凋亡，其不被佛波醇酯(10nM TPA)抑制。
圖6顯示用10μM羅可嘌呤培養(yǎng)18小時的結果。
圖7顯示檢測TPLL-1細胞的細胞周期蛋白A、B1、D1和E表達的結果。
圖8顯示TPLL-1細胞中凋亡抑制因子Bcl-2的表達。
圖9顯示10μM羅可嘌呤對TPLL-1細胞內(nèi)應激信號途徑的影響。
圖10顯示用對于PI-3K-依賴方式的磷酸化的Akt/PKB(Ser-473)和Raf-1(Ser-338)位點的特異抗體免疫印跡的結果。
圖11顯示在未處理、放射或藥物作用下的B-CLL腫瘤細胞隨時間的存活力。a)B-CLL腫瘤對CYC202的劑量-效應，用以下活細胞百分比表示26個不經(jīng)處理的腫瘤樣品的26個，26個用1μg/ml的CYC202處理的腫瘤樣品中的24個，26個用2.5μg/ml的CYC202處理的腫瘤樣品中的19個以及26個用5μg/ml的CYC202處理腫瘤樣品中的26個。細胞存活力和凋亡通過膜聯(lián)蛋白V檢測來測定；b)至d)通過基因型分類的B-CLLsb)15個ATM野生型腫瘤樣品沒有處理或用5戈瑞的放射線、20μM的氟達拉濱或5μg/ml的CYC202處理。通過如a)中的膜聯(lián)蛋白V檢測進行細胞分析；c)7個ATM突變型的腫瘤樣品；d)4個TP53-突變型腫瘤樣品。細胞存活力和凋亡通過膜聯(lián)蛋白V檢測來測定。
圖12顯示a)當暴露于5μg/ml的CYC202、20μM的氟達拉濱、5戈瑞輻照、或沒有處理24小時，B-CLL細胞(所有亞型合并)存活力的百分比下降的比較；b)當暴露于5μg/ml的CYC202、20μM的氟達拉濱、5戈瑞或沒有處理的B-CLL細胞亞型存活力的減少。
圖13顯示a)用5μg/ml的CYC202培養(yǎng)對正常B細胞(實線)以及B-CLL細胞(虛線)存活力的影響，在24、48和72小時用膜聯(lián)蛋白V檢測；和b)正常細胞以及B-CLL細胞對CYC202(5μg/ml)的體外反應。在正常外周B細胞中，存活力的喪失是不太顯著的，并且與B-CLL細胞的超過80％相比，在用CYC202處理后凋亡的增加少于60％。
圖14顯示用5μg/ml的CYC202培養(yǎng)的B-CLL細胞對a)p53和p21蛋白表達和b)PARP1、胱冬酶原3(procaspase-3)和胱冬酶原7裂解的影響。ATM野生型細胞處理0、1、2、3、4、5、6和24小時，ATM突變型細胞處理0、2、10和18小時以及TP53突變型細胞處理0、2、4、6、8、10和24小時并提取蛋白并通過蛋白印跡對p53和和p21表達進行分析。肌動蛋白用作上樣對照。
圖15顯示a)微陣列分析顯示，與相同未處理的瘤相比，用5μg/ml的CYC202處理4小時后的5個B-CLL瘤中典型的基因下調(diào)；b)在所有3種B-CLL亞型中通過蛋白印跡證實二個抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-2的表達降低；c)在培養(yǎng)達24小時的ATM野生型B-CLL細胞中沒有Mcl-1的下調(diào)和PARP1的裂解；d)通過蛋白印跡證實B-CLL細胞中PCNA的表達降低；e)用CYC202處理前后的B-CLLs的微陣列分析。
圖16顯示a)用對RNA pol II的絲氨酸2的磷酸特異抗體的蛋白印跡所示，CYC202處理后2個ATM野生型B-CLL腫瘤樣品的RNA pol II的磷酸化下調(diào)；b)CYC202處理24小時后總RNA pol II蛋白水平下調(diào)。
實施例除非另外定義，在此所用的所有技術和科學術語具有如本領域(例如，細胞培養(yǎng)、分子遺傳學、核酸化學、雜交技術和生物化學)普通技術人員理解的相同意義。使用分子、遺傳和生化法的標準技術。一般性參見，Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版(1989)Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.和Ausubel等，ShortProtocols in Molecular Biology(1999)第4版，John Wiley&Sons，Inc.；以及Guthrie等，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods inEnzymology，Vol.194，Academic Press，Inc.，(1991)，PCR ProtocolsA Guide toMethods and Applications(Innis，等1990.Academic Press，San Diego，Calif.)，McPherson等，PCR Volume1，Oxford University Press，(1991)，Culture ofAnimal CellsA Manual of Basic Technique，第2版(R.1.Freshney.1987.Liss，Inc.New York，N.Y.)，以及Gene Transfer and Expression Protocols，pp.109-128，E.J.Murray編輯，The Humana PressInc.，Clifton，N.J.)。這些文獻作為參考在此引入。
羅可嘌呤的制備根據(jù)在EP0874847B(CNRS)中公開的方法制備CYC202。
實施例1羅可嘌呤對B-CLL細胞的體外活性進行實驗以證明羅可嘌呤能克服B細胞慢性淋巴細胞白血病中的p53-依賴性凋亡途徑的缺陷。B-CLL仍然是不可醫(yī)治的并急迫需要有新的治療。目前大多數(shù)抗癌治療通過激活p53-依賴性凋亡途徑發(fā)揮其作用。然而，5-10％的B-CLL瘤顯示TP53基因的突變，還有20-25％在ATM基因上突變。ATM通過DNA雙鏈斷裂活化并且通過磷酸化活化p53。TP53或ATM基因突變導致?lián)p害的p53-依賴性凋亡并且與不良臨床結果有關。檢測了羅可嘌呤對B-CLL細胞的的體外活性。研究顯示羅可嘌呤抑制細胞周期調(diào)節(jié)性CDK1和CDK2以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)性CDK7和CDK9。它引起多種實體腫瘤細胞系凋亡，作為單個藥劑以及與化療聯(lián)用誘導異種移植中腫瘤的衰退。癌癥患者的I-II期臨床研究正在進行。
8名患者為ATM突變型(7個無ATM蛋白表達，1個為殘余蛋白(residualprotein))并且10名為ATM/TP53野生型。羅可嘌呤以1-25微克/ml劑量使用。膜聯(lián)蛋白V分析[膜聯(lián)蛋白V/碘化丙錠染色試劑盒，Becton DickinsonBiosciences，USA]顯示治療8小時內(nèi)發(fā)生的凋亡的最初跡象。不管ATM的狀態(tài)如何，經(jīng)16小時，存活力顯著降低并且處于早期凋亡的B-CLL細胞比例增加非常明顯。所有患者的細胞顯示活力下降至少75％。沒有觀察到高于5微克/ml的劑量依賴性，因為羅可嘌呤在此濃度的作用已經(jīng)顯著。雖然ATM突變型和野生型腫瘤對輻照應答顯示出明顯的差異，但他們顯示對羅可嘌呤相等的應答。24小時后正常淋巴細胞對5微克/ml羅可嘌呤應答顯示出延遲和降低的毒性。
為研究羅可嘌呤的作用機制，對幾個凋亡相關蛋白進行蛋白質(zhì)印跡分析[Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版(1989)ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.以及Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology(1999)第4版，John Wiley&Sons，Inc.]。在用5微克/ml的羅可嘌呤治療細胞后，抗凋亡蛋白Mcl-1下調(diào)[J.Biol.Chem.，2741801-1813，1999；J.Cell Biol.，128(6)1173-1187，1995；Proc.Nat.Acad.Sci.USA，903516-3520，1993]。凋亡標示物PARP的斷裂在治療2小時后出現(xiàn)[FASEB Journal 10587-597，1996；Science，2671456-1462，1995；Biochim.Biophys.Acta，950147-160，1988；J.Biol.Chem，271(9)4961-4965，1996；Nature，371346-347，1994]。有趣地，PUMA，p53-依賴的前凋亡蛋白表達也下調(diào)[Mol Cell.2001 Mar；7(3)673-82]。我們推斷羅可嘌呤是有效的B-CLL細胞凋亡誘導物，不論p53途徑的功能狀態(tài)如何。
更詳細研究在以下實施例2中闡述。
實施例2材料和方法B-CLL患者樣品取自52到93歲年齡范圍的患者。2個患者診斷為Ao階段，8個患者具有A階段、5個在B階段和2個在B/C階段，而確認10個患者在疾病的C階段。所有患者以前的和當前的治療以及ATM/TP53突變狀態(tài)和對氟達拉濱和CYC202的應答一起顯示在表2中。
B-CLL細胞測試了26個B-CLL患者樣品的ATM或TP53狀態(tài)。7個腫瘤是ATM突變型(6個沒有ATM蛋白表達，1個為殘留ATM蛋白)，15個腫瘤為ATM/TPS3野生型，并且4個腫瘤為突變型TP538。單核細胞通過得自B-CLL患者的全血梯度離心分離，并且在90％胎牛血清(FBS)和10％二甲基亞砜(DMSO)中以存活的狀態(tài)凍存。進行實驗的時候，將細胞解凍，用預溫的含有1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma，Gillingham，UK)和谷氨酰胺的RPMI洗滌，并以每毫升1×106細胞的密度培養(yǎng)至少3小時。體外敏感性試驗中，將細胞以每毫升大約1×106細胞用RPMI-1％BSA/谷氨酰胺鋪在24孔培養(yǎng)板上。
正常B細胞的分離通過如上所述的梯度離心從正常供體得到單核細胞(MNCs)。將全血與RosetteSep B細胞富集抗體混合物(StemCell Technologies，London，UK)混合，在室溫下培養(yǎng)20分鐘，用1∶1的PBS-2％FBS稀釋，用淋巴細胞分離劑分層并離心。將B細胞洗滌、計數(shù)并鋪到用于實驗的培養(yǎng)板上。
體外誘導凋亡藥物將CYC202在DMSO中重懸、過濾滅菌并分成幾份凍存在-20℃。進行實驗的時候，將等分解凍，用培養(yǎng)基進行1∶10稀釋并加到孔中。將氟達拉濱重懸在無菌水中并保持在4℃。對于敏感性試驗，各腫瘤樣品被分成二個等分部分，一半用5戈瑞照射并用不含任何藥物、二個藥物分別各自和一起聯(lián)用培養(yǎng)(所有樣品使用的濃度是20μM氟達拉濱和5、10和25μg/mlCYC202)，而第二等分部分不照射但同樣用藥物以及不用藥物處理。對于洗滌實驗，將細胞在有CYC202的情況下培養(yǎng)不同的持續(xù)時間，然后洗滌，用新鮮的培養(yǎng)基重新鋪板并在24和48小時測定細胞活力。
輻照將腫瘤樣品重懸在RPMI-1％BSA中并用5戈瑞(Gy)照射，使用發(fā)射γ型射線的Precisa 217放射源(Pantatron Ltd，Gosport，Hampshire，UK)。
凋亡分析膜聯(lián)蛋白V凋亡試劑盒(BD Pharmingen，Oxford，UK)用來測定細胞群的凋亡。將細胞如上述“B-CLL細胞”所述鋪到培養(yǎng)板上。將B-CLL和對照細胞用藥物處理0、4、8、16、24、48、72和96小時然后收集并用冷PBS洗滌。將細胞沉淀重懸，并將廠家提供的100μl的1×緩沖液加到各管中。除對照外，然后將5μl的膜聯(lián)蛋白V和5μl的碘化丙錠(PI)加到所有管中。輕輕混合后，在加入500μl的1x緩沖液以前，將管在黑暗中保持15-45分鐘并用Coulter Epics XL-MCL流式細胞器(Beckman Coulter，CA，USA)分析。
蛋白質(zhì)印跡將細胞用RPMI-1％ BSA+谷氨酰胺鋪到非組織培養(yǎng)處理的6孔板上，并恢復培養(yǎng)至少3小時然后加入CYC202。加入CYC202(或DMSO作為對照)后，將培養(yǎng)板輕輕振搖并放回到培養(yǎng)箱中。在標示的時間點，將細胞收集，用冷PBS沖洗并將細胞沉淀在液氮中快速凍存并儲存在-80℃。將解凍的細胞沉淀用100～150μl的含有蛋白酶抑制劑(DTT、V04、NaF、AEBSF、抑肽酶、亮肽素和胃酶抑素)的TGN緩沖液(50mM HCl、150mM NaCl、10％甘油、1％Tween-20、0.2％NP 40和50mMβ-甘油磷酸)在冰上裂解30分鐘。將裂解物在4℃在15,000rpm離心20分鐘，收集上清液并分批地快速凍存。使用Bradford試劑(Bio Rad，HemelHempstead，UK)測定每種樣品的蛋白含量。將等量的蛋白在8、10或12％的丙烯酰胺凝膠上電泳并進行標準蛋白印跡操作。Mcl-1和XPA的第一抗體購自BD Pharmingen(Oxford，UK)，Bcl-2、PARP n20和Mad3購自Santa Cruz(Autogen Bioclear，Calne，UK)并且肌動蛋白購自Sigma Aldrich(Dorset，UK)。抗RNA pol II和抗RNA pol II絲氨酸2購自Covance Research Products(Cambridge Bioscience Ltd，Cambridge，UK)。第二抗體抗小鼠IgG過氧化物酶結合物和抗山羊IgG偶聯(lián)過氧化物酶購自Sigma-Aldrich?？雇肏RP購自DAKO(Ely，UK)。固定化抗原使用ECL蛋白質(zhì)印跡檢測系統(tǒng)(Amersham Biosciences，Chalfont St Giles，UK)以及X光膠片曝光(HyperfilmM，Amersham Biosciences)檢測。
流式細胞測定CD5-PE(T1-RD1)和CD19-FITC(B4-FITC)抗體購自Coulter Clone(HighWycombe，UK)。進行染色的時候，在室溫下，將細胞在含有10％FBS的PBS中孵育20分鐘，然后洗滌、重懸在PBS-10％FBS中并在室溫下避光染色30分鐘。孵育后，將細胞洗滌、重懸在PBS-1％FBS中并通過使用CoulterEpics XL-MCL流式細胞儀進行流式細胞測定分析。
微陣列分析在用5μg/ml CYC202孵育前和孵育4小時后，將5個B-CLL腫瘤樣品，即2個ATM突變型和3個ATM/TP53野生型進行微陣列分析。再延長孵育20小時后，將各樣品的一份染色以測定CD5和CD19，并且另一份使用膜聯(lián)蛋白V染色外測定凋亡。對于微陣列分析，如前所述進行總RNA提取、合成cDNA第一和第二鏈、體外轉(zhuǎn)錄和芯片雜交8。孵育后，將芯片洗滌并用鏈親和素-藻紅蛋白標記并通過第二輪染色將結果信號放大。使用流控技術工作站(Affymetrix，High Wycombe)進行洗滌和染色步驟。用共聚焦氬離子激光器(Agilent Technologies，CA，USA)掃描芯片。
數(shù)據(jù)采集、歸一化、過濾和統(tǒng)計分析使用Affymetrix Microarray Suite 5.0軟件得到所有10個雜交的表達值。使用MAS5.0報告文件和Genespring 5.1(Silicon Genetics，San Carlos，USA)評價數(shù)據(jù)質(zhì)量。為了用GeneSpring 5.1軟件分析，對于各陣列，將原始數(shù)據(jù)從MAS5.0輸出并將值相對于中位信號進行標準化。為了以藥物應答為根據(jù)作比較，將未處理的樣品的基因表達平均水平作了另外的歸一化。U95Av2基因芯片含有12,627種轉(zhuǎn)錄物包括對照細菌基因。為設計一系列信息基因，用Genespring 5.1產(chǎn)生試驗性的解釋以比較接觸CYC202前后的腫瘤。在任何情況下，使用基于重復實驗的總體誤差模型測定差異。在5個B-CLL平行檢測中至少3個樣品中，將信號強度不顯著超出背景值的基因和表達沒有達到可信的檢測的臨界值的基因排除(根據(jù)Affymetrix MAS5.0檢測概率值p≤0.1)。最終，表達水平對藥物的應答變化不超過1.5倍的基因也被排除。剩余的基因被認為是提供信息的，并使用由平行測定獲得的方差統(tǒng)計的總體誤差模型，進行兩種情況(未處理的和處理的細胞)的參數(shù)(Welch)t檢驗。最后，為減少假差別基因表達的發(fā)現(xiàn)，使用Benjamini-Hochberg多重檢測校正過濾。
作為可選擇的方法，微陣列芯片的掃描圖像使用探針水平分位數(shù)歸一化(quantile normalization)進行分析9。隨后，使用Bioconductor方法的Affymetrix package(http//www.biocondutor.org)在原始CEL文件上進行強大的多-陣列分析。差異表達探針組用SAM11，12識別。最后，使用DNA-芯片分析器和默認設置(dChip；Wong Lab，Dept ofBiostatistics，Harvard School ofPublic Health，Dept.of Biostatistical Science，Dana-Farber Cancer Institute；http//www.dchip.org)進行基因的分級聚類(hierarchical clustering)。兩種方法識別的CYC202應答的基因被進一步考慮。另外，為了識別CYC202-特異的前凋亡應答，CYC202-應答基因的列表與得自同樣的腫瘤樣品的IR-應答的基因進行比較8。
結果CYC202是B-CLL腫瘤中是有效的體外凋亡誘導劑為了建立對于誘導B-CLL細胞中的毒性最佳的CYC202劑量和培養(yǎng)時間，典型的B-CLL腫瘤樣品(1個ATM野生型和1個ATM突變型)開始接受增加的CYC202劑量并評價培養(yǎng)4、8、16、24、48和72小時的凋亡情形。如圖11a顯示，1μg/ml的處理對任何樣品中的細胞存活力或凋亡的誘導作用幾乎沒有影響，而2.5μg/ml影響一些但不是所有的B-CLL樣品(圖a)。然而，用5μg/mlCYC202處理24小時內(nèi)，B-CLL的存活力顯著喪失，48小時的處理導致大部分的細胞凋亡。幾乎沒有觀察到高于5μg/ml濃度的劑量-依賴性(結果沒有顯示)。也發(fā)現(xiàn)在用5μg/ml的CYC202處理4和8小時之間可檢測到初步的凋亡跡象，而通過16小時該初步的效應更加明顯并且活細胞的比例大大地減少了(數(shù)據(jù)未顯示)。
為確定，用CYC202處理不同時間的B-CLL細胞如果在暴露于藥物后放置在無藥物培養(yǎng)基中恢復是否能避免藥物的作用，進行了洗滌實驗。將3個腫瘤細胞樣品用5μg/ml的CYC202處理30分鐘、1、2、3、4、6和8小時。然后將藥物洗去并再將細胞孵育24小時。然后通過膜聯(lián)蛋白V/PI染色檢測培養(yǎng)物的存活力。暴露于CYC202小于6小時并隨后恢復培養(yǎng)不誘導可測量的細胞毒性作用，但暴露時間為6小時和更長，不論暴露于藥物后的恢復期如何，可見存活力大的下降。這些結果與處理至少8小時的B-CLL培養(yǎng)物中用膜聯(lián)蛋白V測定的早期凋亡細胞的形態(tài)表現(xiàn)是一致的，并且表明曝露于藥物的最小時間為不可逆導致細胞凋亡的方法所必需。B-CLL樣品(15個ATM野生型腫瘤、7個ATM突變型腫瘤和4個TP53突變型腫瘤)也在用CYC202培養(yǎng)24、48和72小時后通過膜聯(lián)蛋白V測定，并且與通過電離輻照和氟達拉濱殺傷同樣腫瘤的結果相比較。這些比較結果如圖11b(ATM野生型腫瘤)、圖11c(ATM突變型腫瘤)和圖11d(TP53突變型腫瘤)所示。
在26個B-CLLs當中，觀察到用5μg/ml的CYC202處理后的存活力平均下降83.6％(53～97％+/-10.1％，圖12a)，而未經(jīng)處理的B-CLL細胞顯示存活力僅僅下降8.0％+/-8.5％。當B-CLLs按基因型分類，15個ATM野生型腫瘤顯示存活力平均下降83.5％+/-11.7％(圖12b)，而ATM突變型腫瘤和TP53突變型腫瘤分別地顯示存活力喪失83.9％+/-7.4％(圖12b)和85.8％+/-9.7％(圖12b)。因此，3種基因型對5μg/ml的CYC202都不具有抗性并且所有3組都顯示了對藥物類似的應答。
顯著地，當與5μg/ml的CYC202相比時，無論哪種亞型，用20μM氟達拉濱處理的細胞顯示存活力喪失的減少和凋亡增加的降低(圖11b、11c和11d)。該差異在ATM突變型和TP53突變型亞型中最明顯，其中在細胞中處理的第一個24小時內(nèi)沒有觀察到高于自發(fā)凋亡水平的存活力喪失的增加(圖11c和11d)。對于所有腫瘤基因型的組合，在處理24小時后，氟達拉濱誘導的存活力總體下降13.3％+/-12.1％(圖12a)。對于單獨的ATM野生型腫瘤，在同樣的時間點存活力下降14.9％+/-12.7％(圖12b)，與ATM突變型腫瘤的7.9％+/-7.2％(圖12b)和4個TP53突變型腫瘤的16.7％+/-16.0％(圖12b)相比。甚至在氟達拉濱處理48小時后，存活力的下降顯著地低于用CYC202培養(yǎng)24小時的數(shù)值?？傊?，可以看出經(jīng)過同樣的處理期，氟達拉濱誘導凋亡比CYC202誘導的凋亡低得多(如下列表1概括)。有趣地，6/23的腫瘤體外抗氟達拉濱并且67％(4/6)是ATM突變型。在氟達拉濱敏感的腫瘤樣品中，13個為ATM野生型并且3個(19％)是ATM突變型。值得注意地，盡管對于藥物的應答慢于野生型腫瘤，4個突變型TP53腫瘤樣品無一顯示體外抗氟達拉濱(概括在表2中)。
總之，CYC202，而不是氟達拉濱，在包括顯示放射誘導凋亡缺陷的所有B-CLL樣品中能誘導高水平的凋亡。因此，不論ATM/TPS3基因的狀態(tài)如何，CYC202體外殺傷B-CLL細胞比氟達拉濱更加有效。
與CYC202的效應相反，并且與先前的觀察一致，在IR處理24小時后，野生型、ATM突變型和TP53突變型腫瘤顯示很少或幾乎沒有凋亡(圖11c、11d和12b)。暴露于IR中72小時后，IR誘導凋亡變得明顯，但僅僅在有ATM/TPS3野生型序列的腫瘤中。
為了分析3種處理形式間凋亡誘導的協(xié)同效應，26個腫瘤樣品中的25個接受包括IR加氟達拉濱、IR加cyc202或氟達拉濱加cyc202的聯(lián)合處理。一個腫瘤用組合藥物處理，但沒有輻照法。與用氟達拉濱和IR的殺傷的不同的機制一致，在用氟達拉濱處理24小時的20/25腫瘤中觀察到對放射增加的應答率。相反，CYC202處理的樣品的輻照不增加細胞毒性，提示該藥物作為單一藥劑在B-CLL殺傷中極大的效力。同樣地，向CYC202處理的培養(yǎng)物中加入氟達拉濱顯示凋亡沒有超過用CYC202單獨誘導的殺傷水平。因此，可能氟達拉濱的效應被CYC202的更大的細胞毒性掩蓋(尤其在較早的時間點)。
CYC202對正常B淋巴細胞的凋亡誘導的效應為了確定CYC202治療在非白血病性B淋巴細胞上的效應，從5個對照個體分離細胞并用1～20μg/ml濃度的藥物處理。與CYC202在B-CLL細胞上的效應相反，正常B細胞對5μg/ml的CYC202顯示出延遲的和降低的毒性。對照個體的未經(jīng)處理的B細胞顯示24小時存活力平均下降4.4％(+/-1.9％)，而用5μg/ml的CYC202處理相同時間的B細胞的存活力下降31.4％+/-17.1％。這與用5μg/ml的CYC202處理B-CLL腫瘤24小時存活力更多地下降83.6％+/-10.1％(圖13)進行比較。在48小時，未處理的B細胞存活力下降了26.5％+/-19.3％，用CYC202處理的B細胞下降了47.4％+/-17.2％，并且B-CLL腫瘤下降88.3+/-8.1％。CYC202對正常B細胞的細胞毒性僅僅達到使用20μg/ml時B-CLLs中觀察到的相應的水平。因此，從我們的數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)看來在5μg/ml濃度的CYC202顯示對于B-CLL細胞顯著程度的選擇性細胞毒性。
CYC202殺傷B-CLL的機制a)CYC202對凋亡途徑以及效應器胱冬酶的作用B-CLL是慢循環(huán)(slowly-cycling)淋巴樣腫瘤細胞。在用CYC202培養(yǎng)24小時，當有效殺死包括那些帶有缺陷p53通路的所有B-CLL腫瘤的情況下，可以合理地推斷出CYC202殺死B-CLL的原因涉及與細胞周期抑制或p53-依賴性轉(zhuǎn)錄的活化不一樣的機制。實際上，蛋白印跡顯示用CYC202培養(yǎng)后沒有p53活化(圖14a)。盡管ATM野生型B-CLL中用CYC202處理的3和6小時之間的p53水平有一些增加，沒有p53應答蛋白p21上調(diào)的證據(jù)(圖14a)。同樣地并且也象期望的那樣，在用ATM或TP53突變型的腫瘤中，也沒有證據(jù)表明CYC202誘導的p53上調(diào)，p21也沒有。即使有的話，這兩種腫瘤都顯示p53蛋白水平隨時間的減少，用CYC202培養(yǎng)18-24小時后其變得幾乎不可檢測(圖14a)。
分析了下游的凋亡通路活化。與凋亡的誘導一致，PARP1，即活化效應器胱冬酶-3降解的靶標，用CYC202處理6～24小時，在所有3種B-CLL亞型的典型腫瘤中而被切割(圖14b)。此外，在所有3種B-CLL亞型中，通過胱冬酶原-3(procaspase-3)的切割和活化的(切割的)胱冬酶-3的伴隨出現(xiàn)確定直接的胱冬酶-3活化，而胱冬酶原-7的切割和消失表明胱冬酶-7的活化(圖14b)?？梢酝茢喑鯟YC202誘導的殺傷包括p53凋亡通路下游的活化。
b)CYC202對轉(zhuǎn)錄的影響為了研究在B-CLL細胞中CYC202對轉(zhuǎn)錄的影響，5個代表樣品(3個ATM/TP53野生型和2個突變型ATM)在暴露于5μg/ml的CYC202之前和4小時后，使用U95A Affymetrix微陣列芯片進行全基因表達譜分析。如材料和方法所述富集細胞并進行微陣列分析。在用CYC202培養(yǎng)24小時后一部分處理的細胞也用膜聯(lián)蛋白V測定分析以證實在所有腫瘤已經(jīng)誘導了凋亡。CYC202處理的樣品的基因表達的結果與相應未處理的樣品的基態(tài)基因表達比較。經(jīng)過濾除非信息基因和包括多重檢測校正的統(tǒng)計測試后，我們確定暴露于CYC202后下調(diào)超過1.5倍的547種基因和上調(diào)超過1.5倍的135種基因。雖然上調(diào)的基因針對多樣的細胞信號，但下調(diào)的基因則清楚地包含了能解釋CYC202在B-CLL中的前凋亡活性的幾個細胞通路。首先，轉(zhuǎn)錄和翻譯啟動相關蛋白的編碼基因譜，例如TFIIB、TFIID、TFIIS、TFIIEβ、RNA聚合酶II和III、延伸起始因子eiF-2α、γ和eiF-4，在暴露于CYC202后明顯下調(diào)(圖15a)。此外，具有支持細胞的存活的抗凋亡特性的基因如Mcl-1、Bcl-2(圖15a)、Mad3、NFκB亞基、熱休克蛋白家族的幾個成員、干擾素細胞因子和受體的家族也應答CYC202而下調(diào)。最終，許多修復基因包括PCNA、XP-C和ERCC4的表達，在暴露于藥物4小時后下降(圖15a)。其它的重要的下調(diào)通路包括MAP激酶及它們下游的效應器。
CYC202的轉(zhuǎn)錄的效應表現(xiàn)顯著地不同于以前在同類B-CLL腫瘤中IR后觀察到的那些8。與IR誘導信號相反并與CYC202的轉(zhuǎn)錄效應的p53非依賴性質(zhì)一致，在ATM/P53野生型腫瘤中，p53效應基因如p21(圖15a)和Puma的mRNA水平上，CYC202沒有誘導顯著的變化。此外，前存活因子Mcl-1(圖15a)、熱休克蛋白和NFκB基因的下調(diào)對于CYC202效應似乎是完全特異的，因為在野生型B-CLL腫瘤中，在IR后，沒有發(fā)現(xiàn)這些基因上調(diào)。
蛋白質(zhì)印跡用來證實對CYC202的關鍵效應器的差異表達。Mcl-1是調(diào)節(jié)淋巴細胞凋亡的重要的Bcl-2家族的前存活基因13。在ATM野生型、ATM突變型和TP53突變型腫瘤中，研究了用CYC202培養(yǎng)后在多個時間點Mcl-1蛋白水平的表達。對所有腫瘤亞型，在用5μg/ml的CYC202培養(yǎng)2小時觀察到Mcl-1蛋白水平開始下降，隨后用CYC202處理6小時的蛋白的顯著下調(diào)和完全消失(圖15b)。有趣地，另一個前存活蛋白Bcl-2的水平下降的發(fā)生比Mcl-1的慢得更多，Bcl-2的mRNA也應答CYC202而下調(diào)。不希望束縛于理論，這可能是這些蛋白的半衰期差異的反映(Mcl-1的0.5～3小時比Bcl-2的10～14小時)并提示甚至在Bcl-2蛋白存在時可發(fā)生凋亡14。
如總mRNA和蛋白合成下調(diào)的效應證明，24小時后，肌動蛋白水平以及DNA修復相關蛋白(PCNA和XP-C)的水平都降低了。相比之下，作為對照的用DMSO處理的腫瘤對Mcl-1蛋白的表達沒有影響，也不誘導PARP1(圖15c)的斷裂，表明培養(yǎng)條件單獨不誘導這些蛋白的下調(diào)。
為了確定CYC202總體下調(diào)轉(zhuǎn)錄的機制，進行研究以確定是否CYC202不僅影響RNA聚合酶II的水平并且影響RNA聚合酶II的活化。測定了總RNA pol II蛋白的水平以及RNA pol II在絲氨酸2的磷酸化，絲氨酸2是與轉(zhuǎn)錄的延伸期有關的位點。引人注目地，發(fā)現(xiàn)用CYC202處理8小時的B-CLL腫瘤樣品中的磷酸化蛋白的水平顯著地降低(圖16a)，而RNA pol II總蛋白量不同樣顯著地下降(圖16b)。因此結果提示CYC202下調(diào)轉(zhuǎn)錄可包括直接抑制細胞周期蛋白9和細胞周期蛋白7，這兩種激酶是負責RNA polII蛋白的磷酸化。
實施例3羅可嘌呤對人T-前淋巴白血病細胞的效應臨床病例研究由于在常規(guī)血液檢查中發(fā)現(xiàn)白細胞增多，一名66歲的婦女就診于門診部。外周血細胞上進行的免疫表型表明97％的單核細胞是雙陽性T淋巴細胞(TcRα/β+/TcRγ/δ-、CD3+、CD8+、CD4+、CD2+、CD5+和CD7+)、部分活化的(CD25+、CD30-、CD38+、CD45RA-、CD45ROCD69-CD71-、HLA-DR-)、表達多種粘附分子(CD11a+、CD11b+、CD11c+、CD18+、CD28+、CD62L+和CD86-)和不表達CD56、CD34、CD117或B-或NK-細胞標記物。這些細胞不表達CD1a和TdT，這證實它們的成熟的胸腺后(post-thymic)的起源。T細胞受體(TcR)基因分析顯示克隆的TcRγ-鏈重排。TcRα/β+的表面表達也被檢測。細胞被分類為人白細胞抗原-B27(HLA-B27)陽性，但沒有發(fā)現(xiàn)自身免疫病的特征。
圖1顯示TPLL-1細胞(A)的CD8+/CD4+雙陽性免疫表型和HLA-B27的直方圖(B)。在FACScan流式細胞儀(Becton Dickinson，USA)上用CD4的偶聯(lián)到FITC的單克隆抗體和CD8的偶聯(lián)到藻紅蛋白的單克隆抗體進行外周血的流式細胞分析(A)。HLA-B27直方圖中的左側箭頭代表取舍點的位置(B)。相應地使用包括在HLA-B27試劑盒(Becton Dickinson Biosciensies，USA)中的校準珠粒進行儀器校準。右箭頭鍵相應于患者的樣品的中間通道值，表明HLA-B27陽性。
編碼TPLL-1的細胞用Ficoll Paque密度梯度離心法分離。導致具有T-PLL的形態(tài)學變異的小細胞的超過98％的CD8+/CD4+雙陽性細胞的單核細胞群。在用促分裂原(植物凝集素、美洲商陸有絲分裂原和佛波醇酯)刺激之后進行細胞遺傳學研究，但沒有得到細胞分裂中期(methaphases)。比較基因組雜交(CGH)分析顯示在8染色體上的遺傳獲得量，其在TPLL的病例中是常見的(55％)。沒有重排的c-myc原癌基因的3個拷貝和著絲粒(centromer)8的2個拷貝在間期核中用雙色熒光原位雜交(FISH)檢測。
比較基因組雜交腫瘤DNA的雜交用FITC檢測并且參比DNA雜交用TRITC檢測(圖2)。根據(jù)紅綠熒光強度比的拷貝數(shù)的差異用ISIS，Metasystems進行定量。在6cen-q21、6q26和11q13-q23q發(fā)現(xiàn)遺傳的缺失，而在6p21-p25、7p15-p22、8p、8q、22q13有遺傳獲得。這些發(fā)現(xiàn)與在T-PLL中顯示高度基因組不穩(wěn)定的先前數(shù)據(jù)一致[Soulier等，Genes Chromosomes Cancer.2001 Jul；31(3)248-54]。
圖3顯示TPLL-1細胞中的c-myc的熒光原位雜交(FISH)分析。檢測到3組協(xié)同定位信號而不是2組，表明存在另外的c-myc位點?；蛘撸瑢擞?紅色和綠色)的c-myc側翼探針施加到FISH分離測定中。在所有細胞只識別協(xié)同定位的綠色和紅色信號，代表沒有基因重排的完整的c-myc位點。雜交信號在200個形態(tài)學上完好的核中計算。
圖4顯示c-myc的三個拷貝的檢測，通過基因的雙色FISH-羅丹明檢測(紅色)和FITC D8Z1染色體8著絲粒周圍典型衛(wèi)星的FITC檢測(綠色)。
TPLL-1細胞用多種激酶抑制劑(包括對PKC同工型、MAPK和PI-3K選擇性的)處理，但在細胞存活力上沒有影響(數(shù)據(jù)未顯示)。TPLL-1細胞用10μM羅可嘌呤孵育不同的時間間隔并用FACScan計數(shù)凋亡細胞百分比。
圖5顯示培養(yǎng)5小時導致96％的TPLL-1細胞凋亡，其不被佛波醇酯抑制。用羅可嘌呤培養(yǎng)5小時導致96％的TPLL-1細胞凋亡，其不被佛波醇酯(10nM TPA)抑制。
圖6顯示用10μM的羅可嘌呤培養(yǎng)18小時的結果。大部分細胞被裂解。少數(shù)剩余的是晚期凋亡細胞。
檢測TPLL-1細胞的細胞周期蛋白A、B1、D1和E表達(圖7)。只有細胞周期蛋白E表達用抗體HE12(Santa Cruz Biotechnology)通過免疫印跡檢測。箭頭表明MW標準蛋白(Gibco)的位置。
圖8顯示TPLL-1細胞凋亡抑制因子Bcl-2的表達。c-myc ASO處理和羅可嘌呤都不抑制Bcl-2表達。沒有檢測到前凋亡蛋白Bax的表達(數(shù)據(jù)未顯示)。
第一泳道對照第2泳道ASO處理18小時第3泳道10μM羅可嘌呤處理20分鐘第4泳道10μM羅可嘌呤處理5小時羅可嘌呤在TPLL-1細胞中誘導選擇性凋亡。據(jù)信羅可嘌呤的作用至少有2種不同的機制。第一種為對Cdk2/CyclinE的抑制，并且第二種為對PI-3K通路的活化。進行研究以考察羅可嘌呤對TPLL-1細胞中應激信號機制和PI-3K通路的效應。
圖9顯示10μM羅可嘌呤對TPLL-1的細胞內(nèi)應激信號通路的影響。在培養(yǎng)20分鐘后檢測到p38 S51-磷酸化作用的峰。使用Stress Signal SamplePack(BIOSOURCE Int.)進行免疫印跡。
圖10顯示羅可嘌呤不活化TPLL-1細胞中的PI-3K通路。結果是用通過Akt/PKB(Ser-473)和Raf1(Ser-338)的位點PI-3K-依賴方式磷酸化的特異抗體的免疫印跡。在用羅可嘌呤培養(yǎng)后也沒有檢測到在Tyr-508的PI-3K磷酸化(數(shù)據(jù)未顯示)。
作為結論，羅可嘌呤誘導人CD8+/CD4+T-PLL細胞的凋亡。羅可嘌呤通過PKC-非依賴通路誘導凋亡。其效應很迅速并且對于T-PLL細胞有選擇性。這些發(fā)現(xiàn)可能解釋盡管T-PLL細胞體外不增殖，Cdk2/細胞蛋白E活性對于它們的存活力起重要的作用。通過未知機制的p38激酶活化也與羅可嘌呤誘導的凋亡有關。因此，在T-PLL治療中羅可嘌呤提供新的治療的方法。
沒有背離本發(fā)明的范圍和實質(zhì)的本發(fā)明的各種修飾和變化對于本領域的技術人員是顯而易見的。盡管關于具體的優(yōu)選方案本發(fā)明已經(jīng)說明，應當理解所述的本發(fā)明應不限于這些具體的實施方案。實際上，對于相關領域的技術人員明顯的用于執(zhí)行本發(fā)明的描述的方法的各種的修飾確定被本發(fā)明包含。
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表1無處理、CYC202(5μg/ml)或氟達拉濱(20μM)對B-CLLs的影響

1+/+野生型2-/-突變型表2B-CLL患者的基因狀態(tài)、藥物應答和臨床數(shù)據(jù)

表3B-CLL患者的基因狀態(tài)、藥物應答和臨床數(shù)據(jù)的概述

*＝耐氟達拉濱的腫瘤
權利要求
1.羅可嘌呤或其可藥用鹽在制備用于治療慢性淋巴細胞白血病的藥物中的用途。
2.根據(jù)權利要求1的用途，其中慢性淋巴細胞白血病是T細胞幼稚淋巴細胞白血病(T-PLL)。
3.根據(jù)權利要求1的用途，其中慢性淋巴性細胞性白血病是B細胞慢性淋巴細胞白血病(B-CLL)。
4.根據(jù)任一項前述權利要求的用途，其中慢性淋巴細胞白血病與突變型ATM有關。
5.根據(jù)任一項前述權利要求的用途，其中慢性淋巴細胞白血病與突變型TP53有關。
6.根據(jù)任一項前述權利要求的用途，其中羅可嘌呤下調(diào)抗凋亡基因的表達。
7.根據(jù)權利要求6的用途，其中抗凋亡基因包括至少一種選自Mcl-1、Bcl-2和Mad3的基因。
8.根據(jù)任一項前述權利要求的用途，其中羅可嘌呤下調(diào)DNA修復基因的表達。
9.根據(jù)權利要求8的用途，其中DNA修復基因包括PCNA或XPA。
10.根據(jù)任一項前述權利要求的用途，其中羅可嘌呤下調(diào)與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關的基因的表達。
11.根據(jù)權利要求10的用途，其中與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關的基因包括至少一種選自Pol II、eIF-2，4e和E2F的基因。
12.根據(jù)任一項前述權利要求的用途，其中羅可嘌呤或其可藥用鹽的量足夠下調(diào)Mcl-1表達。
13.根據(jù)任一項前述權利要求的用途，其中羅可嘌呤與可藥用的載體、稀釋劑或賦形劑組合給藥。
14.根據(jù)任一項前述權利要求的用途，其中羅可嘌呤與一種或多種其它的抗增殖藥物聯(lián)合給藥。
15.根據(jù)任一項前述權利要求的用途，其中羅可嘌呤以足夠抑制至少一種CDK酶的量給藥。
16.根據(jù)任一項前述權利要求的用途，其中CDK酶選自CDK1、CDK2、CDK4、CDK7和CDK9。
17.根據(jù)權利要求15或權利要求16的用途，其中CDK酶選自CDK1和CDK2。
18.根據(jù)權利要求15或權利要求16的用途，其中CDK酶選自CDK7和CDK9。
19.一種治療患有慢性淋巴細胞白血病(CLL)患者的方法，該方法包括給藥治療有效量的羅可嘌呤或其藥學上有效的鹽。
20.根據(jù)權利要求19的方法，其中羅可嘌呤下調(diào)抗凋亡基因的表達。
21.根據(jù)權利要求20的方法，其中抗凋亡基因包括至少一種選自Mcl-1、Bcl-2和Mad3的基因。
22.根據(jù)權利要求19至21任一項的方法，其中羅可嘌呤下調(diào)DNA修復基因的表達。
23.根據(jù)權利要求22的方法，其中DNA修復基因包括PCNA或XPA。
24.根據(jù)權利要求19至23任一項的方法，其中羅可嘌呤下調(diào)與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關的基因的表達。
25.根據(jù)權利要求24的方法，其中與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關的基因包括至少一種選自Pol II、eIF-2，4e和E2F的基因。
26.一種下調(diào)慢性淋巴細胞白血病細胞中抗凋亡基因表達的方法，該方法包括使細胞接觸羅可嘌呤或其可藥用鹽。
27.一種治療患者的慢性淋巴細胞白血病的方法，該方法包括以足夠下調(diào)患者的抗凋亡基因的表達的量給藥羅可嘌呤或其可藥用鹽于患者。
28.權利要求26或27的方法，其中抗凋亡基因包括Mcl-1、Bcl-2或Mad3。
29.一種下調(diào)慢性淋巴細胞白血病細胞中DNA修復基因表達的方法，該方法包括使細胞接觸羅可嘌呤或其可藥用鹽。
30.一種治療患者的慢性淋巴細胞白血病的方法，該方法包括以足夠下調(diào)患者中DNA修復基因的表達的量給藥羅可嘌呤或其可藥用鹽于患者。
31.根據(jù)權利要求29或30的方法，其中DNA修復基因包括PCNA或XPA。
32.一種下調(diào)慢性淋巴細胞白血病細胞中與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關的基因表達的方法，該方法包括使細胞接觸羅可嘌呤或其可藥用鹽。
33.一種治療患者的慢性淋巴細胞白血病的方法，該方法包括以足夠下調(diào)患者中與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關的基因的表達的量給藥羅可嘌呤或其可藥用鹽于患者。
34.根據(jù)權利要求32或33的方法，其中與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關的基因包括至少一種選自RNAPol II、eIF-2，4e和E2F的基因。
35.根據(jù)權利要求19至34任一項的方法，其中慢性淋巴細胞白血病是T細胞幼稚淋巴細胞白血病(T-PLL)。
36.根據(jù)權利要求19至34任一項的方法，其中慢性淋巴細胞白血病是B細胞慢性淋巴細胞白血病(B-CLL)。
37.根據(jù)權利要求19至36任一項的方法，其中慢性淋巴細胞白血病與突變型ATM有關。
38.根據(jù)權利要求19至37任一項的方法，其中慢性淋巴細胞白血病與突變型TP53有關。
39.根據(jù)權利要求19至38任一項的方法，其中羅可嘌呤以足夠抑制至少一種CDK酶的量給藥。
40.根據(jù)權利要求39的方法，其中CDK酶選自CDK1、CDK2、CDK4、CDK7和CDK9。
41.根據(jù)權利要求39或權利要求40的方法，其中CDK酶選自CDK1和CDK2。
42.根據(jù)權利要求39或權利要求40的方法，其中CDK酶選自CDK7和CDK9。
43.根據(jù)權利要求19至42任一項的方法，其中羅可嘌呤與至少一種選自可藥用的載體、稀釋劑和賦形劑的添加劑組合給藥。
44.根據(jù)權利要求19至43任一項的方法，其中羅可嘌呤與至少一種抗增殖藥物聯(lián)合給藥。
45.一種用于治療慢性淋巴細胞白血病的藥物組合物，包括羅可嘌呤或其可藥用鹽和可藥用的載體。
46.根據(jù)權利要求45的藥物組合物，其中慢性淋巴細胞白血病是T細胞幼稚淋巴細胞白血病
47.根據(jù)權利要求45的藥物組合物，其中慢性淋巴細胞白血病是B細胞慢性淋巴細胞白血病。
48.根據(jù)權利要求45至47的任一項的藥物組合物，還包括稀釋劑或賦形劑。
49.一種下調(diào)B細胞慢性淋巴細胞白血病細胞中的Mcl-1基因表達的方法，所述方法包括使所述細胞接觸羅可嘌呤或其可藥用鹽。
50.一種治療患者的B細胞慢性淋巴細胞白血病的方法，所述方法包括以足夠下調(diào)所述患者中Mcl-1的表達的量給藥羅可嘌呤或其可藥用鹽于患者。
51.羅可嘌呤或其可藥用鹽在制備用于治療B細胞慢性淋巴細胞白血病的藥物中的用途，其中羅可嘌呤或其可藥用鹽的量足夠下調(diào)Mcl-1的表達。
全文摘要
本發(fā)明涉及羅可嘌呤或其可藥用鹽在制備用于治療慢性淋巴細胞白血病的藥物中的用途。
文檔編號A61P35/02GK1816338SQ200480018817
公開日2006年8月9日 申請日期2004年6月30日 優(yōu)先權日2003年6月30日
發(fā)明者阿索斯·賈內(nèi)拉－博拉多里, 保羅·莫斯, 塔特賈納·斯坦科維克, 西蒙·格林, 戴維·萊恩 申請人:西克拉塞爾有限公司